JPWO2016125364A1 - 改良されたマイナス鎖rnaウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
Description
マイナス鎖RNAウイルスベクターを用いて一過性発現を行うために、本発明者らは当初、P遺伝子の欠損ベクターの使用を試みた。しかし作製したベクターを細胞に導入してレポーター蛋白質の発現を調べたところ、P蛋白質を発現しないHeLa細胞ではレポーター蛋白質の発現が確認できなかった。非特許文献3においてもP遺伝子欠損ベクターからの搭載遺伝子の発現は、P遺伝子を欠失していないベクターに比べて1/10以下であることが報告されている。また特許文献4の非複製型SeVベクターは十分な遺伝子発現量を得るために、高タイター、あるいはヘルパーベクターの存在を必要とし、生産効率も低い。一方、特許文献2に記載のTS12骨格やTS15骨格は感染細胞の培養条件を39℃で7日間培養を行うことにより、SeVベクターの除去を行っているが、37℃では除去により長い時間を必要とし、SeVベクター感染からアルカリホスファターゼ陽性のコロニーが得られるまでに28日間が経過している。また、iPS細胞は細胞増殖も速く、ベクターも除去されやすいと想定されるにも関わらずベクターがすぐに除去されないということは、HeLa細胞のような一般的な細胞株では、ベクターの除去により長い時間を必要とすると考えられる。
〔1〕 マイナス鎖RNAウイルスベクターであって、該ウイルスのP蛋白質にdegronを付加するようにP遺伝子が改変されたベクター。
〔2〕 該P蛋白質に温度感受性変異を含む、〔1〕に記載のベクター。
〔3〕 該温度感受性変異がL511F変異を含む、〔2〕に記載のベクター。
〔4〕 該温度感受性変異がD433A、R434A、およびK437Aを含む、〔2〕または〔3〕に記載のベクター。
〔5〕 該ウイルスのL蛋白質にL1361CおよびL1558Iの変異を含む、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載のベクター。
〔6〕 DegronがmTOR degron、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)degron、PEST、TetR degron、およびauxin-inducible degron(AID)からなる群より選択される、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のベクター。
〔7〕 DegronがmTOR degronである、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のベクター。
〔8〕 DegronがPESTである、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のベクター。
〔9〕 DegronがDHFR degronである、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のベクター。
〔10〕 DegronがTetR degronである、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のベクター。
〔11〕 少なくとも1つの外来遺伝子を搭載する、〔1〕から〔10〕のいずれかに記載のベクター。
〔12〕 該外来遺伝子が、degronが付加された蛋白質をコードする、〔11〕に記載のベクター。
〔13〕 該外来遺伝子がコードする蛋白質に付加されたdegronが、P蛋白質に付加されているdegronとは異なるdegronである、〔12〕に記載のベクター。
〔14〕 少なくとも2つの外来遺伝子を搭載し、それぞれの外来遺伝子がコードする蛋白質に、互いに異なるdegronが付加されている、〔1〕から〔13〕のいずれかに記載のベクター。
〔15〕 マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔1〕から〔14〕のいずれかに記載のベクター。
〔16〕 パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔15〕に記載のベクター。
〔17〕 マイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進するための方法であって、〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする方法。
〔18〕 温度を上昇して培養して除去を促進する工程を含む、〔17〕に記載の方法。
〔19〕 35〜39℃で培養して除去を促進する工程を含む、〔17〕または〔18〕に記載の方法。
〔20〕 〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもdegronが付加されていないNP、PおよびL蛋白質の存在下で発現させる工程を含む方法。
〔21〕 〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、搭載遺伝子の発現量を制御する方法。
〔22〕 搭載遺伝子が転写因子をコードする、〔21〕に記載の方法。
〔23〕 多能性幹細胞の作製において使用される、〔21〕または〔22〕に記載の方法。
〔24〕 〔13〕または〔14〕に記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの除去のタイミングとは独立に、外来遺伝子の発現を制御する方法。
〔25〕 マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法であって、該ウイルスまたはベクターを、〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のベクターと共感染させる工程を含む、方法。
〔26〕 〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去促進剤。
本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのP蛋白質にdegronを付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、ベクターの製造方法、ベクターの使用、およびベクターの除去促進方法等を提供する。
レスピロウイルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 N P/C/V M F H - L
またP蛋白質の変異としては、SeV P蛋白質の433位(D433)、434位(R434)、および437位(K437)から任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相当部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAla (A) への置換、434番目のアミノ酸のAla (A) への置換、437番目のアミノ酸のAla (A) への置換などが例示できる。特にこれら3つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
なお「TSΔF」は、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、F遺伝子を欠失することを言う。
mODC PEST配列(WO99/54348)
d2tag:mODC422-461:ACCESSION:P00860のC末端側422-461(配列番号:89)(DNA:配列番号:101)
d4tag:mODC422-461(T436A)(配列番号:90)
d1tag:mODC422-461(E428A/E430A/E431A)(配列番号:91)
また、WO99/54348に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、WO99/54348に記載のMODC376-461、MODC376-456、およびMODC422-461 (配列番号:89)、ならびにMODC422-461 に対する変異配列であるP426A/P427A、P438A、E428A/E430A/E431A、E444A、S440A、S445A、T436A、D433A/D434A、D448A、およびそれらの組み合わせの変異を含むもの等が好適なPEST配列として例示できる。また、これらのアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。特に好ましい配列は、MODC422-461 (配列番号:89)およびその変異体mODC422-461(T436A)(配列番号:90)である。また、P438AやS440Aなども本発明において好適に使用することができる。
DD-tag:FKBP(L106P):ACCESSION:NP_000792の変異体(F37V/L107P)(配列番号:93)(DNA:配列番号:102)
また、US2012/0178168に記載の他の変異体であってもよい。なお、US2012/0178168ではN末端側のMetを数えずにL106Pと表記しており、この変異はNP_000792のL107Pと同位置である。
具体的には、例えばACCESSION:NP_000792の2-108(FKBP2-108)(配列番号:92)、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはF36V、F15S、V24A、H25R、E60G、L106P、D100G、M66T、R71G、D100N、E102G、K105I(いずれもN末端側のMetを数えず2番目のアミノ酸を1とした位置を表す)、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。また、これらのアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。
DDG-tag:DHFR(H12L/Y100I):ACCESSION:B7MAH1 [UniParc](配列番号:94)(DNA:配列番号:42) の変異体(R12L/G67S/Y100I)(配列番号:95)
また、US2012/0178168に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、例えばDFHR蛋白質のアミノ酸配列(ACCESSION:B7MAH1、配列番号:94)、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはN18T/A19V、F103L、Y100I、G121V、H12Y/Y100I、H12L/Y100I、R98H/F103S、M42T/H114R、I61F/T68S、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。また、これらのアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。なお、1アミノ酸目のMetはなくてもよい。
TetR-tag:TetR(R28Q/D95N/L101S/G102D):ACCESSION:NP_941292(配列番号:96)(DNA:配列番号:80) の変異体(R28Q/D95N/L101S/G102D)(配列番号:97)
また、WO2007/032555に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、例えばTetR蛋白質のアミノ酸配列(ACCESSION:NP_941292、配列番号:96)、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはD95N、L101S、G102D、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。さらにR28Qの変異を含んでもよい。また、これらのアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。なお、1アミノ酸目のMetはなくてもよい。
本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製方法を以下に示す。尚、本発明において「18+」とはNP遺伝子の前にGOIを挿入することを表し、「(PM)」とは、P遺伝子とM遺伝子の間にGOIを挿入することを表し、「(F)」とはF遺伝子の代わり(M遺伝子とHN遺伝子の間)にGOIを挿入することを表し、「(HNL)」とは、HN遺伝子とL遺伝子の間にGOIを挿入することを表す。また本発明において「TS」とは、M蛋白質にG69E,T116A,およびA183S の変異を、HN蛋白質にA262T,G264R, およびK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL 蛋白質にN1197SおよびK1795E変異を持つことを表し、「ΔF」とは、F遺伝子を欠失していることを表す。例えばNP遺伝子の前にGOIを挿入するTS変異を有するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターはSeV18+/TSΔFと記載する。GOIの挿入に用いた制限酵素は特に断りがなければNotIである。また、TS12とはP蛋白に上記のTS変異に加えてD433A、R434A、およびK437Aの変異を含み、TS15とは上記のTS12変異に加えてL蛋白にL1361CおよびL1558Iの変異を含むセンダイウイルスベクターである。但しこれらは例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
pSeV(TDK)(WO2005/071092)由来のP遺伝子を NotIで消化したpEBMulti-Hyg(和光純薬工業社)にクローニングし、pEB-Pを得た。
phmAG(Amalgaam有限会社)よりAzami Green(AG)を鋳型にXhoI-AG-F (5’- ATATCTCGAGCTATGGTGAGCGTGATCA -3’)(配列番号:8)およびEcoRI-AG-R (5’- ATATGAATTCGCGGCCGCGATGAACT -3’)(配列番号:9)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をXhoIおよびEcoRIで消化(37℃で一晩)し、得られたDNA断片を、DD-tag配列(配列番号:93)を含むpPTuner(クロンテック)にクローニングし、pPTuner-ddAGを得た。このpPTuner-ddAGを鋳型にNotI-ddAG-F(5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGAGTGCAGGTGGA -3’)(配列番号:10)およびEcoRI-AG-R(配列番号:9)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(F)/TSΔFのNotIサイトにクローニングし、pSeV(F)ddAG/TSΔFを得た。pSeV(F)ddAG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(F)ddAG/TSΔFと称す。
上記ddAGをSeV(HNL)/TSΔFのNotIサイトにクローニングし、pSeV(HNL)ddAG/TSΔFを得た。pSeV(HNL)ddAG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)ddAG/TSΔFと称す。
pSeV18+/TSΔFを鋳型にBamHI-P-F (5’- ATATGGATCCAGTTCACGCGGCCGCA -3’)(配列番号:11)およびXhoI-P-R (5’- ATATCTCGAGTCGGTGCAGGCCTTTA -3’)(配列番号:12)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をBamHIおよびXhoIで消化し、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+(ストラタジーン社)にクローニングし、pBS-Pを得た。このpBS-Pを鋳型にPmut-F1 (5’- GGATCATACGGCGCGCCAAGGTACTTG -3’)(配列番号:13)、Pmut-R1 (5’- CAAGTACCTTGGCGCGCCGTATGATCC -3’)(配列番号:14)、Pmut-F2 (5’- CAACTAGATCCTGCAGGAGGCATCCTAC -3’)(配列番号:15)、およびPmut-R2 (5’- GTAGGATGCCTCCTGCAGGATCTAGTTG -3’)(配列番号:16)のプライマーを用いてPCR反応を行い、P遺伝子の上流にAscIサイトを、P遺伝子の下流にSbfIサイトを導入し、pBS-Pmutを得た。次にpSeV18+TSΔFを鋳型にBamHI-L-F(5’- ATATGGATCCGTACGATCGCAGTCCACCAT -3’)(配列番号:17)およびXhoI-L-R(5’- ATATCTCGAGCAGCTAGCTCAACTGA -3’)(配列番号:18)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をBamHIおよびXhoIで消化し、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-Lを得た。このpBS-Lを鋳型にLmut-F(5’- GTGAATGGGAGGCCGGCCATAGGTC -3’)(配列番号:19)およびLmut-R(5’- GACCTATGGCCGGCCTCCCATTCAC -3’)(配列番号:20)のプライマーを用いてPCR反応を行い、L遺伝子の上流にFseIサイトを導入し、pBS-Lmutを得た。次にpSeV18+/TSΔFをSalIおよびPvuIで消化し、pBS-Lmut をPvuIおよびKpnIで消化し、pBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-LmutSeVを得た。次にpBS-LmutSeVをNheIおよびSalIで消化し、pSeV18+/TSΔFにクローニングし、pSeV18+/LmutTSΔFを得た。次にpSeV18+/LmutTSΔFをNotI、NheI、およびStuIで消化し、pBS-PmutをNotIおよびStuIで消化し、これらのDNA断片を接合し、pSeV18+/PLmutTSΔFを得た。
pSeV18+/TSΔFを鋳型にXhoI-L-F(5’- ATATCTCGAGTCACTAAAGAGT -3’)(配列番号:21)およびHindIII-L-R(5’- ATATAAGCTTCGAGCTGTCATATGGCT -3’)(配列番号:22)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をXhoIおよびHindIIIで消化し、XhoI-L断片を得た。次にpPTunerを鋳型にHindIII-dd-F(5’- ATATAAGCTTCACCGGTCGGGAGTGCAGGTGGAAA -3’)(配列番号:23)およびKpnI-dd-R1(5’- ATATGGTACCCTATTCCAGTTCTAGAAGCTCCACATCGA -3’)(配列番号:24)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をHindIIIおよびKpnIで消化し、dd-KpnI断片を得た。これらのXhoI-L断片とdd-KpnI断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-XhoI-Lddを得た。次にpBS-XhoI-Lddを鋳型にXhoI-L-F(配列番号:21)およびKpnI-Ldd-R2(5’- ATATGGTACCGCCTATTCCAGTTCTAG -3’)(配列番号:25)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をXhoIおよびKpnIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/LddTSΔFを得た。次にTagBFP(Evrogen社)をpCI-neo(プロメガ社)にクローニングして得たpCI-BFP-EISをNotIで消化し、pSeV18+/LddTSΔFにクローニングし、pSeV18+BFP/LddTSΔFを得た。pSeV18+BFP/LddTSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/LddTSΔFと称す。
pSeV18+/LddTSΔFを鋳型にAscI-Pdd-F(5’- ATATGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCG -3’)(配列番号:26)およびHindIII-Pdd-R(5’- ATATAAGCTTGTTGGTCAGTGACTC -3’)(配列番号:27)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をAscIおよびHindIIIで消化し、AscI-P断片を得た。次にpSeV18+/LddTSΔFを鋳型にHindIII-dd-F(配列番号:23)およびSbfI-Pdd-R(5’- ATATCCTGCAGGATCTATTCCAGTTCTAG -3’)(配列番号:28)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をHindIIIおよびSbfIで消化し、Pdd-SbfI断片を得た。これらのAscI-P断片およびPdd-SbfI断片をpSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/PddTSΔFを得た。次にpCI-BFP-EISをNotIで消化し、pSeV18+/PddTSΔFにクローニングし、pSeV18+BFP/PddTSΔFを得た。pSeV18+BFP/PddTSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/PddTSΔFと称す。
半減期を調節することが知られているmODCのPEST配列(WO99/54348)をGFPに付加し、半減期の異なるd1GFP、d2GFP、d4GFPを作製した。mODCのPEST配列であるmODC422-461をd2(配列番号:89)、mODC422-461に半減期を短くするためのE428A/E430A/E431A変異を加えたものをd1(配列番号:91)、mODC422-461に半減期を長くするためのT436A変異を加えたものをd4(配列番号:90)と称する。
pSeV18+GFP/TS7ΔF(WO2010/008054; WO2012/029770)を鋳型にNotI-GFP-F(5’- ATTGCGGCCGCCAAGGTTCACTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG -3’)(配列番号:29)、NotI-GFP-R1(5’- CCGGCGGGAAGCCATGGCTAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCC -3’)(配列番号:30)、NotI-GFP-R2(5’- GGCGCTCTCCTGGGCACAAGACATGGGCAGCGTGCCATCATCCTGGGCGGCCACGGCCGGCGGGAAGCCA -3’)(配列番号:31)、NotI-GFP-R3(5’- CTACACATTGATCCTAGCAGAAGCACAGGCTGCAGGGTGGCGGTCCATGGCGCTCTCCTGGGCACAAGAC -3’)(配列番号:32)、およびNotI-GFP-R4(5’- ATATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCTACACATTGATCCTAGCAGAAGC -3’)(配列番号:33)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d1GFP/TSΔFを得た。次にpSeV18+GFP/TS7ΔFを鋳型にNotI-GFP-F(配列番号:29)、NotI-GFP-R1(配列番号:30)、NotI-GFP-R3(配列番号:32)、NotI-GFP-R4(配列番号:33)およびNotI-GFP-R5(5’- GGCGCTCTCCTGGGCACAAGACATGGGCAGCGTGCCATCATCCTGCTCCTCCACCTCCGGCGGGAAGCCA -3’)(配列番号:34)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d2GFP/TSΔFを得た。次にpSeV18+GFP/TS7ΔFを鋳型にNotI-GFP-F(配列番号:29)、NotI-GFP-R1(配列番号:30)、NotI-GFP-R3(配列番号:32)、NotI-GFP-R4(配列番号:33)およびNotI-GFP-R6(5’- GGCGCTCTCCTGGGCACAAGACATGGGCAGGGCGCCATCATCCTGCTCCTCCACCTCCGGCGGGAAGCCA -3’)(配列番号:35)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d4GFP/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d1GFP/TSΔF、pSeV(HNL)d2GFP/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4GFP/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d1GFP/TSΔF、SeV(HNL)d2GFP/TSΔF、およびSeV(HNL)d4GFP/TSΔFと称す。
pSeV18+AG/TSΔFを鋳型にAG-F1(5’- ACAAGAGAAAAAACATGTATGG -3’)(配列番号:36)およびAG-R1(5’- CCATGGCTAAGCTTCTTGGCCTGGCTGGGC -3’)(配列番号:37)のプライマーを用いてPCR反応を行い、AG断片を得た。次にpSeV(HNL)d1GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2(5’- GCCCAGCCAGGCCAAGAAGCTTAGCCATGG -3’)(配列番号:38)およびAG-R2(5’- GATAACAGCACCTCCTCCCGACT -3’)(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1断片を得た。次にpSeV(HNL)d2GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびAG-R2(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2断片を得た。次にpSeV(HNL)d4GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびAG-R2(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4断片を得た。次にAG断片、d1、d2、およびd4断片を鋳型にAG-F1(配列番号:36)およびAG-R2(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行った。これらのPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d1AG/TSΔF、pSeV(HNL)d2AG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4AG/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d1AG/TSΔF、pSeV(HNL)d2AG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4AG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d1AG/TSΔF、SeV(HNL)d2AG/TSΔF、およびSeV(HNL)d4AG/TSΔFと称す。
pSeV(F)ddAG/TSΔFを鋳型にddAG-F1(5’- ATCAGAGACCTGCGACAA -3’)(配列番号:40)およびAG-R1(配列番号:37)のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddAG-F断片を得た。次にpSeV(HNL)d1GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびddAG-R(5’- CTGGATAGAGTATGTCAGAAGGGTTTTG -3’)(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1ddAG-R断片を得た。次にddAG-F断片およびd1ddAG-R断片を鋳型にAG-F1(配列番号:36)およびddAG-R(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1ddAG断片を得た。次にpSeV(HNL)d2GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびddAG-R(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2ddAG-R断片を得た。次にddAG-F断片およびd2ddAG-R断片を鋳型にAG-F1(配列番号:36)およびddAG-R(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2ddAG断片を得た。次にpSeV(HNL)d4GFP/TSΔFを鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびddAG-R(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2ddAG-R断片を得た。次にddAG-F断片およびd2ddAG-R断片を鋳型にAG-F1(配列番号:36)およびddAG-R(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4ddAG断片を得た。次にこれらのPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d1ddAG/TSΔF、pSeV(HNL)d2ddAG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4ddAG/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d1ddAG/TSΔF、pSeV(HNL)d2ddAG/TSΔF、およびpSeV(HNL)d4ddAG/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d1ddAG/TSΔF、SeV(HNL)d2ddAG/TSΔF、およびSeV(HNL)d4ddAG/TSΔFと称す。
人工遺伝子合成により合成したecDHFR配列(配列番号:42)(Biomatik社)(US2012/0178168の配列をコドン改変した)を鋳型にddg-F(5’- ATTAACCCTCACTAAAGGGA -3’)(配列番号:43)およびddg-R(5’- CCTTAGACACTCGCCGCTCCAGAATCTC -3’)(配列番号:44)のプライマーを用いてPCR反応を行い、DDG-tag(配列番号:95)を含むddg断片を得た。次にTagRFP(Evrogen社)を搭載したSeV18+RFP/TSΔFを鋳型にRFP-F(5’- GAGCGGCGAGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTG -3’)(配列番号:45)およびRFP-R(5’- GGCTAAGCTTATTAAGTTTGTGCCCCAG -3’)(配列番号:46)のプライマーを用いてPCR反応を行い、RFP断片を得た。次にpSeV(HNL)d2AG/TSΔFを鋳型にd2-F(5’- CAAACTTAATAAGCTTAGCCATGGCTTCCC -3’)(配列番号:47)およびddAG-R(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2RFP断片を得た。次にddg断片、RFP断片、およびd2RFP断片を鋳型にddg-F(配列番号:43)およびddAG-R(配列番号:41)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFを得た。pSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFと称す。
pSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFをNotIで消化し、d2ddgRFP をSeV(PM)/TS12ΔFにクローニングし、SeV(PM)d2ddgRFP/TS12ΔFを得た。次にpSeV(HNL)d2ddAG/TSΔFをNotIで消化し、d2ddAGをpSeV(HNL)/TS12ΔFにクローニングし、pSeV(HNL)d2ddAG/TS12ΔFを得た。次にSeV(PM)d2ddgRFP/TS12ΔFおよびpSeV(HNL) d2ddAG/TS12ΔFをPacIおよびNheIで消化、接合し、pSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔFを得た。pSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔFと称す。
人工遺伝子合成により合成したTIR1配列(配列番号:48)(Biomatik社)(WO2010/125620の配列をコドン改変した)を搭載したpBMH-TIR1をNotIで消化し、pSeV18+/TSΔFにクローニングし、pSeV18+TIR1/TSΔFを得た。次にpSeV(HNL)AG/TSΔFを鋳型にAGaid-F(5’- TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG -3’)(配列番号:49)、AGaid-R1(5’- CACTGGTGGCCATCCCACAACTTGACTACCTCCACCTCCGCTTCCACCTCCACCACTCTTGGCCTGACTC -3’)(配列番号:50)、AGaid-R2(5’- CTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCTACTTTCTATATGATCTCACTGGTGGCCATCCC -3’)(配列番号:51)、およびAGaid-R3(5’- CTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC -3’)(配列番号:52)のプライマーを用いてPCR反応を行い、AID配列(accession番号AY117183の244-282 (配列番号:98)、およびAAM51258の82-94 (配列番号:99))を含む断片を増幅した。なお上記プライマーは、天然のAID配列(accession番号AY117183の244-282)にサイレント変異(g264aおよびccgg276-279taga;配列番号:100)が導入されるよう設計されている。このPCR産物をNotIで消化し、得られたDNA断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)AGaid/TSΔFを得た。次にpSeV18+TIR1/TSΔFおよびpSeV(HNL)AGaid/TSΔFをSphIおよびAatIで消化し、接合し、pSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔFを得た。pSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔFと称す。
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にPaid-F(5’- CTGCAACCCATGGAGATGAAGG -3’)(配列番号:53)、Paid-R1(5’- CTGGTGGCCATCCCACAACTTGACTACCTCCACCTCCGCTTCCACCTCCACCACTGTTGGTCAGTGACTC -3’)(配列番号:54)、およびPaid-R2(5’- TATACCTGCAGGATCTACTTTCTATATGATCTCACTGGTGGCCATCCCAC -3’)(配列番号:55)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をAscIおよびSbfIで消化し、得られたDNA断片をpSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/PaidTSΔFを得た。次にpBMH-TIR1をNotIで消化し、pSeV18+/PaidTSΔFにクローニングし、pSeV18+TIR1/PaidTSΔFを得た。次にpSeV18+TIR1/PaidTSΔFをStuIおよびAatII、pSeV(HNL)d2AG/TSΔFをStuI、NheI、およびAatII、pSeV(HNL)d2AG/TSΔFをNheIおよびAatIIで消化し、これらを接合し、pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFを得た。pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔFと称す。
pSeV18+/TSΔFを鋳型にLaid-F(5’- ATCACTGCTAGATCTGTGCTGC -3’)(配列番号:56)、Laid-R1(5’- GGTGGCCATCCCACAACTTGACTACCTCCACCTCCGCTTCCACCTCCACCACTCGAGCTGTCATATGGC -3’)(配列番号:57)、Laid-R2(5’- CTAATTACTACTTTCTATATGATCTCACTGGTGGCCATCCCACAACTTGACTAC -3’)(配列番号:58)、およびLaid-R3(5’- TATAGGTACCGCGGAGCTTCGATCGTTCTGCACGATAGGGACTAATTACTACTTTCTATATGATC -3’)(配列番号:59)のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をNheIおよびKpnIで消化し、得られたDNA断片をpSeV18+TIR1/TSΔFにクローニングし、pSeV18+TIR1/LaidTSΔFを得た。次にpSeV18+TIR1/LaidTSΔFをSphI、NheI、およびSalIで消化し、pSeV(HNL)d2AG/TSΔFをSphI、NheI、およびXhoIで消化し、これらを接合し、pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔFを得た。pSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔFと称す。
pSeV18+/TS15ΔFを鋳型にAscI-Pdd-F(配列番号:26)および HindIII-Pdd-R(配列番号:27)のプライマーを用いてPCR反応を行った。この断片をAscIおよびHindIIIで消化し、AscI-Pts15断片を得た。次にこのAscI-Pts15断片およびSbfI-Pdd断片をpSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/Pts15ddTSΔFを得た。次にpSeV18+/Pts15ddTSΔFおよびpSeV18+/TS15ΔFをKpnIおよびNheIで消化し、これらを接合し、pSeV18+/PddTS15ΔFを得た。pSeV18+/PddTS15ΔFにBFPおよびGFPを搭載し、pSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/PddTS15ΔFを得た。pSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/PddTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびSeV18+GFP/PddTS15ΔFと称す。
pSeV18+/TS15ΔFを鋳型にddPts15-F1(5’- ATTCTCGAGGATCAAGATGCCTTCATTC -3’)(配列番号:60)およびddPts15-R2(5’- AATAAGCTTCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’)(配列番号:61)のプライマーを用いてPCR反応を行った。この断片をXhoIおよびHindIIIで消化し、pPTunerにクローニングし、pPTuner-Pts15を得た。次にpSeV18+/TS15ΔFを鋳型にddPts15-F2(5’- ATTGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCGTAG -3’)(配列番号:62)およびddPts15-R2(5’- CACCTGCACTCCCATGCGGTAAGTGTAGC -3’)(配列番号:63)のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscI-ddPts15を得た。次にpPTuner-Pts15を鋳型にddPts15-F3(5’- GCTACACTTACCGCATGGGAGTGCAGGTG -3’)(配列番号:64)およびddPts15-R3(5’- AATCCTGCAGGTGATGATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’)(配列番号:65)のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddPts15-SbfIを得た。次にAscI-ddPts15およびddPts15-SbfIを鋳型にddPts15-F2(配列番号:62)およびddPts15-R3(配列番号:65)のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscI-ddPts15-SbfIを得た。次にAscI-ddPts15-SbfIをAscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/ddPts15TSΔFを得た。次にpSeV18+/ddPts15TSΔFおよびpSeV18+/TS15ΔFをKpnIおよびNheIで消化し、これらを接合し、pSeV18+/ddPTS15ΔFを得た。pSeV18+/ddPTS15ΔFにBFPおよびGFPを搭載し、pSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/ddPTS15ΔFを得た。pSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびpSeV18+GFP/ddPTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびSeV18+GFP/ddPTS15ΔFと称す。
pRL-TK(プロメガ社)を鋳型にHSVp-F(5’- ATATAGATCTAAATGAGTCTTCGGACCTCG -3’)(配列番号:66)およびHSVp-R(5’- ATATGCTAGCTTAAGCGGGTCGCTGCAG -3’)(配列番号:67)のプライマーを用いてPCR反応を行い、HSV promoterを得た。HSV promoterをBglIIおよびNheIで消化し、pCI-neo(プロメガ社)にクローニングし、pHSV-neoを得た。次にpFN21A HaloTag(プロメガ社)を鋳型にHaloTag-F1(5’- TCTGTACTTTCAGAGCGATAACGATGGATCCGAAATCGGTACTGGC -3’)(配列番号:68)、HaloTag-R(5’- GCGGCCGCTTAACCGGAAATCTCGAGCGTC -3’)(配列番号:69)、およびHaloTag-F2(5’- GCTAGCATATGGTACCCCAACCACTGAGGATCTGTACTTTCAGAGCG -3’)(配列番号:70)のプライマーを用いてPCR反応を行い、pGEM-T Easy(プロメガ社)にクローニングし、pGEM-HaloTagを得た。次にpSeV18+/ddPTS15ΔFを鋳型にddP-Halo-F(5’- ATATGCTAGCATGGGAGTGCAGGTGGAAAC -3’)(配列番号:71)およびddP-Halo-R(5’- ATATGGTACCCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’)(配列番号:72)のプライマーを用いてPCR反応を行った。得られたPCR産物をNheIおよびKpnIで消化し、pGEM-HaloTagにクローニングし、pGEM-ddP-Haloを得た。得られたpGEM-ddP-HaloをNheIおよびNotIで消化し、pHSV-neoにクローニングし、pHSV-ddP-Haloを得た。次にpSeV18+/PddTS15ΔFを鋳型にPdd-Halo-F(5’- ATATGCTAGCATGGATCAAGATGCCTTC -3’)(配列番号:73)およびKpnI-dd-R1(配列番号:24)のプライマーを用いてPCR反応を行った。得られたPCR産物をNheIおよびKpnIで消化し、pGEM-HaloTagにクローニングし、pGEM-Pdd-Haloを得た。得られたpGEM-Pdd-HaloをNheIおよびNotIで消化し、pHSV-neoにクローニングし、pHSV-Pdd-Haloを得た。
pSeV18+/PLmutTSΔF の18+位にAGが搭載されたpSeV18+AG/PLmutTSΔFを鋳型にAG-F1(配列番号:36)および AG-R1(配列番号:37)のプライマーを用いてPCR反応を行い、dAG断片を得た。次にpSeV(HNL)d1GFP/TSdF を鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびdAG-R2(5’- CAAAACCCTTCTGACATACTCTATCCAG -3’)(配列番号:74)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d1断片を得た。次にdAG断片およびd1断片を鋳型にAG-F1(配列番号:36)およびdAG-R2(配列番号:74)のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたd1AG断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-d1AGを得た。次にpSeV(HNL)d2GFP/TSdF を鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびdAG-R2(配列番号:74)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2断片を得た。次にdAG断片およびd2断片を鋳型にAG-F1(配列番号:36)およびdAG-R2(配列番号:74)のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたd2AG断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-d2AGを得た。次にpSeV(HNL)d4GFP/TSdF を鋳型にAG-F2(配列番号:38)およびdAG-R2(配列番号:74)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4断片を得た。次にdAG断片およびd4断片を鋳型にAG-F1(配列番号:36)およびdAG-R2(配列番号:74)のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたd4AG断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-d4AGを得た。次にpBS-d1AG、pBS-d2AG、およびpBS-d4AG をNotIで消化し、pSeV18+/PddTS15ΔFにクローニングし、pSeV18+d1AG/PddTS15ΔF、pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF、およびpSeV18+d4AG/PddTS15ΔFを得た。pSeV18+d1AG/PddTS15ΔF、pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF、およびpSeV18+d4AG/PddTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d1AG/PddTS15ΔF、SeV18+d2AG/PddTS15ΔF、およびSeV18+d4AG/PddTS15ΔFと称す。
pSeV18+d2AG/TS15ΔFを鋳型にPaid-F(配列番号:53)、dP-R1(5’- CCATGGCTAAGCTTGTTGGTCAGTGACTC -3’)(配列番号:75)、dP-R2(5’- CCGGCGGGAAGCCATGGCTAAGCTTGTTGG -3’)(配列番号:76)、NotI-GFP-R5(配列番号:34)、 NotI-GFP-R3(配列番号:32)、およびdP-R5(5’- ATTCCTGCAGGATCTACACATTGATCCTAGCAGAAGC -3’)(配列番号:77)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2P断片を得た。次にd2P断片およびpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV18+d2AG/TS15ΔFを鋳型にPaid-F(配列番号:53)、dP-R1(配列番号:75)、dP-R2(配列番号:76)、NotI-GFP-R6(配列番号:35)、NotI-GFP-R3(配列番号:32)、およびdP-R5(配列番号:77)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d4P断片を得た。次にd4P断片およびpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFを得た。pSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFおよびpSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFおよびSeV18+d2AG/d4PTS15ΔFと称す。
pSeV(HNL)d2ddgRFP/TS/dFを鋳型にHindIII-ddg-F(5’- AATAAGCTTCACCGGTCGATCAGTCTGATTGCGG -3’)(配列番号:78)およびSbfI-ddg-R(5’- CTTCCTGCAGGATTATCTATCGCCGCTCCAGAATCTC -3’)(配列番号:79)のプライマーを用いてPCR反応を行い、HindIII およびSbfIで消化し、HindIII-ddg-SbfI断片を得た。次にpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFのPddの代わりにPaidが挿入されたpSeV18+d2AG/PaidTS15ΔFをAscI、SbfI、HindIIIで消化し、AscI-P-HindIII断片を得た。次にHindIII-ddg-SbfI断片およびAscI-P-HindIII断片をAscIおよびSbfIで消化したpSeV18+d2AG/PaidTS15ΔFに接合し、pSeV18+d2AG/PddgTS15ΔFを得た。pSeV18+d2AG/PddgTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/PddgTS15ΔFと称す。
人工遺伝子合成により合成したTetR変異体配列(配列番号:80)(アミノ酸配列は配列番号:97)(FASMAC社)(WO2007/032555の配列をコドン改変した)を鋳型にNotI-tetR-F(5’- ATATGCGGCCGCCTTGCCACCATGTCTAGGCTGGACAAG -3’)(配列番号:81)およびtetR-R(5’- CACGCTCACAGACCCACTTTCACATTTAAG -3’)(配列番号:82)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-tetR断片を得た。次にpSeV18+d2AG/PddTS15dFを鋳型にd2AG-F(5’- GTGGGTCTGTGAGCGTGATCAAGCCCGAG -3’)(配列番号:83)およびAG-R2(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行い、td2AG断片を得た。次にNotI-tetR断片およびtd2AG断片を鋳型にNotI-tetR-F(配列番号:81)およびAG-R2(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行い、d2tetRAG断片を得た。次にd2tetRAG断片をpSeV(HNL)/TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL) d2tetRAG/TSΔFを得た。pSeV(HNL) d2tetRAG/TSΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL) d2tetRAG/TSΔFと称す。
pSeV18+d2AG/PddTS15dFを鋳型にPaid-F(配列番号:53)およびdP-R7(5’- CAGCCTAGAGTTGGTCAGTGACTCTATGTC -3’)(配列番号:84)のプライマーを用いてPCR反応を行い、Ptet断片を得た。次にTetR変異体配列(配列番号:80)を鋳型にPtetR-F(5’- CTGACCAACTCTAGGCTGGACAAGAGTAAG -3’)(配列番号:85)およびPtetR-R(5’- ATATCCTGCAGGATCTAAGACCCACTTTCACATTTAAG -3’)(配列番号:86)のプライマーを用いてPCR反応を行い、tetR-SbfI断片を得た。次にPtet断片およびtetR-SbfI断片を鋳型にPaid-F(配列番号:53)およびPtetR-R(配列番号:86)のプライマーを用いてPCR反応を行い、PtetR断片を得た。次にPtetR断片をAscIおよびSbfIで消化したpSeV18+d2AG/TS15ΔFにクローニングし、pSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFを得た。pSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFと称す。
d2AGをpSeV18+/TS12ΔFにクローニングし、pSeV18+d2AG/TS12ΔFを得た。次にpSeV18+/TS12ΔF およびpSeV18+d2AG/d2PTS15ΔFをNheIおよびKpnIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/d2PTS12ΔFを得た。次にpSeV18+/TS12ΔF およびpSeV18+d2AG/PddTS15ΔFをNheIおよびKpnIで消化し、接合し、pSeV18+d2AG/PddTS12ΔFを得た。pSeV18+d2AG/TS12ΔF、pSeV18+d2AG/d2PTS12ΔF、およびpSeV18+d2AG/PddTS12ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+d2AG/TS12ΔF、SeV18+d2AG/d2PTS12ΔF、およびSeV18+d2AG/PddTS12ΔFと称す。
pSeV(HNL)AG/PaidTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、pSeV(HNL)AG/TS15ΔF(AscI/SbfI)断片を得た。次にpSeV18+d2AG/d2PTS15ΔF 、pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF 、pSeV18+d2AG/PddgTS15ΔF 、およびpSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、d2P、Pdd、Pddg、PtetR断片を得た。次にこれらの接合を行い、pSeV(HNL)AG/d2PTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddgTS15ΔF 、およびpSeV(HNL)AG/PtetRTS15ΔFを得た。次にpSeV(PM)KOS(HNL)cMYC/TSΔFをNotIで切断し、得られたcMYC断片をNotIで消化したpSeV(HNL)AG/d2PTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddTS15ΔF 、pSeV(HNL)AG/PddgTS15ΔF 、およびpSeV(HNL)AG/PtetRTS15ΔF にクローニングし、pSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔFを得た。pSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF、pSeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF、SeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF、SeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF、SeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔFと称す。
pSeV18+TSΔFを鋳型にNotI-SeV-Pd144-F(5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGATATCCGAGA -3’)(配列番号:103)およびSeV-P-NotI-R(5’- ATATGCGGCCGCCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’)(配列番号:104)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-Pd144断片を得た。pSeV18+TSΔFを鋳型にNotI-SeV-Pd307-F(5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGTCTAGAGACC -3’)(配列番号:105)およびSeV-P-NotI-R(配列番号:104)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-Pd307断片を得た。pSeV18+TSΔFを鋳型にNotI-SeV-Pct-F(5’- ATATGCGGCCGCACCATGGGAGAGAACACA -3’)(配列番号:106)およびSeV-P-NotI-R(配列番号:104)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotI-Pct断片を得た。得られた断片をNotIで消化し、pCAGGS(Gene, vol.108, pp193-199, 1991)のEcoRIサイトにNotIリンカーを組み込んだプラスミドにクローニングし、pCAGGS-d144P、pCAGGS-d307P、pCAGGS-Pctを得た。
人工遺伝子合成により合成したMeV(AIK-C):ACCESSION:AF266286のP遺伝子(配列番号:107)(GENEWIZ社)、NDV(LaSota):ACCESSION:AY845400のP遺伝子(配列番号:108)(GENEWIZ社)、PIV2:ACCESSION:M37748のP遺伝子(配列番号:109)(GENEWIZ社)、VSV(Indiana):ACCESSION:FJ478454のP遺伝子(配列番号:110)(GENEWIZ社)をNheIおよびHindIIIで消化し、pHSV-Pdd-Haloにクローニングし、pHSV-MeV-Pdd-Halo、pHSV-NDV-Pdd-Halo、pHSV-PIV2-Pdd-Halo、pHSV-VSV-Pdd-Haloを得た。次にpHSV-Pdd-Haloとこれらのプラスミドを鋳型にそれぞれNotI-TKp-F(5’- ATATGCGGCCGCGCTTAAGCTAGCATG -3’)(配列番号:111)およびHaloTag-R(配列番号:69)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pEBMulti-Hygクローニングし、pEB-SeV-Pdd-Halo、pEB-MeV-Pdd-Halo、pEB-NDV-Pdd-Halo、pEB-PIV2-Pdd-Halo、pEB-VSV-Pdd-Haloを得た。
YukonOFP(DNA2.0社)を鋳型にNotI-OFP-F (5’- ATATGCGGCCGCTCGCCACCATGTCACTGTCTAAACAGGTG -3’)(配列番号:112)およびOFP-EIS-NotI-R (5’- ATATGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTTACTAGGTTTCCTTGACGTCCACGGTGAAAT -3’)(配列番号:113)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV18+TSΔFにクローニングし、pSeV18+OFP/TSΔFを得た。DasherGFP(DNA2.0社)を鋳型にNotI-DGFP-F (5’- ATAGCGGCCGCGACATGACTGCCCTGACCG -3’)(配列番号:114)およびDGFP-EIS-NotI-R (5’- TATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACTGATAGGTATCGAGATCGAC -3’)(配列番号:115)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV18+TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/TSΔFを得た。次にpSeV(HNL)d2ddgRFP/TSΔFを鋳型にAGaid-F(配列番号:49)およびddgOFP-R(5’- TTAGACAGTGATCGCCGCTCCAGAATCTC -3’)(配列番号:116)のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddgOFP-N断片を得た。pSeV18+OFP/TSΔFを鋳型にddgOFP-F(5’- GGAGCGGCGATCACTGTCTAAACAGGTGC -3’)(配列番号:117)およびEIS-NotI-2R(5’- CCTGCGGCCGCATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC -3’)(配列番号:118)のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddgOFP-EIS断片を得た。ddgOFP-N断片およびddgOFP-EIS断片を鋳型にddgOFP-F(配列番号:117)およびEIS-NotI-2R(配列番号:118)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV(PM)/d2PTS15ΔFにクローニングし、pSeV(PM)ddgOFP/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV18+BFP/PddTS15ΔFを鋳型にNotI-dd-F(5’- ATATGCGGCCGCGCCACCATGGGAGTGCAGGTGGAAACC -3’)(配列番号:119)およびddgOFP-R(5’- CGGTCAGGGCAGTTTCCAGTTCTAGAAGC -3’)(配列番号:120)のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddDGFP-N断片を得た。pSeV18+DGFP/TSΔFを鋳型にddDGFP-F(5’- TCTAGAACTGGAAACTGCCCTGACCGAAGG -3’)(配列番号:121)およびAG-R2(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行い、ddDGFP-EIS断片を得た。ddDGFP-N断片およびddDGFP-EIS断片を鋳型にddDGFP-F(配列番号:121)およびAG-R2(配列番号:39)のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV(HNL)/d2PTS15ΔFにクローニングし、pSeV(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV(PM)ddgOFP/d2PTS15ΔFをSalIおよびAseIで消化し、pSeV(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFをAseIおよびNheIで消化し、pSeV(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFをSalIおよびNheIおよびNotIで消化し、得られた(PM)ddgOFP断片および(HNL)ddDGFP断片およびpSeV-SalI-NheI断片を接合し、pSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFを得た。次にpSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFおよびSeV18+BFP/PddTS15ΔFをAscIおよびSbfIで消化し、接合し、pSeV(PM) ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔFを得た。pSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFおよびpSeV(PM) ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔFの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔFおよびSeV(PM) ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔFと称す。
pSeV18+ΔFを鋳型にBamHI-P-F(配列番号:11)およびPmut-R1(配列番号:14)のプライマーを用いてPCR反応を行い、BamHI-PmutdF断片を得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にPmut-F1(配列番号:13)およびPmut-R2(配列番号:16)のプライマーを用いてPCR反応を行い、PmutdF断片を得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にPmut-F2(配列番号:15)およびXhoI-P-R(配列番号:12)のプライマーを用いてPCR反応を行い、PmutdF-XhoI断片を得た。次にBamHI-PmutdF断片、PmutdF断片およびPmutdF-XhoI断片を鋳型にBamHI-P-F(配列番号:11)およびXhoI-P-R(配列番号:12)のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-PmutdFを得た。次にpBS-PmutdFをNotI、StuI、およびXhoIで消化し、3878bp断片を得た。次にpSeV18+ΔFをNotIおよびNheIで消化し、6321bp断片を得た。次にpSeV18+ΔFをNotI、StuI、およびNheIで消化し、6161bp断片を得た。次に3878bp断片、6321bp断片、および6161bp断片を接合し、pSeV18+/PmutΔFを得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にAscI-Pdd-F(配列番号:26)および HindIII-Pdd-R(配列番号:27)のプライマーを用いてPCR反応を行い、この断片をAscIおよびHindIIIで消化し、AscI-PdF-HindIII断片を得た。次にpSeV18+BFP/PddTSΔFを鋳型にHindIII-dd-F(配列番号:23)およびSbfI-Pdd-R(配列番号:28)のプライマーを用いてPCR反応を行い、このPCR産物をHindIIIおよびSbfIで消化し、Pdd-SbfI断片を得た。これらのAscI-PdF-HindIII断片およびPdd-SbfI断片をpSeV18+/PmutΔFにクローニングし、pSeV18+/PddΔFを得た。次にpSeV18+DGFP/TSΔFをNotIで消化し、pSeV18+/PddΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PddΔFを得た。pSeV18+DGFP/PddΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PddΔFと称す。
HeLa細胞を1x105 cells/wellで12well plateに播種し、Lipofectamine LTX(Life Technologies社)を用いてpEB-Pを遺伝子導入し、37℃でSeV18+GFP/TSΔP(WO2008/133206)をMOI=10で感染させ(day0)、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。蛍光顕微鏡はECLIPSE TE2000-U(株式会社ニコン)を用いた。その結果、pEB-Pを遺伝子導入した細胞ではSeV18+GFP/TSΔPの感染によって緑色蛍光が観察されたが、pEB-Pを遺伝子導入せずにSeV18+GFP/TSΔPのみを感染した細胞では緑色蛍光が観察されなかった(図1)。
HeLa細胞を1x105 cells/wellで12well plateに播種し、37℃でSeV(F)ddAG/TSΔF (ddAG)をMOI=10で感染させ(day0)、day1で1μMのShield1を添加し、5hr後に蛍光顕微鏡による観察およびFACSによる解析を行った。FACS はFACScalibur(BD Biosciences社)を用いた。その結果、Shield1を添加したddAG感染細胞では緑色蛍光が観察され、FACSでddAG+Shield1の強い蛍光が観察された。Shield1を添加しないddAGの蛍光は顕微鏡下で判別し辛いが、FACSではddAGを感染していないControl細胞と明瞭に判別される基底レベルの蛍光が観察された(図2)。
HeLa細胞に、37℃でSeV(HNL)ddAG/TSΔF(ddAG)をMOI=10で感染させ(day0)、day1で1μMのShield1を添加し、5hr後に蛍光顕微鏡による観察およびFACSによる解析を行った。その結果、Shield1を添加したddAG感染細胞では緑色蛍光が観察され、FACSでddAG+Shield1の強い蛍光が観察された。HNL位に搭載することによって、Shield1を添加しないddAGの蛍光は搭載位置がF位のSeV(F)ddAG/TSΔFに比べ低減したが、FACSではddAGを感染していないControl細胞と明瞭に判別される基底レベルの蛍光が観察された(図3)。
HeLa細胞に、37℃でSeV(HNL)d1GFP/TSΔF(d1GFP)、SeV(HNL)d2GFP/TSΔF(d2GFP)、SeV(HNL)d4GFP/TSΔF (d4GFP)、SeV(HNL)d1AG/TSΔF(d1AG)、SeV(HNL)d2AG/TSΔF(d2AG)、SeV(HNL)d4AG/TSΔF (d4AG)をMOI=10で感染させ(day0)、day2で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、PEST配列をGFPやAGのC末端側に付加することで、蛍光の低下を観察した。d4GFP、d2GFP、d1GFPの中ではd4GFPの蛍光が強く、d1GFPの蛍光が弱かった(図4)。 d2AGおよびd4AGは蛍光顕微鏡下で観察可能であったが、d1AGは蛍光顕微鏡下での判別がし辛く、以降の試験にはd2およびd4を用いた。
HeLa細胞に、37℃でSeV(HNL)d2ddAG/TSΔF(d2ddAG)、SeV(HNL)d4ddAG/TSΔF (d4ddAG)をMOI=10で感染させ(day0)、day3で1μMのShield1を添加し、day5でFACSによる解析を行った。その結果、DD-tagに加えてPEST配列を組み合わせてSeVベクターのHNL位に搭載しても、Shield1非添加時にAGの蛍光はControl細胞と明瞭に判別される基底レベルの蛍光が観察された(図5)。
HeLa細胞に、37℃でSeV(PM)d2ddgRFP(HNL)d2ddAG/TS12ΔF(ddgRFP-ddAG)をMOI=10で感染させ(day0)、day2で1μMのShield1あるいは20μMのtrimethoprim(TMP)を添加し、6hr後に蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、Shield1を添加したddgRFP-ddAG感染細胞では緑色蛍光が観察され、TMPを添加したddgRFP-ddAG感染細胞では赤色蛍光が観察され、Shield1およびTMPを添加したddgRFP-ddAG感染細胞では緑色および赤色蛍光が観察され、SeVベクター上で独立制御が可能なことを観察した(図6)。
HeLa細胞に、35℃でSeV(HNL)d2tetRAG/TSΔF(d2tetRAG)をMOI=10で感染させ(day0)、day1で1.5μg/mLのdoxorubicin(DOX)を添加後、37℃へ細胞を移動、day3に蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、DOXを添加したd2tetRAG感染細胞では緑色蛍光を観察した(図7)。
HeLa細胞に、37℃でSeV18+TIR1(HNL)AGaid/TSΔF(TIR1-AGaid)をMOI=10で感染させ(day0)、day3でAuxinとしてnaphthalene acetic acid (NAA)を500μMあるいは2mM添加し、4hr後および1日後に蛍光顕微鏡および蛍光プレートリーダーによる観察を行った。蛍光プレートリーダーはInfinite F200(TECAN社)を用いた。その結果、TIR1-AGaidを感染させた細胞の蛍光はAuxin添加後4時間では低下が観察されず、1日後に79.5%(500μM)への低下を観察した(図8)。
PF発現細胞を得るために、F蛋白質を発現するLLC-MK2/F細胞(WO00/70070)にP遺伝子の導入を行った。LLC-MK2/F細胞にpCXN-P4C(-)をリン酸カルシウム法により遺伝子導入し、G418による選択を行い、P蛋白質およびF蛋白質を発現するLLC-MK2/PF細胞(PF発現細胞)を得た。得られたPF発現細胞にP遺伝子が欠損したSeV18+GFP/TSΔPを感染させ、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を観察し、P蛋白質が機能していることを確認した。また、ウェスタンブロット法によりP蛋白質およびF蛋白質の発現を確認した。本発明のP蛋白質にdegronが付加されたSeVベクターの生産には32℃でこのPF発現細胞を用いた。
BHK細胞に、37℃でSeV18+BFP/PddTSΔF(BFP-Pdd)を、あるいはBJ細胞由来のiPS細胞にSeV18+BFP/LddTSΔF(BFP-Ldd)をMOI=5で感染させ、1μMのShield1を添加し(day0)、day1でShield1を除去し、day5で観察した。その結果、Shield1を除去したBFP-Pdd感染細胞ではShield1を除去していないBFP-Pdd感染細胞に比較して青色蛍光が18%程度に減弱した(ImageJ(NIH)で画像解析)(図9)。それに対し、BFP-Lddの蛍光はShield1存在下でも弱く、発現調節も大きな変化は観察されなかった(図10)。L蛋白へのDD-tag付加はP蛋白へのDD-tag付加に比較してSeVベクターの再構成効率が低かった。さらに、P蛋白を発現するSeV生産細胞は容易に得られたが、L蛋白を発現するSeV生産細胞は容易に得られず、得られたとしてもそのSeV生産性は低かった。
HeLa細胞に、Lipofectamine LTX(Life Technologies社)を用いてpHSV-ddP-Halo およびpHSV-Pdd-Haloを遺伝子導入し、1μMのShield1存在下、FAM ligandで15分間パルスラベル後、蛍光の消失を指標にP蛋白の分解を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、10分以内にP蛋白の分解が始まっており、P蛋白は5時間以内に分解されていることを観察した(図11)。DD-tagはP蛋白のN末端側およびC末端側のどちらに付加されていても同様の分解を示した。
PF発現細胞を用いてSeV18+BFP/PddTS15ΔF、SeV18+GFP/PddTS15ΔF SeV18+BFP/ddPTS15ΔF、およびSeV18+GFP/ddPTS15ΔFの再構成を試みた。その結果、P蛋白のC末端側にDD-tagが付加されたSeV18+BFP/PddTS15ΔFおよびSeV18+GFP/PddTS15ΔFは得られたが、P蛋白のN末端側にDD-tagが付加されたSeV18+BFP/ddPTS15ΔFおよびSeV18+GFP/ddPTS15ΔFは得られなかった。すなわち、C蛋白を供給せずにP蛋白のN末端側にDD-tagを付加することはSeVベクターの再構成効率を低下させることを示している。
HeLa細胞に、37℃でSeV18+TIR1(HNL)d2AG/PaidTSΔF(d2AG-Paid)あるいはSeV18+TIR1(HNL)d2AG/LaidTSΔF(d2AG-Laid)をMOI=5で感染し(day0)、day3でAuxinとしてindole-3-acetic acid (IAA)を500μM添加し、蛍光顕微鏡およびFACSにより観察した。その結果、d2AG-PaidはFACSで中央値の値が149.89から126.35へ減弱するという結果が得られたが(図12)、d2AG-Laidの発現調節に大きな変化は観察されなかった。d2AG-Paid L蛋白へのaid付加はP蛋白へのaid付加に比較してSeVベクターの再構成効率を低下させた。
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/PddTS15ΔF(d2AG-PddTS15)、SeV18+d2AG/TS15ΔF(d2AG-TS15)をMOI=5で感染させ、1μMのShield1を添加し(-day3)、Shield1を除去・37℃に細胞移動をday0として、あるいはShield1を添加したまま35℃に細胞を移動、経時的な観察を行った。その結果、Shield1を除去・37℃のd2AG-PddTS15感染細胞ではday7で蛍光が消失し、35℃の条件ではd2AG-TS15よりも高い蛍光発現レベルを示した(図13)。それに対し37℃のd2AG-TS15はday21で蛍光が消失した細胞も観察されるが、蛍光発現の残存が観察された(図13)。day14でSeV抗体染色を行うと、37℃のd2AG-PddTS15はSeV抗体染色陰性、37℃のd2AG-TS15はSeV抗体染色陽性であった(図14)。d2AG-PddTS15を32℃で感染後、day2で35〜39℃に温度を上昇させ、感染からday5で観察したところ、35〜39℃で蛍光発現が低下し、37〜39℃で消失した(図15)。
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/PddgTS15ΔF(d2AG-PddgTS15)をMOI=5で感染させ、20μMのtrimethoprim(TMP)を添加し(day0)、day3でTMPを除去・37℃に細胞を移動、あるいはTMPを添加したまま35℃に細胞を移動、経時的な観察を行った。その結果、TMPを除去・37℃のd2AG-PddgTS15感染細胞では感染からday6で蛍光の消失が観察された(図16 (a))。搭載遺伝子の発現低下および消失は、35〜39℃で観察された(図16 (b))。DD-tagが35℃で発現するのに対し、ddg-tagでは発現の消失が観察された。
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔF(d2AG-PtetRTS15)をMOI=5で感染させ、1.5μg/mLのDOXを添加し(day0)、day2でDOXを除去・35〜39℃に細胞を移動し、感染からday5に観察を行った。その結果、35〜39℃で蛍光発現が低下および消失した(図17)。
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/d4PTS15ΔF(d2AG-d4PTS15)をMOI=5で感染させ(day0)、day2で35〜39℃に細胞を移動し、感染からday5に観察を行った。その結果、35〜39℃で蛍光発現が低下し、37〜39℃で消失した(図18)。
HeLa細胞に、SeV18+d2AG/d2PTS12Δ(d2AG-d2PTS12)、SeV18+d2AG/PddTS12ΔF(d2AG-PddTS12)、およびSeV18+d2AG/TS12ΔF(d2AG-TS12)をMOI=5で感染させ(day0)(d2AG-PddTS12は感染時に1μMのShield1を添加)、day3でShield1を除去し、38.5℃に5日間培養後に37℃に細胞を移動するか、あるいは35℃に細胞を移動し(35℃のd2AG-PddTS12についてはShield1を添加したまま)、感染からday18に観察を行った(ぞれぞれ図19の「38.5℃(5day)」および「35℃」)。その結果、d2AG-TS12より先にd2AG-d2PTS12およびd2AG-PddTS12の蛍光発現の消失が促進され、d2AG-PddTS12はd2AG-d2PTS12より短期間に蛍光発現が消失した(図19)。
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/d2PTS15Δ(d2AG-d2PTS15)、SeV18+d2AG/d4PTS15ΔF(d2AG-d4PTS15)、およびSeV18+d2AG/TS15ΔF(d2AG-TS15)をMOI=5で感染させ(day0)、day3で37℃に細胞を移動、あるいは35℃に細胞を移動、経時的な観察を行った。その結果、37℃のd2AG-d2P15およびd2AG-d4P15感染細胞ではday7で蛍光が消失し(図20)、day13のFACSでも蛍光の消失を確認した(図21)。それに対し37℃のd2AG-TS15はday13で蛍光の残存が観察された(図21)。Degronを付加しても35℃におけるd2AGの蛍光はdegronを付加していない従来のベクターと同等の値を示した(図21)。
HeLa細胞に、32℃でSeV18+d2AG/d2PTS15ΔF(d2AG-d2PTS15)およびSeV18+d2AG/TS15ΔF(d2AG-TS15)をMOI=5で感染させ(-day3)、37℃に細胞移動をday0とし、経時的な観察を行った。その結果、37℃のd2AG-d2PTS15感染細胞ではday7で蛍光が消失した(図22)。それに対し37℃のd2AG-TS15はday21で蛍光が消失した細胞も観察されるが、蛍光発現の残存が観察された。Degronを付加しても35℃におけるd2AGの蛍光はdegronを付加していない従来のベクターと同等の値を示した(図22)。
実施例14および20の細胞よりRNAを回収し、RT-PCRおよびリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRはApplied Biosystems 7500 Fast(Life Technologies社)を用いた。SeVのPCRプライマーおよびbeta-ActinのPCRプライマーはWO2012/029770の配列を用いた。SeVのリアルタイムPCRプライマーはSeV-L (5’- CCGTAGTAAGAAAAACTTAGGGTGA -3’)(配列番号:87)およびSeV-R (5’- GATCCATGCGGTAAGTGTAGC -3’)(配列番号:88)を用いた。プローブはUniversal ProbeLibraryのProbe#3(Roche社)、GAPDHはHuman GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC / MGB Probe, Primer Limited)(Life Technologies社)を用いた。day21のHeLa細胞において、d2AG-d2PTS15やd2AG-PddTS15のSeVバンド消失を観察したが、d2AG-TS15ではSeVバンドを観察した(図23)。同様にリアルタイムPCRにおいてもday21のd2AG-d2PTS15およびd2AG-PddTS15の消失を観察したが、day21のd2AG-TS15は残存していることを観察した(図24)。PddTS15のday14のRQを1として、d2PTS15およびPddTS15はday21で検出されなくなった。それに対して、従来ベクターのTS15では徐々に減っているがday21でも残存を確認した。PddTS15のday3はTS15のday3に比べ30倍以上高い値を示した。
BJ細胞にCytoTune-iPS 2.0(SeV(PM)KOS/TS12ΔF、SeV(HNL)cMYC/TS15ΔF、およびSeV18+KLF4/TSΔFの組み合わせで、Life Technologies社あるいは株式会社医学生物学研究所より入手可能)、あるいはCytoTune-iPS 2.0のcMYCをSeV(HNL)cMYC/d2PTS15ΔF(d2P-MYC)、SeV(HNL)cMYC/PddTS15ΔF(Pdd-MYC)、SeV(HNL)cMYC/PddgTS15ΔF(Pddg-MYC)、SeV(HNL)cMYC/PtetRTS15ΔF(PtetR-MYC)に置き換えて32℃で感染を行い(iPS細胞の作製方法についてはWO2012/029770、WO2010/008054に詳述、KOSおよびKLF4はMOI=5、cMYCはMOI=1)(day0)、day1で37℃に細胞を移動し、day6でMEF上に播種し、day28でアルカリホスファターゼ(ALP)染色を行った。ALP染色は1-Step NBT/BCIP(Thermo Scientific社)を使用した。37℃で細胞の継代を行い、継代ごとにSeV抗体染色およびTaqMan Sendai Assay ID: Mr04269880_mr(Life Technologies社)を用いたリアルタイムPCR、初期化マーカーであるNANOGおよびTERTのPCRを行った。NANOGおよびTERTのPCRプライマーはWO2012/029770の配列を用いた。その結果、全てのベクターにおいてALP陽性コロニーが形成されることを観察した(図25)。KOSおよびKLF4のMOI=10、d2P-MYCはMOI=5で感染させた場合のday30のALP陽性コロニーの出現効率は0.5%以上であった。SeV抗体染色を行った結果、P=2のCytoTune-iPS 2.0でSeV陽性細胞が観察される継代数でd2P-MYCのSeV抗体染色陰性を観察した(図26)。リアルタイムPCRの結果、P=1のCytoTune-iPS 2.0のRQが1であるのに対し、P=1のd2P-MYCは1/16以下、P=2のd2P-MYCは1/1500以下、P=3で検出されなくなり、CytoTune-iPS 2.0より早いタイミングで消失することを観察した(図27)。初期化マーカーのPCRの結果、P=3のd2P-MYCについては#3、#5、#6の3株で(図28)、Pdd-MYC、Pddg-MYC、およびPtetR-MYCについては各2株で、得られたiPS細胞のNANOG陽性、TERT陽性、SeV陰性を観察した(図29)。また、図28で得られたiPS細胞をNOD-scidマウスに移植したところ、テラトーマが形成され、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い、三胚葉形成能を観察できた(図30)。
HeLa細胞にSeV18+d2AG/TS15ΔF(d2AG-TS15)およびSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔF (d2AG-PtetRTS15)を感染させ(d2AG-PtetRTS15は1.5μg/mlのDOXを添加)(day0)、day2でDOXを除去・35℃に細胞を移動し、感染からday5に観察を行った。その結果、d2AG-TS15単独(TS15と表記)で感染させた場合に比べ、d2AG-PtetRTS15を共感染(TS15+PtetRと表記)させることでベクターの除去が60%に促進されたことを示している(図31)。それに対してd2AG-TS15の感染量を2倍に増やした細胞(TS15+TS15)ではd2AGの蛍光が118%に増加した。
HeLa細胞にTransIT-LT1(Mirus Bio社)を用いてpCAGGS-P4C(-)(WO2005/071085)、pCAGGS-d144P(d144P)、pCAGGS-d307P(d307P)、pCAGGS-Pct(Pct)を遺伝子導入し、37℃でSeV18+GFP/TSΔP(WO2008/133206)をMOI=10で感染させ(day0)、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、pCAGGS-Pを遺伝子導入した細胞と同様に、d144P、d307P、Pctを導入した細胞においてもSeV18+GFP/TSΔPの感染によって緑色蛍光が観察された(図32)。これはP蛋白のN末端側を削ってもP蛋白として機能していることを示している。
HeLa細胞に、TransIT-LT1(Mirus Bio社)を用いてpEB-SeV-Pdd-Halo、pEB-MeV-Pdd-Halo、pEB-NDV-Pdd-Halo、pEB-PIV2-Pdd-Halo、pEB-VSV-Pdd-Haloを遺伝子導入し、1μMのShield1存在下、TMR ligandで15分間パルスラベル後、蛍光の消失を指標にP蛋白の分解を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、マイナス鎖RNAウイルスのP蛋白は1時間で急速に分解されていることが示された(図33)。SeVのP蛋白が1時間で12.1%に低下したのに対し、それぞれMeVは6.1%、NDVは6.8%、PIV2は10.2%、VSVは7.9%に低下していた。
BHK細胞に、32℃でSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/d2PTS15ΔF(ddgOFP-ddDGFP-d2PTS15)を感染させ(day0)、day2で1μMのShield1あるいは1μMのShield1および20μMのTMPを添加し、day3で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、Shield1を添加したddgOFP-ddDGFP感染細胞では緑色蛍光が観察され、Shield1およびTMPを添加したddgOFP-ddDGFP-d2PTS15感染細胞では緑色蛍光および橙色蛍光が観察された(図34A)。
HeLa細胞に1μMのShield1を添加し、32℃でSeV(PM)ddgOFP(HNL)ddDGFP/PddTS15ΔF(ddgOFP-ddDGFP-PddTS15)をMOI=5で感染させ(day0)、day2で1μMのShield1あるいは1μMのShield1および20μMのTMPを添加し、day3で蛍光顕微鏡による観察を行った。蛍光観察後に、Shield1およびTMPを除去して37℃に細胞を移動した。その結果、Shield1を添加したddgOFP-ddDGFP-PddTS15感染細胞では緑色蛍光が観察され、Shield1およびTMPを添加したddgOFP-ddDGFP感染細胞では緑色蛍光および橙色蛍光が観察された。Shield1およびTMPを除去して37℃に細胞を移動した細胞では蛍光の消失が観察された(図34B)。これは複数の搭載遺伝子が薬剤により独立制御され、温度上昇によりベクターが除去されることを示している。
HeLa細胞に1μMのShield1を添加あるいは添加せずに、37℃でSeV18+DGFP/PddΔF(DGFP-Pdd/dF)をMOI=5で感染させ(day0)、day1で蛍光顕微鏡による観察を行い、蛍光画像をMetaMorph(Molecular Devices社)で画像解析を行った。その結果、Shield1を添加したDGFP-Pdd/dF感染細胞と比較してShield1を添加しなかったDGFP-Pdd/dF感染細胞では40%に蛍光の減弱が観察された(図35)。これは温度感受性変異を有していないベクターにおいても、P蛋白質にdegronを付加することで発現調節が可能なことを示している。
Claims (26)
- マイナス鎖RNAウイルスベクターであって、該ウイルスのP蛋白質にdegronを付加するようにP遺伝子が改変されたベクター。
- 該P蛋白質に温度感受性変異を含む、請求項1に記載のベクター。
- 該温度感受性変異がL511F変異を含む、請求項2に記載のベクター。
- 該温度感受性変異がD433A、R434A、およびK437Aを含む、請求項2または3に記載のベクター。
- 該ウイルスのL蛋白質にL1361CおよびL1558Iの変異を含む、請求項1から4のいずれかに記載のベクター。
- DegronがmTOR degron、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)degron、PEST、TetR degron、およびauxin-inducible degron(AID)からなる群より選択される、請求項1から5のいずれかに記載のベクター。
- DegronがmTOR degronである、請求項1から5のいずれかに記載のベクター。
- DegronがPESTである、請求項1から5のいずれかに記載のベクター。
- DegronがDHFR degronである、請求項1から5のいずれかに記載のベクター。
- DegronがTetR degronである、請求項1から5のいずれかに記載のベクター。
- 少なくとも1つの外来遺伝子を搭載する、請求項1から10のいずれかに記載のベクター。
- 該外来遺伝子が、degronが付加された蛋白質をコードする、請求項11に記載のベクター。
- 該外来遺伝子がコードする蛋白質に付加されたdegronが、P蛋白質に付加されているdegronとは異なるdegronである、請求項12に記載のベクター。
- 少なくとも2つの外来遺伝子を搭載し、それぞれの外来遺伝子がコードする蛋白質に、互いに異なるdegronが付加されている、請求項1から13のいずれかに記載のベクター。
- マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、請求項1から14のいずれかに記載のベクター。
- パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項15に記載のベクター。
- マイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進するための方法であって、請求項1から16のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする方法。
- 温度を上昇して培養して除去を促進する工程を含む、請求項17に記載の方法。
- 35〜39℃で培養して除去を促進する工程を含む、請求項17または18に記載の方法。
- 請求項1から16のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもdegronが付加されていないNP、PおよびL蛋白質の存在下で発現させる工程を含む方法。
- 請求項1から16のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、搭載遺伝子の発現量を制御する方法。
- 搭載遺伝子が転写因子をコードする、請求項21に記載の方法。
- 多能性幹細胞の作製において使用される、請求項21または22に記載の方法。
- 請求項13または14に記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの除去のタイミングとは独立に、外来遺伝子の発現を制御する方法。
- マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法であって、該ウイルスまたはベクターを、請求項1から16のいずれかに記載のベクターと共感染させる工程を含む、方法。
- 請求項1から16のいずれかに記載のベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去促進剤。
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