JPWO2017078100A1 - 心不全の予防又は治療のための医薬組成物 - Google Patents
心不全の予防又は治療のための医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2017078100A1 JPWO2017078100A1 JP2017548828A JP2017548828A JPWO2017078100A1 JP WO2017078100 A1 JPWO2017078100 A1 JP WO2017078100A1 JP 2017548828 A JP2017548828 A JP 2017548828A JP 2017548828 A JP2017548828 A JP 2017548828A JP WO2017078100 A1 JPWO2017078100 A1 JP WO2017078100A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- angptl2
- protein
- expression
- angiopoietin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 title claims abstract description 95
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 45
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 13
- 101710085851 Angiopoietin-related protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 245
- 102100025672 Angiopoietin-related protein 2 Human genes 0.000 claims abstract description 232
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 70
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 42
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 122
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 65
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 63
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 210000003748 coronary sinus Anatomy 0.000 claims description 37
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 31
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 30
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 28
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 26
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 17
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 17
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 10
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 10
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000006501 Angiopoietin-like Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010019425 Angiopoietin-like Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 4
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 144
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 73
- 101100001703 Mus musculus Angptl2 gene Proteins 0.000 description 64
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 57
- 108091028049 Mir-221 microRNA Proteins 0.000 description 38
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 108091061917 miR-221 stem-loop Proteins 0.000 description 27
- 108091063489 miR-221-1 stem-loop Proteins 0.000 description 27
- 108091055391 miR-221-2 stem-loop Proteins 0.000 description 27
- 108091031076 miR-221-3 stem-loop Proteins 0.000 description 27
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 25
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 24
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 description 24
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 23
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 21
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 20
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 19
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 19
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 18
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 17
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 16
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 16
- 101001123331 Homo sapiens Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Proteins 0.000 description 15
- 102000023984 PPAR alpha Human genes 0.000 description 15
- 102100028960 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Human genes 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 15
- 108091008725 peroxisome proliferator-activated receptors alpha Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 15
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 13
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 12
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 12
- 238000012549 training Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 101000693081 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 2 Proteins 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 108091080321 miR-222 stem-loop Proteins 0.000 description 11
- 102000057758 human ANGPTL2 Human genes 0.000 description 10
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 9
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 9
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 9
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 9
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 9
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 9
- 101100001702 Homo sapiens ANGPTL2 gene Proteins 0.000 description 9
- CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N Ile(5)-angiotensin II Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=[NH2+])NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC([O-])=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CZGUSIXMZVURDU-JZXHSEFVSA-N 0.000 description 9
- 101150043413 MYH7 gene Proteins 0.000 description 9
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 9
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 9
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101800002247 Brain natriuretic peptide 45 Proteins 0.000 description 8
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 8
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 8
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 8
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 8
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 7
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 7
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 7
- 102000012215 HSC70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 7
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 7
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 208000038002 heart failure with reduced ejection fraction Diseases 0.000 description 7
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 7
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 5
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 5
- 101100328884 Caenorhabditis elegans sqt-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000004631 Calcineurin Human genes 0.000 description 5
- 108010042955 Calcineurin Proteins 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000009787 cardiac fibrosis Effects 0.000 description 5
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 4
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 4
- 102100030431 Fatty acid-binding protein, adipocyte Human genes 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 102100027732 Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710109123 Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 Proteins 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 230000008828 contractile function Effects 0.000 description 4
- 208000038003 heart failure with preserved ejection fraction Diseases 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 108091045872 miR-135 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091026523 miR-135a stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091031479 miR-204 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091032382 miR-204-1 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091085803 miR-204-2 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091089766 miR-204-3 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091073500 miR-204-4 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091053626 miR-204-5 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091050113 miR-211 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091024443 miRa-135-1 stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 description 3
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 3
- -1 Col3a Proteins 0.000 description 3
- 101150008975 Col3a1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 206010071436 Systolic dysfunction Diseases 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000005961 cardioprotection Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006571 energy metabolism pathway Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000010247 heart contraction Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000582 ATP assay Toxicity 0.000 description 2
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 2
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010013012 Dilatation ventricular Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 102000013948 Fatty acid-binding protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 108050003772 Fatty acid-binding protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010018525 NFATC Transcription Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000002673 NFATC Transcription Factors Human genes 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 206010037368 Pulmonary congestion Diseases 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 101150005678 RPS18 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 2
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 2
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 2
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000009125 cardiac resynchronization therapy Methods 0.000 description 2
- 230000003293 cardioprotective effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N chembl421 Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000002586 coronary angiography Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 210000002458 fetal heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000036723 left ventricular dilatation Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008437 mitochondrial biogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000001908 sarcoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011265 2D-echocardiography Methods 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIBDVOOELVZGDU-UHFFFAOYSA-N 4-(1h-indol-2-yl)benzene-1,3-dicarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=CC=C2N1 VIBDVOOELVZGDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150013604 ACADS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150054149 ANGPTL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150048150 Acsl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 108700042530 Angiopoietin-Like Protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000045205 Angiopoietin-Like Protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100025668 Angiopoietin-related protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100034599 Angiopoietin-related protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102400000667 Brain natriuretic peptide 32 Human genes 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000057 Coronary Stenosis Diseases 0.000 description 1
- 206010011089 Coronary artery stenosis Diseases 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150082967 FABP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101000693085 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000924549 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000685655 Homo sapiens Long-chain fatty acid transport protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001030243 Homo sapiens Myosin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000588302 Homo sapiens Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001093899 Homo sapiens Retinoic acid receptor RXR-alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100023111 Long-chain fatty acid transport protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100025404 Mus musculus Myh6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- 101000995101 Mus musculus Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 102100038934 Myosin-7 Human genes 0.000 description 1
- 101150006407 NRF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100168274 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cox-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031701 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101150062589 PTGS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000187 PTGS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 102100037765 Periostin Human genes 0.000 description 1
- 101710199268 Periostin Proteins 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102100035178 Retinoic acid receptor RXR-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710188689 Small, acid-soluble spore protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710188693 Small, acid-soluble spore protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710166422 Small, acid-soluble spore protein A Proteins 0.000 description 1
- 101710166404 Small, acid-soluble spore protein C Proteins 0.000 description 1
- 101710174019 Small, acid-soluble spore protein C1 Proteins 0.000 description 1
- 101710174017 Small, acid-soluble spore protein C2 Proteins 0.000 description 1
- 101710174574 Small, acid-soluble spore protein gamma-type Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- CAWBRCOBJNWRLK-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[4-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-1h-indole-6-carboxylate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C=2NC3=CC(=CC=C3C=2)C(=O)OCOC(C)=O)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O CAWBRCOBJNWRLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 208000037849 arterial hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004094 calcium homeostasis Effects 0.000 description 1
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001054 cardiac fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000027902 cell growth involved in cardiac muscle cell development Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000009850 completed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000013229 diet-induced obese mouse Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002253 embryonic cardiomyocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000005183 environmental health Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000009067 heart development Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018578 heart valve disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PNDZEEPOYCVIIY-UHFFFAOYSA-N indo-1 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C=2N=C3[CH]C(=CC=C3C=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 PNDZEEPOYCVIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037493 inherited obesity Diseases 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150087530 mt:ATPase6 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001147 pulmonary artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000010967 transthoracic echocardiography Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010047470 viral myocarditis Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
- C12N15/8645—Adeno-associated virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明の他の目的は、心不全を治療又は予防するための医薬組成物に用いることができるsiRNA及び該siRNAを発現するベクターを提供することである。
本発明の他の目的はまた、本発明の医薬組成物を適用する対象を選択するための方法及び本発明の医薬組成物の効果を確認するための方法を提供することである。
[1]心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)のmRNA又はその選択的スプライス型RNAからの連続する18〜29ヌクレオチド(好ましくは、19〜27、さらに好ましくは19〜25ヌクレオチド、より好ましくは19〜23ヌクレオチド)のセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むRNAをコードするDNA配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクター、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAは、動物細胞(好ましくは、ヒト細胞)に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質2遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
[2]前記DNA配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列(ヘアピン配列)からなるヘアピン型RNAをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内RNaseであるDicerによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAが形成される、上記[1]に記載の医薬組成物。
[3]前記センス鎖配列が、下記の配列番号2〜配列番号8のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、上記[1]又は[2]に記載の医薬組成物、
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。
[4]前記DNA配列が、下記の配列番号9〜配列番号15のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、上記[1]又は[2]に記載の医薬組成物、
配列番号9:GGAACATTGACGGCGAATA
配列番号10:GAGAGTTCATTTACCTAAA
配列番号11:GGCTCTTACTCACTCAAGA
配列番号12:GGCATTGTGAGCGAGGTGA
配列番号13:GCCATTACCGGAGCCGCTA
配列番号14:GTTTCCGCCTGGAACCTGA
配列番号15:GAAACTGTGCCCACTACCA。
[5]前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、上記[1]〜[4]のいずれか一つに記載の医薬組成物。
[6]前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである上記[5]に記載の医薬組成物。
[7]前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターAAV6ベクターである上記[6]に記載の医薬組成物。
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAは、動物細胞(好ましくは、ヒト細胞)に形質導入されると、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
[9]前記センス鎖配列が、下記の配列番号2〜配列番号8のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む上記[8]に記載の医薬組成物、
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAは、動物細胞(好ましくは、ヒト細胞)に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質2遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
[11]前記DNA配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列(ヘアピン配列)からなるヘアピン型RNAをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内RNaseであるDicerによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAが形成される、上記[10]に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
[12]前記センス鎖配列が、下記の配列番号2〜配列番号8のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、上記[10]又は[11]に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤、
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。
[13]前記DNA配列が、下記の配列番号9〜配列番号15のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、上記[10]又は[11]に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤、
配列番号9:GGAACATTGACGGCGAATA
配列番号10:GAGAGTTCATTTACCTAAA
配列番号11:GGCTCTTACTCACTCAAGA
配列番号12:GGCATTGTGAGCGAGGTGA
配列番号13:GCCATTACCGGAGCCGCTA
配列番号14:GTTTCCGCCTGGAACCTGA
配列番号15:GAAACTGTGCCCACTACCA。
[14]前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、上記[10]〜[13]のいずれか一つに記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
[15]前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである上記[14]に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
[16]前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターAAV6ベクターである上記[15]に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
[18]前記血液が拡張型心筋症(DCM)患者由来の血液である上記[17]に記載の方法。
[19]前記血液が拡張型心筋症患者の大動脈基部(Ao)及び冠状静脈洞(CS)の血液である上記[18]に記載の方法。
[20]冠状静脈洞(CS)の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)の発現レベルが、大動脈基部(Ao)の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全の治療又は予防が必要であると判定する、上記[19]に記載の方法。
[21]冠状静脈洞(CS)の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)の発現レベルが、大動脈基部(Ao)の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、上記[1]〜[9]のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する対象と判定する方法。
[22]上記[1]〜[9]のいずれか一つに記載の医薬組成物が投与された対象由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)の発現を測定することにより、該対象において心不全の治療効果が得られているか否かを判定する方法。
[23]前記血液が対象の冠状静脈洞(CS)の血液である上記[22]に記載の方法。
[24]上記[1]〜[9]のいずれか一つに記載の医薬組成物の投与前後のアンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)の発現を測定する上記[23]に記載の方法。
[26]前記DNA配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列(ヘアピン配列)からなるヘアピン型RNAをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内RNaseであるDicerによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAが形成される、上記[25]に記載の心不全を治療又は予防するための方法。
[27]前記センス鎖配列が、下記の配列番号2〜配列番号8のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、上記[25]又は[26]に記載の心不全を治療又は予防するための方法、
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。
[28]前記DNA配列が、下記の配列番号9〜配列番号15のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、上記[25]又は[26]に記載の心不全を治療又は予防するための方法、
配列番号9:GGAACATTGACGGCGAATA
配列番号10:GAGAGTTCATTTACCTAAA
配列番号11:GGCTCTTACTCACTCAAGA
配列番号12:GGCATTGTGAGCGAGGTGA
配列番号13:GCCATTACCGGAGCCGCTA
配列番号14:GTTTCCGCCTGGAACCTGA
配列番号15:GAAACTGTGCCCACTACCA。
[29]前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、上記[25]〜[28]のいずれか一つに記載の心不全を治療又は予防するための方法。
[30]前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである上記[29]に記載の心不全を治療又は予防するための方法。
[31]前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターAAV6ベクターである上記[30]に記載の心不全を治療又は予防するための方法。
[33]前記血液が大動脈基部(Ao)及び/又は冠状静脈洞(CS)の血液である上記[32]に記載の方法。
[34]冠状静脈洞(CS)の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)の発現レベルが、大動脈基部(Ao)の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全に罹患しているまたは心不全を発症するリスクがあると判定する、上記[33]に記載の方法。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等又は同様の任意の材料及び方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物及び特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
ヒトANGPTL2遺伝子のmRNA配列を配列番号1に示す。
本発明によれば、心筋細胞においてアンジオポエチン様タンパク質2遺伝子の発現が抑制される。その結果、本発明は、心不全への移行を阻止又は遅延でき、心不全の治療又は予防のために有効である。
したがって、本発明のsiRNAは、哺乳動物(好ましくはヒト)のANGPTL2 mRNA又はその選択的スプライス型RNA配列からの連続する約18〜29ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含む。
本明細書中で使用する「選択的スプライス型RNA」とは、転写によって形成されたmRNA前駆体が成熟mRNAにスプライシングされるときに、通常のスプライス部位と異なる部位での切断の結果生じるmRNAを意味する。
本発明の実施形態によれば、ヒトANGPTL2 mRNAは、配列番号1に示される核酸配列によってコードされるRNA配列である。該RNA配列は、配列番号1の核酸配列中のすべてのTがUに読み替えられた配列に相当する。このRNA又は該核酸配列から本発明に使用可能なsiRNA配列を決定することができる。本発明に使用するsiRNAのための該mRNA上のターゲットサイトの選択は、公知の知識を用いて行うことができる。例えば、これに限定されないが、U. Tei K., et al. Nucleic Acids Research (2004) 32 (3): 936-948などの文献の記載を参考にすることができる。また、これに限定されないが、例えば、(i)GC含量が約30〜約70%、好ましくは約50%である、(ii)すべての塩基が均等であり、また、Gが連続していない、(iii)アンチセンス鎖の5'末端の塩基がA又はUである、などの基準を参考にできる。なお、本発明の実施例においては、AAに続く19ヌクレオチドであり、AAのあとにGやCが存在することを一つの基準としてターゲットサイトを選択したが、これに限定されるものではない。
また、標的遺伝子であるANGPTL2遺伝子の発現を効率よく抑制すると同時に、無関係の遺伝子の発現に影響(off−target効果)を及ぼすことのない高い選択性を有すること、及び、オリゴ核酸(siRNA)自体が望ましくない毒性、副作用を発現しないことが望ましい。このようなsiRNA配列は、公知知識に基づき、当業者が決定することができ、siRNA自体は、常法に従って作製して検討を行う(例えば、実際にsiRNAを作製し、細胞に形質転換し、ANGPTL2遺伝子の発現抑制活性や細胞に対する毒性を確認することを含む)ことにより、当業者が取得することができる。off−target効果がないことの確認は、これに限定されないが、例えば、候補siRNAについて、予めジーンチップなどを利用して交差反応がないことにより確認できる。
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。
また、これらの配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列をセンス鎖配列とするsiRNAも同様に、ANGPTL2遺伝子のサイレンシング効果を生じ、かつ、避けるべきoff−target効果を生じない限り用いることができる。これらの配列において任意の1つの塩基を置換・欠失又は付加することは常法に従って行うことができる。また、そのようにして作製した配列を用いて、本明細書の実施例に示された手法に準じて、それらの配列から作製したsiRNAが本発明の目的の効果を生じるか否かを確認することができる。従って、上記配列において、1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列も本発明の効果を生じる限り本発明に含まれ、それらを含む医薬組成物及びそれを利用する方法も本発明に含まれる。
また、それらのセンス鎖配列を含むRNAコードするDNA配列も本発明において用いることができ、本発明に含まれる。
また、それらのセンス鎖配列を含むRNAをコードするDNA配列も本発明において用いることができ、本発明に含まれる。
siRNAを直接患部に注入する場合には、それらをリポソーム、たとえばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームと複合体形成して注入することができる。
本発明のsiRNAの発現が可能なベクターを使用する場合は、例えば、siRNAのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むRNAをコードするDNA配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターが好ましく用いられる。
本発明で使用可能なヘアピン型RNAは、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含むものであり、細胞内RNaseであるDicerによってプロセシングされてsiRNAが形成されるRNAである。
本発明のsiRNAを生じるヘアピン型RNAをコードするヘアピン型DNAは、その3’末端には、転写停止シグナル配列として、或いはオーバーハングのために、1〜6個、好ましくは1〜5個のTからなるポリT配列、例えば、4個又は5個のTからなるTTTT又はTTTTTが連結される。ベクターDNAから転写されたsiRNA前駆体としてのshort hairpin RNA(shRNA)は、そのアンチセンス鎖の3’末端に2〜4個のUからなるオーバーハングを有することが望ましく、オーバーハングの存在によって、センスRNA及びアンチセンスRNAはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。ヒトには内在性のDicerが1つ存在し、これが長鎖dsRNAや前駆体マイクロRNA(miRNA)をそれぞれsiRNAと成熟miRNAに変換する役割をもつ。本発明における前記ループ配列の例(RNAをコードするDNA配列を示す)としては、例えば、TAGTGCTCCTGGTTG(配列番号16)及びCAACCAGGAGCACTA(配列番号17)をあげることができるが、これに限定されず公知のループ配列も使用できる。
プロモーターとして、特に限定されないが、polIIIプロモーター、たとえばヒトもしくはマウスU6プロモーター及びH1プロモーターを使用することができる。
siRNAは、5’又は3’末端、好ましくはRNAの3’末端にオーバーハングをもつことが好ましい。従って、siRNAをコードするDNA配列は、オーバーハングを構成するようにした配列を含むことが好ましい。オーバーハングのヌクレオチド数は、約1〜5ヌクレオチドであり、好ましくは約1〜4ヌクレオチド、さらに好ましくは約2〜3ヌクレオチド、より好ましくは2ヌクレオチドである。また、コードされるsiRNAのオーバーハングは、U又はGであるのが好ましい。これに限定されないが、siRNAのオーバーハングとして、UU、UGをコードするDNA配列が好ましい。
プラスミドベクターは、例えば、リポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームから選択されるリポソームと複合体を形成しカプセル化された状態で患部に直接注入することができる。正電荷リポソームによる遺伝子導入では、DNAが細胞内にエンドサイトーシスされたのち、エンドソームと核膜との融合が起こり、ベクターが核へ移行する。
本発明においては、心筋細胞においてANGPTL2遺伝子の発現を抑制することを目的としているので、心筋へのデリバリー選択性があるアデノ随伴ウイルスベクターが特に好ましく用いられる。アデノ随伴ウイルスベクターとしては、現在まで、I型からXI型まで知られており、これらを制限なく用いることができるが、今後開発されるベクターも本発明の目的を達するかぎり制限なく用いることができる。好ましいベクターは、これに限定されないが、AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,又はAAV9であり、特に好ましくはAAV6である。好適に用いられる各種アデノ随伴ウイルスベクターは市販されている。
アンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)の発現は、常法に基づいて行うことができ、例えば、これに限定されないが、抗ANGPTL2抗体を用いて測定できる。抗体と用いた測定方法としては、これに限定されないが、例えば、イムノウェスタンブロティング、ELIZA法をあげることができる。
血液は、好ましくは心筋細胞から分泌されるタンパク質の量を鋭敏に反映する血液であり、心臓、特に左心室を循環した血液をあげることができる。これに限定されないが、特に好ましくは、大動脈基部(Ao)及び冠状静脈洞(CS)由来の血液である。
或いは、本発明の方法においては、心臓組織内を循環した静脈、例えば、冠状静脈洞(CS)の血液中のANGPTL2の発現レベルが、前もって定めた数値より高い場合に、血液が由来する対象が、本発明の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であると判定することもできる。
本発明の方法においては、上記のようにして対象が本発明の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であると判定した場合に、それらの対象は、本発明の医薬組成物を投与する対象であると判定する。
よって、本発明の方法は、心不全の治療又は予防のための医薬品の投与前後において、血液中のANGPTL2の濃度を測定することにより、医薬品の治療又は予防効果がでているかを判定する方法でもある。
アンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)の発現を測定する方法は上記した通りである。
また、血液が由来する哺乳動物、対象とする血液を採取する部位、その他についても、上記の判定方法の記載がそのまま適用できる。
1)ANGPTL2生産が、病的リモデリングを受けたマウスの心臓で活性化されており、また、潜在的なDCM患者の一部で潜在的に活性化されている。
2)病的刺激が、カルシニューリンNFATシグナル伝達を介して心筋細胞のANGPTL2の生産を増加させる。
3)マウス心臓におけるANGPTL2活性(過剰発現)は、AKT−SERCA2aのシグナル伝達及び心筋のエネルギー代謝を乱すことにより、心不全(HF)への進行を加速させる。一方、Angptl2ノックアウトマウスは、増加したAKT−SERCA2aシグナル伝達、増幅した心筋エネルギー代謝及びATP生産、及び運動誘発性肥大に似た表現型である非病的な心筋肥大を示す。
4)運動トレーニング及び/又はmiR−221/222活性は、心臓のANGPTL2発現を減少させる。
5)Angptl2 KOマウスは、増加したAKT−SERCA2aシグナル伝達、増幅した心筋エネルギー代謝及びATP生産を示し、病的な心臓リモデリングから保護され、そして、KOマウスの心臓の表現型は運動によって誘発されるものに似ている。
6)心臓の病的肥大状況でのANGPTL2の抑制が、マウスでは、AKT−SERCA2aのシグナル伝達を活性化し、心筋のエネルギー代謝を増強し、HFへの移行をブロックする。
7)AKT−SERCA2aの活性化及び増強された心筋のエネルギー代謝が、ANGPTL2ノックダウンヒトiPS由来心筋細胞において起こる。
これらのことより、心臓ANGPTL2活性が、心臓リモデリングが病的になるかどうかを支配していると考えられることを示した。また、心臓病理学において、ANGPTL2の抑制が、運動による心臓保護効果を反復できることを示した。
(1)動物実験
全ての実験手順は、熊本大学の動物実験倫理審査委員会によって承認された手順で行った。すべての動物は通常の食餌を与え、自動制御照明(12時間オン、12時間オフ)で、23℃で飼育した。下記の実験で用いた遺伝子改変マウスは以下のとおりである:C57BL/6NJclバックグランドのAngptl2ノックアウトマウス(Angptl2 KO)、C57BL/6NJclバックグランドのaP2プロモーターによって誘導されたAngptl2過剰発現トランスジェニックマウス(aP2−Angptl2)、C57BL/6JバックグランドのマウスαMHCプロモーターで誘導されたEGFP過剰発現Tgマウス(αMHC−EGFP)、及びFVB/NバックグランドのケラチノサイトでAngptl2を過剰発現しているTgマウス(K14−Angptl2)。Angptl2 KOマウスは、ヘテロ接合のブリーダーによって維持した。KK−Ay及びdb/dbマウスは、日本クレアから購入した。
マウスAngptl2をコードするcDNAを、αMHCプロモーター発現ベクターにクローン化した。発現ベクターは、シンシナティ小児病院医療センターの心臓研究所のジェフリー・ロビンス博士から提供を受けた。Tgの子孫を同定するために、以下のフォワード及びリバースプライマーを用いてゲノムPCRを行った:フォワードプライマー(5’−ACTTCTACATGAGATCATTC−3’(配列番号18))、リバースプライマー(5’−GGTATTCTCAGGCTTCACCAGGTA−3’(配列番号19))。同質遺伝子系統を維持するために、マウスは、野生型C57BL/6NJclマウスと交配することによりヘテロ接合体として増殖させた。F2又はF3世代の動物をすべての実験に用いた。
C57BL/6NバックグランドのmiR−221/222コンディショナルKOマウスは、German Research Center for Environmental Health(ドイツ)から提供を受けた。同質遺伝子系統を維持するために、野生型C57BL/6NJclマウスと交配させてヘテロ接合体として繁殖させた。
約10週齢の雄マウス(23−25g体重)にTAC手術を施して、圧負荷を与えた。簡単に言えば、マウスを、ペントバルビタールの腹腔内注射によって麻酔して、左開胸から大動脈弓にアクセスし、アーチ形の胸部大動脈を、27ゲージ針を用いて締め付けて、完全な狭窄圧を作り出した。擬似マウスは、大動脈の結束をせずに同じ手順を行った。
アンジオテンシンII(Ang II)は、150mMのNaCl及び1mMの酢酸に溶解した。アンジオテンシンIIは、ミニ浸透圧ポンプを用いてマウスの背部皮下組織に連続的に2週間投与した(3mg/kg/日)。ビークル処置群は、ビークル(150mM NaCl及び1mM 酢酸)を用いて同じ手順を行った。
心室はαMHC−EGFPトランスジェニックマウスから回収し(一試料当たり3つの心臓)、組織を小片に刻んだ後、0.075%のコラゲナーゼ、0.12%のトリプシン及び0.02%のDNaseで、40分間、37℃で消化した。細胞を回収し、再懸濁した後、100μmメッシュフィルターを通して50mlの遠心チューブに入れた。細胞は最終的に、0.5mlのFACS緩衝液(PBS/0.1% BSA)に再懸濁し、GFP陽性(心筋細胞)及びGFP陰性(非心筋細胞)に、セルソーターをFACSAria II(Becton Dickinson社製、米国)を用いて単離した。
マウス心臓組織試料は、24時間、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。ブロックは、4μm厚の切片に切断し、空気乾燥し、脱パラフィンした。形態、コムギ胚芽凝集素(WGA)、又はマッソントリクロームを評価するために、切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。スライドをマウントし、BIOREVO BZ−9000顕微鏡(キーエンス、日本)を用いて観察した。アレクサFluor(登録商標)594結合WGA及びDAPI(4’,6ジアミド−2−フェニルインドール)染色後に、心筋細胞の大きさの定量化を行った。各心室について、BZ−H2Aソフトウェア(KEYENCE、日本)を用いて100の心筋細胞を測定した。測定は、中心の円形の心筋細胞核のレベルで、その長軸方向に対して垂直に切断された心筋細胞に限定した。線維化領域の定量化は、青色に染色された領域を可視化することにより行った。線維化領域は、全心室の領域で割った青色染色領域の和としてイメージJソフトウェア(国立衛生研究所)を用いて計算した。
全RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen社、米国)を用いて単離した。DNase処理RNAはPrimeScript RT試薬キット(タカラバイオ株式会社、日本)を用いて逆転写した。心臓組織は、マルチビーズshocker(登録商標)を使用して均質化した。リアルタイム定量的RT−PCRは、SYBER Premix Ex TaqTMII(タカラバイオ株式会社、日本)及び及びサーマルサイクラーダイスリアルタイムシステム(タカラバイオ株式会社、日本)を用いて行った。相対的な転写産物量は、マウス、ラット、及びヒト試料中の18S rRNAレベルに対して正規化した。以下の遺伝子のフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドをRT−PCRに用いた。
マウス:Rps18,Angptl2,BNP,Myh7,CTGF,Col1,Col3a,PGC−1α,PGC−1β,Nrf1,Nrf2,RXRα,PPARα,FATP,CD36,Fabp3,Acsl1,CPT1α,CTP1β,Acads,Acadm,Acox1,ND6,ND4,as9,Cyt.b,Cyt.c,Cox1,Cox2,Cox3,ATPase6,ATP5a1,ATP5b。
ラット:Rps18,Angptl2,ANP,BNP,MYH7,Serca2a,PGC−1α,PPARα。
ヒト:PRS18,ANGPTL2,PGC−1α,PPARα。
マウスは予め胸の毛を除去した。マウスは、1.5−2.5%のイソフルラン吸入により麻酔し、撮像中、専用の動物保持具上で仰臥位にて維持した。心臓及び呼吸速度を連続的にモニターしながら、体温を一定に維持した。経胸壁心エコー検査は、MS 400リニアアレイトランスデューサ(18−38 MHz)を使用して、小動物イメージングのための専用の高周波超音波システム(VisualSonics VEVO 2100、Fujifilm VisualSonics Inc, カナダ)を用いて行った。Mモード記録を心室中部レベルで行った。全ての画像は、専用ソフトウェア(VEVO 2100バージョン1.4)を用いて分析した。左心室(LV)壁の厚さ(LVPW)と内部空洞拡張期(LVID;d)及び収縮期(LVID;s)における直径を測定した。パーセントLV短縮率(%FS)をMモードの測定値から算出した。すべての手順は、遺伝子型又は処置に関して、二重盲検条件下で行った。
心室心筋細胞を酵素的に単離した後、単一心筋細胞における細胞ショートニングとCa2+トランジェントを公知の情報(Shioya, T. J Physiol Sci 57, 327-335 (2007)、Katanosaka, Y., et al., Nat Commun 5, 3932 (2014))に従って測定した。Ca2+トランジェントを10mMのIndo−1 AMを負荷した心筋細胞で記録した。単離した心筋細胞は、倒立顕微鏡のステージ上で、20倍水浸対物レンズを用いて、二極刺激装置に接続された2つの白金電極インサートを使用して、1 Hzで、電場中で刺激した。細胞ショートニングとIndo−1の蛍光シグナルは、高性能Evolve EMCCDカメラ(Photometrics、米国)を使用して記録し、MetaMorphソフトウェア(バージョン7.7.1.0;Molecular Devices、米国)により分析した。実験は、2mg/mlのBSAを補充したタイロード溶液で細胞を灌流して行った。
マウスの心臓組織を、溶解緩衝液(10mMのTris−HCl、1%のトリトンX−100、50mMのNaCl、30mMのピロリン酸ナトリウム、50mMのNaF、5mMのEDTA、0.1mMのNa3VO4、にプロテアーゼインヒビターカクテル(ナカライテスク、日本)を加えたもの、pH7.5)中で、shocker(登録商標)を用いてホモジナイズした。総タンパク質(20μg)又は血清(0.1μl)をSDS−PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。膜を、1:1000倍希釈した抗PDK1(#3062)、抗P−PDK1(S241)(#3438S)、抗AKT(#9272S)、抗P−AKT(s473)(#9271)、抗P−AKT(T308)(#4056)、抗mTOR(#2983)、抗p−mTOR(s2448)(#5536)、抗p−mTOR(s2481)(#2974)、抗p70S6K(#9202)、抗p−p70S6K(T389)(#9205S)、抗Erk(#9102S)、抗p−ERK(T204/y202)(#9106S)、抗AMPK(#2532S)、抗p−AMPK(T172)(#2535)(以上は、Cell Signaling Technology、米国)、又は抗Serca2a(ab3625;Abcam社、米国)と共に、4℃で、一晩インキュベートした。PBSTで洗浄した後、膜を、1:2000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヒツジ抗ウサギIgG抗体と共に60分間室温でインキュベートした。Angptl2の免疫ブロッティングは、膜を、1:3000倍希釈したビオチン化ヤギ抗Angptl2抗体と4℃で一晩インキュベートした。PBSTで洗浄後、膜を、1:6000倍希釈したHRP結合ストレプトアビジンと室温で60分間インキュベートした。内部コントロールとして、1:2000倍希釈したマウス抗Hsc70(SC−7298;Santa Cruz Biotechnology、米国)抗体及び1:2000倍希釈したHRP結合ヒツジ抗マウスIgG抗体を、それぞれ、第一及び二次抗体として使用した。ブロットを、ECLウェスタンブロッティング検出試薬とインキュベートし、発光イメージアナライザーLAS−4000システム(富士フイルム、日本)を用いて可視化し、マルチゲージソフトウェア(富士フイルム、日本)を用いて定量化した。Hsc70は、正規化のために使用した。
心臓組織におけるATPレベルは、製造業者の説明書に従って、ATPアッセイキット(東洋インキ社製、日本)を用いて決定した。簡単に述べると、心臓組織片(100mg)を10mlのホモジネート緩衝液(10mMのHEPES−NaOH、pH7.4、0.25Mのスクロース)中でホモジナイズし、10分間、4℃で、1,000×gで遠心分離した。上清を、氷上で、ホモジネート緩衝液で8倍に希釈した。混合物100μlを、100μlのATP抽出液と混合し、発光をルミノメーターモデルTD−20/20(Turner Designs、日本)で測定した。
NRCMsにおけるATPレベルは、同じキットを用いて測定した。簡単に述べると、細胞を形質導入した48時間後に、NRCMs(2×105細胞)をPBSで2回洗浄し、100μlのPBS中に懸濁した。細胞懸濁液は、96ウェルプレートに入れ、ATPアッセイ溶液100μlを加えた。1分間振盪、次いで、室温で10分間インキュベートした後、発光をFLUOROSKAN上昇マイクロプレートルミノメーター(Thermo Fisher Scientific Inc.、米国)を用いて測定し、次いで、Ascent・software・version2.6を用いて分析した。
NRCMsを公知の報告(Yoshikawa, N., et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 296, E1363-1373 (2009))に従って調製した。簡単に述べると、1〜2日齢の新生仔ウィスターラットの心室を、0.06%のトリプシン、0.025%のコラゲナーゼII、及び20μg/mlのDNase I中で20分間処理し、解離した。心筋細胞は、パーコール密度勾配手順によって別々に調製した。NRCMsを回収し、コラーゲン(タイプI)コートされた24ウェル培養プレートに1×105細胞/cm2で播種した。細胞を、10%のウシ胎児血清及び抗生物質を補充した199/DMEM培地(Life Technologies社、米国)中で、5%CO2で37℃の加湿雰囲気中で増殖させた。24時間後に、特に記載のない限り、種々の試薬又はアデノウイルス感染の処理に先だって培地を交換した。
10週齢の雄のC57BL/6NJclマウスは、動きの制限なしで、30分間トレッドミル室(モデルMK−680AT/02M、室町株式会社、日本)で適応させた。マウスには、その後15分間、ウォームアップのトレッドミル内ランニングをさせ(5メートル/分で5分間、10メートル/分で5分間、及び15メートル/分で5分間)、次いで、本当の持久運動トレーニングを開始した。急性の持久運動として、20メートル/分で60分間のトレッドミルランニングをマウスに開始した。慢性持久運動として、15分間のウォームアップ及びそれに続く20メートル/分での60間のトレッドミルランニングを、1週間に5日、3週間マウスに繰り返した。最後のランニング運動の3時間後にマウスを安楽死させ、心臓組織を分析した。
レポータープラスミド(Fluc−Angptl2−3’UTR)を構築するために、マウスAngptl2の3’UTRをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってゲノムDNAから増幅した後、pGL3−プロモーターベクター(Promega、米国)中のホタルルシフェラーゼ(Fluc)遺伝子の下流のXba I部位にクローニングした。Angptl2 3’UTRからmiR−221/222結合部位を削除するために、以下のプライマーセットを設計した:5’−CATTTCTCATGTTCTGTGTATATATAAAAGGGAGG−3’(配列番号23)及び5’−AGAACATGAGAAATGCTGAGGTAACAGGGCAG−3’(配列番号24)。Angptl2−3’UTRレポーターにおけるmiR−221/222結合部位の削除(Fluc−Angptl2−3’UTR−Δ221/222)は、製造元の手順に従い、PrimeSTAR突然変異誘発基礎キット(タカラバイオ株式会社、日本)を用いて行った。miR−221、miR−222、miR−211、miR−204又はmiR−135aの過剰発現ベクターは、pBApo−CMV(タカラバイオ株式会社、日本)への完全長の成熟マイクロRNA配列を含む配列を挿入することによって構築した。NRCMsを、Lipofectamine(登録商標)3000試薬(Life technologies、米国)を使用して、ネガティブコントロールとしてpcDNA3.1と、或いはマイクロRNAをコードするプラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼ(RLuc)又はFluc−Angptl2−3’UTRかFluc−Angptl2−3’UTR−Δ221/222のいずれかをコードするphRL−TKベクター(Promega、米国)とともにトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、製造元の指示に従って、デュアル・グロ・ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、米国)を用いて決定した。
組換えAAV6ベクターの生産及び精製は、タカラバイオ株式会社(日本)に依頼して行った。簡単に説明すると、shRNA合成のために、マウスAngptl2を標的とするsiRNAをもつ一本鎖のオリゴヌクレオチド(shAngptl2−A、shAngptl2−B)、及びコントロールとしてshScramble)と、その相補鎖を以下のように設計した。A−top:5’−CTAGAGAGAGTACATTTACCTCAATAGTGCTCCTGGTTGTTGAGGTAAATGTACTCTCTTTTTTA−3’(配列番号25)、及びA−bottom:5’−CTAGTAAAAAAGAGAGTACATTTACCTCAACAACCAGGAGCACTATTGAGGTAAATGTACTCTCT−3’(配列番号26)、B−top:5’−CTAGAGCCAGAAAGCGAGTACTATATAGTGCTCCTGGTTGTATAGTACTCGCTTTCTGGCTTTTTTA−3’(配列番号27)、及びB−bottom:5’−CTAGTAAAAAAGCCAGAAAGCGAGTACTATACAACCAGGAGCACTATATAGTACTCGCTTTCTGGCT−3’(配列番号28)、Scramble−top:5′−CTAGAGTCTTAATCGCGTATAAGGCTAGTGCTCCTGGTTGGCCTTATACGCGATTAAGACTTTTTTA−3′(配列番号37)、及びScramble−bottom:5′−CTAGTAAAAAAGTCTTAATCGCGTATAAGGCCAACCAGGAGCACTAGCCTTATACGCGATTAAGACT−3′(配列番号38)。それぞれの配列における、マウスAngptl2を標的とするセンス鎖配列又はアンチセンス鎖配列を下線で示した。なお、下線を付した配列の間の配列(TAGTGCTCCTGGTTG(配列番号16)、及び、CAACCAGGAGCACTA(配列番号17))はループ配列である。
一本鎖オリゴ(shAngptl2−A、shAngptl2−B、及びshScramble)をアニールし、pAAV−2xU6ベクター(タカラバイオ株式会社、日本)にクローニングした。組換えAAV6ベクターは、AAVproヘルパーフリーシステム(タカラバイオ株式会社、日本)を用いて製造し、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって精製して、次いでPBSに対して透析した。ゲノムコピー数は、AAVpro滴定キット版(リアルタイムPCR用)バージョン2(タカラバイオ株式会社、日本)を用いて測定した。
ヒトiPS細胞株253G4又は836B3は多能性細胞である。両株の心筋細胞への分化誘導は、公知の報告(Tohyama, S., et al., Cell Stem Cell 12, 127-137 (2013). Uosaki, H., et al., PLoS One 6, e23657 (2011). Hemmi, N., et al. Stem Cells Transl Med 3, 1473-1483 (2014))に従って行った。製造元の説明書に従って、Lipofectamine(登録商標)RNAi MAX試薬(Life technologies、米国)を用いて、誘導した心筋細胞を、Mission Universal Negative Control(Sigma-Aldrich社、米国)、又はヒトANGPTL2を標的としたsiRNA(siANGPTL2−A:s23855:GGAACAUUGACGGCGAAUATT(配列番号29),siANGPTL2−B:s23854:GAGAGUUCAUUUACCUAAATT(配列番号30),siANGPTL2−C:s23853:GGCUCUUACUCACUCAAGATT(配列番号31),siANGPTL2−D:SASI_Hs01_00042802:GGCAUUGUGAGCGAGGUGATT(配列番号32),siANGPTL2−E:SASI_Hs01_00042803:GCCAUUACCGGAGCCGCUATT(配列番号33),siANGPTL2−F:SASI_Hs01_00042804:GUUUCCGCCUGGAACCUGATT(配列番号34),siANGPTL2−G:SASI_Hs01_00042806:GAAACUGUGCCCACUACCATT(配列番号35))でトランスフェクトした。siANGPTL2−A,B,及びCは、Life technologies から購入し、siANGPTL2−D,E,F,及びGは、Sigma-Aldrich から購入した。それぞれの配列のヒトANGPTL2配列(配列番号1)上の位置を図24に示す。トランスフェクションの12時間後に、培地を交換し、細胞をさらに48時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞からの馴化培地中のANGPTL2濃度は、製造元の説明書に従って、ANGPTL2 ELISAキット(IBL、日本)を用いて概算した。リアルタイムRT−PCRのためにTRI Reagent(登録商標)で細胞を処理、又はイムノブロット分析のために細胞を回収し、RIPA(50mMのトリス−HCl、150mMのNaCl、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、1%のノニデットP−40、1mMのEDTA、プロテアーゼ阻害剤(Roche)、pH7.5)で溶解した。
拡張型心筋症(DCM)に罹った58人の患者(40人の男性と18人の女性;平均年齢±SEM、54.7±1.7)が試験に登録された。26人は、ニューヨーク心臓協会(NYHA)クラスIに分類され、27人はクラスIIに、5人はクラスIIIであった。過去3ヶ月以内に急性HFが発現した者又は腎機能障害[推定糸球体濾過率(EGFR)が30ml/分/1.73m2未満]を持つ者は試験から除外した。すべての被験者に対し、冠動脈疾患の可能性を排除するために冠動脈造影を、そして、心筋炎又は特定の筋肉疾患を除外するために心内膜心筋生検を行った。DCMは、左心室の(LV)駆出率(EF)が50%未満(コントラスト左室造影により明らかになる)であることと、50%を越える冠動脈狭窄、心臓弁膜症、動脈性高血圧、及び公知の全身症状に起因する二次性心筋疾患が存在しない場合の拡張したLV腔の両方が認められる場合と定義される。急性ウイルス性心筋炎又は家族性DCMの履歴をもつ患者はいなかった。免疫トリガーが原因でDCMの進展を起こしていることを示す証拠をもつ患者もいなかった。患者は、心臓カテーテルのために大学病院へ紹介される前は安定した状態であった。書面によるインフォームドコンセントを心臓カテーテルの実施前に各患者から得た。試験は、名古屋大学大学院医学研究科のヒト倫理委員会によって承認され(プロトコル承認番号357−9、2015年3月16日)、行われた。
すべての患者は、以前の報告(Okamoto, R., et al. Int Heart J 54, 202-206 (2013). Sakakibara, M., et al.Diabetes Res Clin Pract 92, 348-355 (2011).)のようにして左右心カテーテル診断を受けた。簡単に言うと、肺動脈楔入圧(PCWP)、及び心拍出量(CO)を、右内頸静脈を通して挿入したスワンガンツカテーテルを用いて測定した。心係数(CI)は以下の式により算出した:CI=CO/体表面積(L/分/m2)。右橈骨又は大腿動脈を介して、冠動脈造影と左心室造影も行った。6Fの液体で充たされたピグテールカテーテルを、LV圧を測定するために左心室に配置した。EFは、area-length法を用いて、左心室造影により評価した。血清ANGPTL2の経心臓放出を調べるために、両心室カテーテル時に、大動脈基部(Ao)からのANGPTL2と冠状静脈洞(CS)からのANGPTL2を同時に採取した。血清ANGPTL2レベルはヒトANGPTL2 ELISAキット(IBL、日本)を用いて測定した。
二次元心エコー検査は、報告(Okamoto, R., et al. Int Heart J 54, 202-206 (2013))に従って、VIVID7システム(ViVid7、GEヘルスケア、米国)を用いて行った。LVエンド拡張期寸法(LVDd)、LV収縮末期寸法(LVDs)、及び左動脈寸法(LAD)を測定した。パーセント短縮率(%FS)は、LVDd及びLVDsから計算した。LV質量指数(LVMI)は米国カルディオロジー協会により承認された式に従って、二次元の測定値から算出した。
ヒト心臓組織サンプルは、うっ血性心不全(CHF)患者及び非CHF患者を含む患者からバイオプシーにより得た。全ての場合において、書面によるインフォームドコンセントを、関連する家族から入手した。試験はまた、熊本大学の倫理委員会によって承認された上で行った。ヒト心臓組織サンプルは、24時間、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。ブロックは、4μm厚の切片に切断し、空気乾燥し、脱パラフィンした。免疫組織化学的分析のために、切片を、過ヨウ素酸で前処理して、内因性ペルオキシダーゼを阻害した。その後試験片は、ヒトANGPTL2のアミノ酸383−400(SFRLEPESEYYKLRLGRY(配列番号36))に対応する合成ペプチドをウサギに免疫して産生した、ウサギポリクローナル抗ヒトANGPTL2抗体を100倍に希釈したものとともに4℃にて一晩インキュベートした。PBSで洗浄後、試験片を、二次抗体としてペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギIgGを500倍希釈したものと共に、60分間、室温でインキュベートした。次いで、試験片をヘマトキシリンで対比染色した。ネガティブコントロールとして、同じ手順を、一次抗体の代わりにアイソタイプコントロールIgG用いて行った。ペルオキシダーゼ活性は、3,3−ジアミノベンジジン溶液でインキュベーションすることによって可視化し、光学顕微鏡(モデルBZ−9000)によって分析した。二重免疫蛍光染色は、ウサギポリクローナル抗ヒトANGPTL2抗体(1:100)、ヤギポリクローナル抗ヒトαMHC(1:100)、マウスモノクローナル抗ヒトCD31(1:100)、及びヤギポリクローナル抗ヒトペリオスチン(1:100)と共に用いた。アレクサFluor(登録商標)488結合抗ウサギ又はアレクサFluor(登録商標)594結合抗ヤギ/マウス抗体(1:200)を二次抗体として用いた。PBSで洗浄後、蛍光画像を共焦点レーザー顕微鏡(LSM410、Zeiss、ドイツ)によって取得した。
すべての値は、平均±SEMとして記載した。データは、不対の両側t検定によって、変数の2群の比較で評価した。カプラン・マイヤーログランク検定をマウスの生存データを分析するために適用し、グラフパッドプリズムソフトウエア(バージョン5.0、グラフパッドソフトウェア)を用いて計算した。P<0.05の値は、統計的に有意とみなされた。
(実施例1)マウスの病理学的心臓肥大におけるANGPTL2発現増加
心臓におけるANGPTL2機能を評価するために、TACを用いた過酷な圧負荷により誘導したマウス心肥大モデルの心臓組織におけるANGPTL2タンパク質レベルを測定し、擬似コントロールマウスのレベルと比較した。野生株マウスを用い、TAC又は擬似手術を行い、6週間後に、ウェスタンブロットによりタンパク質の発現を測定した。結果を図1の左図に示す。TACマウスの心臓組織で観察されたANGPTL2のタンパク質レベルは、コントロールマウスに比べて高かった。
心臓におけるANGPTL2タンパク質の増加が、病的リモデリングを促進するかどうかを検討した。検討のために、αMHCプロモーターの制御下で心筋細胞にANGPTL2を過剰発現する4つのトランスジェニックマウス系統(αMHC−Angptl2 Tgマウス)を作成した。全ての系統で出生時には正常であり、ANGPTL2のアップレギュレーションが心臓発生においてひどい混乱を引き起こさないことが示された。3つの系統(#1−9、#2−3、及び#2−14)は、TAC誘発性の肥大に見られるのと同様の、心臓におけるANGPTL2発現増加を示した。これらの3つの系統を以下の実験に用いた。
TAC処置の8週間後には、殆どのαMHC−Angptl2 Tgマウスは死亡したが、この時点では対照のマウスは殆ど死ななかった。結果を図7に示す。さらに、超音波心エコー検査の結果、短縮率によって推定されるように、野生型マウスは心臓の収縮機能を維持したが、一方、アンギオテンシンIIモデルで分析したαMHC−Angptl2 Tgマウスは減少した短縮率に起因する深刻な心臓の収縮機能障害を示した。心臓線維症及び、心不全及び線維症のマーカーの発現が、対照マウスと比較してαMHC−Angptl2 Tgで有意に増加していた。これらの知見は、心臓ANGPTL2の誤発現が、心臓の収縮を減少させることによって、HFに導くことを示している。
TAC処理は循環しているANGPTL2タンパク質レベルを上昇させるので、循環ANGPTL2が心機能不全の内分泌効果を持っているかどうかを検討した。本発明者らは以前、食餌誘導性肥満マウスは、脂肪組織におけるANGPTL2発現と、循環ANGPTL2タンパク質レベルを増加させることを報告している(Tabata M. et al. Cell Metab. 10, 178-188 (2009))。そこで、2つの遺伝性肥満糖尿病マウスモデル(db/db及びKK−Ay)を用いて検討した。このモデルでは、対照に比べて、心臓組織におけるANGPTL2タンパク質レベルは同等であったのに対し、循環ANGPTL2タンパク質レベルは上昇していた。超音波心エコー検査の結果、非肥満の対照に対して、db/db又はKK−Ayマウスでは、心臓肥大、心室拡張、又は心機能障害はなかった。いずれの肥満モデルでも、心臓におけるANP、BNP及びMyh7発現は対照に比較して変化がなかった。
さらに、野生型の対照に比べて循環ANGPTL2タンパク質レベルが上昇している、K14プロモーターの制御下で皮膚にANGPTL2を過剰発現するトランスジェニックマウス(K14−Angptl2 Tgマウス)を用いて検討した。このTgマウスは、心臓のANGPTL2タンパクレベルは野生型と同等である。超音波心エコー検査及びRT−PCR分析の結果、Tgマウスと野生型対照の間で、心臓の表現型又は分子マーカーに差が無いことが判った。このことは、心臓リモデリングにおいて、循環ANGPTL2の内分泌影響がないことを示唆している。
心臓でのANGPTL2欠損が病的リモデリングへと変化させるかどうかを評価するために、Angptl2 KOマウス表現型を調べた。Angptl2 KOマウスは出生時には正常であり、肉眼における心臓表現型を示さなかった。対照と比較して、6週齢のAngptl2 KOマウスは心臓の収縮機能の増加を示し、12週齢のAngptl2 KOマウスは増加した心臓の収縮機能を伴う心筋細胞肥大を呈した(データ示さず)。しかしながら、Angptl2 KOマウスの心臓においては、心不全マーカーの発現は相対的に減少していた(図8)が、一方、線維化マーカーは変化がなかった(図8)。このことは、TAC処置なしでAngptl2 KOマウスで見られた心肥大が病的ではないであろうことを示唆している。
心機能は、一定の細胞内のATP産生を必要とする。αMHC−Angptl2 Tgマウスは、TAC誘発性のHFに進展するので、αMHC−Angptl2 Tgの心筋エネルギー代謝を調節する遺伝子の発現を野生型対照と比較した。PGC−1α及びPPARα(β−酸化及びミトコンドリア生合成を制御する転写因子)の発現は、これらの活性及びATP産生に関係する他の遺伝子の中で、野生株対照と比較して、13週齢のαMHC−Angptl2 Tgにおいて有意に減少していた(データ示さず)。逆に、13週齢のAngptl2 KOマウスにおけるエネルギー関連遺伝子の発現は、野生型対照よりも有意に大きかった(データ示さず)。さらに、PGC−1α及びPPARαの発現、CD36(脂肪酸の受容体)の発現は、野生型対照マウスに比べて、6週齢Angptl2 KOで有意に増加していた(データ示さず)。また、PPARα及びPGC−1αの発現及び細胞内ATP産生が、Angptl2ノックダウン(KD)プライマリーNRCMsで有意に増加していたが、一方、PPARα(PGC−1αではない)の発現及びATP産生は、アデノウイルス発現ANGPTL2で形質転換したNRCMsでは、有意に減少していた(データ示さず)。これらの知見は、心筋細胞におけるANGPTL2抑制が、正常な心臓のエネルギー代謝を促進する遺伝子の発現を増加させることを示している。
心臓の収縮とANGPTL2活性のリンク機構を同定するために、パスウェイスキャンアッセイを行い、AKT及びその作用因子mTORとp70S6Kを、心臓において活性化し、野生型対照マウスとAngptl2 KOマウスを比較した。免疫ブロッティングの結果を図9〜図12に示す。同腹子対照マウスに比べてAngptl2 KOマウスの心臓でAKTシグナル伝達は活性化していた(図9)。SERCA2aのタンパク質レベルも同様の増加を示した(図9)。逆に、AKTシグナリングはαMHC−Angptl2 Tgマウスの心臓で減衰しており(図10)、相対的SERCA2aレベルは、同様に有意に減少していた(図10)。また、Angptl2 KD NRCMsにおいて、AKTの活性化及び高いSERCA2aのタンパク質レベルが確認された(図11)。このような増加したSERCA2aレベルは、ドミナントネガティブAKT(dnAKT)の過剰発現により有意に減衰した(データ示さず)。逆に、AKTシグナル伝達は、ANGPTL2を過剰発現しているNRCMsで著しく阻害されており(図12)、そして、SERCA2aのタンパク質レベルは比較的減少していた(図12)。従って、ANGPTL2に続くAKT−SERCA2aのシグナル伝達の活性化は、おそらく、心臓の収縮性を増加させる一方、ANGPTL2の過剰発現は反対の表現型を促進する。
病的リモデリングのもとで心臓組織においてどのようにANGPTL2発現が上昇するかを検討するために、培養したNRCMsを心臓肥大の促進因子で刺激した。アンギオテンシンII又はイソプロテレノール(ISO)処理は、NRCMsでのAngptl2 mRNAレベルを有意に増加させた。アンギオテンシンIIとISOは共にNFATの核移行を促進すると報告されており、NFATはまた、病的な心臓肥大の発展を引き起こす転写因子でもある。これらのことより、NFATの活性化が、心筋細胞におけるAngptl2転写を増加させているかも知れないと示唆している。免疫細胞化学的分析の結果、Ang II処理後の核移行下で、NFATC1とNFATC4が共に心筋細胞で発現しており、これらはシクロスポリンA(CsA)によって阻害された。さらに、NRCMsでのAng II又はISO依存的なANGPTL2アップレギュレーションは、CsAの処理によってブロックされた。Ang II処理はまた、NRCMsでのANGPTL2タンパク質レベルを増加させたが、これはCsAによりブロックされた。また、活性なNFAT(CA−NFAT)の過剰発現は、NRCMsでAngptl2 mRNAレベルを上昇させた。このことは、カルシニューリンNFATシグナル伝達が、心筋細胞でのANGPTL2の過剰発現を増加させていることを示唆している。
Angptl2 KOマウスで観察された心肥大は、運動によって誘発される肥大に似ている。したがって、運動訓練されたマウスと同様に、Angptl2 KOマウスは、病的な心臓リモデリングに対して心臓保護を示した。このことは、ANGPTL2の欠損が、運動効果を再現することを示唆している。興味深いことに、運動負荷を行っていない対照マウスにおける結果と比較して、ANGPTL2タンパク質レベルは、トレッドミルランニングによる急性の訓練を受けたマウスの心臓部で著しく減少しており、その減少したレベルは慢性訓練を受けたマウスの心臓で持続していた(図13)。
抗ANGPTL2試薬のインビボでの投与が病的心臓リモデリングを防ぐことができるか否かを検討した。心筋に選択的に形質導入することが報告されている組換えAAV6ベクターの全身デリバリーを用いた。Angptl2のshRNAを発現する組換えアデノ随伴ウイルス血清型6(AAV6)ベクターを静脈内注射することにより、Angptl2のshRNAカセットをマウスの心臓にデリバリーした。これを行うために、マウスAngptl2のshRNAを発現する2つの構築物(AAV6−shAngptl2−A及び−B)を作製し、組換えAAV6−shAngptl2−A又はAAV6−shAngptl2−Bを、1×1010vg/マウス及び3×1010vg/マウスで野生型マウスへ静脈内投与した。2週間後、AAV6−shAngptl2−Bを注射したマウスの心臓においてANGPTL2発現が有意に減少していたが、一方、AAV6−shAngptl2−A構築物は、投与した濃度では効果がなかった(図16)。AAV6−shAngptl2−Bを投与したマウスの心臓は、対照に比べて、PGC−1α及びPPARαの発現の上昇及びAKT−のSERCA2aシグナルデンタルの活性化が見られた(図17)。
次いで、処置後2週間で肥大が起こるTACモデルを用いて、インビボで、AAV6−shAngptl2−Bの静脈内注射がANGPTL2のアップレギュレーションを抑制するかを検討した。TAC処置2週間後のTAC誘発性心機能障害をもつマウスを、3群に分け、その後、ウイルスなし(コントロール)、1×1010 vg/マウス及び3×1010 vg/マウスにてAAV6−shAngptl2−Bを静脈内投与した。投与の2週間後から、2週間おきに、超音波心エコー検査により心機能を調べた。いずれのAAV6−shAngptl2−Bの投与量でも、圧負荷での病的心臓リモデリングにおいてANGPTL2アップレギュレーションを抑制した(図18)。対照マウスは減少した短縮率を伴う左心室拡張を示したが、一方、いずれの投与量のAAV6−shAngptl2−Bが投与されたマウスにおいても、対照マウスに比べ、心機能障害を弱められており、左心室の拡張がブロックされていた(図19及び図20)。心臓重量/体重比は、対照と比較して、いずれの投与量のAAV6−shAngptl2−Bが投与されたマウスにおいても減少していた。ANP、BNP及びMyh7の発現は対照心臓に対して有意に増加していたが、アップレギュレートされたANP及びMyh7の発現は組換えAV6−shAngptl2−Bが投与されたマウスでブロックされていた(データ示さず)。
実施例10と同様にして、TACモデルを用いて、インビボで、AAV6−shAngptl2−B又はAAV6−shAngptl2−Aの静脈内注射がANGPTL2のアップレギュレーションを抑制するかを検討した。但し、本実施例では、コントロールは、TACモデルにAAV−shScrambleを静脈内投与した。また、超音波心エコー検査による心機能の確認は、投与の2週間後及び5週間後に行った。
AAV6−shAngptl2−B投与は、AAV−shScrambleを投与したTACモデルと比較しても、実施例10と同様に効果を示した。
AAV6−shAngptl2−A投与の結果を図21に示す。AAV6−shAngptl2−Bに加えAAV6−shAngptl2−A投与でも、対照マウスに比べ、心機能障害の改善が確認できた。
ヒト線維芽細胞由来のiPS細胞から分化したヒト心筋細胞において、ANGPTL2の抑制が、AKT−SERCA2aのシグナル伝達を活性化し、そして、エネルギー代謝を高めるか否かを検討した。結果を図22及び図23に示す。ヒトANGPTL2を標的とするsiRNA(ANGPTL2のsiRNA)で形質転換した心筋細胞では、AKT−SERCA2aのシグナル伝達及びPGC−1α及びPPARαの発現は活性化されたが、ANGPTL2の産生と分泌は抑制された。さらに、対照のヒトiPS由来心筋細胞に比べ、ANGPTL2のsiRNAで形質転換した心筋細胞で、拍動数、(大きさや形状を含む)細胞特性、又は細胞死の頻度について変化はなかった。このことは、心臓毒性がないことを示唆している。図23に示されるように、検討した7種類のヒトANGPTL2を標的とするsiRNAにより、ANGPTL2タンパク質の発現が有意に減少した。
病的心臓リモデリングにおいてANGPTL2が機能するかどうかを検討するために、慢性心不全と診断された患者又は心臓病に関連していない状況下で死亡した患者からのオートプシーで得られた心臓組織におけるANGPTL2タンパク質のレベルを調べた。免疫組織化学的分析の結果、HF患者において、ANGPTL2タンパク質が心筋細胞及び毛細血管内皮細胞で豊富に発現されていたが、心臓線維芽細胞ではそうではなかった。対照的に、対照個体では、ANGPTL2タンパク質は、心臓においてより低いレベルで発現されていた。
Claims (27)
- 心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)のmRNA又はその選択的スプライス型RNAからの連続する18〜29ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むRNAをコードするDNA配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクター、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAは、動物細胞に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質2遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。 - 前記DNA配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列(ヘアピン配列)からなるヘアピン型RNAをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内RNaseであるDicerによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるsiRNAが形成される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記センス鎖配列が、下記の配列番号2〜配列番号8のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、請求項1又は2に記載の医薬組成物、
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。 - 前記DNA配列が、下記の配列番号9〜配列番号15のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、請求項1又は2に記載の医薬組成物、
配列番号9:GGAACATTGACGGCGAATA
配列番号10:GAGAGTTCATTTACCTAAA
配列番号11:GGCTCTTACTCACTCAAGA
配列番号12:GGCATTGTGAGCGAGGTGA
配列番号13:GCCATTACCGGAGCCGCTA
配列番号14:GTTTCCGCCTGGAACCTGA
配列番号15:GAAACTGTGCCCACTACCA。 - 前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項1〜4のいずれか一つに記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターAAV6ベクターである請求項6に記載の医薬組成物。
- 心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)のmRNA又はその選択的スプライス型RNAからの連続する18〜29ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列を含むsiRNA、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むsiRNAは、動物細胞に形質導入されると、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。 - 前記センス鎖配列が、下記の配列番号2〜配列番号8のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む請求項8に記載の医薬組成物、
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。 - アンジオポエチン様タンパク質2(ANGPTL2)のmRNA又はその選択的スプライス型RNAからの連続する18〜29ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むRNAをコードするDNA配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを含む、動物細胞でのアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるsiRNAは、動物細胞(好ましくは、ヒト細胞)に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質2遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質2遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。 - 前記DNA配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列(ヘアピン配列)からなるヘアピン型RNAをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内RNaseであるDicerによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるsiRNAが形成される、請求項10に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
- 前記センス鎖配列が、下記の配列番号2〜配列番号8のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、請求項10又は11に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤、
配列番号2:GGAACAUUGACGGCGAAUA
配列番号3:GAGAGUUCAUUUACCUAAA
配列番号4:GGCUCUUACUCACUCAAGA
配列番号5:GGCAUUGUGAGCGAGGUGA
配列番号6:GCCAUUACCGGAGCCGCUA
配列番号7:GUUUCCGCCUGGAACCUGA
配列番号8:GAAACUGUGCCCACUACCA。 - 前記DNA配列が、下記の配列番号9〜配列番号15のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において1つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、請求項10又は11に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤、
配列番号9:GGAACATTGACGGCGAATA
配列番号10:GAGAGTTCATTTACCTAAA
配列番号11:GGCTCTTACTCACTCAAGA
配列番号12:GGCATTGTGAGCGAGGTGA
配列番号13:GCCATTACCGGAGCCGCTA
配列番号14:GTTTCCGCCTGGAACCTGA
配列番号15:GAAACTGTGCCCACTACCA。 - 前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項10〜13のいずれか一つに記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである請求項14に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターAAV6ベクターである請求項15に記載のアンジオポエチン様タンパク質2の発現抑制剤。
- 対象であるヒト由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2の発現を測定することにより、該対象が請求項1〜9のいずれか一つに記載の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であるか否かを判定する方法。
- 前記血液が拡張型心筋症(DCM)患者由来の血液である請求項17に記載の方法。
- 前記血液が拡張型心筋症患者の大動脈基部(Ao)及び冠状静脈洞(CS)の血液である請求項18に記載の方法。
- 冠状静脈洞(CS)の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2の発現レベルが、大動脈基部(Ao)の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全の治療又は予防が必要であると判定する、請求項19に記載の方法。
- 冠状静脈洞(CS)の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2の発現レベルが、大動脈基部(Ao)の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、請求項1〜8のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する対象と判定する、請求項19に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一つに記載の医薬組成物が投与された対象由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2の発現を測定することにより、該対象において心不全の治療効果が得られているか否かを判定する方法。
- 前記血液が対象の冠状静脈洞(CS)の血液である請求項22に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一つに記載の医薬組成物の投与前後のアンジオポエチン様タンパク質2の発現を測定する請求項23に記載の方法。
- 対象であるヒト由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2の発現を測定することにより、該対象が心不全に罹患しているか心不全を発症するリスクがあるかを判定する方法。
- 前記血液が大動脈基部(Ao)及び/又は冠状静脈洞(CS)の血液である請求項25に記載の方法。
- 冠状静脈洞(CS)の血液中のアンジオポエチン様タンパク質2の発現レベルが、大動脈基部(Ao)の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全に罹患しているまたは心不全を発症するリスクがあると判定する、請求項26に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015218507 | 2015-11-06 | ||
JP2015218507 | 2015-11-06 | ||
JP2016123615 | 2016-06-22 | ||
JP2016123615 | 2016-06-22 | ||
PCT/JP2016/082673 WO2017078100A1 (ja) | 2015-11-06 | 2016-11-02 | 心不全の予防又は治療のための医薬組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017078100A1 true JPWO2017078100A1 (ja) | 2018-09-20 |
JP6978774B2 JP6978774B2 (ja) | 2021-12-08 |
Family
ID=58662089
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017548828A Active JP6978774B2 (ja) | 2015-11-06 | 2016-11-02 | 心不全の予防又は治療のための医薬組成物 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20190022250A1 (ja) |
JP (1) | JP6978774B2 (ja) |
WO (1) | WO2017078100A1 (ja) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090169540A1 (en) | 2005-03-03 | 2009-07-02 | Inserm (Institute National De La Sane Et De La Recherche Medicle) | Use Of An Antagonist Of Epac For Treating Human Cardiac Hypertrophy |
WO2009018492A2 (en) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Micro-rnas that control myosin expression and myofiber identity |
US8404658B2 (en) * | 2007-12-31 | 2013-03-26 | Nanocor Therapeutics, Inc. | RNA interference for the treatment of heart failure |
JP2011093896A (ja) | 2009-09-30 | 2011-05-12 | Kumamoto Univ | 癌治療剤 |
JPWO2011071027A1 (ja) * | 2009-12-08 | 2013-04-22 | 学校法人 久留米大学 | Socs3遺伝子がコードするsocs3タンパク質の発現を抑制し得るrna干渉分子、及びその利用 |
US8865675B2 (en) * | 2010-05-12 | 2014-10-21 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein B |
-
2016
- 2016-11-02 US US15/773,466 patent/US20190022250A1/en not_active Abandoned
- 2016-11-02 WO PCT/JP2016/082673 patent/WO2017078100A1/ja active Application Filing
- 2016-11-02 JP JP2017548828A patent/JP6978774B2/ja active Active
-
2020
- 2020-03-23 US US16/826,984 patent/US11235073B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6978774B2 (ja) | 2021-12-08 |
US20190022250A1 (en) | 2019-01-24 |
WO2017078100A1 (ja) | 2017-05-11 |
US11235073B2 (en) | 2022-02-01 |
US20200345866A1 (en) | 2020-11-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fu et al. | Mitophagy directs muscle-adipose crosstalk to alleviate dietary obesity | |
Tian et al. | ANGPTL2 activity in cardiac pathologies accelerates heart failure by perturbing cardiac function and energy metabolism | |
Widyantoro et al. | Endothelial cell–derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition | |
Li et al. | Overexpression of microRNA-99a attenuates cardiac hypertrophy | |
Huang et al. | Cardiomyocyte-enriched protein CIP protects against pathophysiological stresses and regulates cardiac homeostasis | |
Weng et al. | Down-regulation of miR-34a-5p potentiates protective effect of adipose-derived mesenchymal stem cells against ischemic myocardial infarction by stimulating the expression of C1q/tumor necrosis factor-related protein-9 | |
Wang et al. | Spliced X-box binding protein 1 stimulates adaptive growth through activation of mTOR | |
Zhong et al. | Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against DOX-induced heart failure through the miR-100-5p/NOX4 pathway | |
Chen et al. | Mesenchymal stem cells expressing eNOS and a Cav1 mutant inhibit vascular smooth muscle cell proliferation in a rat model of pulmonary hypertension | |
Minami et al. | The Down syndrome critical region gene 1 short variant promoters direct vascular bed–specific gene expression during inflammation in mice | |
Lv et al. | Metformin ameliorates cardiac conduction delay by regulating microRNA-1 in mice | |
Liu et al. | Myeloid MKL1 disseminates cues to promote cardiac hypertrophy in mice | |
Zhu et al. | miR-340-5p mediates cardiomyocyte oxidative stress in diabetes-induced cardiac dysfunction by targeting Mcl-1 | |
Xu et al. | The endothelium-dependent effect of RTEF-1 in pressure overload cardiac hypertrophy: role of VEGF-B | |
US10865412B2 (en) | Therapeutics targeting IGFBP7 for the treatment or prevention of heart failure and metabolic diseases | |
Wang et al. | Insufficient S-adenosylhomocysteine hydrolase compromises the beneficial effect of diabetic BMSCs on diabetic cardiomyopathy | |
US11235073B2 (en) | Method for treating or preventing heart failure | |
US20190209648A1 (en) | ApoO FOR USE IN A METHOD FOR TREATING CANCER AND VARIOUS PATHOPHYSIOLOGICAL SITUATIONS | |
Jalink et al. | Non-coding RNAs in the pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction | |
Pu et al. | Salt-inducible kinase 1 deficiency promotes vascular remodeling in pulmonary arterial hypertension via enhancement of yes-associated protein-mediated proliferation | |
CN114344468B (zh) | NFAT的lncRNA非编码阻遏子在血管相关疾病的用途 | |
EP2126047B1 (en) | Cardiac hypertrophy | |
CN114306371B (zh) | Nron的表达促进剂在制备动脉粥样硬化斑块动物模型中的用途 | |
US20240026354A1 (en) | Suppressing hippo signaling in the stem cell niche promotes skeletal muscle regeneration | |
US20120035241A1 (en) | Use of inhibitors of plac8 activity for the modulation of adipogenesis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191007 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20191007 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201117 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210112 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210312 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210811 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211005 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211019 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211105 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6978774 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |