JPWO2016199895A1 - 核酸送達用キャリア、核酸送達用キット、及び核酸送達方法 - Google Patents

核酸送達用キャリア、核酸送達用キット、及び核酸送達方法 Download PDF

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Abstract

本発明の課題は、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れた核酸送達用キャリア、核酸送達用キット、及び核酸送達方法を提供することである。本発明の核酸送達用キャリアは、膜融合性能を有するリポソームからなる、細胞内への核酸送達用キャリアであって、リポソームは、膜構成成分としてカチオン性脂質を含み、リポソームの表面が温度応答性ポリマーで修飾されたものである。本発明の核酸送達用キャリアは、子宮頸癌細胞内への核酸の送達に好適に用いられる。本発明の核酸送達用キットは、上記の送達用キャリアを含む、細胞内への核酸送達用キットである。本発明の核酸送達方法は、上記の核酸送達用キャリアと核酸との複合体と、単離された細胞とを接触させる工程、又は、上記の核酸送達用キャリアと核酸との複合体をヒトを除く動物に投与する工程を有する、細胞内への核酸送達方法である。

Description

本発明は、細胞内への核酸送達用キャリア、核酸送達用キット、及び核酸送達方法に関する。
遺伝子治療において、ｓｉＲＮＡ等の核酸を単独で静脈内へ投与すると、細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みやヌクレアーゼ等による分解によって、血中から消失しやすいため、標的細胞へのｓｉＲＮＡ等の核酸を到達させることは困難である。そのため、核酸をより効率的に標的細胞へ送達することに適した、薬物送達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）のためのキャリアが、従来より必要とされている。
他方、近年、リポソームのＤＤＳへの利用が注目されている。リポソームは、細胞膜と同様の脂質二分子膜構造を有する球状の粒子であり、核酸と複合体を形成して核酸を安定に保持できることから、核酸のＤＤＳにも使用されている。
例えば、インビトロジェン株式会社製のリポフェクタミン（登録商標）（非特許文献１を参照）は、効率的にｓｉＲＮＡを細胞内へと送達可能なＤＤＳのキャリアとして、従来から利用されている。
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１３７７８０３０
しかしながら、上述のリポフェクタミン（登録商標）は、核酸の細胞内への送達効率には優れるものの、核酸送達後に細胞が死滅しやすいという点で問題がある。
他方、リポソームの表面をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）で修飾することで、核酸の送達後の細胞の死滅を抑えることは可能である。しかし、ＰＥＧで表面が修飾されたリポソームでは、核酸の細胞内への送達効率は低い。
核酸送達後の細胞の死滅を抑え、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れた核酸送達用キャリアは、未だ存在しなかった。
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れた核酸送達用キャリア、核酸送達用キット、及び核酸送達方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、膜構成成分としてカチオン性脂質を含むリポソームの表面を温度応答性ポリマーで修飾することで、核酸送達後の細胞の死滅の抑制しつつ、核酸の細胞内への送達効率に優れることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
（１） 膜融合性能を有するリポソームからなる、細胞内への核酸送達用キャリアであって、
前記リポソームは、膜構成成分としてカチオン性脂質を含み、
前記リポソームの表面が温度応答性ポリマーで修飾された、核酸送達用キャリア。
（２） 前記温度応答性ポリマーの水に対する下限臨界溶解温度が３５．０〜４５．０℃である、（１）に記載の核酸送達用キャリア。
（３） 前記リポソームは、膜構成成分としてリン脂質を含む、（１）又は（２）に記載の核酸送達用キャリア。
（４） 子宮頸癌細胞内への核酸の送達に用いられる、（１）から（３）のいずれかに記載の核酸送達用キャリア。
（５） （１）から（４）のいずれかに記載の核酸送達用キャリアを含む、細胞内への核酸送達用キット。
（６） （１）から（４）のいずれかに記載の核酸送達用キャリアと核酸との複合体と、単離された細胞とを接触させる工程、又は、
前記核酸送達用キャリアと核酸との複合体をヒトを除く動物に投与する工程を有する、細胞内への核酸送達方法。
本発明によれば、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れた核酸送達用キャリア、核酸送達用キット、及び核酸送達方法を提供することができる。
実施例１、比較例１、対照例１、２についてのルシフェラーゼ活性の測定結果のグラフを示す図である。 実施例１、比較例１〜３、対照例２についてのルシフェラーゼ活性の測定結果のグラフを示す図である。 実施例１、比較例１、対照例３、４についての細胞生存率の測定結果のグラフを示す図である。 実施例１、比較例１、比較例３についての３０℃又は４０℃におけるルシフェラーゼ活性の測定結果のグラフを示す図である。 実施例２についての３７℃又は４２℃におけるルシフェラーゼ活性の測定結果のグラフを示す図である。 カルボキシフルオレセインを封入した実施例１に係るリポソームに対する、Ｔｒｉｔｏｎ処理前と処理後の蛍光強度の測定結果のグラフを示す図である。 カルボキシフルオレセインを封入した実施例１に係るリポソーム、及び比較例１に係るリポソームについてのルシフェラーゼ活性の測定結果のグラフを示す図である。 実施例１、比較例１、比較例３を用いてプラスミド（ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミド）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションさせたときに、ＧＦＰを発現した細胞の割合のグラフを示す図である。
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されず、適宜変更可能である。
＜核酸送達用キャリア＞
本発明の核酸送達用キャリアは、膜融合性能を有するリポソームからなる、細胞内への核酸送達用キャリアであって、リポソームは、膜構成成分としてカチオン性脂質を含み、リポソームの表面が温度応答性ポリマーで修飾されたものである。本発明の核酸送達用キャリアは、かかる構成により、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れる。
本発明の核酸送達用キャリアが、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れる理由は、以下のとおりであると推測される。
本発明の核酸送達用キャリアは、リポソーム表面に温度応答性ポリマーが修飾されることで、温度応答性ポリマーが下限臨界溶解温度以下のときには、該ポリマーが水和層を形成し、これによりカチオン性脂質による細胞毒性を抑制することが可能であり、また、温度上昇により温度応答性ポリマーが疎水性となることにより、形成された水和層が減少することにより細胞親和性が向上し、膜融合性能を有する脂質であるためにリソソームを経由せず細胞内へ直接核酸を送達することができる。これにより、結果的に、本発明の核酸送達用キャリアは、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れる。
本発明におけるリポソームを構成する脂質は、膜融合性能を有し、膜構成成分としてカチオン性脂質を有するものであれば、特に限定されず、例えば、カチオン性脂質と、膜融合性能を有する脂質もしくは高分子等とから形成されたものであってもよく、カチオン性脂質自体が、膜融合性能を有する脂質であってもよい。本発明におけるリポソームにおいて、膜構成成分として含まれる脂質は、１種類であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。なお、本発明における「膜融合性能」とは、エンドソーム膜又は細胞膜に対する融合性能のことを指す。
カチオン性脂質としては、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）等のリン脂質でないカチオン性脂質が挙げられる。あるいは、カチオン性のリン脂質等が挙げられる。これらのうち、核酸の細胞内への送達効率に優れることから、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＤＯＤＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＲＩＥを用いることが好ましい。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本発明におけるリポソームが膜融合性能を有するために、カチオン性脂質とともに膜構成成分として用いられる脂質（以下、本明細書において、「膜融合性脂質」ということがある。）としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、大豆レシチン、卵黄レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質等のリン脂質や膜融合能を持つ高分子サクシニル化ポリグリシドール（ＳｕｃＰＧ）等が挙げられる。これらのうち、特に、核酸の細胞内への送達効率に優れることから、ホスファチジルエタノールアミン、サクシニル化ポリグリシドールが好ましい。また、カチオン性脂質による細胞の死滅をより抑えることができることから、本発明におけるリポソームは、膜構成成分として、リン脂質を含むことが好ましい。
ホスファチジルエタノールアミンとしては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられる。これらのうち、特に、核酸の細胞内への送達効率に優れることから、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が好ましい。
本発明におけるリポソームは、より核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れるという観点から、リン脂質でないカチオン性脂質と膜融合性脂質とを、核酸の細胞内への送達効率に優れるモル比で、３：０．５〜３：２０のモル比で膜構成成分として含むことが好ましく、３：２〜３：１５のモル比で膜構成成分として含むことがより好ましく、３：５〜３：１０のモル比で膜構成成分として含むことが更に好ましい。
また、カチオン性脂質として１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を、膜融合性脂質として１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を、これらのモル比でリポソームの膜構成成分として含むことが特に好ましい。また、温度応答性ポリマーを、リポソームの膜構成成分としての脂質によって修飾することで、リポソーム表面を修飾する場合、該脂質で修飾された温度応答性ポリマーは、より核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れるという観点から、膜構成成分としての全脂質のうち、０．０５〜４０モル％であることが好ましく、１．０〜２０モル％であることがより好ましく、２．０〜８．０モル％であることが更に好ましい。また、温度応答性ポリマーは、膜融合性脂質により修飾されることが好ましく、膜融合性脂質のうち、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）により修飾されることが特に好ましい。
温度応答性ポリマーは、水に対する下限臨界溶解温度（Ｌｏｗｅｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＬＣＳＴ）以下の温度では、リポソーム表面に水和層を形成させ、リポソームと細胞膜との親和性を低下させるが、下限臨界溶解温度以上では、凝集して疎水化し、リポソームとの細胞膜との親和性を向上させる。このように、本発明における温度応答性ポリマーは、水に対する下限臨界溶解温度が低いと、リポソームと細胞膜との親和性を低下して細胞内への送達効率が下がる。そのため、本発明における温度応答性ポリマーの水に対する下限臨界溶解温度は、体温に近い温度（例えば、３５．０〜４５．０℃）の温度であることが好ましい。他方、本発明のおける温度応答性ポリマーは、下限臨界溶解温度が体温付近の温度であっても、できるだけ高い方が、核酸の細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすい。このように、核酸の細胞内への送達にも優れ、かつ、核酸の細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすいことから、温度応答性ポリマーは、水に対する下限臨界溶解温度は、３７．０〜４２．０℃であることが好ましく、３７．５〜４１．０℃であることがより好ましく、３８．０〜４０．５℃であることが更に好ましい。なお、本発明において、温度応答性ポリマーの水に対する下限臨界溶解温度は、示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＤＳＣ）により測定する。
本発明におけるリポソームの表面を修飾する温度応答性ポリマーの具体例としては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（又はＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ビニルエーテル誘導体等を構成モノマーとして構成されたポリマーや、これらのうちの２種類以上のモノマーの共重合体であってもよい。また、これらのモノマー以外のモノマーとの共重合、ポリマー同士のグラフト重合又は共重合を行ったものを用いてもよく、あるいはこれらモノマーの単独重合体と共重合体の混合物を用いてもよい。また、温度応答性ポリマーは、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋してもよい。
具体的な温度応答性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。温度応答性ポリマーは、これらのモノマーの単独重合体であってもよく、２種以上の共重合体であってもよい。また、これらのモノマーと更に共重合してもよいモノマーとしては、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノ（メタ）アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、エチレンオキシド、（メタ）アクリル酸及びその塩、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ポリヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。温度応答性ポリマーの水に対する下限臨界溶解温度は、以上で述べたような温度応答性ポリマーを構成するモノマーを、それぞれの性質に応じて適宜選択することで、調節することができる。
温度応答性ポリマーとしては、核酸の細胞内への送達にも優れ、かつ、核酸の細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすいことから、特に、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド（ＮＩＰＡＡ）と、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡ）との共重合体である以下の一般式（１）で表される化合物を用いることが好ましい。以下の式（１）中、ｘは、６０〜９９であることが好ましく、９０〜９９であることがより好ましく、ｙは、１〜４０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましい。
Figure 2016199895
本発明における温度応答性ポリマーの分子量は、特に限定されず、例えば、重量平均分子量が１０００〜１０００００であってもよいが、核酸の細胞内への送達にも優れ、かつ、核酸の細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすいことから、重量平均分子量が２０００〜５００００であることが好ましく、３０００〜１００００であることがより好ましく、４０００〜７０００であることが更に好ましい。なお、重量平均分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定することができる。
温度応答性ポリマーでリポソームの表面を修飾するには、例えば、カチオン性脂質と膜融合性脂質とからリポソームを作製する際に、あらかじめ、膜融合性脂質、あるいはカチオン性脂質のいずれかによって温度応答性ポリマーを化学的に修飾しておき、この脂質で修飾された温度応答性ポリマーを、リポソーム作製時に混合することで、リポソームの作製後、表面が温度応答性ポリマーにより修飾された構造となる。
本発明のリポソームの作製方法は、従来の公知の方法を用いることができる。例えば、本発明のリポソームをカチオン性脂質と膜融合性脂質とから作製する場合、カチオン性脂質と膜融合性脂質を、溶媒（例えば、クロロホルム等）中に溶解し、溶媒を取り除いてから、形成された脂質の薄膜をリン酸緩衝生理食塩水等を用いて水和させ、次いで超音波処理を行って、リポソームの粒径を調整することで、作製することができる。
リポソームの粒径は、特に限定されず、例えば、平均粒径０．０５〜１μｍのものを用いることができる。また、リポソームの平均粒径は、動的散乱法（ＤＬＳ）により測定する。
本発明の核酸送達用キャリアが送達される細胞は、特に限定されず、例えば、肺細胞、結腸細胞、直腸細胞、肛門細胞、胆管細胞、小腸細胞、胃細胞、食道細胞、胆嚢細胞、肝細胞、膵臓細胞、虫垂細胞、乳細胞、卵巣細胞、子宮頸細胞、前立腺細胞、腎細胞、神経膠芽腫細胞、皮膚細胞、リンパ細胞、絨毛腫瘍細胞、頭頸部細胞、骨原性肉腫細胞、血液細胞等の細胞、又はこれらの癌細胞（子宮頸癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肛門癌細胞、胆管癌細胞、小腸癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、虫垂癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、腎癌細胞、中枢神経系の癌細胞、神経膠芽腫細胞、皮膚癌細胞、リンパ腫細胞、絨毛癌腫瘍細胞、頭頸部癌細胞、骨原性肉腫細胞、血液癌細胞等）等が挙げられる。本発明の核酸送達用キャリアが送達される細胞は、特に、細胞内への核酸送達効率、及び核酸送達後の細胞の死滅を抑制しやすいことから、癌細胞内への送達に用いることが好ましく、また、癌細胞のうち、特に、子宮頸癌細胞内、結腸癌細胞内、腎癌細胞内リンパ細胞内への送達に好適である。
送達する核酸は、特に限定されず、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、環状プラスミドＤＮＡ等が挙げられる。これらの核酸は、１本鎖、２本鎖、３本鎖のいずれでもよい。また、本発明において、核酸は化学的に修飾されたものであってもよく、酵素、ペプチド等で修飾されたものであってもよい。また、核酸は、１種のものを単独で使用してもよく、また２種以上のものを適宜組み合わせて使用してもよい。核酸は、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ、かつ、核酸の細胞内への送達効率に優れることから、ｓｉＲＮＡの送達に用いられることが好ましい。また、核酸の塩基数は、特に限定されず、目的に応じて適宜変更することができ、例えば、１０〜１００００ｂｐの範囲内から選択することができる。すなわち、本発明の核酸送達用キャリアによると、１０〜５０ｂｐという短い塩基数の核酸でも送達可能であり、１０００〜１００００ｂｐといった長い塩基数の核酸でも送達可能である。
＜核酸送達用キット＞
本発明の核酸送達用キットは、上述の核酸送達用キャリアを含むものである。
本発明の核酸送達用キットは、上述の核酸送達用キャリア以外のものを含んでもよい。例えば、本発明の核酸送達用キットの構成要素は、上述の核酸送達用キャリアを溶媒（水、バッファー、スクロース等）に分散させた分散液を含む容器や、キットの使用方法を記載した取扱説明書等であってもよい。また、該核酸送達用キャリアを含む分散液には、水やバッファー等の溶媒のほか、核酸送達用キャリア以外の成分（例えば、スクロース等）を含んでいてもよい。
＜細胞内への核酸送達方法＞
本発明の核酸送達方法は、上述の核酸送達用キャリアと核酸との複合体と、単離された細胞とを接触させる工程、又は、核酸送達用キャリアと核酸との複合体をヒトを除く動物に投与する工程を有する、細胞内への核酸送達方法である。
（接触工程）
本発明の核酸送達方法における接触工程は、上述の核酸送達用キャリアと核酸との複合体と、単離された細胞とを接触させる工程である。該工程はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。これにより、細胞内に上述の核酸送達用キャリアを介して核酸が送達される。
核酸送達用キャリアと核酸との複合体は、従来の公知の方法により行うことができ、例えば、核酸送達用キャリアと核酸とを、それぞれ別々の培地（血清ＭＥＭ（最少必須培地等））に分散させ、これらを混合することで、作製することができる。
リポソーム−核酸複合体中の窒素とリンとのモルの割合（Ｎ／Ｐ）は、特に限定されないが、特に、核酸の細胞内への送達効率に優れることから、５：０．１〜５：１０であることが好ましく、５：０．５〜５：８であることがより好ましく、５：０．７〜５：２．０であることが更に好ましい。リポソーム−核酸複合体中の窒素とリンとのモル比（Ｎ／Ｐ）は、動的散乱法（ＤＬＳ）によるゼータ電位により測定する。
接触は、従来の公知の方法により行うことができ、核酸送達用キャリアと核酸との複合体を、細胞を含む培地に投与してから、３７〜４２℃で、２０分〜４８時間インキュベートすることで、細胞内への拡散の投与を行うことができる。
接触される細胞は、単離された細胞であれば、ヒト又は非ヒトの細胞であってもよく、また、上述の核酸送達用において核酸が送達される細胞と同様のものを用いることができる。
（投与工程）
本発明の核酸送達方法における投与工程は、上述の核酸送達用キャリアと核酸との複合体をヒトを除く動物に投与する工程である。該工程はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。これにより、ヒトを除く動物の細胞内に上述の核酸送達用キャリアを介して核酸が送達される。
投与方法は、特に限定されず、標的とする細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、経口投与、注射（静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等）による投与方法を用いることができる。
ヒトを除く動物は、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ等の哺乳等物等の動物であってよい。
＜核酸送達用キャリアの準備−１＞
（実施例１）
［温度応答性ポリマーの合成］
式（２）で表されるＮＩＰＡＡｍ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と式（３）で表されるＤＭＡＰＡＡｍ（メチルアミノプロピルアクリルアミド）とのモル比率が９５：５の割合になるようにＤＭＦ（ジチルホルムアミド）に溶解させた。なお、ＮＩＰＡＡｍとＤＭＡＰＡＡｍとの総量は１０ｇとした。溶解後の溶媒に、ＭＰＡ（３−メルカプトプロピオン酸）をＮＩＰＡＡｍの０．０２８ｍｏｌ倍となるように加え、更にＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を５８ｍｇ加えた。その後、溶媒に対して窒素置換と超音波による脱気を行った後、７０℃で５時間ラジカル重合を行った。反応後の液体の温度を室温に戻してから、あらかじめ冷やしておいたジエチルエーテルに滴下し、再沈精製を行った。その後、沈殿物を濾過で回収した。この再沈精製を更に２回行い、式（１）で表される温度応答性ポリマーを回収した。この式（１）で表される温度応答性ポリマーについて水により透析を行い、その後、凍結乾燥によって式（１）で表される温度応答性ポリマーを更に精製した。なお、式（１）で表される温度応答性ポリマーの分子量は５５００であり、水に対する下限臨界溶解温度は４０℃である。この反応スキームを以下に示す。
Figure 2016199895
［脂質修飾温度応答性ポリマーの合成］
式（１）で表される温度応答性ポリマーを活性エステル化させるために、モル比が、式（１）で表される温度応答性ポリマー：ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）：ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）＝１：２．５：２．５の割合となるように塩化メチルに溶解させてから、室温で２４時間反応させた。反応後、吸引濾過により副生成物のジシクロヘキシル尿素を取り除き、ジエチルエーテルによる再沈精製を行い、沈殿物として、式（４）で表されるスクシニルポリマーを回収した。式（４）で表されるスクシニルポリマーと膜融合性脂質であるＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）がモル比１：１でとなるようにジオキサンに溶解させ、室温で２４時間反応させた。反応後の溶液をエバポレーターでバキュームし、溶媒を飛ばすことによって、式（５）で表される脂質修飾温度応答性ポリマーを調製した。この反応スキームを以下に示す。
Figure 2016199895
［リポソームの作製］
脂質総量が２０ｍｇとなり、モル比率が、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）：ＤＯＰＥ（式（５）で表される脂質修飾温度応答性ポリマーを含む）＝３：７の割合となるように、それぞれの脂質をクロロホルムに溶解した。なお、クロロホルムに溶解したＤＯＰＥのうち、ＤＯＰＥと式（５）で表される脂質修飾温度応答性ポリマーとのモル比は、６．５：０．５とした。その溶液を、ナスフラスコに移動させ、エバポレーターで溶媒を飛ばし、リピッドフィルムを作製した。このリピッドフィルムに精製水を１ｍｌ加え、リピッドフィルムを水和させた後、ボルテックスで分散させた。その後、超音波槽で３０分ソニケーションを行い、リポソームのサイズを小さくしてから、エクストルーダーを用いて、１００ｎｍのフィルターを通して、リポソームのサイズを整えた。その後、ゲル濾過によりリポソームを分離させて精製し、目的の、表面が式（１）で表される温度応答性ポリマーにより修飾された、実施例１に係るリポソームを作製した。
（比較例１）
インビトロジェン社製のリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）を準備し、これを比較例１に係るリポソームとした。
（比較例２）
リポソームを作製する際に、ＤＯＰＥに式（５）で表される脂質修飾温度応答性ポリマーを含まずに行わなかった点以外は、実施例１と同様の手順によって、比較例２に係るリポソームを作製した。比較例２に係るリポソームは、表面が式（１）で表される温度応答性ポリマーにより修飾されてない点以外は、実施例１に係るリポソームと同様である。
（比較例３）
実施例１において、式（１）で表される温度応答性ポリマーの代わりに、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量：２０００）を用いた点以外は、実施例１と同様の手順によって、比較例３に係るリポソームを作製した。
＜ｓｉＲＮＡの細胞内への送達後のルシフェラーゼ活性の測定−１＞
実施例１、比較例１〜３に係るリポソームについて、それぞれ、核酸との複合体の分散液を作製し、この分散液を用いて、核酸のＨｅＬａ細胞への送達を行った。核酸としては、ルシフェラーゼ活性を抑制するｓｉＲＮＡ（シグマジェノシス社製のｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ）を用いた。以下に、実施例１、比較例１〜３についての、ｓｉＲＮＡと複合体との分散液中における、それぞれのリポソームとｓｉＲＮＡの量を示す。なお、ｓｉＲＮＡと複合体との分散液中のｓｉＲＮＡ濃度は、全て終濃度を５０ｎＭとした。
実施例１：リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ（窒素とリンとのモル比））＝５：１
比較例１：ｓｉＲＮＡ：リポソーム＝０．１ｎｍｏｌ：１０μｌ（インビトロジェン社製のリポフェクタミン（液体に分散した状態で）１０μｌ）
比較例２：リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）＝５：１
比較例３：リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）＝５：１
具体的には、以下のような方法で、核酸との複合体の分散液の作製と、核酸の細胞内への送達を行った。
まず、６ｗｅｌｌプレートを用いて、それぞれのｗｅｌｌで最終濃度５０ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡを（ｎｏｎ ＦＢＳ（非ウシ胎児血清）（血清ＭＥＭ（最少必須培地）））に混合して、合計１２５μｌとして、５分間静置した。他方、実施例１、比較例１〜３に係るそれぞれのリポソームをｎｏｎ ＦＢＳ培地（血清ＭＥＭ（最少必須培地））１２５μｌに分散させ、５分間静置した。これら２つのｎｏｎ ＦＢＳ培地を混合することで、リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液を作製し、３０分間静置した。その後、分散液をＦＢＳ培地で１ｍｌにメスアップした。メスアップの後に、前日に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で６ｗｅｌｌプレートにまいておいたＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞）の培地をリポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液に変えて、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、それぞれのｗｅｌｌから培地を取り除き、ＰＢＳで５倍希釈した細胞溶解剤（ピッカジーン細胞溶解剤Ｌｃβ（東洋インキ））を２５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。この状態で３０分インキュベートした後、ピペッティングにより細胞をはがしてから、得られた溶液をマイクロチューブに移した。その後、マイクロチューブを−８０℃で凍結させ、細胞を崩壊させた。細胞を崩壊させた後、３７℃の浴槽で溶液を融解させ、１２０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心を行い、夾雑物を沈殿させた。得られた上澄みのうち９０μｌを他のマイクロチューブに移し、そこから１０μｌを９６ｗｅｌｌプレートに加え、更に５０μｌピッカジーン溶液を加えて発光測定を行い、ＨｅＬａ細胞内へのｓｉＲＮＡ送達後のルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、検出された発光量をＣ（Ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ Ｓｅｃｏｎｄ）とし、これをタンパク量Ｐ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｂｕｎｄａｎｔ）で除したものを単位発光量（Ｃ／Ｐ）として、それぞれの単位発光量について評価を行った。なお、上記の他にｓｉＲＮＡを細胞内に送達していないＨｅＬａ細胞の培地１０μｌを９６ｗｅｌｌプレートに加え、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイキットを使用して、ＢＣＡ標準品を０〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度として検量線を作成してからタンパク定量を行い、発光量Ｃ及びタンパク量Ｐから求められた単位発光量（Ｃ／Ｐ）を１００％（ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、上記の実施例１、比較例１〜３に係るルシフェラーゼ活性を相対的に評価した。
（対照例１）
実施例１に係るリポソームについて、ｓｉＲＮＡとの複合体を形成せず、リポソーム単独で細胞内へ送達した点以外は、全て上述と同様の条件で、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（対照例２）
比較例１に係るリポソームについて、ｓｉＲＮＡとの複合体を形成せず、リポソーム単独で細胞内へ送達した点以外は、全て上述と同様の条件で、ルシフェラーゼ活性を測定した。
＜ｓｉＲＮＡの細胞内への送達後の細胞生存率の測定＞
９６ｗｅｌｌプレートを用いて、それぞれのｗｅｌｌで最終濃度１００ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡを（ｎｏｎ ＦＢＳ（非ウシ胎児血清）（血清ＭＥＭ（最少必須培地）））に混合して、合計１２５μｌとして、５分間静置した。他方、実施例１、比較例１に係るそれぞれのリポソームをｎｏｎ ＦＢＳ培地（血清ＭＥＭ（最少必須培地））１２５μｌに分散させ、５分間静置した。これら２つのｎｏｎ ＦＢＳ培地を混合することで、リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液を作製し、３０分間静置した。その後、分散液をＦＢＳ培地で１ｍｌにメスアップした。メスアップの後に、前日に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で６ｗｅｌｌプレートにまいておいたＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞）の培地をリポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液に変え、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベートした後に、それぞれのｗｅｌｌにＷＳＴ−８溶液（同仁化学製品 Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８ − 同仁化学研究所社製）を１０μｌ加えて、更に３７℃で３０分インキュベートしてから、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率を測定した。また、未処理のＨｅＬａ細胞について、４５０ｎｍを測定し、この数値を細胞生存率１００％（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、上記の実施例１、比較例１に係る細胞生存率を相対的に評価した。
（対照例３）
実施例１に係るリポソームについて、ｓｉＲＮＡとの複合体を形成せず、リポソーム単独で細胞内へ送達した点以外は、全て上述と同様の条件で、細胞生存率を測定した。
（対照例４）
比較例１に係るリポソームについて、ｓｉＲＮＡとの複合体を形成せず、リポソーム単独で細胞内へ送達した点以外は、全て上述と同様の条件で、細胞生存率を測定した。
＜評価結果＞
図１に、実施例１、比較例１、対照例１、２についてのルシフェラーゼ活性の測定結果を示す。図２に、実施例１、比較例１〜３、対照例２についてのルシフェラーゼ活性の測定結果を示す。図３に、実施例１、比較例１、対照例３、４についての細胞生存率の測定結果を示す。
図１に示すグラフより、リポフェクタミンを用いてｓｉＲＮＡを送達した比較例１に係るルシフェラーゼ活性と、表面が式（１）で表される温度応答性ポリマーにより修飾されたリポソームを用いてｓｉＲＮＡを送達した実施例１に係るルシフェラーゼ活性は、同等であることが確認された。また、図２に示すグラフから、実施例１に係るルシフェラーゼ活性は、比較例２に係るルシフェラーゼ活性（表面が式（１）で表される温度応答性ポリマーにより修飾されていない以外、実施例１に係るリポソームと同様の構成を有するリポソームを用いたときのルシフェラーゼ活性）、比較例３に係るルシフェラーゼ活性（式（１）で表される温度応答性ポリマーの代わりに、表面がＰＥＧにより修飾された点以外は、実施例１に係るリポソームと同じリポソームを用いたときのルシフェラーゼ活性）より、高いことが確認された。これらの結果より、表面を温度応答性ポリマーで修飾したリポソームは、表面をＰＥＧで修飾したリポソーム、及び表面を修飾していないリポソームより、核酸の細胞内への送達効率が優れており、従来品であるリポフェクタミンと同様の核酸の細胞内への送達効率を有することが示された。
図３に示すグラフより、実施例１に係る細胞生存率は、比較例１に係る細胞生存率より、有意に優れていることが示された。しかも、実施例１に係る細胞生存率は、未処理のＨｅＬａ細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）の細胞生存率と、同等の細胞生存率を示した。このことから、実施例１に係る細胞生存率は、従来品であるリポフェクタミンより、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れることが示された。
以上のことから、本発明の核酸送達用キャリアは、核酸の細胞内への送達効率に優れ、更に、膜構成成分としてカチオン性脂質を含むにもかかわらず、核酸送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れることが示された。その理由は、本発明の核酸送達用キャリアは、リポソームの表面が温度応答性ポリマーで修飾されていることで、下限臨界溶解温度では水和層が形成され、カチオン性脂質による細胞毒性を抑制することが可能であり、温度上昇によりポリマーが疎水性となることにより水和層が減少し細胞親和性が向上し、膜融合性能を有する脂質によりリソソームを経由せず細胞内へ直接核酸を送達することができるからと推測される。
＜ｓｉＲＮＡの細胞内への送達後のルシフェラーゼ活性の測定−２＞
実施例１、比較例１、比較例３に係るリポソームについて、それぞれ、核酸との複合体の分散液を作製し、この分散液を用いて、異なる温度条件下で核酸のＨｅＬａ細胞への送達を行った。核酸としては、ルシフェラーゼ活性を抑制するｓｉＲＮＡ（シグマジェノシス社製のｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ）を用いた。以下に、実施例１、比較例１についての、ｓｉＲＮＡと複合体との分散液中における、それぞれのリポソームとｓｉＲＮＡの量を示す。なお、ｓｉＲＮＡと複合体との分散液中のｓｉＲＮＡ濃度は、全て終濃度を５０ｎＭとした。
実施例１：リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ（窒素とリンとのモル比））＝５：１
比較例１：ｓｉＲＮＡ：リポソーム＝０．１ｎｍｏｌ：１０μｌ（インビトロジェン社製のリポフェクタミン（液体に分散した状態で）１０μｌ）
比較例３：リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）＝５：１
具体的には、以下のような方法で、核酸との複合体の分散液の作製と、核酸の細胞内への送達を行った。
まず、６ｗｅｌｌプレートを用いて、それぞれのｗｅｌｌで最終濃度５０ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡを（ｎｏｎ ＦＢＳ（非ウシ胎児血清）（血清ＭＥＭ（最少必須培地）））に混合して、合計１２５μｌとして、５分間静置した。他方、実施例１、比較例に係るそれぞれのリポソームをｎｏｎ ＦＢＳ培地（血清ＭＥＭ（最少必須培地））１２５μｌに分散させ、５分間静置した。これら２つのｎｏｎ ＦＢＳ培地を混合することで、リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液を作製し、３０分間静置した。その後、分散液をＦＢＳ培地で１ｍｌにメスアップした。メスアップの後に、前日に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で６ｗｅｌｌプレートにまいておいたＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞）の培地をリポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液に変えて、３０℃又は４０℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、それぞれのｗｅｌｌから培地を取り除き、ＰＢＳで５倍希釈した細胞溶解剤（ピッカジーン細胞溶解剤Ｌｃβ（東洋インキ））を２５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。この状態で３０分インキュベートした後、ピペッティングにより細胞をはがしてから、得られた溶液をマイクロチューブに移した。その後、マイクロチューブを−８０℃で凍結させ、細胞を崩壊させた。細胞を崩壊させた後、３７℃の浴槽で溶液を融解させ、１２０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心を行い、夾雑物を沈殿させた。得られた上澄みのうち９０μｌを他のマイクロチューブに移し、そこから１０μｌを９６ｗｅｌｌプレートに加え、更に５０μｌピッカジーン溶液を加えて発光測定を行い、ＨｅＬａ細胞内へのｓｉＲＮＡ送達後のルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、検出された発光量をＣ（Ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ Ｓｅｃｏｎｄ）とし、これをタンパク量Ｐ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｂｕｎｄａｎｔ）で除したものを単位発光量（Ｃ／Ｐ）として、それぞれの単位発光量について評価を行った。なお、上記の他にｓｉＲＮＡを細胞内に送達していないＨｅＬａ細胞の培地１０μｌを９６ｗｅｌｌプレートに加え、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイキットを使用して、ＢＣＡ標準品を０〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度として検量線を作成してからタンパク定量を行い、発光量Ｃ及びタンパク量Ｐから求められた単位発光量（Ｃ／Ｐ）を１００％（ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、上記の実施例１、比較例１、比較例３に係るルシフェラーゼ活性を相対的に評価した。その結果を図４に示す。
図４に示すグラフより、温度応答性ポリマーにより修飾されたリポソームにおいては、温度応答性ポリマーの下限臨界溶解温度以下（３０℃）ではルシフェラーゼ活性が十分に抑制されていなかったにもかかわらず、下限臨界溶解温度以上（４０℃）ではルシフェラーゼ活性が従来品であるリポフェクタミンと同等に抑制されていた。
この結果により、表面を温度応答性ポリマーで修飾したリポソームは、温度を下限臨界溶解温度以上又は以下に調整することにより、細胞内への核酸の送達を制御できることが示された。
＜核酸送達用キャリアの準備−２＞
（実施例２）
［温度応答性ポリマーの合成］
式（２）で表されるＮＩＰＡＡｍ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と式（７）で表されるＤＭＡＡｍ（ジメチルアミノアクリルアミド）とのモル比率が６９．５：３０．５の割合になるようにＤＭＦ（ジチルホルムアミド）に溶解させた。なお、ＮＩＰＡＡｍとＤＭＡＡｍとの総量は１０ｇとした。溶解後の溶媒に、ＭＰＡ（３−メルカプトプロピオン酸）をＮＩＰＡＡｍの０．０２８ｍｏｌ倍となるように加え、更にＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を５８ｍｇ加えた。その後、溶媒に対して窒素置換と超音波による脱気を行った後、７０℃で５時間ラジカル重合を行った。反応後の液体の温度を室温に戻してから、あらかじめ冷やしておいたジエチルエーテルに滴下し、再沈精製を行った。その後、沈殿物を濾過で回収した。この再沈精製を更に２回行い、式（６）で表される温度応答性ポリマーを回収した。この式（６）で表される温度応答性ポリマーについて水により透析を行い、その後、凍結乾燥によって式（６）で表される温度応答性ポリマーを更に精製した。なお、式（６）で表される温度応答性ポリマーの分子量は５０００であり、水に対する下限臨界溶解温度は４１．８℃である。この反応スキームを以下に示す。
Figure 2016199895
［脂質修飾温度応答性ポリマーの合成］
式（６）で表される温度応答性ポリマーを活性エステル化させるために、モル比が、式（６）で表される温度応答性ポリマー：ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）：ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）＝１：２．５：２．５の割合となり、かつ、ポリマーと膜融合性脂質であるＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）とのモル比が１：１となるようにクロロホルムに溶解させ、室温で２４時間反応させた。反応後の溶液をメタノール溶液により透析することにより生成物を精製した。さらにエバポレーターでバキュームして溶媒を飛ばすことによって、式（８）で表される脂質修飾温度応答性ポリマーを調製した。この反応スキームを以下に示す。
Figure 2016199895
［リポソームの作製］
脂質総量が２０ｍｇとなり、モル比率が、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）：ＤＯＰＥ（式（８）で表される脂質修飾温度応答性ポリマーを含む）＝３：７の割合となるように、それぞれの脂質をクロロホルムに溶解させた。なお、クロロホルムに溶解したＤＯＰＥのうち、ＤＯＰＥと式（８）で表される脂質修飾温度応答性ポリマーとのモル比は、６．５：０．５とした。その溶液を、ナスフラスコに移動させ、エバポレーターで溶媒を飛ばし、リピッドフィルムを作製した。このリピッドフィルムに精製水を１ｍｌ加え、リピッドフィルムを水和させた後、ボルテックスで分散させた。その後、超音波槽で３０分ソニケーションを行い、リポソームのサイズを小さくしてから、エクストルーダーを用いて、１００ｎｍのフィルターを通して、リポソームのサイズを整えた。その後、ゲル濾過によりリポソームを分離させて精製し、目的の、表面が式（６）で表される温度応答性ポリマーにより修飾された、実施例２に係るリポソームを作製した。
＜ｓｉＲＮＡの細胞内への送達後のルシフェラーゼ活性の測定−１＞
実施例２に係るリポソームについて、核酸との複合体の分散液を作製し、この分散液を用いて、異なる温度条件下の核酸のＨｅＬａ細胞への送達を行った。核酸としては、ルシフェラーゼ活性を抑制するｓｉＲＮＡ（シグマジェノシス社製のｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ）を用いた。以下に、実施例２についての、ｓｉＲＮＡと複合体との分散液中における、それぞれのリポソームとｓｉＲＮＡの量を示す。なお、ｓｉＲＮＡと複合体との分散液中のｓｉＲＮＡ濃度は、全て終濃度を５０ｎＭとした。
実施例２：リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ（窒素とリンとのモル比））＝５：１
具体的には、以下のような方法で、核酸との複合体の分散液の作製と、核酸の細胞内への送達を行った。
まず、６ｗｅｌｌプレートを用いて、それぞれのｗｅｌｌで最終濃度５０ｎＭとなるようにｓｉＲＮＡを（ｎｏｎ ＦＢＳ（非ウシ胎児血清）（血清ＭＥＭ（最少必須培地）））に混合して、合計１２５μｌとして、５分間静置した。他方、実施例２に係るそれぞれのリポソームをｎｏｎ ＦＢＳ培地（血清ＭＥＭ（最少必須培地））１２５μｌに分散させ、５分間静置した。これら２つのｎｏｎ ＦＢＳ培地を混合することで、リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液を作製し、３０分間静置した。その後、分散液をＦＢＳ培地で１ｍｌにメスアップした。メスアップの後に、前日に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で６ｗｅｌｌプレートにまいておいたＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞）の培地をリポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体の分散液に変えて、３７℃又は４２℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、それぞれのｗｅｌｌから培地を取り除き、ＰＢＳで５倍希釈した細胞溶解剤（ピッカジーン細胞溶解剤Ｌｃβ（東洋インキ））を２５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。この状態で３０分インキュベートした後、ピペッティングにより細胞をはがしてから、得られた溶液をマイクロチューブに移した。その後、マイクロチューブを−８０℃で凍結させ、細胞を崩壊させた。細胞を崩壊させた後、３７℃の浴槽で溶液を融解させ、１２０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心を行い、夾雑物を沈殿させた。得られた上澄みのうち９０μｌを他のマイクロチューブに移し、そこから１０μｌを９６ｗｅｌｌプレートに加え、更に５０μｌピッカジーン溶液を加えて発光測定を行い、ＨｅＬａ細胞内へのｓｉＲＮＡ送達後のルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、検出された発光量をＣ（Ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ Ｓｅｃｏｎｄ）とし、これをタンパク量Ｐ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｂｕｎｄａｎｔ）で除したものを単位発光量（Ｃ／Ｐ）として、それぞれの単位発光量について評価を行った。なお、上記の他にｓｉＲＮＡを細胞内に送達していないＨｅＬａ細胞の培地１０μｌを９６ｗｅｌｌプレートに加え、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイキットを使用して、ＢＣＡ標準品を０〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度として検量線を作成してからタンパク定量を行い、発光量Ｃ及びタンパク量Ｐから求められた単位発光量（Ｃ／Ｐ）を１００％（ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、上記の実施例２に係るルシフェラーゼ活性を相対的に評価した。その結果を図５に示す。
図５に示す結果により、実施例１とは異なる組成の温度応答性ポリマーを用いたリポソームである実施例２によるｓｉＲＮＡトランスフェクションにおいても、ルシフェラーゼ活性の抑制が見られ、ＬＣＳＴ（下限臨界溶解温度）以下の温度と比較して、ＬＣＳＴ（下限臨界溶解温度）以上における活性の抑制が強く示された。
＜カルボキシフルオレセイン封入量測定＞
リポソームは実施例１に係るリポソームを準備し、リピッドフィルムの水和には精製水の代わりにカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）２ｍＭを含有したＰＢＳを１ｍｌ加えた。準備したリポソームをＰＢＳで２０倍希釈し、蛍光光度測定器にてその蛍光強度を測定し、ＣＦ封入時蛍光強度とした。また、Ｔｒｉｔｏｎ１０Ｘを１％加え、リポソームを完全崩壊させたのちに測定した蛍光強度を完全放出時の蛍光強度とした。そしてＴｒｉｔｏｎを加えたときの蛍光強度の値から封入時の蛍光強度の値を引くことで、その差を封入量として算出した。Ｔｒｉｔｏｎ処理前と処理後の蛍光強度を図６に示す。図６に示すように、Ｔｒｉｔｏｎ処理後に蛍光強度が増加したことから、カルボキシフルオレセインを封入できたことが確認された。
＜ＣＦ封入リポソームによるｓｉＲＮＡトランスフェクション＞
上記のカルボキシフルオレセインを封入した実施例１に係るリポソーム、及び比較例１に係るリポソーム（リポフェクタミン）に対して、ルシフェラーゼ活性を測定し、ｓｉＲＮＡトランスフェクション能を有するかを確認した。その結果を図７に示す。図７に示すように、比較例１と同等にルシフェラーゼ活性が低下しており、同等の効率のトランスフェクション能を有することが確認できた。すなわち、実施例１に係るリポソームは、リポソーム内に低分子物質であるカルボキシフルオレセインを封入することができ、かつそれを利用してｓｉＲＮＡと複合体を作製することにより、リポフェクタミンと同等な効率のトランスフェクション能を示した。
＜プラスミドトランスフェクション＞
上記の比較例１に係るリポソーム（インビトロジェン社製のリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００））、比較例３に係るリポソーム（温度応答性ポリマーの代わりにＰＥＧにより修飾）を準備した。また、上記の実施例１に係るリポソームを準備した。実施例１、比較例１及び比較例２に係るリポソームについて、核酸（プラスミド）との複合体の分散液をそれぞれ作製し、核酸（プラスミド）のＨｅＬａ細胞内への送達を行った。具体的には、以下のような方法で、核酸との複合体の分散液の作製と、核酸の細胞内への送達を行った。
５μｇのＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドを５０μｌの血清ｆｒｅｅ培地に分散させた。更に３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００及び２μｌのそれぞれのリポソームを５０μｌの血清ｆｒｅｅ培地に分散させた。これら２つの培地を混合して３０分間静置することでリポソーム・プラスミド複合体を作製した。その後、血清入り培地を複合体分散液に加え、１ｍｌになるようにメスアップした。メスアップ後に、前日に６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌあたりに５．０×１０４ｃｅｌｌｓで播種したＨｅＬａ細胞の培地を、リポソーム・プラスミド複合体を分散させた培地に入れ替えて４８時間４０℃でインキュベートした。インキュベート後、培地を取り除き、細胞をトリプシン処理によりｄｉｓｈからはがし、ＰＢＳを加えて遠心により細胞を洗浄したのち、フローサイトメトリーで観察を行い、ＨｅＬａ細胞のＧＦＰタンパク発現率を評価した。その結果を図８に示す。
図８に示す結果より、温度応答性ポリマーを修飾したリポソーム（実施例１）は、ＰＥＧリポソーム（比較例３）と比較して有意にプラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションすることができ、そのトランスフェクション能はリポフェクタミンと同等以上であった。

Claims (6)

  1. 膜融合性能を有するリポソームからなる、細胞内への核酸送達用キャリアであって、
    前記リポソームは、膜構成成分としてカチオン性脂質を含み、
    前記リポソームの表面が温度応答性ポリマーで修飾された、核酸送達用キャリア。
  2. 前記温度応答性ポリマーの水に対する下限臨界溶解温度が３５．０〜４５．０℃である、請求項１に記載の核酸送達用キャリア。
  3. 前記リポソームは、膜構成成分としてリン脂質を含む、請求項１又は２に記載の核酸送達用キャリア。
  4. 子宮頸癌細胞内への核酸の送達に用いられる、請求項１から３のいずれかに記載の核酸送達用キャリア。
  5. 請求項１から４のいずれかに記載の核酸送達用キャリアを含む、細胞内への核酸送達用キット。
  6. 請求項１から４のいずれかに記載の核酸送達用キャリアと核酸との複合体と、単離された細胞とを接触させる工程、又は、
    前記核酸送達用キャリアと核酸との複合体をヒトを除く動物に投与する工程を有する、細胞内への核酸送達方法。
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