JPWO2017104796A1 - 人工rna制限酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明において、好ましくは、ペプチドリンカーは、GlyGlyGlyGlySerからなるペプチド、又はGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySerからなるペプチドである。
Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n、(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n等を使用することができるが(式中、nは2〜20の整数であり、好ましくは2〜10整数であり、より好ましくは2〜5の整数であり、特に好ましくは2又は3である)、特に限定されない。
まず、本発明の人工RNA制限酵素を大腸菌を用いて作製可能とするために、RNA結合タンパク質の発現ベクターに、ペプチドリンカーをコードする配列を付加したプライマーで増幅した核酸切断酵素を導入して、大腸菌での発現ベクターを構築した。
R1':GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG (配列番号9)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ(配列番号1)
R2 :AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG(配列番号2)
R3 :HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG(配列番号3)
R4 :HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG(配列番号4)
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ(配列番号5)
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG(配列番号6)
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS(配列番号7)
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP(配列番号8)
R8':HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG (配列番号10)
R1 :HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ(配列番号1)
R2 :AAYQLMVDVFGCYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG(配列番号11)
R3 :HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG(配列番号3)
R4 :HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG(配列番号4)
R5 :QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ(配列番号5)
R6 :HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG(配列番号6)
R7 :NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS(配列番号7)
R8 :ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP(配列番号8)
標的配列を含むインフルエンザゲノム由来の190塩基からなるRNAをコードするDNAを合成し、これをpET21aベクターのT7プロモーターの下流に導入した。
上述した方法で得られた基質RNAを用い、上述した方法で精製した人工RNA制限酵素のRNA切断活性を試験管内で検証した。
上述した人工RNA制限酵素では、ペプチドリンカーを、GlyGlyGlyGlySerの5アミノ酸からなるペプチドを3つ繰り返して、15アミノ酸のペプチドリンカーとしており、この場合の人工RNA制限酵素をL15型と呼ぶこととする。
上述した実施形態では、核酸切断酵素としてSNaseを用いたが、他の核酸切断酵素を用いた場合でも同様の切断活性を有していることを確認するため、SNaseドメインの代わりにRNAを切断することが知られているPINドメインを用いることとした。
(1)プラスミドの構築(図5〜図22)
動物細胞用人工RNA制限酵素発現ベクターpCMV(-H)-hPUF_MT-L10-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF_MT-L10-hPIN-FLAGのEcoRIサイトとHindIIIサイト間にhPUFをコードするDNA配列をクローニングしてpCMV(-H)-hPUF-L10-SNase-FLAGとCMV(-H)-hPUF-L10-hPIN-FLAGを構築した。次に、pCMV(-H)-hPUF-L5-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF-L5-hPIN-FLAGからhPUFをコードするDNA配列を除去するためにEcoRIとHindIIIで切断・平滑化・ライゲーションを行い、pCMV(-H)-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPIN-FLAGを構築した。これらの4種類のプラスミドから核局在化シグナルをコードするDNA配列を除去するために、合成オリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製したT7タグをコードするDNA配列をNheIサイトとBamHIサイトの間にクローニングしてpCMV(-H)-hPUF-L10-SNase-FLAG(-NLS)、pCMV(-H)-hPUF-L10-hPIN-FLAG(-NLS)、pCMV(-H)-SNase-FALG(-NLS)、およびpCMV(-H)-hPIN-FLAG(-NLS)を構築した。そして、これらの4種類のプラスミドを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をそれぞれpCAGGSプラスミドのXhoIサイト間にクローニングしてpCAGGS-hPUF-L10-SNase-FLAG(-NLS)、pCAGGS-hPUF-L10-hPIN-FLAG(-NLS)、pCAGGS-SNase-FLAG(-NLS)、およびpCAGGS-hPIN-FLAG(-NLS)を構築した。
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO2 5%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド81 ng、RNA分解ドメイン発現プラスミド81 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 81 ngをレポータープラスミド9 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 10 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃・CO2 5%培養槽で48時間培養後に1×Passive Lysis Buffer 100 mlで細胞ライセートを調製し、Luciferase Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、ウェル間のトランスフェクション効率を標準化するためにLuminescent b-galactosidase Detection Kit IIを用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性値をβ-ガラクトシダーゼ活性値で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なルシフェラーゼ活性を評価した。測定結果を図23に示す。標的配列のコピー数に依存してルシフェラーゼ活性が減少した。
(1)プラスミドの構築(図25〜図34)
動物細胞用人工RNA制限酵素発現ベクターpCMV(-H)-hPUF_MT-L5-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF_MT-L5-hPIN-FLAGのEcoRIサイトとHindIIIサイト間にhPUFをコードするDNA配列をクローニングしてpCMV(-H)-hPUF-L5-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF-L5-hPIN-FLAGを構築した。そして、これらのプラスミドを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をそれぞれpCAGGSプラスミドのXhoIサイト間にクローニングしてpCAGGS-hPUF-L5-SNase-FLAGとpCAGGS-hPUF-L5-hPIN-FLAGを構築した。
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO2 5%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド86 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 86 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各1 ng、レポータープラスミド0.1 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 10 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後に1×Passive Lysis Buffer 100 mlで細胞ライセートを調製し、Luciferase Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、ウェル間のトランスフェクション効率を標準化するためにLuminescent b-galactosidase Detection Kit IIを用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性値をβ-ガラクトシダーゼ活性値で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なルシフェラーゼ活性を評価した。レポータープラスミドにpUC-vRNA(TGTATATA_Luc)(NCR_NS)とpUC-vRNA[(TGTATATA)3_Luc](NCR_NS)を使用した時はvRNA(マイナス鎖)内にhPUF結合サイトが存在し、pUC-vRNA(Luc_TGTATATA)(NCR_NS)とpUC-vRNA[Luc_(TGTATATA)3](NCR_NS)を使用した時はcRNA(プラス鎖)およびmRNA内にhPUF結合サイトが存在する。
(1)プラスミドの構築(図40〜図41)
A型インフルエンザウイルス(A/chicken/kumamoto/1-7/2014(H5N8))由来NPをコードするDNA配列を委託合成し、これを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をpUC-vRNA(Luc_MCS)(NCR_NS)のAgeIサイトとBglIIサイト間にマイナス鎖が転写される向きにクローニングにしてpUC-vRNA(Luc_Kuma_NP)(NCR_NS)を構築した。同様に、A型インフルエンザウイルス(A/whooper swan/Akita/1/2008(H5N1))由来PAをコードするDNA配列を委託合成し、これを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をpUC-vRNA(Luc_MCS)(NCR_NS)のAgeIサイトとBglIIサイト間にマイナス鎖が転写される向きにクローニングしてpUC-vRNA(Luc_Aki_PA)(NCR_NS)を構築した。
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO25%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド85 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 85 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各1 ng、レポータープラスミド1 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 10 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後に1×Passive Lysis Buffer 100 mlで細胞ライセートを調製し、Luciferase Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、ウェル間のトランスフェクション効率を標準化するためにLuminescent b-galactosidase Detection Kit IIを用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性値をβ-ガラクトシダーゼ活性値で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なルシフェラーゼ活性を評価した。レポータープラスミドにpUC-vRNA(Luc_Kuma_NP)(NCR_NS)を使用した時はvRNA(マイナス鎖)内にhPUF結合サイトが存在し、pUC-vRNA(Luc_Aki_PA)(NCR_NS)を使用した時はcRNA(プラス鎖)およびmRNA内にhPUF結合サイトが存在する。
RNAレベルでの解析)(図46)
(1)プラスミドの構築(図47〜図48)
ヒト由来のRNAポリメラーゼIプロモーターの下流にA型インフルエンザウイルス(A/PR/8/34(H1N1))のNSをコードするセグメント由来の5’非翻訳領域(5’NCR)、A型インフルエンザウイルス(A/chicken/kumamoto/1-7/2014(H5N8))由来のNP遺伝子のマイナス鎖、(A/PR/8/34(H1N1))のNSをコードするセグメント由来の3’非翻訳領域(3’NCR)、およびマウス由来のRNAポリメラーゼIターミネーターを配置したDNA配列を委託合成した。これをpUC19のXbaIサイトとAcc65Iサイト間にクローニングしてウイルスRNA発現プラスミドpUC-vRNA(Kuma_NP)(NCR_NS)を構築した。
poly-D-lysine 35 mmディッシュに4×105個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO25%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド2400 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 2400 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各25 ng、ウイルスRNA発現プラスミドpUC-vRNA(Kuma_NP)(NCR_NS)2.5 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 2.5 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後にTRIzolとRNeasy Mini kitを用いてトータルRNAを抽出し、DNaseI処理後にウイルスRNA特異的プライマーを用いて逆転写反応をし、RNaseH処理をしてから細胞内で複製したウイルスRNAを定量するためにTaqMan Fast Advanced Master Mixを用いてリアルタイムPCR解析を行った。また、ディッシュ間のトランスフェクション効率を標準化するために抽出したトータルRNAを用いてランダムプライマーで逆転写反応をし、RNaseH処理をしてからβ-ガラクトシダーゼmRNA発現量を定量するためにリアルタイムPCR解析を行った。細胞内のウイルスRNA量をβ-ガラクトシダーゼmRNA発現量で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なウイルスRNA複製量を評価した。
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO2 5%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド96 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 96 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各1 ng、ウイルスRNA発現プラスミドpUC-vRNA(Kuma_NP)(NCR_NS)0.2 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 0.2 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後にCell Counting Kit-8のWST-8を10 ml添加し、37℃、CO25%培養槽で培養してからマルチプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして細胞生存率を評価した。
Claims (6)
- RNAと結合するRNA結合タンパク質と、RNAの所定の部位を切断する酵素とを、ペプチドリンカーを介して連結して成る人工RNA制限酵素。
- 前記酵素がSNaseの場合には、ペプチドリンカーの長さを5アミノ酸とする請求項1に記載の人工RNA制限酵素。
- 前記酵素がPINの場合には、ペプチドリンカーの長さを5アミノ酸または10アミノ酸とする請求項1に記載の人工RNA制限酵素。
- RNAと結合するRNA結合タンパク質が、ヒトPumilio及びFBFホモロジー(hPUF)タンパク質又はその改変体である、請求項1から3の何れか一項に記載の人工RNA制限酵素。
- ペプチドリンカーが、GlyGlyGlyGlySerからなるペプチド、又はGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySerからなるペプチドである、請求項1から4の何れか一項に記載の人工RNA制限酵素。
- プロモーター、RNAと結合するRNA結合タンパク質をコードするDNA、ペプチドリンカーをコードするDNA、及びRNAの所定の部位を切断する酵素をコードするDNAとをこの順に有する組み換え発現ベクター。
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