JPWO2017010568A1 - RNA-protein complexes and uses thereof - Google Patents

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Abstract

ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体またはＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を設計する。2 RNA-protein complexes or 2 RNA-protein binding motif sequences comprising a double-stranded RNA having two RNA-protein binding motif sequences and functional molecules at both ends and a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence An RNA-protein complex is designed that includes two or more double-stranded RNAs, a protein that fuses the protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence, and an aggregated protein.

Description

本発明は、特的の構造を有するＲＮＡ−タンパク質複合体とその使用方法に関する。   The present invention relates to an RNA-protein complex having a specific structure and a method of using the same.

多様なナノ構造をデザインするために核酸の特性は有用であるため、近年、核酸は、分子ロボットのツールとして利用されている（非特許文献１）。DNAナノテクノロジーは、分子ロボット（非特許文献２）、ナノ分子デバイス（非特許文献３）およびナノマシン（非特許文献４）と言った制御可能な構造と機能性を備えた構造体のプラットフォームとして期待されている。RNAもまた同様に良く知られたナノ構造の構築に有用である（非特許文献５）。RNAナノ構造体は、アプタマー、リボザイムおよびRNA干渉（siRNA）と言った機能的なRNAナノ構造体を誘導するスキャフォールドとして既に利用されており、機能的なRNAナノ構造は、ドラックデリバリーといった治療用に用いることが提案されている（非特許文献６）。RNAは、DNAをテンプレートとして細胞内で合成できることから、RNAナノテクノロジーは、in vivoへの応用という利点がある。RNAの機能性および表現特徴は、細胞内で機能する分子ロボットの構築のために有用なナノ構造体を取らせることができる。特に、RNA結合タンパク質と合成RNAは、細胞内RNAの構造および機能を制御することができるRNA-タンパク質複合体（RNP）として生物の機能を制御するために利用することが期待される。しかし、RNAナノ構造体の構造および機能をタンパク質との相互作用によって制御することは、難しい。   Since the characteristics of nucleic acids are useful for designing various nanostructures, in recent years, nucleic acids have been used as tools for molecular robots (Non-Patent Document 1). DNA nanotechnology is expected as a platform for structures with controllable structures and functionality, such as molecular robots (Non-patent Document 2), nanomolecular devices (Non-patent Document 3), and nanomachines (Non-Patent Document 4). Has been. RNA is also useful for the construction of well-known nanostructures (Non-Patent Document 5). RNA nanostructures are already used as scaffolds to induce functional RNA nanostructures such as aptamers, ribozymes and RNA interference (siRNA), and functional RNA nanostructures are used for therapeutics such as drug delivery. It is proposed to be used for (Non-Patent Document 6). Since RNA can be synthesized intracellularly using DNA as a template, RNA nanotechnology has the advantage of in vivo application. The functionality and expression characteristics of RNA can allow nanostructures useful for the construction of molecular robots that function in cells. In particular, RNA-binding proteins and synthetic RNAs are expected to be used to control the functions of organisms as RNA-protein complexes (RNPs) that can control the structure and function of intracellular RNA. However, it is difficult to control the structure and function of RNA nanostructures by interacting with proteins.

これまで、発明者は、RNA kink-turn (K-turn)モチーフおよびこれに結合するL7Aeタンパク質を用いてRNP依存型のナノ構造体のデザインと構築に成功している（特許文献１、非特許文献６および非特許文献７）。K-turnモチーフを含むRNAナノ構造体は、L7Aeの結合に応答して立体配座を変化させることで構造的な変化を生じさせることが可能である（非特許文献８）。そのため、RNP相互作用を利用して、RNAナノ構造体の動的な性質を制御することが可能である。   Until now, the inventors have succeeded in designing and constructing an RNP-dependent nanostructure using an RNA kink-turn (K-turn) motif and an L7Ae protein that binds to the RNA kink-turn (K-turn) motif (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). Reference 6 and Non-Patent Reference 7). An RNA nanostructure containing a K-turn motif can cause a structural change by changing the conformation in response to the binding of L7Ae (Non-patent Document 8). Therefore, it is possible to control the dynamic properties of RNA nanostructures using RNP interactions.

WO2010/010862WO2010 / 010862

Hagiya, M , et al. Accounts of chemical research 2014, 47, 1681-1690.Hagiya, M, et al. Accounts of chemical research 2014, 47, 1681-1690. Wickham, S. F, et al, Nat Nanotechnol. 2012, 7, 169-173.Wickham, S. F, et al, Nat Nanotechnol. 2012, 7, 169-173. Liu M, et al, Nat Commun. 2013, 4, 2127.Liu M, et al, Nat Commun. 2013, 4, 2127. Modi, S, et al, Nat Nanotechnol 2009, 4, 325-330.Modi, S, et al, Nat Nanotechnol 2009, 4, 325-330. Afonin, K, et al, Accounts of chemical research 2014, 47, 1731-1741.Afonin, K, et al, Accounts of chemical research 2014, 47, 1731-1741. Osada, E, et al, ACS nano 2014, 8, 8130-8140Osada, E, et al, ACS nano 2014, 8, 8130-8140 Ohno, H, et al, Nature nanotechnology 2011, 6, 116-120.Ohno, H, et al, Nature nanotechnology 2011, 6, 116-120. Turner, B, et al, Rna 2005, 11, 1192-1200.Turner, B, et al, Rna 2005, 11, 1192-1200.

RNA構造と機能を制御することができるRNAナノマシンを提供することを目的とする。   An object is to provide an RNA nanomachine capable of controlling RNA structure and function.

本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることを特徴とする。
本発明は、別の実施の形態によれば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることを特徴とする。The present invention has been made to solve the above problems. That is, the present invention includes, according to one embodiment, a double-stranded RNA having two RNA-protein binding motif sequences, having functional molecules at both ends, and a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence. An RNA-protein complex is used.
According to another embodiment, the present invention includes a double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences, a protein in which a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence and an aggregated protein are fused. An RNA-protein complex is used.

すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含む２重鎖ＲＮＡであって、当該２重鎖ＲＮＡの両端に機能的分子を有するもの、および
（２）前記（１）のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質。
［２］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対である、［１］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［３］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対である、［１］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［４］前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、［３］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［５］前記機能的分子が、アプタマーである、［１］から［４］のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［６］［１］から［５］のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。
［７］前記ＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または１５塩基対から１９塩基対である、［６］に記載のヒト細胞。
［８］ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで、当該機能的分子の相互作用を制御する方法。
［９］前記２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を調整することで、前記相互作用を正または負へ制御する、［８］に記載の方法。
［１０］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を正へ制御する、［９］に記載の方法。
［１１］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を負へ制御する、［９］に記載の方法。
［１２］前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、［１１］に記載の方法。
［１３］前記機能的分子が、アプタマーである、［８］から［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、［８］から［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡ、および
（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質との融合タンパク質。
［１６］前記２重鎖ＲＮＡにおけるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対である、［１５］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［１７］前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、［１５］または［１６］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［１８］前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、［１５］から［１７］のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［１９］［１５］から［１８］に記載のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。
［２０］ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合した融合タンパク質とを結合させることで、被凝集タンパク質の凝集を制御する方法。
［２１］前記２重鎖ＲＮＡにおけるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、３１塩基対から３５塩基対である、［２０］に記載の方法。
［２２］前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、［２０］または［２１］に記載の方法。
［２３］前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、［２０］から［２２］のいずれか１項に記載の方法。
［２４］前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、［２０］から［２３］のいずれか１項に記載の方法。That is, the present invention has the following features:
[1] An RNA-protein complex comprising the following (1) and (2);
(1) a double-stranded RNA comprising two RNA-protein binding motif sequences, having functional molecules at both ends of the double-stranded RNA, and (2) the RNA-protein binding motif of (1) above A protein that binds to a sequence.
[2] The RNA according to [1], wherein the distance between the RNA-protein binding motif sequences is 20 to 24 base pairs, or 31 to 35 base pairs, or 42 to 46 base pairs -Protein complex.
[3] The RNA according to [1], wherein the distance between the RNA-protein binding motif sequences is 15 to 19 base pairs, or 26 to 30 base pairs, or 37 to 41 base pairs -Protein complex.
[4] The RNA-protein complex according to [3], wherein the double-stranded RNA has an overhang of 6 base pairs or more that are complementary strands at both ends.
[5] The RNA-protein complex according to any one of [1] to [4], wherein the functional molecule is an aptamer.
[6] A human cell comprising the RNA-protein complex according to any one of [1] to [5].
[7] The human cell according to [6], wherein the distance between the RNA-protein binding motif sequences in the RNA-protein complex is 20 to 24 base pairs, or 15 to 19 base pairs.
[8] Interaction of the functional molecule by binding a double-stranded RNA containing two RNA-protein binding motif sequences and having a functional molecule at both ends and a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence How to control.
[9] The method according to [8], wherein the interaction is controlled to be positive or negative by adjusting a distance between RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA.
[10] By changing the distance between the RNA-protein binding motif sequences from 20 base pairs to 24 base pairs, 31 base pairs to 35 base pairs, or 42 base pairs to 46 base pairs, The method according to [9], wherein the interaction is positively controlled by binding a protein that binds to a sequence.
[11] By changing the distance between the RNA-protein binding motif sequences from 15 base pairs to 19 base pairs, or from 26 base pairs to 30 base pairs, or from 37 base pairs to 41 base pairs, the RNA-protein binding motif The method according to [9], wherein the interaction is controlled to be negative by binding a protein that binds to a sequence.
[12] The method according to [11], wherein the double-stranded RNA has an overhang of 6 base pairs or more that are complementary strands at both ends.
[13] The method according to any one of [8] to [12], wherein the functional molecule is an aptamer.
[14] The method according to any one of [8] to [13], wherein the double-stranded RNA and the fusion protein are bound in a human cell.
[15] An RNA-protein complex comprising the following (1) and (2);
(1) a double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences, and (2) a fusion protein of a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence and an aggregated protein.
[16] The distance between RNA-protein binding motif sequences in the double-stranded RNA is 20 base pairs to 24 base pairs, or 31 base pairs to 35 base pairs, or 42 base pairs to 46 base pairs. ] RNA-protein complex as described in.
[17] The RNA-protein complex according to [15] or [16], wherein the double-stranded RNA includes 9 or more RNA-protein binding motif sequences.
[18] The RNA-protein complex according to any one of [15] to [17], wherein the aggregated protein is caspase 8 or a fragment thereof.
[19] A human cell comprising the RNA-protein complex according to any one of [15] to [18].
[20] A protein to be aggregated by binding a double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences to a fusion protein obtained by fusing a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence and the aggregated protein. To control agglomeration.
[21] The method according to [20], wherein the distance between the RNA-protein binding motif sequences in the double-stranded RNA is from 31 base pairs to 35 base pairs.
[22] The method according to [20] or [21], wherein the double-stranded RNA comprises 9 or more RNA-protein binding motif sequences.
[23] The method according to any one of [20] to [22], wherein the aggregated protein is caspase 8 or a fragment thereof.
[24] The method according to any one of [20] to [23], wherein the double-stranded RNA and the fusion protein are bound in a human cell.

本発明によれば、本発明で提供されるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることで、当該機能を対応するタンパク質の存在により制御することができるため、有利である。また、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いること、当該被凝集を凝集することができるため、有利である。   According to the present invention, a RNA comprising a double-stranded RNA having two RNA-protein binding motif sequences provided by the present invention and having functional molecules at both ends and a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence. Use of a protein complex is advantageous because the function can be controlled by the presence of the corresponding protein. In addition, using an RNA-protein complex comprising a double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences, a protein fused with a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence and an aggregated protein, Advantageously, the agglomeration can be agglomerated.

図１aは、 2Kt-33bp および2Kt-28bp RNA ナノマシンのタンパク質誘因性の構造変化ならびに二つのRNA鎖（青と緑）およびL7Ae タンパク質（黄）を含むRNA-タンパク質複合体の三次元モデリング結果を示す。図１bは、 RNAの構造および機能を制御する、タンパク質駆動性RNA ナノマシンの概要図を示す。図１cは、細胞内で発現したセンシングL7AeによるRNAナノマシンの発動の模式図を示す。図１dは、細胞内RNP相互作用によって誘導される細胞死の制御の模式図を示す。Figure 1a shows the protein-induced structural changes of 2Kt-33bp and 2Kt-28bp RNA nanomachines and three-dimensional modeling results of an RNA-protein complex containing two RNA strands (blue and green) and L7Ae protein (yellow) . FIG. 1b shows a schematic diagram of a protein-driven RNA nanomachine that controls RNA structure and function. FIG. 1c shows a schematic diagram of the activation of RNA nanomachines by sensing L7Ae expressed in cells. FIG. 1d shows a schematic diagram of the control of cell death induced by intracellular RNP interactions. 図２aは、 2Kt-33bp (lane 1-6) および2Kt-28bp (lane 7-12) RNAナノマシンならびにL7Aeとの相互作用のEMSAの結果を示す。図２bは、L7Ae結合に対応するCy3およびCy5でラベルした2Kt-33bp RNAナノマシンのFRETの模式図および蛍光測定結果を示す。L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）における、Cy3およびCy5でラベルした2Kt-33bp (下左図) および2mKt-33bp (下中央図)の蛍光スペクトルを示し、L7Aeの存在（黒色）および非存在（白抜き）における蛍光強度比（F665/F565）を示す。図２cは、L7Aeの非存在下での2Kt-33bp（左図）およびL7Aeの存在下での2Kt-33bp（右図）RNA ナノ構造体のAFM像を示す。図２dは、L7Aeの非存在下での2Kt-28bp（左図）およびL7Aeの存在下での2Kt-28bp（右図） RNA ナノ構造体のAFM像を示す。図２eは、L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）における2Kt-33bp RNA ナノ構造体に対する両ＲＮＡ端の距離の測定結果を示す。図２fは、L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）における2Kt-28bp RNA ナノ構造体に対する両ＲＮＡ端の距離の測定結果を示す。FIG. 2a shows the EMSA results of interaction with 2Kt-33bp (lane 1-6) and 2Kt-28bp (lane 7-12) RNA nanomachines and L7Ae. FIG. 2b shows a schematic diagram of FRET and fluorescence measurement results of 2Kt-33bp RNA nanomachine labeled with Cy3 and Cy5 corresponding to L7Ae binding. Shows fluorescence spectra of 2Kt-33bp (bottom left) and 2mKt-33bp (bottom middle) labeled with Cy3 and Cy5 in the presence (red) and absence (black) of L7Ae, with the presence of L7Ae (black) and The fluorescence intensity ratio (F 665 / F 565 ) in the absence (outlined) is shown. FIG. 2c shows an AFM image of 2Kt-33bp (left) in the absence of L7Ae and 2Kt-33bp (right) in the presence of L7Ae. FIG. 2d shows AFM images of 2Kt-28bp in the absence of L7Ae (left) and 2Kt-28bp in the presence of L7Ae (right) RNA nanostructures. FIG. 2e shows the measurement results of the distance of both RNA ends to the 2Kt-33bp RNA nanostructure in the presence (red) and absence (black) of L7Ae. FIG. 2f shows the measurement results of the distance of both RNA ends to the 2Kt-28bp RNA nanostructure in the presence (red) and absence (black) of L7Ae. 図３aは、L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）におけるbiMGA-2Kt-33bp (左図) およびbiMGA-2Kt-33bp (右図)の蛍光スペクトルを示す。図３bは、L7Aeの存在（左図）および非存在（右図）における biMGA-2Kt-33bpRNA ナノ構造体のAFM像を示す。図３cは、L7Aeの存在（左図）および非存在（右図）における biMGA-2Kt-28bp RNA ナノ構造体のAFM像を示す。図３dは、biMGA-2Kt-33bpまたはbiMGA-2Kt-28bpの開放型（黒）および閉鎖型（赤）のナノ構造体数の測定結果を示す。FIG. 3a shows the fluorescence spectra of biMGA-2Kt-33bp (left) and biMGA-2Kt-33bp (right) in the presence (red) and absence (black) of L7Ae. FIG. 3b shows AFM images of biMGA-2Kt-33bpRNA nanostructures in the presence (left) and absence (right) of L7Ae. FIG. 3c shows AFM images of biMGA-2Kt-28bp RNA nanostructures in the presence (left) and absence (right) of L7Ae. FIG. 3d shows the measurement results of the number of open (black) and closed (red) nanostructures of biMGA-2Kt-33bp or biMGA-2Kt-28bp. 図４aは、細胞内FRET シグナルを検出するためのタンパク質駆動性RNAナノマシンの模式図を示す。図４bは、フローサイトメトリーに基づいたFRETアッセイの略図を示す。図４cは、L7Aeの存在下（赤）および非存在下（黒）における2Kt-17bp-Xbp (X = 4, 5, 6, 7, 8)の蛍光スペクトルの測定結果を示す。右下図は、ＲＮＡ二本鎖長に対するFRET シグナル、[F565/F665(+L7Ae)]/ [F565/F665 (-L7Ae)]をプロットした結果を示す。図４dは、L7Ae-K-tur相互作用による RNAナノマシンの発動におけるフローサイトメトリー解析結果を示す。MS2CP (左)またはL7Ae (右)の存在下における2Kt-10bp-7bp (赤) または2mKt-10bp-7bp (青) RNA ナノマシンをHeLa細胞にコトランスフェクトした結果を示す。図４eは、MS2CPまたはL7Aeの存在下における2Kt-10bp-7bpまたは2mKt-10bp-7bp RNA ナノマシンをHeLa細胞にコトランスフェクトした際のFRETシグナルの測定結果を示す。すべてのCy3/Cy5平均強度は、MS2CP mRNA および2mKt-10bp-7bpでコトランスフェクトした細胞のCy3/Cy5平均強度で標準化した。Figure 4a shows a schematic diagram of a protein driven RNA nanomachine for detecting intracellular FRET signals. FIG. 4b shows a schematic of a FRET assay based on flow cytometry. FIG. 4c shows the measurement results of the fluorescence spectrum of 2Kt-17bp-Xbp (X = 4, 5, 6, 7, 8) in the presence (red) and absence (black) of L7Ae. The lower right figure shows the result of plotting the FRET signal, [F 565 / F 665 (+ L7Ae)] / [F 565 / F 665 (-L7Ae)] against RNA duplex length. FIG. 4d shows the results of flow cytometry analysis in the activation of RNA nanomachine by L7Ae-K-tur interaction. The results of co-transfecting 2Kt-10bp-7bp (red) or 2mKt-10bp-7bp (blue) RNA nanomachines into HeLa cells in the presence of MS2CP (left) or L7Ae (right) are shown. FIG. 4e shows the measurement result of FRET signal when 2Kt-10bp-7bp or 2mKt-10bp-7bp RNA nanomachine in the presence of MS2CP or L7Ae was cotransfected into HeLa cells. All Cy3 / Cy5 mean intensities were normalized with the Cy3 / Cy5 mean intensities of cells co-transfected with MS2CP mRNA and 2mKt-10bp-7bp. 図５aは、細胞内のカスパーゼ８の凝集を検出するためのタンパク質駆動性RNAナノマシンの模式図を示す。図５bは、各ナノ構造体（1Kt-33bp、3Kt-33bp、6Kt-33bp、9Kt-33bpおよび14Kt-33bp）のL7Ae-caspase-8 mRNA存在下でのAFM像を示す。図５cは、各ナノ構造体（1Kt-33bp、3Kt-33bp、6Kt-33bp、9Kt-33bpおよび14Kt-33bp）およびL7Ae-caspase-8 mRNAをトランスフェクションした細胞の顕微鏡像を示す。図５dは、各ナノ構造体（1Kt-33bp、3Kt-33bp、6Kt-33bp、9Kt-33bpおよび14Kt-33bp）（左図）および対応する変異Ktを有するナノ構造体（右図）を導入した細胞をPacific Blue Annexin V染色した後のフローサイトメトリーで解析結果を示す。図５eは、図５dの結果をK-turnモチーフ数に対する死細胞数のプロットした結果を示す。FIG. 5a shows a schematic diagram of a protein driven RNA nanomachine for detecting intracellular caspase 8 aggregation. FIG. 5b shows an AFM image of each nanostructure (1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bp and 14Kt-33bp) in the presence of L7Ae-caspase-8 mRNA. FIG. 5c shows a micrograph of cells transfected with each nanostructure (1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bp and 14Kt-33bp) and L7Ae-caspase-8 mRNA. FIG. 5d introduces each nanostructure (1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bp and 14Kt-33bp) (left) and the corresponding nanostructure with the mutant Kt (right) The analysis result is shown by flow cytometry after staining cells with Pacific Blue Annexin V. FIG. 5e shows the result of plotting the number of dead cells against the number of K-turn motifs of the result of FIG. 5d. 図６aは、14 K-turn モチーフを有するRNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8の相互作用によって誘導される細胞死を測定した結果を示す。RNA ナノ構造体とmRNAをHeLa細胞にコトランスフェクトし、Pacific Blue Annexin V染色および死細胞染色し、フローサイトメトリーで、Pacific Blue-陽性細胞を死細胞として計数した。図６bは、RNAナノ構造体(14Kt-33bp または14mKt-33bp) とmRNA(L7Ae-caspase-8, L7Ae, または caspase-8)のコトランスフェクション後の細胞の顕微鏡像を示す。FIG. 6a shows the results of measuring cell death induced by the interaction of RNA nanostructures having a 14 K-turn motif and L7Ae-caspase-8. RNA nanostructures and mRNA were co-transfected into HeLa cells, Pacific Blue Annexin V staining and dead cell staining, and Pacific Blue-positive cells were counted as dead cells by flow cytometry. FIG. 6b shows a micrograph of cells after co-transfection of RNA nanostructures (14Kt-33bp or 14mKt-33bp) and mRNA (L7Ae-caspase-8, L7Ae, or caspase-8). 図７aは、2Kt-30bpの構造を示す。図７bは、2Kt-30bp（青）およびL7Ae タンパク質（黄）を含むRNA-タンパク質複合体の三次元モデリング結果を示す。FIG. 7a shows the structure of 2Kt-30bp. FIG. 7b shows the three-dimensional modeling results of an RNA-protein complex containing 2Kt-30bp (blue) and L7Ae protein (yellow). 図８は、2Kt-33bp、2mKt-33bp、2Kt-28bpおよび2mKt-28bpの二重鎖RNANの構造を示す。FIG. 8 shows the structure of double-stranded RNAN of 2Kt-33bp, 2mKt-33bp, 2Kt-28bp and 2mKt-28bp. 図９aは、2Kt-33bp (lane 1-6) または2mKt-33bp (lane 7-12)（左図）もしくは2Kt-28bp (lane 1-6)または2mKt-28bp (lane 7-12)（右図）のL7Aeの存在下でのL7Ae-K-turn相互作用をEMSAで確認した結果を示す。Figure 9a shows 2Kt-33bp (lane 1-6) or 2mKt-33bp (lane 7-12) (left) or 2Kt-28bp (lane 1-6) or 2mKt-28bp (lane 7-12) (right) ) Shows the result of confirming the L7Ae-K-turn interaction by EMSA in the presence of L7Ae. 図１０は、L7Aeの存在下（右図）および非存在下（左図）における2Kt-33bp（上図）および（下図）2Kt-28bpのAFM像を示す。図中スケールバーは、100 nmを示す。FIG. 10 shows AFM images of 2Kt-33bp (upper figure) and 2Kt-28bp in the presence (right figure) and absence (left figure) of L7Ae. The scale bar in the figure indicates 100 nm. 図１１は、biMGA (orginal stem)-2Kt-33bp-U0、biMGA (orginal stem)-2Kt-33bp-U2、biMGA (orginal stem)-2Kt-33bp-U4およびorginal stem部分の二重鎖RNANの構造を示す。FIG. 11 shows the structures of biMGA (orginal stem) -2Kt-33bp-U0, biMGA (orginal stem) -2Kt-33bp-U2, biMGA (orginal stem) -2Kt-33bp-U4, and double-stranded RNAN of the orginal stem part. Indicates. 図１２は、biMGA (orginal stem)-2Kt-28bp-U0、biMGA (orginal stem)-2Kt-28bp-U2、biMGA (orginal stem)-2Kt-28bp-U4およびorginal stem部分の二重鎖RNANの構造を示す。FIG. 12 shows the structure of double-stranded RNAN of biMGA (orginal stem) -2Kt-28bp-U0, biMGA (orginal stem) -2Kt-28bp-U2, biMGA (orginal stem) -2Kt-28bp-U4 and the orginal stem part. Indicates. 図１３は、L7Aeの存在下（白）および非存在下（黒）における、biMGA-結合RNAナノ構造体の各ウリジンリンカーにおける蛍光強度(FI)を測定した結果を示す（上図）。biMGA-2Kt-33bp (四角) およびbiMGA-2Kt-28bp (丸)の各ウリジンリンカーFI (+L7Ae)/FI (-L7Ae)をプロットした結果を示す。FIG. 13 shows the measurement results of the fluorescence intensity (FI) of each uridine linker of the biMGA-bound RNA nanostructure in the presence (white) and absence (black) of L7Ae (upper figure). The result of having plotted each uridine linker FI (+ L7Ae) / FI (-L7Ae) of biMGA-2Kt-33bp (square) and biMGA-2Kt-28bp (circle) is shown. 図１４は、biMGA (stem A)-2Kt-33bp-U0、biMGA (stem B)-2Kt-33bp-U0およびbiMGA (stem C)-2Kt-33bp-U0ならびにstem A、stem Bおよびstem C部分の二重鎖RNANの構造を示す。FIG. 14 shows biMGA (stem A) -2Kt-33bp-U0, biMGA (stem B) -2Kt-33bp-U0 and biMGA (stem C) -2Kt-33bp-U0 and stem A, stem B and stem C parts. The structure of double-stranded RNAN is shown. 図１５は、biMGA (stem D)-2Kt-33bp-U0、biMGA (stem E)-2Kt-33bp-U0およびbiMGA (stem F)-2Kt-33bp-U0ならびにstem D、stem Eおよびstem F部分の二重鎖RNANの構造を示す。FIG. 15 shows biMGA (stem D) -2Kt-33bp-U0, biMGA (stem E) -2Kt-33bp-U0 and biMGA (stem F) -2Kt-33bp-U0 and stem D, stem E and stem F parts. The structure of double-stranded RNAN is shown. 図１６は、7Aeの存在下（白）および非存在下（黒）における、biMGA-結合RNAナノ構造体における各biMGA stem配列のごとの蛍光強度(FI)測定結果を示す。FIG. 16 shows the fluorescence intensity (FI) measurement results for each biMGA stem sequence in the biMGA-binding RNA nanostructure in the presence (white) and absence (black) of 7Ae. 図１７は、biMGA-結合RNAナノ構造体における各biMGA stem配列および各ウリジンリンカーのL7Aeの存在下でのL7Ae-K-turn相互作用をEMSAで確認した結果を示す。FIG. 17 shows the results of EMSA confirming the L7Ae-K-turn interaction in the presence of each biMGA stem sequence and each uridine linker L7Ae in the biMGA-binding RNA nanostructure. 図１８は、L7Aeの存在下（右図）および非存在下（左図）におけるbiMGA-2Kt-33bp（上図）およびbiMGA-2Kt-28bp（下図）のAFM像を示す。図中、スケールバーは、100 nmを示す。FIG. 18 shows AFM images of biMGA-2Kt-33bp (upper figure) and biMGA-2Kt-28bp (lower figure) in the presence (right figure) and absence (left figure) of L7Ae. In the figure, the scale bar indicates 100 nm. 図１９は、2Kt-17bp-4bp、2Kt-17bp-5bp、2Kt-17bp-6bp、2Kt-17bp-7bp、2mKt-17bp-7bpおよび2Kt-17bp-8bpの二重鎖RNANの構造を示す。FIG. 19 shows the structure of double-stranded RNAN of 2Kt-17bp-4bp, 2Kt-17bp-5bp, 2Kt-17bp-6bp, 2Kt-17bp-7bp, 2mKt-17bp-7bp and 2Kt-17bp-8bp. 図２０は、14 K-turn モチーフを有するRNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8をトランスフェクトした際のCasapase-8活性を測定した結果を示す。RNAナノ構造とmRNAをトランスフェクトしたHela細胞のcaspase-8活性は、蛍光発生基質IETD-AMCを用いて測定した。FIG. 20 shows the results of measuring Casapase-8 activity when transfected with RNA nanostructures having a 14 K-turn motif and L7Ae-caspase-8. The caspase-8 activity of Hela cells transfected with RNA nanostructures and mRNA was measured using the fluorogenic substrate IETD-AMC. 図２１は、14 K-turnモチーフを有するRNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8の相互作用によって誘導される細胞死を測定した結果を示す。RNA ナノ構造体 (14Kt-33bpまたは14mKt-33bp)とmRNA(L7Ae, dcasp-8, L7Ae-dcasp-8 (L7Ae-caspase-8), L7Ae-dcasp-8-CS, DED-caspase-8, L7Ae-DED-caspase-8またはL7Ae-DED-caspase-8-CS)をHeLa細胞にコトランスフェクトし、Pacific Blue Annexin V染色および死細胞染色し、フローサイトメトリーで、Pacific Blue-陽性細胞を死細胞として計数した。FIG. 21 shows the results of measurement of cell death induced by the interaction of RNA nanostructure having 14 K-turn motif and L7Ae-caspase-8. RNA nanostructure (14Kt-33bp or 14mKt-33bp) and mRNA (L7Ae, dcasp-8, L7Ae-dcasp-8 (L7Ae-caspase-8), L7Ae-dcasp-8-CS, DED-caspase-8, L7Ae -DED-caspase-8 or L7Ae-DED-caspase-8-CS) is co-transfected into HeLa cells, Pacific Blue Annexin V staining and dead cell staining, and Pacific Blue-positive cells are dead cells by flow cytometry As counted.

以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments. The following embodiments do not limit the present invention.

本発明は、ＲＮＡ−タンパク質複合体および当該ＲＮＡ−タンパク質複合体中のＲＮＡまたはタンパク質に付加された機能的分子の機能を発動するためのＲＮＡ−タンパク質複合体の設計方法を提供する。   The present invention provides an RNA-protein complex and a method for designing an RNA-protein complex for activating the function of a functional molecule added to the RNA or protein in the RNA-protein complex.

本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体の一実施形態は、次の（１）および（２）を含む第一のＲＮＡ−タンパク質複合体である；（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含む２重鎖ＲＮＡであって、当該２重鎖ＲＮＡの両端に機能的分子を有するもの、および（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質。   One embodiment of the RNA-protein complex of the present invention is a first RNA-protein complex comprising the following (1) and (2): (1) 2 comprising two RNA-protein binding motif sequences Heavy-chain RNA having functional molecules at both ends of the double-stranded RNA, and (2) a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence.

また、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体の一実施形態は、次の（１）および（２）を含む第二のＲＮＡ−タンパク質複合体である；（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡ、および（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質との融合タンパク質。   An embodiment of the RNA-protein complex of the present invention is a second RNA-protein complex comprising the following (1) and (2): (1) two RNA-protein binding motif sequences Double-stranded RNA comprising the above, and (2) a fusion protein of a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence and an aggregated protein.

本発明の２重鎖RNAに含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列とは、天然または既知のＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフに含まれるＲＮＡ配列、または試験管内進化法（ｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法）により得られた人工的なＲＮＡ−タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡ配列である。   The RNA-protein binding motif sequence contained in the double-stranded RNA of the present invention is the RNA sequence contained in the binding motif between RNA and protein in a natural or known RNA-protein complex, or in vitro evolution (in vitro selection method) RNA sequence contained in an artificial RNA-protein binding motif obtained by (Method).

天然のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列は、通常、約５〜７０塩基で構成されており、当該配列を有するＲＮＡは、特定のアミノ酸配列を保有するタンパク質と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮＡ／ＲＮＡ．ｈｔｍｌから、所望の構造変化を生ずるモチーフから適宜選択して入手することができる。本実施形態において好ましく用いられるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフは、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲによる構造解析が既に行われているモチーフ、あるいは構造解析がなされている相同タンパク質の立体構造から立体構造を推定可能なモチーフである。さらに、タンパク質がＲＮＡの二次構造及び塩基配列を特異的に認識するモチーフであることがのぞましい。   Natural RNA-protein binding motif sequences are usually composed of about 5 to 70 bases, and an RNA having the sequence is noncovalently bonded to a protein having a specific amino acid sequence, that is, by hydrogen bonding. It is known to form specific bonds. Such natural RNA-protein binding motif sequences can be found in Tables 1 and 2 below and the database available on the website: http: // gibk26. bse. kyutech. ac. jp / jouhou / image / dna-protein / RNA / RNA. From html, it can be obtained by appropriately selecting from motifs that cause a desired structural change. The RNA-protein binding motif preferably used in this embodiment can be estimated from a three-dimensional structure of a motif that has already undergone an X-ray crystal structure analysis or NMR structure analysis, or a homologous protein that has undergone a structural analysis. Motif. Furthermore, it is desirable that the protein is a motif that specifically recognizes the secondary structure and base sequence of RNA.

Figure 2017010568
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Figure 2017010568
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人工のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を含むＲＮＡとは、人工的に設計したＲＮＡ−タンパク質複合体における、２重鎖ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフ中の２重鎖ＲＮＡのいずれか一方に含まれるＲＮＡである。このようなＲＮＡの塩基配列は、通常、約１０〜８０塩基で構成されており、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するように設計する。このような人工的なＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を含むＲＮＡとしては、特定のタンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが例示される。標的となる所望のタンパク質に対して特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、例えば、in vitro selection法またはSELEX法として知られている進化工学的手法により得ることができる。このときのトリガータンパク質は、当該ＲＮＡアプタマーが結合するタンパク質となる。例えば、以下の表３に挙げるＲＮＡの配列が知られており、これらもまた本発明のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列として用いることができる。   An RNA containing an artificial RNA-protein binding motif sequence is an RNA contained in one of the double-stranded RNAs in the binding motif between a double-stranded RNA and a protein in an artificially designed RNA-protein complex. It is. The base sequence of such RNA is usually composed of about 10 to 80 bases, and forms a specific bond with a specific amino acid sequence of a specific protein non-covalently, that is, by hydrogen bonding. Design as follows. An RNA aptamer that specifically binds to a specific protein is exemplified as the RNA containing such an artificial RNA-protein binding motif sequence. An RNA aptamer that specifically binds to a desired target protein can be obtained by, for example, an evolutionary engineering method known as an in vitro selection method or a SELEX method. The trigger protein at this time is a protein to which the RNA aptamer binds. For example, the RNA sequences listed in Table 3 below are known, and these can also be used as sequences forming the RNA-protein binding motif of the present invention.

Figure 2017010568
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本実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列は、対応するタンパク質との解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ〜約１μＭ程度であるものが好ましい。   In the present embodiment, the RNA-protein binding motif sequence preferably has a dissociation constant Kd with the corresponding protein of about 0.1 nM to about 1 μM.

また、これらのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列自体に加え、このような配列の変異体も本発明による当該配列に包含される。本発明でいう変異体とは、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間の解離定数Ｋｄが１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以上高い変異体もしくは１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以下の変異体である。このような変異体は、ＲＮＡ−タンパク質複合体が形成できる限り、適宜選択して用いることができる。また、このような変異体の塩基配列は、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列（正鎖）に対する相補的な配列を有する核酸（相補鎖）とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の塩基配列であってもよい。ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA）に教示されるように、結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、上述のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡの配列と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する塩基配列からなる。かかる変異体は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間で、一定の結合を保持し、ＲＮＡ−タンパク質複合体の形成に寄与することができる。   In addition to the sequences forming these RNA-protein binding motifs themselves, variants of such sequences are also encompassed by the sequences according to the present invention. The mutant referred to in the present invention is a mutation having a dissociation constant Kd of 10%, 20%, 30%, 40% or 50% or more higher than a protein that specifically binds to a sequence forming an RNA-protein binding motif. Body or 10%, 20%, 30%, 40% or 50% or less mutant. Such mutants can be appropriately selected and used as long as an RNA-protein complex can be formed. Moreover, the base sequence of such a mutant can hybridize with a nucleic acid (complementary strand) having a sequence complementary to the sequence (positive strand) forming the RNA-protein binding motif under stringent conditions. A base sequence of a degree may be used. The stringent conditions here are the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to be bound, as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). Can be determined based on For example, as washing conditions after hybridization, the conditions of about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned. The complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions. Although not particularly limited, washing is performed under more severe hybridization conditions such as “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, more strictly “0.1 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” However, the conditions for maintaining the hybridized state between the positive strand and the complementary strand can be mentioned. Specifically, it comprises a base sequence having at least 90%, preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the RNA sequence contained in the above-mentioned RNA-protein binding motif. . Such a mutant can maintain a certain bond with a protein that specifically binds to a sequence that forms an RNA-protein binding motif, and can contribute to the formation of an RNA-protein complex.

本実施形態によるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列の具体的な例としては、Ｌ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｖｏｌ． １２， ｐｐ． ８０７−８１８ （２００４））が結合する配列である、K-turn（Kt） モチーフ（５’−ＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣ−３’/５’−ＧＣＵＣＵＧＡＣＣ−３’）（配列番号１/配列番号２）、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ（配列番号３）、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ２（配列番号４）が挙げられる。Ｌ７Ａｅとの結合活性を保持したK-turn（Kt） モチーフの変異体として５’−ＮＮＣＲＵＧＡＵＮＮＮＮ−３’ /５’−ＮＮＮＮＵＧＡＮＮ−３’（Ｎは任意の塩基を意味し、ＲはＡまたはＧを意味する）の配列が例示され、例えば、５’−ＧＧＣＡＵＧＡＵＧＡＡＣ−３’/５’−ＧＵＵＣＵＧＡＣＣ−３’（配列番号５/配列番号６）、５’−ＡＧＣＧＵＧＡＵＣＧＡＵ−３’/５’−ＡＵＣＧＵＧＡＣＵ−３’（配列番号７/配列番号８）、５’−ＣＧＣＡＵＧＡＵＣＡＧＡ−３’/５’−ＵＣＵＧＵＧＡＣＧ−３’（配列番号９/配列番号１０）、５’−ＵＧＣＡＵＧＡＵＧＣＵＵ−３’/５’−ＡＡＧＣＵＧＡＣＡ−３’（配列番号１１/配列番号１２）、５’−ＵＧＣＡＵＧＡＵＣＵＣＧ−３’/５’−ＣＧＡＧＵＧＡＣＡ−３’（配列番号１３/配列番号１４）、５’−ＧＧＣＧＵＧＡＵＣＡＡＣ−３’/５’−ＧＵＵＧＵＧＡＣＣ−３’（配列番号１５/配列番号１６）、５’−ＵＧＣＧＵＧＡＵＧＡＣＡ−３’/５’−ＵＧＵＣＵＧＡＣＡ−３’（配列番号１７/配列番号１８）、５’−ＣＧＣＡＵＧＡＵＧＧＵＡ−３’/５’−ＵＡＣＣＵＧＡＣＧ−３’（配列番号１９/配列番号２０）、５’−ＡＧＣＡＵＧＡＵＣＡＣＣ−３’/５’−ＧＧＵＧＵＧＡＣＵ−３’（配列番号２１/配列番号２２）、５’−ＡＧＣＧＵＧＡＵＧＵＵＣ−３’/５’−ＧＡＡＣＵＧＡＣＵ−３’（配列番号２３/配列番号２４）、５’−ＧＧＣＡＵＧＡＵＣＣＡＵ−３’/５’−ＡＵＧＧＵＧＡＣＣ−３’（配列番号２５/配列番号２６）、５’−ＡＧＣＡＵＧＡＵＧＵＧＣ−３’/５’−ＧＣＡＣＵＧＡＣＵ−３’（配列番号２７/配列番号２８）および５’−ＵＧＣＧＵＧＡＵＣＵＧＡ−３’/５’−ＵＣＡＧＵＧＡＣＡ−３’（配列番号２９/配列番号３０）が挙げられる。   As a specific example of the sequence forming the RNA-protein binding motif according to the present embodiment, L7Ae (Moore T et al., Structure Vol. 12, pp. 807-818 (2004)) binds. K-turn (Kt) motif (5′-GGCGUGAUGAGC-3 ′ / 5′-GCUCUGACC-3 ′) (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2), kink-loop (SEQ ID NO: 3), kink-loop2 (SEQ ID NO: 4) ). 5'-NNCRUGAUNNNNN-3 '/ 5'-NNNNGANN-3' (N is any base, R is A or G as a mutant of K-turn (Kt) motif that retains L7Ae binding activity. For example, 5′-GGCAUGAUGAAC-3 ′ / 5′-GUUCUGACC-3 ′ (SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6), 5′-AGCGUGAUCGAU-3 ′ / 5′-AUCGUGACU-3 '(SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8), 5'-CGCAUGAUCAGA-3' / 5'-UCUGUGAGCG-3 '(SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10), 5'-UGCAUGAUGCUU-3' / 5'-AAGCUGACA-3 '(SEQ ID NO: 11 / SEQ ID NO: 12), 5'-UGCAUGUAUCUCG-3' / 5'-CGAGGAGACA-3 '(SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 14), 5′-GGCGUGAUCAAC-3 ′ / 5′-GUUGUGACCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 15 / SEQ ID NO: 16), 5′-UGCGUGAUGACA-3 ′ / 5′-UGUCCUGACA-3 ′ (SEQ ID NO: 17) / SEQ ID NO: 18), 5′-CGCAUGAUGGUA-3 ′ / 5′-UACCUGACG-3 ′ (SEQ ID NO: 19 / SEQ ID NO: 20), 5′-AGCAUGAUCACC-3 ′ / 5′-GUGGUGACU-3 ′ (SEQ ID NO: 21) / SEQ ID NO: 22), 5′-AGCGUGAUGUCUC-3 ′ / 5′-GAACUGACU-3 ′ (SEQ ID NO: 23 / SEQ ID NO: 24), 5′-GGCAUGAUCCAU-3 ′ / 5′-AUGUGUACC-3 ′ (SEQ ID NO: 25) / SEQ ID NO: 26) 5′-AGCAUGAUGUGC-3 ′ / 5′-GCACUGACU-3 (SEQ ID NO: 27 / SEQ ID NO: 28) and 5'-UGCGUGAUCUGA-3 '/ 5'-UCAGUGACA-3' (SEQ ID NO: 29 / SEQ ID NO: 30) can be mentioned.

別の具体例としては、ＭＳ２コートタンパク質が特異的に結合する配列であるＭＳ２ステムループモチーフ（22：Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100:125-138）、バチルスのリボソームタンパク質Ｓ１５が結合する配列であるＦｒ１５（24：Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: I. Defining the minimal RNA site. J Mol Biol 261:536-549）が挙げられる。   As another specific example, MS2 stem loop motif (22: Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100: 125-138), Fr15 (24: Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: I. Defining the minimal RNA site J Mol Biol 261: 536-549).

さらなる具体例には、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られているＴｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｃｅｌｌ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．） ｖ９７， ｐｐ．３７１−３８１ （１９９９））が結合する配列である、５’−ＧＧＣＧＵＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＣＡＣＣＡＣＵＧＣＧＣＣ−３’（配列番号３１）、およびその変異体がある。また、癌細胞特異的な内在性タンパク質であるＢｃｌ−２ファミリーＣＥＤ−９由来のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する塩基配列である、Ｒ９−２；５’−ＧＧＧＵＧＣＵＵＣＧＡＧＣＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＣ−３’ （配列番号３２）、およびその変異体、ＮＦ−ｋａｐｐａＢに結合するＲＮＡ配列のアプタマー由来の塩基配列およびその変異体が挙げられる。   A further specific example is an enzyme that performs aminoacylation, which is known to have Threonyl-tRNA synthetase (Cell (Cambridge, Mass.) V97, which binds to its own mRNA and is known to have feedback inhibition that inhibits translation. pp.371-381 (1999)), which is a sequence to which 5′-GGCGUAUGUGAUCUUGUCGUUGGGGUCACCACUGCGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 31), and variants thereof are present. In addition, R9-2; 5′-GGGGUGUCGAGCGUAGGAAGAAAGCCGGGGGGCUGGCAGAUAAUGUAUAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 32), which is a base sequence forming an RNA-protein binding motif derived from Bcl-2 family CED-9, which is an endogenous protein specific to cancer cells , And variants thereof, base sequences derived from aptamers of RNA sequences that bind to NF-kappaB, and variants thereof.

本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡ中のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列は、任意の配列であって良いが、例えば、パリンドローム等の互いに相補的な配列な配列を含まず、ＲＮＡ配列単独で３次構造を取らない配列が良い。   The RNA sequence between the RNA-protein binding motif sequences in the double-stranded RNA contained in the RNA-protein complex of the present invention may be any sequence, for example, a sequence complementary to each other such as a palindrome. A sequence that does not include a sequence and does not take tertiary structure by RNA sequence alone is preferable.

本発明において、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離とは、２重鎖ＲＮＡに含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列の間の塩基対数であり、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列に含まれる２重鎖を形成する部分も当該距離として計数する。ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列として、上述したK-turn（Kt） モチーフ（５’−ＮＮＣＲＵＧＡＵＮＮＮＮ−３’ /５’−ＮＮＮＮＵＧＡＮＮ−３’）を用いる場合、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列の間は、５’−ＮＮＣＲＵＧＡＵ−（Ｎ）ｎ−ＣＲＵＧＡＵＮＮＮＮ−３’として表記され（ｎは整数）、この場合、当該距離は、ｎ+１となる。   In the present invention, the distance between RNA-protein binding motif sequences is the number of base pairs between the RNA-protein binding motif sequences contained in the double-stranded RNA, and the duplexes contained in the RNA-protein binding motif sequences. The part that forms is also counted as the distance. When the above-mentioned K-turn (Kt) motif (5′-NNCRUGAUNNNNN-3 ′ / 5′-NNNNNUGANN-3 ′) is used as the RNA-protein binding motif sequence, the RNA-protein binding motif sequence is 5 ′ -NNCRUGAU- (N) n-CRUGAUNNNNN-3 ', where n is an integer, in which case the distance is n + 1.

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離は、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として保持するため、３３塩基対であることが例示されるが、１１塩基対で３６０°回転することから、１１塩基対および２２塩基対ならびに４４塩基、５５塩基対、およびそれ以上の１１の倍数であっても良い。さらに、２塩基対の増加および減少においても、同等の効果を有する可能性が高いことから、９塩基対から１３塩基対、２０塩基対から２４塩基対、３１塩基対から３５塩基対、４２塩基対から４６塩基対、５３塩基対から５７塩基対が例示される。   The distance between the RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA contained in the first RNA-protein complex of the present invention is 33 base pairs in order to retain the first RNA-protein complex as a triangular structure. Illustratively, since it rotates 360 ° with 11 base pairs, it may be 11 base pairs and 22 base pairs and 44 bases, 55 base pairs, and multiples of 11 more. Furthermore, since it is highly possible that the increase and decrease of 2 base pairs have the same effect, 9 base pairs to 13 base pairs, 20 base pairs to 24 base pairs, 31 base pairs to 35 base pairs, 42 bases Examples include 46 to 50 base pairs and 53 to 57 base pairs.

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離の他の態様として、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ型構造として保持するため、２８塩基対であることが例示されるが、１１塩基対で３６０°回転することから、６塩基対および１７塩基対ならびに３９塩基、５０塩基対、およびそれ以上の１１の倍数＋６塩基対であっても良い。さらに、２塩基対の増加および減少においても、同等の効果を有する可能性が高いことから、４塩基対から８塩基対、１５塩基対から１９塩基対、２６塩基対から３０塩基対、３７塩基対から４１塩基対、４８塩基対から５２塩基対が例示される。   In order to retain the first RNA-protein complex as a Z-shaped structure as another embodiment of the distance between the RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA contained in the first RNA-protein complex of the present invention 28 base pairs, but since it rotates 360 ° with 11 base pairs, it is 6 base pairs and 17 base pairs and 39 bases, 50 base pairs, and multiples of 11 + 6 base pairs. There may be. Further, since it is highly possible that the increase and decrease of 2 base pairs have the same effect, 4 base pairs to 8 base pairs, 15 base pairs to 19 base pairs, 26 base pairs to 30 base pairs, 37 bases Examples are 41 base pairs from pairs and 52 base pairs from 48 base pairs.

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を哺乳細胞に導入することを考慮すると、インターフェロン活性を防ぐため、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が２５塩基対以下であることが好ましい。   In consideration of introducing the first RNA-protein complex of the present invention into a mammalian cell, the distance between RNA-protein binding motif sequences is preferably 25 base pairs or less in order to prevent interferon activity.

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体として、Ｚ型構造と三角形構造の中間の構造を保持させるため、適宜、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列の距離を調整することが可能である。例えば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間が３０塩基対である第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を図７に示す。   Since the first RNA-protein complex of the present invention retains an intermediate structure between the Z-shaped structure and the triangular structure, the distance of the RNA sequence between the RNA-protein binding motif sequences can be adjusted as appropriate. . For example, FIG. 7 shows the structure of a first RNA-protein complex having 30 base pairs between RNA-protein binding motif sequences.

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体として、Ｚ型構造を保持する場合、対応するタンパク質の非存在下において、両側の末端を結合させ、後述する機能的分子を機能的な状態にするために、ループ構造を保持するため、末端に、互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを付加しても良い。ここで、オーバーハングとは、２重鎖構造を有するＲＮＡにおいて、３’末端または５’末端において、突出した１重鎖構造を付加された状態を意味する。   In the case where the first RNA-protein complex of the present invention retains the Z-type structure, the functional molecules described later are put into a functional state by binding both ends in the absence of the corresponding protein. Furthermore, in order to maintain the loop structure, an overhang of 6 base pairs or more that are complementary strands may be added to the ends. Here, the overhang means a state in which a protruding single-stranded structure is added at the 3 'end or 5' end in RNA having a double-stranded structure.

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡの３’末端および５’末端は、機能的分子を付加されている。本発明において、機能的分子とは、呈色、蛍光、発光、他分子への特異的結合、分子間の特異的結合阻害、酵素活性、酵素活性阻害などを可能とする分子であり、当該分子は、低分子化合物であっても良く、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質と言った生体内で機能する高分子であってもよい。例えば、蛍光色素、抗体、ＲＮＡ干渉、ＲＮＡアプタマーが例示される。   A functional molecule is added to the 3 'end and 5' end of the double-stranded RNA of the first RNA-protein complex of the present invention. In the present invention, a functional molecule is a molecule that enables coloration, fluorescence, luminescence, specific binding to other molecules, specific binding inhibition between molecules, enzyme activity, enzyme activity inhibition, and the like. May be a low-molecular compound or a polymer that functions in vivo, such as DNA, RNA, or protein. Examples include fluorescent dyes, antibodies, RNA interference, and RNA aptamers.

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡの３’末端および５’末端へ付加する機能的分子は、３’末端へ付加された分子と５’末端へ付加された分子が、互いに相互作用することで当該機能を発揮することが好ましい。ＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として設計した場合、対応するタンパク質の存在下では、当該機能を発揮するが、対応するタンパク質の非存在下では、当該機能を発揮できないため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮を制御することが可能となる。一方、ＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ型構造として設計した場合、対応するタンパク質の存在下では、当該機能を発揮しないが、対応するタンパク質の非存在下では、当該機能を発揮するため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮を制御することが可能となる。   The functional molecules added to the 3 ′ end and 5 ′ end of the double-stranded RNA of the first RNA-protein complex of the present invention include molecules added to the 3 ′ end and molecules added to the 5 ′ end. It is preferable to exhibit the function by interacting with each other. When an RNA-protein complex is designed as a triangular structure, the function is exhibited in the presence of the corresponding protein, but the function cannot be exhibited in the absence of the corresponding protein. Alternatively, the presence of the function can be controlled by the absence. On the other hand, when the RNA-protein complex is designed as a Z-type structure, it does not exhibit the function in the presence of the corresponding protein, but does not exhibit the function in the absence of the corresponding protein. It is possible to control the performance of the function by the presence or absence of.

一つの態様として、機能的分子として蛍光色素を用いる場合、５’末端と３’末端には、蛍光共鳴エネルギー移動が起きる蛍光色素を付加することが例示される。このような蛍光色素として、Cy3およびCy5が例示される。この場合、ＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、Cy3とCy5が相互作用し、蛍光共鳴エネルギー移動が起きるが、対応するタンパク質の非存在下では、蛍光共鳴エネルギー移動が起きないため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（蛍光共鳴エネルギー移動）を制御することが可能となる。一方、ＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ形構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、Cy3とCy5が相互作用せず、蛍光共鳴エネルギー移動が起きないが、対応するタンパク質の非存在下では、Cy3とCy5が相互作用して、蛍光共鳴エネルギー移動が起きるため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（蛍光共鳴エネルギー移動）を制御することが可能となる。   As one embodiment, when a fluorescent dye is used as a functional molecule, a fluorescent dye that causes fluorescence resonance energy transfer is added to the 5 'end and the 3' end. Examples of such fluorescent dyes include Cy3 and Cy5. In this case, when the RNA-protein complex is designed as a triangular structure, Cy3 and Cy5 interact in the presence of the corresponding protein to cause fluorescence resonance energy transfer, but in the absence of the corresponding protein, fluorescence resonance Since energy transfer does not occur, the function (fluorescence resonance energy transfer) can be controlled by the presence or absence of the corresponding protein. On the other hand, when the RNA-protein complex is designed as a Z-shaped structure, Cy3 and Cy5 do not interact and fluorescence resonance energy transfer does not occur in the presence of the corresponding protein, but in the absence of the corresponding protein, Since Cy3 and Cy5 interact to cause fluorescence resonance energy transfer, the function (fluorescence resonance energy transfer) can be controlled by the presence or absence of the corresponding protein.

他の態様として、機能分子としてＲＮＡアプタマーを用いる場合、当該ＲＮＡアプタマーのセンス鎖を５’末端へ付加し、アンチセンス鎖を３’末端へ付加する態様が例示される。このようなＲＮＡアプタマーとして、malachite green aptamerが挙げられ、５’末端へ配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６から成る群より選択されるいずれか一つの配列を付加し、３’末端へ配列番号４５、４７、４９、５１、５３、５５および５７から成る群より選択されるいずれか一つの配列を付加することが例示される。この場合、ＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されるが、対応するタンパク質の非存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されないため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（ＲＮＡアプタマーとしての結合能）を制御することが可能となる。一方、ＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されないが、対応するタンパク質の非存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されるため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（ＲＮＡアプタマーとしての結合能）を制御することが可能となる。   As another embodiment, when an RNA aptamer is used as a functional molecule, an embodiment in which the sense strand of the RNA aptamer is added to the 5 'end and the antisense strand is added to the 3' end is exemplified. Such an RNA aptamer includes malachite green aptamer, and any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 50, 52, 54 and 56 is added to the 5 ′ end, and 3 It is exemplified to add any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 45, 47, 49, 51, 53, 55 and 57 to the end. In this case, when the RNA-protein complex is designed as a triangular structure, an RNA aptamer is formed in the presence of the corresponding protein, but no RNA aptamer is formed in the absence of the corresponding protein. It is possible to control the function (binding ability as an RNA aptamer) by the presence or absence of. On the other hand, when an RNA-protein complex is designed as a Z structure, an RNA aptamer is not formed in the presence of the corresponding protein, but an RNA aptamer is formed in the absence of the corresponding protein. By making it exist or not present, it becomes possible to control the function (binding ability as an RNA aptamer).

本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる二重鎖ＲＮＡの両端に上述の通り付加された機能的分子の相互作用は、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって制御することができる。従って、本発明は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで、当該機能的分子の相互作用を制御する方法を提供する。当該方法に用いられるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡは、上述した第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡである。   The interaction of the functional molecules added as described above to both ends of the double-stranded RNA contained in the first RNA-protein complex of the present invention is controlled by the presence or absence of the corresponding protein. Can do. Therefore, the present invention binds a double-stranded RNA having two RNA-protein binding motif sequences and having a functional molecule at both ends and a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence, thereby binding the functional molecule. Provide a method for controlling the interaction of. The double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences used in the method is a double-stranded RNA contained in the first RNA-protein complex described above.

当該第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の機能的分子の相互作用の制御において、２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を調整することで、対応するタンパク質の存在下において、相互作用を正の制御または負の制御することができる。本発明において、正の制御とは、２重鎖ＲＮＡの両端に付加された機能的分子の相互作用が起きることを意味し、同様に、負の制御とは、同機能的分子の相互作用が停止することを意味する。本発明において、機能的分子の相互作用とは、例えば、上述したとおり、機能的分子が蛍光色素の場合、蛍光共鳴エネルギー移動であり、機能的分子がＲＮＡアプタマーの場合、相補鎖の結合によるＲＮＡアプタマーの形成を意味する。   In controlling the interaction of the functional molecules of the first RNA-protein complex, the interaction between the RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA is adjusted in the presence of the corresponding protein. Can be positively controlled or negatively controlled. In the present invention, positive control means that the interaction of functional molecules added to both ends of the double-stranded RNA occurs, and similarly, negative control means that the interaction of functional molecules is the same. Means to stop. In the present invention, the functional molecule interaction is, for example, as described above, fluorescence resonance energy transfer when the functional molecule is a fluorescent dye, and RNA due to binding of complementary strands when the functional molecule is an RNA aptamer. It means the formation of aptamer.

第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成させた場合、相互作用を正に制御することができる。   The distance between the RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA of the first RNA-protein complex is changed from 20 base pairs to 24 base pairs, or 31 base pairs to 35 base pairs, or 42 base pairs to 46 base pairs. Thus, when the RNA-protein complex is formed, the interaction can be positively controlled.

一方、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成させた場合、相互作用を負に制御することができる。   On the other hand, the distance between the RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA of the first RNA-protein complex is 15 base pairs to 19 base pairs, or 26 base pairs to 30 base pairs, or 37 base pairs to 41 bases. By forming a pair, the interaction can be negatively controlled when the RNA-protein complex is formed.

本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質は、被凝集タンパク質との融合タンパク質であり、融合タンパク質とは、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質とがリンカー等を介して結合した単一のタンパク質であることを意味する。   The protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence contained in the second RNA-protein complex of the present invention is a fusion protein with the aggregated protein, and the fusion protein binds to the RNA-protein binding motif sequence. It means that the protein and the aggregated protein are a single protein bound via a linker or the like.

本発明において、被凝集タンパク質とは、凝集することによって機能を発揮するタンパク質を意味し、例えば、アポトーシス制御タンパク質、プリオンタンパク質、カスパーゼ9、カスパーゼ８、アミロイドβ、タウ、ポリグルタミンタンパク質（Gatchel JR, Zoghbi HY. Nat Rev Gene 6, 743-755, 2005）またはこれらのタンパク質の断片、ならびにApoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain（ASC）（Hara H, et al, Nat Immunol. 14, 1247-55, 2013）などが挙げられる。   In the present invention, the aggregated protein means a protein that exhibits a function by aggregation, and includes, for example, apoptosis control protein, prion protein, caspase 9, caspase 8, amyloid β, tau, polyglutamine protein (Gatchel JR, Zoghbi HY. Nat Rev Gene 6, 743-755, 2005) or fragments of these proteins, as well as Apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain (ASC) (Hara H, et al, Nat Immunol. 14, 1247- 55, 2013).

本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列の距離は特に限定されないが、例えば、１５塩基対から５２塩基対が例示される。対応するタンパク質が結合したＲＮＡ−タンパク質複合体において三角形様の構造を基盤とする繰り返し構造を呈することが、好ましく、従って、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列の距離として、９塩基対から１３塩基対、２０塩基対から２４塩基対、３１塩基対から３５塩基対、４２塩基対から４６塩基対、５３塩基対から５７塩基対が例示される。   The distance of the RNA sequence between the RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA contained in the second RNA-protein complex of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include 15 to 52 base pairs. . It is preferable that the RNA-protein complex to which the corresponding protein is bound to exhibit a repeating structure based on a triangle-like structure, and therefore the distance of the RNA sequence between the RNA-protein binding motif sequences is from 9 base pairs to 13 Examples include base pairs, 20 base pairs to 24 base pairs, 31 base pairs to 35 base pairs, 42 base pairs to 46 base pairs, and 53 base pairs to 57 base pairs.

被凝集タンパク質とＲＮＡ−タンパク質複合体に対応するタンパク質との融合タンパク質は、本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体を存在させるまたは存在さないことによって当該非凝集タンパク質の凝集を制御することができる。従って、本発明は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を結合させることで、被凝集タンパク質の凝集を制御する方法を提供する。当該方法に用いられるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡは、上述した第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡである。   The fusion protein of the aggregated protein and the protein corresponding to the RNA-protein complex may control the aggregation of the non-aggregated protein by the presence or absence of the second RNA-protein complex of the present invention. it can. Therefore, the present invention binds a double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences, a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence, and a protein fused with the aggregated protein, thereby allowing the aggregated protein to bind. A method of controlling aggregation of The double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences used in the method is a double-stranded RNA contained in the second RNA-protein complex described above.

被凝集タンパク質を多く凝集させることによって、当該機能を発揮させるために、本発明の被凝集タンパク質の凝集を制御する方法に用いられる２重鎖ＲＮＡはＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含むことが好ましく、例えば、９つまたは１４個が挙げられる。   The double-stranded RNA used in the method for controlling the aggregation of the aggregated protein of the present invention in order to exert the function by aggregating many aggregated proteins contains 9 or more RNA-protein binding motif sequences. Are preferable, for example, 9 or 14 may be mentioned.

本発明における、２重鎖ＲＮＡは、細胞毒性を低減させるため、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５−メチルシチジンなどの修飾塩基に置き換えても良い。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。   In order to reduce cytotoxicity, the double-stranded RNA in the present invention may be replaced with a modified base such as pseudouridine or 5-methylcytidine instead of ordinary uridine or cytidine. The positions of the modified bases can be all or part of the uridine and cytidine independently, and if they are part of the base, they can be random positions at an arbitrary ratio.

以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The following examples do not limit the invention.

＜DNAおよびRNAの調製＞
すべてのＤＮＡテンプレートは、Greiner Japanより購入した。インビトロトランスクリプションに使用するＤＮＡテンプレートは、KOD-plus DNAポリメラーゼ（Toyobo）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製した。すべてのＲＮＡは、MEGAshortscript キット（Amibion）によって転写した。転写ＲＮＡは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製した。ＲＮＡの回収後、ＲＮＡ濃度をNanoDrop （Thermo Scienctific）によって測定した。本実施例に用いたＲＮＡ配列を表４に示す。2mKt-33bp、2mKt-28bpおよび2mKt-17bp-7bp中の変異K-turnは、long鎖において、表４中のmKtに適宜置き換えて作製した。また、biMGA-original stem、biMGA-stem A、biMGA-stem B、biMGA-stem C、biMGA-stem D、biMGA-stem EおよびbiMGA-stem Fを有するbiMGA-2Kt-28bpは、short鎖において、表４中の各stemに適宜置き換えて作製した。生細胞に導入するRNAナノマシン(1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bp, 14Kt-33bpと1mKt-33bp, 3mKt-33bp, 6mKt-33bp, 9mKt-33bp, 14mKt-33bp) 及びmRNAを調整する際には、は、免疫応答を低減させるため、転写の際にウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、それぞれシュードウリジン−5’ −三リン酸及びメチルシチジン−5’−三リン酸(TriLink BioTechnologies)を用いて調整を行った。<Preparation of DNA and RNA>
All DNA templates were purchased from Greiner Japan. The DNA template used for in vitro transcription was prepared by polymerase chain reaction (PCR) using KOD-plus DNA polymerase (Toyobo). All RNA was transcribed with MEGAshortscript kit (Amibion). Transcribed RNA was purified by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). After RNA recovery, RNA concentration was measured by NanoDrop (Thermo Scienctific). The RNA sequences used in this example are shown in Table 4. Mutant K-turns in 2mKt-33bp, 2mKt-28bp and 2mKt-17bp-7bp were prepared by appropriately replacing mKt in Table 4 in the long chain. In addition, biMGA-2Kt-28bp having biMGA-original stem, biMGA-stem A, biMGA-stem B, biMGA-stem C, biMGA-stem D, biMGA-stem E and biMGA-stem F, 4 were prepared by appropriately replacing each of the stems. RNA nanomachines (1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bp, 14Kt-33bp and 1mKt-33bp, 3mKt-33bp, 6mKt-33bp, 9mKt-33bp, 14mKt-33bp) and mRNA introduced into living cells In order to reduce the immune response, the uridine triphosphate and cytidine triphosphate were replaced with pseudouridine-5′-triphosphate and methylcytidine-5′- Adjustments were made using triphosphate (TriLink BioTechnologies).

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＜RNAのCy3および Cy5のラベル化＞
Cy3または Cy5でラベルされたＲＮＡを、T4 RNAリガーゼ（Ambion）およびpCp-Cy3 (Jena Bioscience) または pCp-Cy5 (Jena Bioscience)を使用したライゲーションによって調製した。Cy3または Cy5のラベル化は、１０μｌの１０％（v/v）DMSO中、１０ＵのT4 RNAリガーゼ、３nmolのpCp-Cy3 または pCp-Cy5と、１５０pmolのＲＮＡを１６℃で３６〜４８時間混合した。Cy3またはCy5ラベルＲＮＡをRNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)で精製した。ＲＮＡの回収後、Cy3 または Cy5およびＲＮＡ濃度をNanoDrop (Thermo Scienctific)で測定した。<Labeling of Cy3 and Cy5 of RNA>
Cy3 or Cy5 labeled RNA was prepared by ligation using T4 RNA ligase (Ambion) and pCp-Cy3 (Jena Bioscience) or pCp-Cy5 (Jena Bioscience). Cy3 or Cy5 labeling was performed by mixing 10 U of T4 RNA ligase, 3 nmol of pCp-Cy3 or pCp-Cy5 and 150 pmol of RNA at 16 ° C. for 36-48 hours in 10 μl of 10% (v / v) DMSO. . Cy3 or Cy5 labeled RNA was purified with RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen). After RNA recovery, Cy3 or Cy5 and RNA concentrations were measured with NanoDrop (Thermo Scienctific).

＜電気泳動移動度シフト解析（EMSA）＞
1.5 mM MgCl2 および 150 mM KClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)中、L-RNA および S-RNA (各50 nM)の混合液を８０℃で３分間加熱した後、室温で１０分間冷却した。L7Ae (100, 300, および 600 nM)を添加した後、混合液を室温で１０〜３０分インキュベートした。該混合液を10×添加液（0.25% ブロモフェノールブルー、30% グリセロール）と混合し、室温で0.5×Tris/Borate/EDTA 緩衝液を使用した未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをSYBR I および II (Lonza)で10分間染色した。Gel Doc EZ Image(画像）r (BIO-RAD) または Typhoon FLA-7000 laser scanner (GE Healthcare)を使用してゲル画像を得た。<Electrophoretic mobility shift analysis (EMSA)>
A mixture of L-RNA and S-RNA (50 nM each) in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.5 mM MgCl 2 and 150 mM KCl was heated at 80 ° C. for 3 minutes, then at room temperature for 10 minutes. Cooled for minutes. After adding L7Ae (100, 300, and 600 nM), the mixture was incubated at room temperature for 10-30 minutes. The mixture was mixed with 10 × additive solution (0.25% bromophenol blue, 30% glycerol), and subjected to native polyacrylamide gel electrophoresis using 0.5 × Tris / Borate / EDTA buffer at room temperature. The gel after electrophoresis was stained with SYBR I and II (Lonza) for 10 minutes. Gel images were obtained using Gel Doc EZ Image r (BIO-RAD) or Typhoon FLA-7000 laser scanner (GE Healthcare).

＜高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)＞
RNA および RNPのナノ構造体は、溶液中で観察された。本サンプルは、EMSAにおいて記載した通りに調製した。ばね定数約0.1 N/m、および水中約300-600 kHz 、気中約1500 kHzの共振振動数で、スモールカンチレバー（small cantilevers）(長さ9 μm , 幅2 μm and厚さ130 nm ; BL-AC10DS, Olympus, Tokyo, Japan)およびHS-AFM (Nano Live Vision, Research Institute of Biomolecules Metrology Co.)を使用してAFM画像を得た。シャーププローブを各カンチレバーに置き、Nano- tools instrument (Munich)を用いた電子ビーム蒸着を使用した。0.2-1.0フレーム/秒 (fps)の走査速度で320 × 240ピクセル画像を得た。新しいマイカ表面を0.1% APTES (3-aminopropyltriethoxy silane)で被覆した。本サンプル（600 nM タンパク質がある場合とない場合における50 nM RNA ナノ構造体）をRNP binding buffer中で調製し、AFM observation buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), および 10 mM MgCl2)で10倍希釈した。その後、室温で5分間マイカにアプライして緩衝液で洗浄した。画像シーケンスは、Image(画像）J および WSxM softwareで解析した。<High-speed atomic force microscope (HS-AFM)>
RNA and RNP nanostructures were observed in solution. This sample was prepared as described in EMSA. Small cantilevers (length 9 μm, width 2 μm and thickness 130 nm; spring constant about 0.1 N / m, underwater about 300-600 kHz and about 1500 kHz in the air, BL- AFM images were obtained using AC10DS, Olympus, Tokyo, Japan) and HS-AFM (Nano Live Vision, Research Institute of Biomolecules Metrology Co.). A sharp probe was placed on each cantilever and electron beam evaporation using a Nano-tool instrument (Munich) was used. A 320 x 240 pixel image was obtained at a scan rate of 0.2-1.0 frames per second (fps). A new mica surface was coated with 0.1% APTES (3-aminopropyltriethoxy silane). Prepare this sample (50 nM RNA nanostructure with and without 600 nM protein) in RNP binding buffer and add 10% with AFM observation buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.6) and 10 mM MgCl2). Diluted twice. Thereafter, it was applied to mica for 5 minutes at room temperature and washed with a buffer solution. Image sequences were analyzed with Image J and WSxM software.

＜蛍光共鳴エネルギー移動解析＞
Cy3- および Cy5-標識ＲＮＡ（各50 nM）を80℃で3分間加熱し、1.5 mM MgCl2および150 mM KClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)中で室温10分間冷却した。タンパク質緩衝液（20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)、1.5 mM MgCl2、150 mM KCl、40% グリセロール）またはL7Ae (600 nM)および0.1% tween-20を混合液に添加し、室温で10〜30分間インキュベートした。励起波長は512 nmであり、放出および励起バンド幅は10 nmであった。蛍光測定はInfinite M1000 Plate-Reader (TECAN)を用いて行った。<Fluorescence resonance energy transfer analysis>
Cy3- and Cy5-labeled RNA (50 nM each) were heated at 80 ° C. for 3 minutes and cooled in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.5 mM MgCl 2 and 150 mM KCl for 10 minutes at room temperature. Add protein buffer (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1.5 mM MgCl 2 , 150 mM KCl, 40% glycerol) or L7Ae (600 nM) and 0.1% tween-20 to the mixture and add 10% at room temperature. Incubated for ~ 30 minutes. The excitation wavelength was 512 nm and the emission and excitation bandwidth was 10 nm. Fluorescence measurement was performed using Infinite M1000 Plate-Reader (TECAN).

＜バイナリーマラカイトグリーンアプタマー(biMGA)の蛍光測定＞
biMGA-結合RNA ナノ構造体 (100 nM)を80℃で3分間加熱し、1.5 mM MgCl2および150 mM KClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)中で室温10分間冷却した。マラカイトグリーン(2 μM)、タンパク質緩衝液（20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)、1.5 mM MgCl2、150 mM KCl、40% グリセロール）またはL7Ae (600 nM)および0.1% tween-20を混合液に添加し、室温で10〜30分間インキュベートした。励起波長は610 nmであり、放出および励起バンド幅はそれぞれ10および20 nmであった。蛍光測定はInfinite M1000 Plate-Reader (TECAN)を用いて行った。<Fluorescence measurement of binary malachite green aptamer (biMGA)>
The biMGA-bound RNA nanostructure (100 nM) was heated at 80 ° C. for 3 minutes and cooled in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.5 mM MgCl 2 and 150 mM KCl for 10 minutes at room temperature. Malachite green (2 μM), protein buffer (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1.5 mM MgCl 2 , 150 mM KCl, 40% glycerol) or L7Ae (600 nM) and 0.1% tween-20 And incubated for 10-30 minutes at room temperature. The excitation wavelength was 610 nm and the emission and excitation bandwidths were 10 and 20 nm, respectively. Fluorescence measurement was performed using Infinite M1000 Plate-Reader (TECAN).

＜細胞培養＞
HeLa細胞を、5% CO2下37℃の、10% ウシ胎児血清(Japan Bio Serum)、可欠アミノ酸(Invitrogen)、ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、およびAntibiotic Antimycotic solution (Sigma)を含む、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）高グルコース(Nacalai tesque)で培養した。<Cell culture>
HeLa cells, of under 5% CO 2 37 ° C., 10% fetal bovine serum (Japan Bio Serum), including non-essential amino acids (Invitrogen), sodium pyruvate (Sigma), and Antibiotic Antimycotic solution (Sigma), Dulbecco's strange Cultured in high Eagle medium (DMEM) high glucose (Nacalai tesque).

＜ＲＮＡトランスフェクションおよびフローサイトメトリー解析＞
5×104の細胞を１２ウエルプレートに播種した。24時間培養後、ＲＮＡナノマシン(8 pmol)およびmRNA (500 ng)を2 μLのStem Fect (STEMGENT)を使用して細胞にコトランスフェクトした。2時間後培地を交換した。トランスフェクションの12時間後に細胞をPBSで洗浄し、37℃で3分間、200 μLの0.25% Tripsin-EDTA (Nacalai tesque)中でインキュベートした。2%ウシ胎児血清を含むダルベッコPBSを100 μL添加した後、FACSAria セルソーター(BD Bioscience)で細胞を解析した。Cy3蛍光を検出するために、532 nmレーザーおよび575/25 nm光学フィルタを使用した。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に帰するCy5蛍光を検出するために、532 nmレーザーおよび670/30 nm光学フィルタを使用した。フローサイトメトリー解析において、FSCに対するSSCのドットプロットを用いて死細胞を除去した。Cy3およびCy5の蛍光強度比の平均を計算することによって、ＲＮＡナノマシンの発動によるFRETシグナル変化を評価した。得られた平均値は、MS2CP mRNAおよび2mKt-10bp-7bpでトランスフェクトしたネガティブコントロール細胞の平均値によって標準化した。<RNA transfection and flow cytometry analysis>
5 × 10 4 cells were seeded in 12 well plates. After 24 hours of culture, RNA nanomachines (8 pmol) and mRNA (500 ng) were cotransfected into the cells using 2 μL Stem Fect (STEMGENT). After 2 hours, the medium was changed. Cells were washed with PBS 12 hours after transfection and incubated in 200 μL of 0.25% Tripsin-EDTA (Nacalai tesque) for 3 minutes at 37 ° C. After adding 100 μL of Dulbecco's PBS containing 2% fetal bovine serum, the cells were analyzed with a FACSAria cell sorter (BD Bioscience). A 532 nm laser and a 575/25 nm optical filter were used to detect Cy3 fluorescence. A 532 nm laser and a 670/30 nm optical filter were used to detect Cy5 fluorescence attributed to fluorescence resonance energy transfer (FRET). In flow cytometry analysis, dead cells were removed using a dot plot of SSC against FSC. By calculating the average of the fluorescence intensity ratio of Cy3 and Cy5, the change in FRET signal due to the activation of RNA nanomachine was evaluated. The average value obtained was normalized by the average value of negative control cells transfected with MS2CP mRNA and 2mKt-10bp-7bp.

＜細胞死測定アッセイ＞
5×104個の細胞を24-well platesに播種し、24時間培養後、RNA nanostructures (0.1 pmol)およびmRNA (10 ng)を1 μLのStem Fect (STEMGENT)を用いて、細胞に共導入した。2時間後、培地を交換した。細胞の形態分析は、RNA導入後２４時間後に行った。培養上清および細胞を回収し、Pacific Blue-labeled Annexin V (Life Technologies)を用いて染色した。死細胞は、必要に応じて、SYTOX AADvanced Dead Cell stain (Life Technologies)で追加染色した。染色された細胞は、FACSAria cell sorter (BD Bioscience)を用いて解析した。405 nmおよび488 nmのレーザーでそれぞれPacific BlueおよびSYTOX AADvanced Dead Cell stainの励起に用いた。450/50 nmおよび660/20 nmの光学フィルタを用いて、それぞれPacific BlueおよびSYTOX AADvanced Dead Cell stainを検出した。Pacific Blueの高い蛍光強度細胞を有する細胞を、アポトーシスおよび死細胞として計数した。<Cell death assay>
5 × 10 4 cells are seeded in 24-well plates, cultured for 24 hours, and then co-introduced into the cells using 1 μL Stem Fect (STEMGENT) of RNA nanostructures (0.1 pmol) and mRNA (10 ng) did. After 2 hours, the medium was changed. Cell morphology analysis was performed 24 hours after RNA introduction. Culture supernatants and cells were collected and stained using Pacific Blue-labeled Annexin V (Life Technologies). Dead cells were additionally stained with SYTOX AADvanced Dead Cell stain (Life Technologies) as needed. Stained cells were analyzed using a FACSAria cell sorter (BD Bioscience). 405 nm and 488 nm lasers were used to excite Pacific Blue and SYTOX AADvanced Dead Cell stain, respectively. Pacific Blue and SYTOX AADvanced Dead Cell stain were detected using 450/50 nm and 660/20 nm optical filters, respectively. Cells with Pacific Blue high fluorescence intensity cells were counted as apoptotic and dead cells.

［実施例１］＜タンパク質作動性のRNAナノマシンのデザインと構築＞
RNAナノマシンを構築するため、２つのL7Ae-K-turn相互モチーフを含む2種類のRNPナノ構造体をデザインした(図１a)。K-turnモチーフは、L7Aeとの結合がない状態においては、柔軟な立体構造を取るが、L7Ae-K-turn相互作用により、K-turnモチーフにおいて約60℃で屈曲することで立体構造の変化を引き起こす。3回転および2.5回転のらせん回転に対応するように33塩基対、30塩基対および28塩基対の3つの二重鎖RNAの間に2つのK-turnモチーフを設置した(それぞれ、2Kt-33bp、2Kt-30bpおよび2Kt-28bpと言う)（図１a、図７および図８）。2Kt-33bpおよび2Kt-28bpは、L7Ae導入により立体配座変化を引き起こし、それぞれ、三角形およびZ型構造を形成するようデザインされた。また、2Kt-30bpは、その中間の構造を示すことが想定された。RNAナノマシンは、互いに相互作用する長鎖（L鎖：K-turmモチーフにおいて長い）と短鎖（S鎖：K-turmモチーフにおいて短い）から成る。Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)によって、2Kt-33bpおよび2Kt-28bpのL7Ae-K-turn相互作用を調べた。この二つのRNAナノマシンは、濃度依存的に2つのバンドが呈されL7Aeと相互作用することが確認された(図２a)。一方、2つのK-turnに変異体を有するRNAナノ構造体(2mKt-33bpおよび2mKt-28bp)（図８）では、L7Aeの存在下においてもこのようなバンドシフトは見られなかった(図９)。これらの結果は、2つのK-turnモチーフにL7Aeが特異的に結合することによって、RNPナノ構造体が形成されたことを示唆している。続いて、Cy3およびCy5をラベルした2Kt-33bpを用いてForster resonance energy-transfer (フェルスター共鳴エネルギー移動、FRET)によりL7Aeによる2Kt-33bpの構造変化を確認した。2Kt-33bpのＬ鎖およびＳ鎖の3'末端をそれぞれCy3およびCy5でラベルした。L7Aeの存在下および非存在下においてCy3およびCy5でラベルした2Kt-33bpの蛍光スペクトルを測定した。その結果、L7Aeの存在下では、565 nm (F565)のCy3シグナルの減弱および665 nm (F665)のCy5でシグナルの増加が確認された(図２b左図)。一方、Cy3およびCy5ラベルした2mKt-33bpでは、L7Aeによって蛍光スペクトルの影響は確認されなかった(図２b右図)。2mKt-33bpでは、シグナル比(F665/F565)の変化はなかったが、2Kt-33bpでのシグナル比(F665/F565)は、ＲＮＰ形成前後で1.4倍の増加が見られた。以上の結果より、L7Ae-K-turn相互作用に起因する構造変化によってFRETが惹起されることが示された。[Example 1] <Design and construction of protein-operated RNA nanomachine>
To construct RNA nanomachines, two types of RNP nanostructures containing two L7Ae-K-turn mutual motifs were designed (FIG. 1a). The K-turn motif takes a flexible three-dimensional structure in the absence of L7Ae binding, but changes in the three-dimensional structure by bending at about 60 ° C in the K-turn motif due to the L7Ae-K-turn interaction. cause. Two K-turn motifs were placed between 3 double-stranded RNAs of 33, 30 and 28 base pairs to correspond to 3 and 2.5 helical turns (2Kt-33bp, respectively) 2Kt-30bp and 2Kt-28bp) (FIGS. 1a, 7 and 8). 2Kt-33bp and 2Kt-28bp were designed to cause conformational changes upon introduction of L7Ae, forming triangular and Z-shaped structures, respectively. In addition, 2Kt-30bp was assumed to show an intermediate structure. RNA nanomachines consist of long chains that interact with each other (L chain: long in the K-turm motif) and short chains (S chain: short in the K-turm motif). The 2Kt-33bp and 2Kt-28bp L7Ae-K-turn interactions were examined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). It was confirmed that these two RNA nanomachines interacted with L7Ae with two bands depending on the concentration (Fig. 2a). On the other hand, in the RNA nanostructures (2mKt-33bp and 2mKt-28bp) having mutants in two K-turns (FIG. 8), such a band shift was not observed even in the presence of L7Ae (FIG. 9). ). These results suggest that the RNP nanostructure was formed by the specific binding of L7Ae to the two K-turn motifs. Subsequently, structural change of 2Kt-33bp by L7Ae was confirmed by Forster resonance energy-transfer (Ferster resonance energy transfer, FRET) using 2Kt-33bp labeled with Cy3 and Cy5. The 3 'ends of the 2Kt-33bp L and S chains were labeled with Cy3 and Cy5, respectively. The fluorescence spectrum of 2Kt-33bp labeled with Cy3 and Cy5 was measured in the presence and absence of L7Ae. As a result, in the presence of L7Ae, attenuation of Cy3 signal at 565 nm (F 565 ) and increase in signal at Cy5 of 665 nm (F 665 ) were confirmed (the left figure in FIG. 2b). On the other hand, in the case of 2mKt-33bp labeled with Cy3 and Cy5, the influence of the fluorescence spectrum was not confirmed by L7Ae (the right figure in FIG. 2b). In 2mKt-33bp, while the change in signal ratio (F 665 / F 565) was not, signal ratio (F 665 / F 565) in the 2kT-33 bp, 1.4 fold increase before and after RNP formation was observed. From the above results, it was shown that FRET is induced by the structural change caused by the L7Ae-K-turn interaction.

RNAナノマシンの構造変化を観察するため、2Kt-33bpおよび2Kt-28bpへのL7Aeの添加前後で高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)にて解析した（図２cおよびd）。L7Aeの非存在下では、2Kt-33bpおよび2Kt-28bpは、不均一なRNA構造を示したが、L7Aeの存在下では、単一の構造を示した。2Kt-33bpおよび2Kt-28bpは、L7Ae導入により立体配座変化を引き起こし、それぞれ、三角形およびZ型構造を形成するようデザインされていることから(図２c、図２dおよび図１０)、AFMを用いて、末端間の距離を測定した(図２eおよびf)。L7Aeの非存在下において、2Kt-33bpでの当該距離は、2つのK-turnモチーフに柔軟性があることから、10-44 nmに分布していた。一方、L7Aeの存在下においては、当該距離の分布は収束していた。L7Aeの非存在下と存在下における平均距離は、それぞれ24.0 nmおよび4.9 nmであった(図２e)。これは、L7Ae-K-turn相互作用により、三角形構造を取ることで構造が限定したためであると考えられる。一方、2Kt-28bpでは、Z型構造を取ると想定さており、RNPナノ構造体の当該平均距離は、20.8 nmであり、これは、３Dモデルによる想定値とよく一致している。これらの結果より、L7Ae-K-turn相互作用により、所望のRNAナノマシンの構造変化を導入できることが示唆された。   In order to observe the structural change of RNA nanomachine, it was analyzed with high-speed atomic force microscope (HS-AFM) before and after the addition of L7Ae to 2Kt-33bp and 2Kt-28bp (FIGS. 2c and d). In the absence of L7Ae, 2Kt-33bp and 2Kt-28bp showed heterogeneous RNA structure, but in the presence of L7Ae showed a single structure. 2Kt-33bp and 2Kt-28bp cause conformational changes upon introduction of L7Ae, and are designed to form triangular and Z-shaped structures, respectively (FIGS. 2c, 2d and 10). The distance between the ends was measured (FIGS. 2e and f). In the absence of L7Ae, the distance at 2Kt-33bp was distributed at 10-44 nm due to the flexibility of the two K-turn motifs. On the other hand, in the presence of L7Ae, the distribution of the distance converged. The average distances in the absence and presence of L7Ae were 24.0 nm and 4.9 nm, respectively (FIG. 2e). This is thought to be because the structure was limited by taking a triangular structure due to the L7Ae-K-turn interaction. On the other hand, 2Kt-28bp is assumed to have a Z-type structure, and the average distance of the RNP nanostructure is 20.8 nm, which is in good agreement with the value estimated by the 3D model. These results suggest that the desired RNA nanomachine structural changes can be introduced by the L7Ae-K-turn interaction.

＜タンパク質応答型RNAナノマシンによる機能性RNAの制御＞
RNAナノマシンの構造変化は、L7Ae-K-turn相互作用により制御できることが示されたため、続いて、RNAナノマシンがRNP形成応答によって分割されたRNAアプタマーの活性を制御できるかを検討した。分割したbinary malachite green aptamer (biMGA)をそれぞれ末端に付加したRNAナノマシンを構築した。biMGAプローブは、2Kt-33bpおよび2Kt-28bp 付加し、RNP形成によるアプタマーの活性化と抑制の制御を検討した。biMGA付加RNAナノマシン(それぞれ、biMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpと言う)をmalachite green (MG)の存在下でL7Aeの接触の前後において蛍光スペクトルを測定することで、構造変化による機能的RNAの制御の検討を行った。biMGA付加RNAナノマシンの構築のため、RNAナノマシンとbiMGA間のリンカーの長さ（0〜４塩基対）およびbiMGAのステム配列（biMGA-original stem、biMGA-stem A、biMGA-stem B、biMGA-stem C、biMGA-stem D、biMGA-stem EおよびbiMGA-stem F）を検討し、リンカーの長さは、0塩基対で、biMGA-2Kt-33bpではstem Aで、biMGA-2Kt-28bpではstem Dが最適であることを確認し（図１１から図１８)、RNP 形成によりbiMGA を活性化または抑制できるbiMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpの 2つのbiMGA付加RNAナノマシンを製造した(図３a)。当該biMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpのL7Aeの非存在下および存在下の構造をHS-AFMを用いて観察した(図３bおよびc)。L7Aeの非存在下のbiMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpのAFM像によれば、開放構造や閉鎖構造など不均一なRNA構造を呈した(図３bおよびcの左図)。一方、L7Aeの存在下では、biMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpはそれぞれ、三角形構造またはZ型構造のRNPナノ構造体を形成することが確認された(図３bおよびcの右図)。RNP形成前後における閉鎖状態の分画の変化を調べるため、L7Aeの存在下および非存在下での閉鎖および開放状態の分画を定量化した(図３d)。biMGA- 2Kt-33bpにおいて、RNP形成前後における閉鎖および開放状態の分画はそれぞれ19%および81%であった。RNP形成後、閉鎖状態のbiMGA- 2Kt-33bpの分画は92％まで増加した。一方、biMGA- 2Kt-28bpの開放状態の分画は、RNP 形成により47％から75％まで増加した。これらの結果は、biMGAの活性は、RNP相互作用に応答してRNAナノマシンの構造変化により制御できることが示された。<Control of functional RNA by protein-responsive RNA nanomachine>
Since it was shown that the structural change of RNA nanomachine can be controlled by L7Ae-K-turn interaction, we next investigated whether RNA nanomachine can control the activity of RNA aptamer cleaved by RNP formation response. RNA nanomachines were constructed by adding the divided binary malachite green aptamer (biMGA) to the ends. BiMGA probes were added with 2Kt-33bp and 2Kt-28bp, and activation and repression control of aptamers by RNP formation was investigated. BiMGA-added RNA nanomachines (referred to as biMGA-2Kt-33bp and biMGA-2Kt-28bp, respectively) were measured for fluorescence spectra before and after contact with L7Ae in the presence of malachite green (MG). We examined the regulation of RNA. For the construction of biMGA-added RNA nanomachine, the length of the linker between RNA nanomachine and biMGA (0-4 base pairs) and the stem sequence of biMGA (biMGA-original stem, biMGA-stem A, biMGA-stem B, biMGA-stem C, biMGA-stem D, biMGA-stem E and biMGA-stem F), the linker length is 0 base pairs, stem A for biMGA-2Kt-33bp, stem D for biMGA-2Kt-28bp 2 biMGA-added RNA nanomachines (biMGA-2Kt-33bp and biMGA-2Kt-28bp) that can activate or suppress biMGA by RNP formation were produced (FIG. 3a). ). The structures in the absence and presence of L7Ae of the biMGA-2Kt-33bp and biMGA-2Kt-28bp were observed using HS-AFM (FIGS. 3b and c). According to the AFM images of biMGA-2Kt-33bp and biMGA-2Kt-28bp in the absence of L7Ae, heterogeneous RNA structures such as an open structure and a closed structure were exhibited (the left figure of FIGS. 3b and c). On the other hand, in the presence of L7Ae, biMGA-2Kt-33bp and biMGA-2Kt-28bp were confirmed to form RNP nanostructures having a triangular structure or a Z-type structure, respectively (right figure in FIGS. 3b and c). . To examine changes in the closed fraction before and after RNP formation, the closed and open fractions in the presence and absence of L7Ae were quantified (FIG. 3d). In biMGA-2Kt-33bp, the fractions closed and open before and after RNP formation were 19% and 81%, respectively. After RNP formation, the fraction of closed biMGA-2Kt-33bp increased to 92%. On the other hand, the open fraction of biMGA-2Kt-28bp increased from 47% to 75% due to RNP formation. These results indicate that biMGA activity can be controlled by structural changes in RNA nanomachines in response to RNP interactions.

＜生細胞内で発現するタンパク質によるRNAナノマシンの作動＞
L7Aeにより起動するRNAの構造および機能を活性化するナノマシンの構築を試みた。タンパク質は、機能表現を呈することができる生体適合材料として用いることができる。そこで、RNAナノマシンが細胞内で発現するL7Aeに応答して作動することができるか否かを検討した。細胞内のRNAナノマシンの構造変化を検出するため、Cy3およびCy5でラベルしたRNAナノマシンを用いてFRET解析によるフローサイトメトリーを行った(図４aおよびb)。RNAナノマシンによるインターフェロン活性を抑制するため、3つの17 bpの二重鎖RNAを含む2つのK-turnモチーフを有する2Kt-17bpを構築した。4, 5, 6, 7および8塩基対の短鎖二重鎖RNAを2Kt-17bpに取り込み、RNP相互作用により環状構造からZ様型へと変化するRNAナノマシンを製造した(それぞれ2Kt-17bp-4bp, 2Kt-17bp-5bp, 2Kt-17bp-6bp, 2Kt-17bp-7bpおよび2Kt-17bp-8bpと言う)(図４aおよび図１９)。In vitroでのRNP形成の前後におけるFRETシグナルの変化を検出するため、Cy3およびCy5でラベルしたRNAナノマシンの蛍光スペクトルを測定した(図４c)。2Kt-17bp-4bpおよび2Kt-17bp-5bpの蛍光スペクトルは、L7Aeの存在下で微小な変化を示した。一方、2Kt-17bp-6bp, 2Kt-17bp-7bpおよび2Kt-17bp-8bpの場合、RNP形成により565 nmのCy3のシグナルが増加し、665 nmのCy5のシグナルが減少した。FRETシグナルの変化は、二重鎖RNAの長さによって増加し、7塩基対で最も大きい変化に到達した。従って、RNAナノマシンとして2Kt-17bp-7bpを以後の実施例に用いた。
細胞内でのRNP相互作用を調べるため、2mKt-17bp-7bp（変異K-turnモチーフを有する陰性対照）L7AeおよびMS2CP（RNA結合タンパク質の陰性対照）mRNAを構築した。RNAナノマシン（2Kt-17bp-7bpまたは2mKt-17bp-7bp）およびL7AeまたはMS2CPをコードするmRNAをHeLa細胞へ同時導入した(図４b)。細胞内のRNAナノマシンのFRETシグナルの変化への関与をフローサイトメーターを用いて解析した(図４dおよびe)。MS2CPを発現するHeLa細胞のフローサイトリー解析結果は、2Kt-17bp-7bp and 2mKt-17bp-7bp間のFRETシグナル値に有意な違いは見られなかった。L7Aeを発現するHeLa細胞では、2Kt-17bp-7bpを導入した細胞において最も高いFRETシグナル値を示したが、2mKt-17bp-7bpを導入した細胞では、MS2CPを発現する細胞での結果と同様にFRETシグナル値に有意な違いは見られなかった(図４e)。以上の結果から、L7Aeを発現する細胞における2Kt-17bp-7bpのFRETシグナルの増加は、細胞内におけるL7Ae-K-turn相互作用に起因することが示唆された。RNAナノマシンはL7Aeを発現する細胞でL7Aeを検知し、L7Ae-K-turn相互作用により発動することができることが確認された。<Operation of RNA nanomachines by proteins expressed in living cells>
We attempted to construct a nanomachine that activates the structure and function of RNA activated by L7Ae. Proteins can be used as biocompatible materials that can exhibit functional expression. Therefore, we examined whether RNA nanomachines can operate in response to L7Ae expressed in cells. In order to detect structural changes in RNA nanomachines in cells, flow cytometry was performed by FRET analysis using RNA nanomachines labeled with Cy3 and Cy5 (FIGS. 4a and b). In order to suppress interferon activity by RNA nanomachine, 2Kt-17bp with two K-turn motifs including three 17 bp double-stranded RNAs was constructed. Incorporated short double-stranded RNAs of 4, 5, 6, 7 and 8 base pairs into 2Kt-17bp, and produced RNA nanomachines that change from a circular structure to a Z-like form by RNP interaction (each 2Kt-17bp- 4bp, 2Kt-17bp-5bp, 2Kt-17bp-6bp, 2Kt-17bp-7bp and 2Kt-17bp-8bp) (FIGS. 4a and 19). In order to detect changes in the FRET signal before and after RNP formation in vitro, the fluorescence spectra of RNA nanomachines labeled with Cy3 and Cy5 were measured (FIG. 4c). The fluorescence spectra of 2Kt-17bp-4bp and 2Kt-17bp-5bp showed slight changes in the presence of L7Ae. On the other hand, in the case of 2Kt-17bp-6bp, 2Kt-17bp-7bp and 2Kt-17bp-8bp, the signal of Cy3 at 565 nm increased and the signal of Cy5 at 665 nm decreased due to RNP formation. The change in FRET signal increased with the length of the double stranded RNA, reaching the largest change at 7 base pairs. Therefore, 2Kt-17bp-7bp was used as an RNA nanomachine in the following examples.
In order to examine intracellular RNP interaction, 2mKt-17bp-7bp (negative control with mutant K-turn motif) L7Ae and MS2CP (negative binding control RNA) mRNA were constructed. RNA nanomachine (2Kt-17bp-7bp or 2mKt-17bp-7bp) and mRNA encoding L7Ae or MS2CP were simultaneously introduced into HeLa cells (FIG. 4b). Involvement of intracellular RNA nanomachines in the change of the FRET signal was analyzed using a flow cytometer (FIGS. 4d and e). As a result of flow cytometric analysis of HeLa cells expressing MS2CP, there was no significant difference in the FRET signal value between 2Kt-17bp-7bp and 2mKt-17bp-7bp. HeLa cells expressing L7Ae showed the highest FRET signal value in cells transfected with 2Kt-17bp-7bp, but in cells transfected with 2mKt-17bp-7bp, similar to the results in cells expressing MS2CP There was no significant difference in FRET signal values (Fig. 4e). From the above results, it was suggested that the increase in the 2Kt-17bp-7bp FRET signal in cells expressing L7Ae was due to the L7Ae-K-turn interaction in the cells. It was confirmed that RNA nanomachine can detect L7Ae in cells expressing L7Ae and can be triggered by L7Ae-K-turn interaction.

＜RNP相互作用を介した細胞内タンパク質凝集によるヒト細胞の制御＞
RNP相互作用を介した細胞内タンパク質凝集と当該凝集の感知によるヒト細胞制御を試みた。ヒト細胞の制御のため、デスエフェクタードメイン（death effector domain）欠損caspase-8をL7Aeと融合し(以下、L7Ae-caspase-8と言う) （配列番号６５および６６）、RNP相互作用によるL7Ae-caspase-8を凝集させ、当該凝集caspase-8の活性化により引き起こされる細胞死が誘導できるかを検討した（図５a）。1個、3個、6個、9個または14個のK-turnモチーフを有する RNAナノ構造体（それぞれ、1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bpおよび14Kt-33bpと言う）を設計した（図５b）。また、対応する変異K-turnモチーフを有する変異体（それぞれ、1mKt-33bp, 3mKt-33bp, 6mKt-33bp, 9mKt-33bpおよび14mKt-33bpという）を陰性対照として用いた。細胞死はRNAナノ構造体のK-turnモチーフ上にL7Ae-caspase-8が凝集することによって引き起こされるかを検討するため、各RNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8 mRNAをHeLa細胞へ同時導入した。細胞形態の解析によりK-turnモチーフの数が増加するごとに細胞死が誘導されることが示された(図５cの上図)。一方、変異K-turnモチーフを有するRNAナノ構造体では細胞死が確認されなかった(図５cの下図)。細胞死を定量化するため、Pacific Blue Annexin Vで染色し、フローサイトメーターを用いて解析した。細胞死を引き起こしていると推測されるPacific Blue陽性細胞は、RNAナノ構造体中のK-turnモチーフの数と比例して増加することが確認され、14Kt-33bp導入細胞において最も多く観察された。一方、変異K-turnモチーフを有するRNAナノ構造体ではこのようなK-turnモチーフの数による細胞死の増加は見られなかった(図５dおよびe)。さらに、14Kt-33bpまたは14mKt-33bpと共にL7Aeまたはcaspase-8 mRNAを導入した場合、すべての組み合わせではほとんど細胞死が確認できなかった（図６）。以上の結果から、RNAナノ構造体上のL7Ae-K-turn相互作用を介したL7Ae-caspase-8の凝集により細胞死の制御が可能であることが示された。<Control of human cells by intracellular protein aggregation via RNP interaction>
We attempted to regulate human cells by intracellular protein aggregation via RNP interaction and sensing the aggregation. For control of human cells, death effector domain-deficient caspase-8 is fused with L7Ae (hereinafter referred to as L7Ae-caspase-8) (SEQ ID NOs: 65 and 66), and L7Ae-caspase by RNP interaction -8 was aggregated to examine whether cell death caused by the activation of the aggregate caspase-8 could be induced (FIG. 5a). RNA nanostructures with 1, 3, 6, 9 or 14 K-turn motifs (referred to as 1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bp and 14Kt-33bp, respectively) Was designed (FIG. 5b). Mutants having the corresponding mutant K-turn motif (referred to as 1mKt-33bp, 3mKt-33bp, 6mKt-33bp, 9mKt-33bp and 14mKt-33bp, respectively) were used as negative controls. In order to investigate whether cell death is caused by aggregation of L7Ae-caspase-8 on the K-turn motif of RNA nanostructures, each RNA nanostructure and L7Ae-caspase-8 mRNA are simultaneously introduced into HeLa cells. did. Analysis of cell morphology showed that cell death was induced each time the number of K-turn motifs increased (upper figure in FIG. 5c). On the other hand, cell death was not confirmed in the RNA nanostructure having the mutant K-turn motif (lower figure in FIG. 5c). In order to quantify cell death, it was stained with Pacific Blue Annexin V and analyzed using a flow cytometer. The number of Pacific Blue positive cells, which are presumed to cause cell death, increased in proportion to the number of K-turn motifs in the RNA nanostructure, and was most frequently observed in 14Kt-33bp-introduced cells. . On the other hand, no increase in cell death due to the number of K-turn motifs was observed in RNA nanostructures having mutant K-turn motifs (FIGS. 5d and e). Furthermore, when L7Ae or caspase-8 mRNA was introduced together with 14Kt-33bp or 14mKt-33bp, almost no cell death could be confirmed in all combinations (FIG. 6). From the above results, it was shown that cell death can be controlled by aggregation of L7Ae-caspase-8 via L7Ae-K-turn interaction on RNA nanostructures.

＜caspase-8活性測定＞
2×105 の細胞を6ウエルプレートに播種した。24時間培養後、RNAナノ構造(0.4 pmol)およびmRNA (40 ng)を4 μLのStem Fect (STEMGENT)を使用して細胞にコトランスフェクトした。2時間後培地を交換した。caspase-8活性測定はトランスフェクション6時間後に行った。Caspase-8活性は、APOPCYTO Caspase-8 Fluorometric Assay Kit (MBL)を用いて測定を行った。<Measurement of caspase-8 activity>
2 × 10 5 cells were seeded in 6-well plates. After 24 hours of culture, RNA nanostructures (0.4 pmol) and mRNA (40 ng) were cotransfected into cells using 4 μL Stem Fect (STEMGENT). After 2 hours, the medium was changed. The caspase-8 activity was measured 6 hours after transfection. Caspase-8 activity was measured using APOPCYTO Caspase-8 Fluorometric Assay Kit (MBL).

caspase-8の活性化を介したアポトーシスによって細胞死が誘起されるかを調べるために、14Kt-33bpまたは14mKt-33bpと L7Ae-caspase mRNA（配列番号６５）をHela細胞にトランスフェクションし、蛍光発生基質IETD-AMCを用いてcaspase-8活性を測定した。14Kt-33bpと L7Ae-caspase mRNAの組み合わせの際に最も高いcaspase-8活性を観測し、その活性は、caspase-8阻害剤の添加により明らかに減少した。   To investigate whether apoptosis is induced by apoptosis through caspase-8 activation, 14Kt-33bp or 14mKt-33bp and L7Ae-caspase mRNA (SEQ ID NO: 65) were transfected into Hela cells, and fluorescence was generated. Caspase-8 activity was measured using the substrate IETD-AMC. The highest caspase-8 activity was observed when 14Kt-33bp was combined with L7Ae-caspase mRNA, and the activity was clearly reduced by the addition of caspase-8 inhibitor.

＜アポトーシスアッセイ＞
5×104 の細胞を24ウエルプレートに播種した。24時間培養後、RNAナノ構造(0.1 pmol)およびmRNA (10 ng)を1 μLのStem Fect (STEMGENT)を使用して細胞にコトランスフェクトした。2時間後培地を交換した。細胞を回収した後、Pacific Blue-labelled Annexin V (Life Technologies)とSYTOX AADvanced Dead Cell stain (Life Technologies)で染色を行った。その染色した細胞は、FACSAria cell sorter (BD Bioscience)またはBD LSRFortessa (BD Bioscience)を用いて解析を行った。高いPacific Blueの蛍光強度を示す細胞をアポトーシス細胞としてカウントした。<Apoptosis assay>
5 × 10 4 cells were seeded in 24-well plates. After 24 hours of culture, RNA nanostructures (0.1 pmol) and mRNA (10 ng) were cotransfected into cells using 1 μL Stem Fect (STEMGENT). After 2 hours, the medium was changed. After recovering the cells, the cells were stained with Pacific Blue-labelled Annexin V (Life Technologies) and SYTOX AADvanced Dead Cell stain (Life Technologies). The stained cells were analyzed using a FACSAria cell sorter (BD Bioscience) or BD LSR Fortessa (BD Bioscience). Cells showing high Pacific Blue fluorescence intensity were counted as apoptotic cells.

細胞死がRNA-タンパク質相互作用により起こるかどうか調べるためにRNA ナノ構造体 (14Kt-33bpまたは14mKt-33bp)とmRNA(L7Ae［配列番号９２］, dcasp-8［配列番号８７］, L7Ae-dcasp-8 (L7Ae-caspase-8) ［配列番号６５］, L7Ae-dcasp-8-CS［配列番号８８］, DED-caspase-8［配列番号８９］, L7Ae-DED-caspase-8［配列番号９０］またはL7Ae-DED-caspase-8-CS［配列番号９１］)を導入し、細胞死が起こるかどうかを調べた。L7Ae-DED-caspase-8はL7Ae-dcasp-8にDED配列を付加したmRNAである。L7Ae-dcasp-8-CS及びL7Ae-DED-caspase-8-CS は、対応するL7Ae-dcasp-8及びL7Ae-DED-caspase-8のcaspase活性化を引き起こさない変異体である。14Kt-33bpとL7Ae-dcasp-8及びL7Ae-DED-caspase-8において高い細胞死活性が観測された。一方でその他の組み合わせではほとんど細胞死が確認できなかった。以上の結果から、RNAナノ構造体上のL7Ae-K-turn相互作用を介したL7Ae-caspase-8の凝集によりcaspase-8が活性化し、細胞死を引き起こすことが示された。   RNA nanostructures (14Kt-33bp or 14mKt-33bp) and mRNA (L7Ae [SEQ ID NO: 92], dcasp-8 [SEQ ID NO: 87], L7Ae-dcasp) to investigate whether cell death occurs due to RNA-protein interaction -8 (L7Ae-caspase-8) [SEQ ID NO: 65], L7Ae-dcasp-8-CS [SEQ ID NO: 88], DED-caspase-8 [SEQ ID NO: 89], L7Ae-DED-caspase-8 [SEQ ID NO: 90] ] Or L7Ae-DED-caspase-8-CS [SEQ ID NO: 91]) was introduced to examine whether cell death occurred. L7Ae-DED-caspase-8 is an mRNA obtained by adding a DED sequence to L7Ae-dcasp-8. L7Ae-dcasp-8-CS and L7Ae-DED-caspase-8-CS are mutants that do not cause caspase activation of the corresponding L7Ae-dcasp-8 and L7Ae-DED-caspase-8. High cell death activity was observed in 14Kt-33bp, L7Ae-dcasp-8 and L7Ae-DED-caspase-8. On the other hand, almost no cell death was confirmed in other combinations. From the above results, it was shown that caspase-8 was activated by the aggregation of L7Ae-caspase-8 via L7Ae-K-turn interaction on the RNA nanostructure and caused cell death.

Claims (22)

次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含む２重鎖ＲＮＡであって、当該２重鎖ＲＮＡの両端に機能的分子を有するもの、および
（２）前記（１）のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質。An RNA-protein complex comprising the following (1) and (2);
(1) a double-stranded RNA comprising two RNA-protein binding motif sequences, having functional molecules at both ends of the double-stranded RNA, and (2) the RNA-protein binding motif of (1) above A protein that binds to a sequence. 前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対である、請求項１に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。   The RNA-protein complex according to claim 1, wherein the distance between the RNA-protein binding motif sequences is 20 base pairs to 24 base pairs, or 31 base pairs to 35 base pairs, or 42 base pairs to 46 base pairs. body. 前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対である、請求項１に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。   The RNA-protein complex according to claim 1, wherein the distance between the RNA-protein binding motif sequences is 15 to 19 base pairs, or 26 to 30 base pairs, or 37 to 41 base pairs. body. 前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、請求項３に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。   The RNA-protein complex according to claim 3, wherein the double-stranded RNA has overhangs of 6 base pairs or more that are complementary strands at both ends. 前記機能的分子が、アプタマーである、請求項１から４のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。   The RNA-protein complex according to any one of claims 1 to 4, wherein the functional molecule is an aptamer. 請求項１から５のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。   A human cell comprising the RNA-protein complex according to any one of claims 1 to 5. 前記ＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または１５塩基対から１９塩基対である、請求項６に記載のヒト細胞。 The human cell according to claim 6, wherein a distance between RNA-protein binding motif sequences in the RNA-protein complex is 20 to 24 base pairs, or 15 to 19 base pairs. ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで、当該機能的分子の相互作用を制御する方法。   The interaction of the functional molecule is controlled by binding a double-stranded RNA containing two RNA-protein binding motif sequences and having a functional molecule at both ends and a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence. Method. 前記２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を調整することで、前記相互作用を正または負へ制御する、請求項８に記載の方法。   The method according to claim 8, wherein the interaction is controlled to be positive or negative by adjusting a distance between RNA-protein binding motif sequences of the double-stranded RNA. 前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を正へ制御する、請求項９に記載の方法。   Binding to the RNA-protein binding motif sequence by changing the distance between the RNA-protein binding motif sequences from 20 base pairs to 24 base pairs, 31 base pairs to 35 base pairs, or 42 base pairs to 46 base pairs The method according to claim 9, wherein the interaction is positively controlled by binding a protein that binds. 前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を負へ制御する、請求項９に記載の方法。   Binding to the RNA-protein binding motif sequence by changing the distance between the RNA-protein binding motif sequences from 15 base pairs to 19 base pairs, or from 26 base pairs to 30 base pairs, or from 37 base pairs to 41 base pairs The method according to claim 9, wherein the interaction is controlled to be negative by binding a protein that binds. 前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、請求項１１に記載の方法。   The method according to claim 11, wherein the double-stranded RNA has overhangs of 6 base pairs or more that are complementary strands at both ends. 前記機能的分子が、アプタマーである、請求項８から１２のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 8 to 12, wherein the functional molecule is an aptamer. 前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、請求項８から１３のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 8 to 13, wherein the double-stranded RNA and the fusion protein are bound in a human cell. 次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡ、および
（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質との融合タンパク質。An RNA-protein complex comprising the following (1) and (2);
(1) a double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences, and (2) a fusion protein of a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence and an aggregated protein. 前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、請求項１５に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。   The RNA-protein complex according to claim 15, wherein the double-stranded RNA comprises 9 or more RNA-protein binding motif sequences. 前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、請求項１５または１６に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。   The RNA-protein complex according to claim 15 or 16, wherein the aggregated protein is caspase 8 or a fragment thereof. 請求項１５から１７に記載のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。   A human cell comprising the RNA-protein complex according to any one of claims 15 to 17. ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合した融合タンパク質とを結合させることで、被凝集タンパク質の凝集を制御する方法。   Aggregation of aggregated proteins can be achieved by binding a double-stranded RNA containing two or more RNA-protein binding motif sequences to a fusion protein that is a fusion of a protein that binds to the RNA-protein binding motif sequence and the aggregated protein. How to control. 前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、請求項１９に記載の方法。   20. The method of claim 19, wherein the double stranded RNA comprises 9 or more RNA-protein binding motif sequences. 前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、請求項１９または２０に記載の方法。   The method according to claim 19 or 20, wherein the aggregated protein is caspase 8 or a fragment thereof. 前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 19 to 21, wherein the double-stranded RNA and the fusion protein are bound in a human cell.
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