CN114306371B - Nron的表达促进剂在制备动脉粥样硬化斑块动物模型中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学研究技术领域，尤其涉及Nron及其表达促进剂在血管调节药物中的用途。本发明主要涉及：Nron和/或Nron表达促进剂在制备促血管新生药物中的应用。Nron和/或Nron表达促进剂在制备防治血管新生障碍疾病药物中的应用。Nron和/或Nron表达促进剂在制备防治缺血所致的血管疾病中的应用。Nron和/或Nron表达促进剂在制备血管内皮生长因子表达促进剂中的应用。Nron和/或Nron表达促进剂在制备促进动脉粥样硬化斑块血管新生制剂中的应用。本发明提供了一些血管相关病症新的治疗方案，尤其在促新生血管形成方面具有较好的促进作用。也提供了一些生物模型制作所需的调节试剂，能够更好的在体外模拟一些病变情况等。

Description

Nron的表达促进剂在制备动脉粥样硬化斑块动物模型中的用途

技术领域

本发明属于医学研究技术领域，尤其涉及Nron的表达促进剂在制备动脉粥样硬化斑块动物模型中的用途。

背景技术

血管生成(Angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。

长非编码RNA(lncRNAs)是一组非蛋白质编码的RNA，它们是长度大于200个核苷酸。虽然大部分研究都集中在lncRNAs在细胞发育和分化中的作用越来越多的证据表明lncRNAs在肿瘤中起着额外的作用心血管疾病，如动脉粥样硬化。最近，越来越多的lncRNAs干扰动脉粥样硬化进展的因素在致动脉粥样硬化细胞，如VSMC、内皮细胞(ECs)和单核细胞/巨噬细胞。lncRNA的调节可能提供新的减少动脉粥样硬化负担的诊断和治疗策略。NFAT的lncRNA非编码阻遏子(Nron)长度约为2.7kb，为由三个外显子组成，可选择性剪接产生转录本大小从0.8到3.7KB不等。它为一个RNA/蛋白质复合物，作为磷酸化蛋白质的细胞质陷阱T淋巴细胞中活化T细胞核因子(NFAT)蛋白。虽然最初被认为仅限于免疫系统，并在免疫系统中发挥重要作用在T细胞的分化过程中，Nron已经被证明可以调节不同的细胞分化病理生理过程并涉及许多其他疾病。这项工作探讨了Nron在新生血管形成进展中的作用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供Nron的表达促进剂在制备动脉粥样硬化斑块动物模型中的用途。主要针对一些血管新生障碍相关病症提供了治疗方案，并且针对其中部分调节机理做出了适应性应用。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

Nron和/或Nron表达促进剂在制备促血管新生药物中的应用。

在一些方式中，所述Nron为过表达Nron。

在一些方式中，所述促血管新生药物为促内膜新生血管形成药物。

Nron和/或Nron表达促进剂在制备防治缺血所致的血管疾病中的应用。

在一些方式中，所述缺血所致的血管疾病包括下肢缺血。

Nron和/或Nron表达促进剂在制备防治血管新生障碍疾病药物中的应用。

Nron和/或Nron表达促进剂在制备血管内皮生长因子表达促进剂中的应用。

Nron和/或Nron表达促进剂在制备促进动脉粥样硬化斑块血管新生制剂中的应用。

本发明的有益效果是：

提供了一些血管相关病症新的治疗方案，尤其在促新生血管形成方面具有较好的促进作用。也提供了一些生物模型制作所需的调节试剂，能够更好的在体外模拟一些病变情况等。

附图说明

图1为人和小鼠动脉粥样硬化病变中Nron表达下调；

图2为Nron过表达诱导高度特征性结构更脆弱的斑块；

图3为敲低Nron抑制动脉粥样硬化的发展和增加动脉粥样硬化斑块的稳定性；

图4为Nron与VSMC中的NFATc3结合；

图5为动脉粥样硬化病变VSMC中NFATc3激活并易位到细胞核中；

图6为Nron敲低结合ox-LDL处理诱导核NAFTc3在VSMC中的易位；

图7为Nron敲低对细胞增殖、迁移和凋亡的影响VSMC依赖于NFATc3激活；

图8为Nron有助于动脉粥样硬化斑块的新生血管形成；

图S1：在ApoE-/-小鼠中检测腺病毒和腺相关病毒的感染效率。A、6周龄雄性ApoE-/-或野生型小鼠喂食西方饮食(WD)或标准对照饮食(SCD)16周。Nron在主动脉中不同的时间点的相对表达量。B、主动脉中Nron在分别给药1,2,3周的腺病毒(Ad-SM22-EV或Ad-SM22-Nron)后的表达。C、动物实验。6周雄性ApoE-/-小鼠用WD喂养16周。小鼠于后8周每两周静脉注射一次腺病毒(Ad-SM22-EV或Ad-SM22-Nron)。D、腺相关病毒感染3周后主动脉中Nron的表达(rAAV2/8-shNC或rAAV2/8-shNron)。E、腺相关病毒(rAAV2/9-shNC或rAAV2/9-shNron)感染后3周后主动脉和心脏中Nron的表达。F、动物实验。6周雄性ApoE-/-小鼠用WD喂养16周。小鼠喂养4周后接受一次静脉注射腺相关病毒2/8(rAAV shNC或rAAV shNron)。数据以平均值±标准误(每组n＝6)。A图中使用Dunnett-t检验，B、D、E组中数据进行Student-t检验。*号表示P<0.05；

图S2：Nron在VSMC中不与NFATc1、NFATc2和NFATc4结合。利用蛋白免疫印迹分析VSMC中NFATc1、NFATc2和NFATc4与生物素化Nron的结合情况；

图S3：NFAT家族在正常血管和动脉粥样硬化病变区域中的定位。免疫荧光测定C57BL/6小鼠(正常)和ApoE-/-小鼠(斑块)主动脉窦中的NFATc1、NFATc2和NFATc4。共定位分析：切片共染色NFAT家族(绿色)和α-SMA(红色；平滑肌细胞标记物)。DAPI用于细胞核染色(蓝色)；

图S4：人动脉粥样硬化病变区域的NFATc3易位到VSMC的细胞核中。A、免疫荧光测定人正常血管和颈动脉粥样硬化病变区域中NFATc3的表达。为了进行共定位分析，对切片进行了NFATc3(绿色)和α-SMA(红色；平滑肌细胞标记物)共染色分析。DAPI用于细胞核染色(蓝色)。箭头表示核NFATc3和α-SMA染色双阳性细胞。B、核NFATc3阳性的VSMC的百分比；

图S5：Nron调节VSMC中VEGFA的表达。A和B，体外培养的T/G HA-VSMC转染NRON表达质粒或NRON siRNA。测定VEGFA的mRNA水平(A)和蛋白水平(B)。数据表示三个独立实验的平均值±标准误。*表示与EV组或扰乱siRNA组相比，P<0.05。统计分析采用Student-t检验。C和D，6周雄性ApoE-/-小鼠被喂食西方饮食16周。小鼠在后八周每两周用腺病毒(Ad-SM22-EV或Ad-SM22-Nron)注射一次。主动脉窦横断面用VEGFA抗体进行免疫染色(C)，并将阳性染色面积量化为总斑块染色面积的百分比(D)。数据以平均值±标准误表示(每组n＝8)。进行统计分析使用Student-t检验。*表示与Ad-SM22-EV组相比，P<0.05。

具体实施方式

部分名词释义

术语“过表达Nron”：其中所述“过表达”为相对而言，不限定具体程度，凡是Nron的表达程度能够使其具有相关的功能，均应属于本发明所述的过表达。

术语“Nron表达促进剂”：促进Nron表达的试剂，包括现有的和后续研发的，只要将其用于与本发明相关的目的，均应在本发明的保护范围内。其中促进为相对表述，不限定其程度，主要对Nron表达起到正向调节作用。

术语“防治”：指对患者进行的意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍的医疗管理。该术语包括积极治疗，即治疗特别指向疾病、病理状况或障碍的改善，并且还包括病因治疗，即治疗指向去除相关疾病、病理状况或障碍的病因。此外，该术语还包括姑息治疗，即为减轻症状而不是治愈疾病、病理状况或障碍而设计的治疗；预防性治疗，即旨在尽量最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗；和支持治疗，即用于补充指向相关疾病、病理状况或障碍的改善的另一种特定疗法的治疗。同时，在商业活动中，如果生产了含有与本发明相同组分的产品，产品说明书未记载与本发明相同相近用途，但其给出了将相应产品用于实现与本发明相同相近目的提示时，也应当视为应用。

前述名词定义作为参考释义，除有特殊说明外，其余可参考领域内一般意义理解。在没有反例的前提下，不做缩小型解释，也即，除存在反例证据的实例，其余均应落入范围内。

本部分第一方面介绍Nron及其表达促进剂在疾病治疗中作为药物的应用：

其一，Nron和/或Nron表达促进剂在制备促血管新生药物中的应用。

其二，Nron和/或Nron表达促进剂在制备防治血管新生障碍疾病药物中的应用。

其三，Nron和/或Nron表达促进剂在制备血管内皮生长因子表达促进剂中的应用。通过Nron和/或Nron表达促进剂的作用，能够促进血管内皮生长因子表达。

通过Nron直接促进进行作用，或者通过促进Nron间接的对某些机理记性调节作用。如通过Nron直接促进新生血管形成，或者通过促进Nron间接促进新生血管形成。

上述的Nron在一些方式中为过表达Nron，采用过表达的Nron具有更好的生物表达，能够产生更好的效果。当然，过表达是相对而言的，只要具有一定表达能力的Nron对相应机理具有调节作用，均应在本发明范围内。

本部分第二方面介绍Nron及其表达促进剂的一些更具体的用途：

Nron和/或Nron表达促进剂在制备防治缺血所致的血管疾病中的应用。在缺血导致的血管疾病中，容易引起血管的损伤等，通过Nron可以促其血管生长，从而实现缓解和治疗的目的。

在一些方式中，所述缺血所致的血管疾病包括下肢缺血。

当然，其还可以应用于一些生物模型，比如Nron和/或Nron表达促进剂在制备促进动脉粥样硬化斑块血管新生制剂中的应用。通过促进动脉粥样硬化斑块新生血管形成模拟硬化斑块的发展，从而实现一些研究项目模型的模拟。其虽然没有直接用于将生物机体向正常有利方向调节，但其为一些药物等研究也做出了贡献，同样可以认为是在制备药物中的应用。

本部分第三方面结合具体的研究项目介绍：

材料和方法

材料：所有的人体研究和动物实验都符合美国国立卫生研究院(NIH)的指导方针，并获华中科技大学协和医院伦理委员会批准。根据《赫尔辛基宣言》，获得了所有参与者的书面知情同意。

方法：人动脉粥样硬化组织：收集武汉协和医院颈动脉内膜剥脱术患者8例动脉粥样硬化病变，冠状动脉搭桥手术患者10例乳腺内动脉作为非动脉粥样硬化对照动脉。

重组腺病毒及腺相关病毒的制备：携带对照GFP(Ad-SM22-EV)或Nron cDNA的腺病毒SM22α启动子(Ad-SM22-Nron)用于诱导过表达(OE)Nron在ApoE^-/-小鼠VSMC中的表达。重组腺相关病毒2/8[rAAV2/8，AAV2反向末端重复序列(ITR)DNA与AAV血清型8结合衣壳]携带scramble shRNA或Nron shRNA被用来敲低Nron在ApoE^-/-小鼠中的表达。所有重组腺病毒和AAV均由GeneChem Technologies提供。

动物研究：6周龄雄性C57BL/6小鼠和ApoE^-/-小鼠购自北京大学(中国北京)。所有的小鼠均在适宜温度和湿度并具有光控设施中饲养，允许随意用水。小鼠分别用标准对照饮食(SCD)或西方饮食(WD)喂养16周。ApoE^-/-小鼠在处死前8周每两周用腺病毒(Ad-SM22-EV或Ad-SM22-Nron；每组n＝12)静脉注射一次，或者西方饮食喂养四周后单次静脉注射一次腺相关病毒2/8(rAAV shNC或rAAV shNron；每组n＝12)。

动脉粥样硬化病变的组织学分析和量化：小鼠禁食4小时，然后麻醉。脂肪堆积胸腹主动脉采用enface油红O染色法测定。简单地说，用极细的Vanna显微割肌纵向解剖小鼠主动脉，并用直径为0.2mm的不锈钢销平钉在黑蜡表面上。固定的主动脉用油红O染色，图像用标准图像数码相机采集。主动脉窦病变的显微镜评估：心脏固定在4％多聚甲醛中，冷冻保存在15％蔗糖中，随后用30％蔗糖。植入OCT化合物(Sakura Finetek,托伦斯,加利福利亚)后，心脏冷冻切片，从距离主动脉瓣外观100μm以80μm的间隔收集6μm切片。主动脉窦切片油红O染色显示脂质积聚，苏木精-伊红(HE)染色显示形态学，用Masson三色染色法(Masson)检测胶原含量，用elastica van Gieson染色(EVG)检测弹性纤维。免疫组化检测巨噬细胞和平滑肌细胞的相对含量。

冷冻连续切片：在PBS中用0.3％H₂O₂处理以阻断内源性过氧化物酶活性，然后在4％BSA(sigma)中封闭。一抗：F4/80(ab100790，Abcam)、α-SMA(ab7817，Abcam)或VEGFA(ab1316，Abcam)。所有切片均用生物素二抗染色并使用ABC试剂(Vector Laboratories)进行检测。图像由光学显微镜采集，并用Image Pro Plus进行定量形态测量。以80μm为间隔计算4个切片的平均病变面积，确定病变区域。为了评估染色成分的相对含量，测定了蓝色(Masson染色胶原蛋白)和DAB染色(免疫组化)阳性区域占总斑块面积的百分比。纤维帽面积被量化为总斑块面积的百分比。将纤维帽定义为VSMC和富含蛋白多糖的区域，覆盖在坏死核心的富含胆固醇、缺乏基质和脱细胞区域上。通过定量弹性纤维的断裂(即不连续或断裂)来评估中膜的弹性板破坏。为了检测血管内膜毛细血管，将有实质性病变的主动脉窦切片与抗cd31抗体(ab182981，Abcam)孵育。管腔和外膜毛细血管内皮阳性染色作为对照。在高倍镜(×400)下识别内膜血管，当发现内皮细胞核和管腔及在相邻切片中也观察到血管时计数。

RNA荧光原位杂交：将组织切片在4％多聚甲醛中固定30分钟，并用0.1％Triton渗透。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞三次并用预杂交缓冲液(2×生理盐水柠檬酸钠，10％甲酰胺)处理。将Nron(Exiqon)FISH(荧光原位杂交)探针重悬于杂交缓冲液(2×生理盐水柠檬酸钠、10％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯)，至最终浓度为250nM/探针组。在37℃的加湿室中杂交16h。孵育Nron探针后，用PBS洗涤细胞三次，37℃下用α-SMA抗体(ab7817，Abcam)处理2小时，用PBS清洗细胞三次并在37℃下用荧光标记的二抗处理1小时。继续经过几轮清洗(包括可选的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚染色步骤)，最后用抗褪色的安装介质将盖玻片安装到显微镜载玻片上。

免疫荧光：人颈动脉和小鼠主动脉窦切片的免疫荧光研究。简单地说，对于双重染色，切片用抗α-SMA孵育抗体(ab7817，Abcam)，以及抗NFATc1抗体(ab25916，Abcam)，抗NFATc2抗体(sc-7296，Santa Cruz)，抗NFATc3抗体(sc-8405，Santa Cruz)或抗NFATc4抗体(ab99431，Abcam)在4℃过夜，然后与AlexaFluor 568(红色)和AlexaFluor 488(绿色)(分子探针公司，Eugene，OR)结合的二级抗体孵育30分钟。使用荧光显微镜(日本奥林巴斯)和Axiovision 4.8软件检测信号抗原的单个和合并图像。

RNA提取与qRT-PCR：用TRIzol试剂(D9108A，Takara Bio)从细胞或组织中提取总RNA。使用RNA PCR试剂盒(RR036A，Takara Bio)反向转录RNA。定量聚合酶链反应(qPCR)扩增使用ABI PRISM 7900序列检测器系统(Applied Biosystem,，加利福尼亚州福斯特市)，使用遵循制造商说明书。相对基因表达(内源性控制基因β-肌动蛋白进行归一化处理)使用ΔCt法进行计算。引物序列见表1(参见图9)。

蛋白免疫印迹：在指定的时间点收集细胞，并在冰凉中均质化添加蛋白酶抑制剂混合物的悬浮缓冲液(Sigma-Aldrich)。使用BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo)测定蛋白质浓度。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质，然后用抗NFATc3抗体(sc-8405，SantaCruz)或抗VEGFA抗体(ab1316，Abcam)进行免疫印迹。膜与过氧化物酶结合的二级抗体孵育，产生特异性条带使用Bio-Rad成像系统(Hercules，CA)检测。

RNApull down和质谱分析：生物素标记的RNA使用Biotin RNA标记Mix和T7 RNA聚合酶(Ambion)在体外转录，并用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)柱上DNA消化纯化。生物素化的Nron或反义Nron与细胞裂解液(含Rnasin)在4℃孵育过夜。相互作用的配合物用链霉亲和素珠在室温下纯化3小时，并通过银染色(Pierce silver stain kit,Thermo Scientific)观察。在质谱分析中，提取实验组特异性条带进行进一步分析。

RNA免疫沉淀：细胞在37℃下用0.3％甲醛处理10分钟。加入终浓度0.125M甘氨酸室温5分钟。然后将细胞用PBS洗涤两次后收集细胞。将细胞重悬在RIPA缓冲液中(50mMTris，pH 7.4，150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％SDS、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.5mM DTT和1mM PMSF混合物)，在冰上涡旋孵育30分钟。添加NFATc3或IgG抗体，4℃下孵育过夜。用protein G磁珠回收RNA/蛋白复合物，并用PBS洗涤多次。用Trizol回收RNA，并通过RT-PCR进行分析。

VSMC增殖试验：使用EdU(5-乙炔基-20-脱氧尿苷)(Cell Light EdUApollo 567体外试剂盒(RiboBio，中国广州))法检测VSMC增殖。接种VSMC于六孔板。经过指定的处理后，将培养基替换为含有50μM EdU的DMEM，培养2小时。将细胞在含有4％多聚甲醛的PBS中固定30分钟，然后根据制造商的说明进行染色。五个随机选择的区域(放大倍数，×200)进行EdU阳性细胞计数。

VSMC迁移分析：用Transwell细胞培养室测定SMC的迁移。将VSMC(每孔5×10⁴个细胞)悬浮在100μl DMEM中加到上室。下部隔室添加10％的FBS的DMEM诱导迁移。孵育5小时后，膜两侧的细胞用1％甲苯胺蓝(Sigma-Aldrich)固定并进行染色。膜上部的细胞用棉签除去。随机选择5个高分辨率(200X)视野，计数膜下侧平均细胞数。

VSMC Tunel分析：使用Promega(麦迪逊，WI)试剂盒进行Tunel分析。VSMC在12孔板的玻璃盖玻片上以2×10⁵细胞/孔的密度培养。ox-LDL和siRNA处理后，用PBS洗涤VSMCs，室温下4％多聚甲醛固定10min。然后将固定的细胞放在渗透溶液(0.1％Triton X-100在0.1％柠檬酸钠中)中，冰上孵育2分钟。在加入rTdT孵育液前，用PBS冲洗载玻片。37℃孵育60分钟后，用2×SSC漂洗3次，用DAPI复染细胞核。随机选择5个视野(×200倍)计数tunel阳性细胞数。

试管形成试验：如前所述进行试管形成试验。小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)以4×10⁴/孔的速度接种在96孔板上，板上涂有ECMatrix(BD生物科学)。然后用Nron OE培养基处理细胞VSMC单独或联合VEGFR2 siRNA。使用ImageJsoftware的angiogenesis Analyzer工具对总管长度和分支点进行计算和分析。

细胞培养：采用胶原酶-弹性酶消化法从6-8周龄C57雄性小鼠主动脉中获得原代VSMCs，方法如下：切除主动脉，PBS冲洗，在含有1mg/mL II型胶原酶(Worthington生化公司)的DMEM中孵育10～15分钟，然后在显微镜下剥离血管外膜，用剪刀切碎并用胶原酶0.5mg/ml(Sigma I型，C-0130)和弹性蛋白酶0.125mg/ml(Sigma III型，E-0127)消化于37℃无血清DMEM中，直至大多数细胞悬液。回收细胞悬液，400g离心5min后，用含20％胎牛血清(FBS,HyClone)、2％青霉素链霉素的DMEM(Invitrogen)重悬，平板培养。使用第3代到第5代的细胞用于实验。

统计分析：采用GraphPad Prism软件(GraphPad software Inc.，La Jolla,CA)进行统计分析。Western blot图像的灰度用Image J Software量化。数值表示为至少三个独立实验的平均值±标准误。用学生检验来评估两组间差异的统计学意义。对于多组，采用Bonferroni检验(方差齐性)或Tamhanes s T2检验(方差异质性)的单因素方差分析(one-wayANOVA)评估显著性。P＜0.05为有统计学意义。在可能的情况下采用随机和盲法。动物队列规模的确定是基于以前类似的研究。

结果

Nron在人及小鼠动脉粥样硬化病变中表达下调：为了阐明Nron在动脉粥样硬化发生中的作用，首先检测了其在人颈动脉粥样硬化斑块和内部乳腺动脉(正常血管)中的表达。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)结合免疫染色表明，Nron在健康血管SMCs中大量表达，并与α-SMA共定位；然而，在动脉粥样硬化病变的增生内膜SMCs中，几乎检测不到Nron的表达(图1A)。值得注意的是，在病变血管的介质中可以观察到Nron的荧光信号，虽然相对较弱(图1A)。进一步检测了Nron在ApoE-/-小鼠主动脉窦的表达(图1B)。相应地，Nron在正常血管中高表达，在动脉粥样硬化斑块中几乎不表达。此外，还观察到心肌内的Nron信号较弱。接下来分析了Nron在动脉粥样硬化进展中的动态变化。ApoE-/-小鼠主动脉Nron水平随着年龄的增长而下降，且在喂食西方饮食(WD)时下降更明显，而野生型C57/BL6小鼠在标准对照饮食(SCD)或喂食WD时，Nron水平保持不变(图S1A)。这些结果表明，Nron的表达与疾病的严重程度密切相关，而与年龄或饮食无关。

VSMC中Nron过表达可诱导更脆弱斑块的高度特征性结构：Nron在动脉粥样硬化中的减少促使研究Nron和动脉粥样硬化之间是否存在因果关系。用带有SM22α启动子驱动的Nron cDNA的腺病毒载体(Ad-SM22-Nron)处理ApoE-/-小鼠，诱导VSMCs中Nron的过表达(OE)。实验显示，在静脉注射重组腺病毒载体1周后，主动脉中转基因表达明显，随后逐渐下降到基础水平(图S1中B)。考虑到转基因的短期表达，在小鼠处死前每2周注射一次腺病毒，持续8周。

体重和血脂谱不受Nron基因转移的影响(参见图10中表2)。

病变区域无显著差异，如下所示：胸腹主动脉和主动脉窦油红O染色测定，在Ad-SM22-Nron治疗的小鼠和对照组(Ad-SM22-EV)之间(图2A和B)。进一步研究了动脉粥样硬化斑块在巨噬细胞方面的复杂性(F4/80阳性)浸润，平滑肌细胞(α-SMA阳性)增殖，胶原(马森三色染色)含量、纤维帽和坏死核心区域，以及评估弹性层(Verhoeff'sVan Gieson染色)的破坏情况(图2C和D)。与对照组相比，Nron OE组小鼠出现斑块较薄的VSMC缺陷纤维帽，胶原疏松，基质覆盖富含脂质的坏死核。此外，巨噬细胞含量增加，Nron OE小鼠损伤区域内弹性纤维的降解更为明显。这些结果表明，Nron OE诱导了一种高度特征性的更脆弱斑块结构。

Nron基因的敲低抑制动脉粥样硬化的发展并增加动脉粥样硬化斑块的稳定性：为了在主动脉中实现更高的敲低(KD)效率，合成并应用重组携带Nron-shRNA(rAAV-shNron)的腺相关病毒(rAAV)载体。检测了不同载体类型的感染效率，发现静脉注射rAAV2/8有效地抑制了ApoE^-/-小鼠主动脉Nron的表达(图S1中D和E)。由于rAAV在体内介导转基因的长期表达，ApoE^-/-小鼠在10周时给予rAAV2/8，并在处死前连续喂食WD 3个月。

油红O染色显示与对照组(rAAV-shNC处理)相比，Nron KD小鼠胸腹主动脉脂质积累显著降低(29.4％)(图3A)。主动脉窦的脂质积累也一致减少了31.6％(图3B)。接下来，对斑块进行了斑块易损性形态特征的检测(图3C和D)，结果发现，与对照组相比，Nron KD小鼠的胶原含量和纤维帽面积显著增加，平滑肌细胞比例更高。此外，Nron KD小鼠病灶内巨噬细胞含量和坏死核心区域明显减少。这些结果表明rAAV2/8介导的Nron KD不仅减少了斑块面积，而且增加了斑块的稳定性。值得注意的是，Nron KD小鼠在喂食致动脉粥样硬化饮食4个月后，与对照组相比，体重增加速度减慢，血浆甘油三酯水平降低，胆固醇水平有下降趋势，但无统计学意义，表3(参见图11)。

VSMC中Nron与NFATc3结合：VSMC作为动脉粥样硬化病变的重要组成部分，在动脉粥样硬化中起着重要作用疾病的发展。VSMC的适度增殖有利于斑块的稳定性晚期病变和凋亡率增加导致斑块破裂。血管平滑肌细胞作为动脉粥样硬化病变的重要组成部分，在疾病的发展中起着重要作用。中度增殖有利于晚期病变斑块的稳定，凋亡率增加导致斑块破裂3,4。与对照组相比，主动脉窦病变的荧光染色显示Nron OEApoE^-/-小鼠增生性(ki67阳性)VSMCs减少(图4A和B)，凋亡(tunel阳性)VSMCs增加(图4C和D)。为了深入了解Nron调控斑块稳定性和VSMC功能的分子机制，进行了RNApull down分析和质谱分析，发现NFAT的一个亚基——白介素增强结合因子2(ILF2)与VSMCs中的Nron相关(图4E)。独立免疫印迹试验进一步鉴定了NFATc3蛋白，而不是其他NFAT蛋白，作为一种特异性的nron结合蛋白(图4F和图S2)。这一发现被RNA免疫沉淀(RIP)试验证实(图4G)。

在动脉粥样硬化病变中，NFATc3被激活并转位到VSMC的细胞核内：虽然最初被认为仅限于调节免疫功能，从那以后，不同的NFAT家庭成员被证明可以调节不同的行为病理生理过程和参与各种疾病。接下来检测了NFAT蛋白在小鼠正常和动脉粥样硬化血管中的表达。免疫荧光染色显示(图5A和图S3)，NFATc2、NFATc3和NFATc4在正常血管大量表达，均定位于VSMCs的细胞质中，而NFATc1主要定位于心肌中。值得注意的是，在动脉粥样硬化病变中，NFATc3在纤维帽中大量表达，并从细胞质转移到细胞核，而NFATc2和NFATc4都保留在细胞质中。在人类的动脉粥样硬化斑块中观察到一致的结果(图S4A和B)。进一步使用westernblot检测动物模型主动脉中NFATc3的蛋白水平。NFATc3在对照组C57小鼠胞浆中表达，在细胞核中几乎不表达；然而，WD喂养的ApoE^-/-小鼠的主动脉出现了进展性动脉粥样硬化病变，显示出NFATc3活性形式的增加(通过凝胶内更快的迁移显示)。更显著的是，VSMCs中的NronOE有效地抑制了ApoE^-/-小鼠主动脉NFATc3的核转位(图5C和E)。

Nron敲低联合ox-LDL治疗可诱导vsmc中NFATc3的核转位：由于已证实Nron在VSMCs中与NFATc3结合，且其在斑块中的表达减少，推测Nron对NFATc3活性的直接调控是合理的。用siRNA转染原代VSMCs体外诱导Nron KD，并用ox-LDL处理。ox-LDL和Nron KD均不能诱导NFATc3核易位；然而，在一起使用时，清楚地观察到NFATc3在细胞核中大量积累(图6A)。Western blot分析进一步证实了这一结果。NFATc3被磷酸化并保留在细胞质中，NronKD联合ox-LDL导致NFATc3的去磷酸化和核转位(图6B和C)。与此同时，Nron KD VSMCs中nfat驱动的荧光素酶报告基因的活性也增加(图6D)。这些结果表明，Nron表达的降低与ox-LDL激发可能是NFATc3激活的一个原因，两者都是不可或缺的。

Nron KD对VSMC细胞增殖、迁移和凋亡的影响依赖于NFATc3：由于Nron调控ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中VSMCs的增殖和凋亡，检测了这种作用是否通过Nron与NFATc3的相互作用介导。使用EdU进行检测,Nron KD结合ox-LDL治疗促进VSMCs培养体外的增殖，而这一效应在NFATc3敲低后消失(图7A和B)。此外，Nron KD对VSMCs迁移的加速作用也被NFATc3的联合敲低完全阻断(图7C和D)。接下来，用TUNEL法分析VSMCs的凋亡。Nron KD造成Tunel-阳性VSMCs明显减少，这种抗凋亡作用被NFATc3敲低消除(图7e和F)。总的来说，这些数据表明Nron KD的促增殖和抗凋亡的作用依赖于NFATc3的核易位和激活。

Nron有助于动脉粥样硬化内膜内的新生血管形成：斑块内膜内的新生血管已被认为是导致血管破裂的一个可能因素无症状纤维粥样斑块变为病变的过程容易破裂。同样的，Nron同样有助于其他类型新生血管形成，具体比如应用于治疗缺血性血管损伤导致的病症，促进相应的血管新生。与对照组相比，观察到Nron OEApoE^-/-小鼠主动脉窦斑块中CD31阳性微血管数量增加(图8A)。为了确定在血管生成中负责Nron作用的分子和细胞机制，检测了培养的VSMCs分泌的血管生成因子的表达。Nron OE导致原代小鼠VSMCs Vegfa和Vegfc mRNA水平升高，而Nron KD则相反(图8B和C)。此外,免疫印迹分析发现的蛋白质水平VEGFA不断改变(图8d和E)。人类主动脉平滑肌细胞系T/G HA-VSMC中也观察到类似的结果图S5中a和B)。由于Nron对nfat驱动的荧光素酶报告基因的活性没有影响(图6d,图8F、G)。Nron对VEGFA表达的调控与NFATc3的激活无关。免疫组化检测结果一致显示，NronOEApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中VEGFA表达增加(附图5C和D)。接下来，用小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)进行试管形成实验。用来自VSMCs的条件培养基处理培养的MAEC，并测量总分支长度和分支点，以评估EC血管生成。结果表明，Nron OE VSMCs处理组的分枝长度和分枝数均显著高于对照组。然而，在MAECs中，抑制VEGFR2(VEGFA的主要受体)会阻断Nron OEVSMCs的促血管生成作用(图8H和I)。这些发现支持了这样一个概念，即由Nron调控的VSMCs来源的VEGFA可以作为旁分泌因子，参与血管生成过程。

讨论

大量证据表明，lncRNA与动脉粥样硬化有关。在本研究中，发现lncRNANron在动脉粥样硬化斑块样本的VSMCs中特异性表达降低。这导致了激活NFATc3促进VSMCs增殖和抑制凋亡，并导致了独立于NFATc3的斑块内血管生成的抑制。所有这些效应都诱发了一种高度特征性的更稳定的动脉粥样硬化斑块结构。揭示Nron在VSMC功能和动脉粥样硬化发展中的作用的研究。

Nron被鉴定为转录因子NFAT的非编码RNA阻遏子。NFAT家族有五名成员，NFAT1至NFAT5，除NFAT5外，其他成员均为钙调节转录因子。在静息的T细胞中，NFAT被Nron/蛋白质复合物磷酸化并保留在细胞质中。在T细胞抗原受体(TCR)信号之后，NFAT蛋白被去磷酸化并转移到细胞核以激活基因表达。先前的研究发现Nron的敲低导致免疫细胞中NFATc1的核移位。在本研究中，观察到在动脉粥样硬化病变中Nron表达显著降低并伴有NFATc3激活，这为Nron与NFATc3特异性相关并调控其在vsmc中的核转运提供了证据。然而，Nron的敲低仅在以下情况下诱导NFATc3易位：用ox-LDL进行预处理。这些结果表明，Nron表达的降低与其他致病因素如ox-LDL一起导致了动脉粥样硬化病变中NFATc3的激活。值得注意的是，没有观察到斑块中其他NFAT成员的激活，这表明Nron和NFAT家族在不同细胞类型和疾病中的功能异质性。

血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化发生中起关键作用。一般来说，内膜VSMCs被认为通过促进纤维帽从而稳定动脉粥样硬化斑块而发挥有益作用。细胞凋亡导致的血管平滑肌细胞的缺失导致纤维帽变薄并促进坏死核心的形成。NFAT在vsmc迁移和增殖中的作用已经在之前的文章中提出。在这里，发现联合敲低NFATc3完全消除了Nron KD在ox-LDL诱导的VSMCs中的增殖和抗凋亡作用。这为Nron-NFATc3相互作用参与VSMC行为调控提供了直接证据。

微血管很少出现在健康的血管内膜，但通常在病理条件下，如动脉粥样硬化中观察到。斑块内血管生成是斑块进展的重要触发因素，也与斑块侵蚀、出血和冠状动脉血栓形成相关。由于新形成的血管生长到斑块中是不成熟的，它们天生就是渗漏的，允许炎症细胞浸润和血液成分流入(包括红细胞和血小板)，使其成为斑块的重要标志不稳定性。VEGFA由多种细胞释放，包括SMCs、ECs和巨噬细胞，是新生血管的有效启动剂。VEGFA在生理条件下有助于动脉内皮的维持和再生；然而，晚期动脉粥样硬化斑块中VEGFA的升高明显导致微血管的高渗透性和漏性，这些微血管不能正常成熟。在本研究中，在Nron OE小鼠斑块中观察到更多的微血管，并提供了Nron促进vsmc中VEGFA表达的证据。血管内皮细胞分泌的VEGFA作为旁分泌因子，参与动脉粥样硬化斑块内膜EC血管生成。这可能是引起斑块不稳定的重要因素之一。值得注意的是，Nron对VEGFA表达的调控是独立于NFATc3的。需要更多的研究来确定可能介导Nron对血管生成作用的新型信号蛋白。

为了探讨动脉粥样硬化发展过程中VSMCs中Nron的功能，使用由SM22α启动子驱动的腺病毒载体来控制主动脉中Nron的表达。此外，成功地利用尾静脉注射递送的携带NronshRNA的rAAV2/8载体，在主动脉获得了稳定的Nron敲低，尽管这种效果不是vsmc特异性的。令人惊讶的是，rAAV2/8介导的Nron KD不仅增加了斑块的稳定性，而且显著降低了主动脉和主动脉窦的斑块面积(VSMC的Nron OE对斑块面积没有影响)。值得注意的是，Nron KD小鼠的血脂水平有所改善，体重再次降低。这一发现提示了Nron在其他代谢性疾病中的潜在作用，值得进一步研究。此外，在未来的研究中，利用条件敲低或转基因小鼠来阐明Nron在动脉粥样硬化发病机制中不同类型细胞中的具体作用可能更有意义和值得考虑。综上所述，lncRNANron表达的降低通过调节晚期病变的VSMC功能和抑制新生血管形成，增加了动脉粥样硬化斑块的稳定性。本研究为阐明动脉粥样硬化的发病机制提供了重要线索，并暗示Nron可能是动脉粥样硬化的一个潜在治疗靶点。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为。

Claims (1)

1.带有SM22α启动子驱动的Nron cDNA的腺病毒载体在制备动脉粥样硬化斑块动物模型中的应用；其中，所述动脉粥样硬化斑块动物模型用于模拟动脉粥样硬化斑块的发展，所述带有SM22α启动子驱动的Nron cDNA的腺病毒载体的作用为促进动脉粥样硬化斑块新生血管形成。

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