JPWO2016104716A1

JPWO2016104716A1 - 遺伝子のノックアウト方法

Info

Publication number: JPWO2016104716A1
Application number: JP2016566520A
Authority: JP
Inventors: 泰己上田; 玄志郎砂川; 健太隅山; 磨貴鵜飼; ディミトリペリン
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2017-10-05
Also published as: US20180020646A1; WO2016104716A1; EP3239298A4; US10863730B2; EP3239298A1

Abstract

１種以上の標的遺伝子を有する細胞中に、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAとCasタンパク質とを生成できるCRISPR-Casシステムを導入することを含む、標的遺伝子がノックアウトされた細胞の製造方法。本発明は、一世代において全身の２対立遺伝子のノックアウト動物を高効率(９０％以上)に作製できる方法を提供することができる。

Description

本出願は、２０１４年１２月２６日に出願された特願第２０１４−２６５７９３の優先権を主張する出願であり、上記日本国出願の明細書の記載事項は、参照によって本願明細書に組み込まれる。

本発明は、遺伝子をノックアウトする方法、例えば、特定の遺伝子の機能を欠失させたノックアクト動物の作製方法に関する。

生物内の分子ネットワークのシステムレベルの同定は、生物学における重要な課題である。古典的な逆遺伝学は、表現型解析に十分な質および量の変異動物を作製するために数世代の動物の交配を必要とする。ノックアウトマウスを作製するための従来の方法は通常、ターゲティングベクター構築(約２週間)、相同組換えによる胚性幹(ES)細胞内への標的変異の導入(２〜３週間)、およびキメラマウスを作製するための野生型胚盤胞内への変異ES細胞の注射(３週間)を伴う。変異ES細胞が新生仔キメラマウスの生殖系列に寄与する場合、これらの次世代の子孫は、ヘテロ接合変異を有することになる(約３カ月)。子孫の更なる交配(数カ月〜数年;１世代当たり少なくとも３カ月)により、信頼できる表現型解析に必要な、近交系ゲノムバックグラウンドに対して完全にホモ接合のノックアウト変異を有するマウスが得られる。従って、従来の方法によれば、単一の遺伝子でさえノックアウトするためには、多量の時間、空間および手間が必要である。従って、生物内で分子ネットワークを包括的に同定するためには、交配を用いない遺伝子変化が必要である。この目的のためには、一世代での効率的な(＞９０％)変異体生成および変異動物の正確な(＞９０％)表現型解析の両方が必要とされる。

２つの対立遺伝子がノックアウトされたマウス（以下、２対立遺伝子ノックアウトマウスともいう）の効率的な生成は、ZFN(zinc-finger nucleases、ジンクフィンガーヌクレアーゼ)(非特許文献１)、TALEN(transcription activator-like effector nucleases、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ)( 非特許文献２)、およびCRISPR/Casヌクレアーゼシステム（以下、CRISPR/CasまたはCRISPR-Casシステムともいう）(非特許文献３および４)などの最近開発されたゲノム編集法によって実施することができる。タンパク質ベースのZFNおよびTALENと異なり、CRISPR/Casシステムは、細菌適応免疫系に由来するRNAベースDNA認識を使用する(非特許文献５および６)。この方法によれば、胚へのCas9タンパク質又はそれをコードする発現ベクターもしくはRNAおよびターゲット遺伝子座特異的ガイドRNA(gRNA)またはそれをコードする発現ベクターの同時注射を介して、ノックアウト動物を作製することができる(非特許文献４および７)。また特許文献１には、標的配列に基づいて設計したガイドRNAおよびCasタンパク質をコードするRNAを細胞に導入して標的配列を特異的に切断する方法が記載されている。CRISPR/Cas9システムを改変して、ゲノム内のターゲット変異の効率および特異性を改善することも報告されている(非特許文献８から１０)。

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国際公開第「ＷＯ／２０１４／０９３６６１号公報」（２０１４年６月１９日公開）

上記の通り、２対立遺伝子ノックアウトマウスの効率的な生成方法として、CRISPR/Casシステムは有望であるが、２つの問題がある。すなわち、1)第1世代マウスは、野生型細胞およびノックアウト細胞のモザイクを含有することが多く、2)作製される完全な２対立遺伝子ノックアウトマウスの割合が相対的に低い(通常約６０〜８０％)という課題がある。例えば、非特許文献１０には１つの標的遺伝子に２つのガイドRNAを使用したことが報告されているが、ノックアウト効率は８０％未満と低く、交配なしに表現型を観察することはできないと考えられる。即ち、本発明の課題は、一世代において全身の２対立遺伝子のノックアウト動物を高効率(９０％以上)に作製できる方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、１つの標的遺伝子に対して３種のガイドRNAを使用することによって非常に高いノックアウト効率を実現し（ほぼ１００％）、その結果、得られた動物を交配や選別なしに「一世代」で表現型の観察試験に供することができることを見出した。従来のノックアウトマウスの作製方法では、予め構築したベクターを導入したES細胞株の樹立、ES細胞のマウス胚盤胞への注入によるキメラマウスの作製、キメラマウスの交配によるホモ型ノックアウトマウスの取得などの手順が必要であり、系統の樹立には長期間（１年程度）を要していたが、本発明の方法によれば、ガイドRNAを設計・合成して受精卵に注入して誕生したマウスをそのまま使用できるので、１カ月程度の短期間で目的のマウスが得られる。

すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）１種以上の標的遺伝子を有する細胞中に、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAとCasタンパク質とを生成できるCRISPR-Casシステムを導入することを含む、標的遺伝子がノックアウトされた細胞の製造方法。

本発明によれば、一世代において全身の２対立遺伝子のノックアウト動物を高効率に作製することができる。本発明によれば、非常に高いノックアウト効率を実現できることから、得られた動物を交配や選別なしに一世代で表現型の観察試験に供することができる。

図１は、全身２対立遺伝子ノックアウトマウスを高効率的に作製するためのトリプルターゲットCRISPR法（３種のガイドRNAを用いるCRISPRによるノックアウト方法）を示す。図２は、図１に関連して、全身２対立遺伝子ノックアウトマウスを高度に効率的に生成するためのトリプルターゲットCRISPR法を示す。図３は、トリプルターゲットCRISPR法によって生成された全身２対立遺伝子Tyrノックアウトマウスのエクソーム解析の結果を示す。図４は、トリプルターゲットCRISPR法の公的に利用可能なデータベースを示す。図５は、図４に関連して、トリプルターゲットCRISPR法の公的に利用可能なデータベースを示す。

以下、本発明についてさらに具体的に説明する。

本発明による細胞中の標的遺伝子をノックアウトする方法は、１種以上の標的遺伝子を有する細胞中に、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAとCasタンパク質とを生成できるCRISPR-Casシステムを導入することを含む方法である。本発明においては、３種以上のガイドRNAが標的遺伝子にターゲッティングし、Casタンパク質が標的遺伝子を切断し、これにより標的遺伝子がノックアウトされる。

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)とは、数十塩基対の短い反復配列を含み、原核生物における一種の獲得免疫系として働く座位である。また、CRISPR反復配列の近傍にはヌクレアーゼやヘリカーゼをコードするCRISPR-associated (cas)遺伝子群が存在することが知られている。外来DNAはcas遺伝子群のいずれかにコードされているタンパク質によって30塩基対ほどの長さに分断され、それがCRISPR座位に何らかの方法で挿入されることで免疫記憶として機能する。CRISPR座位ではRNAが転写されており、Casタンパク質によって各々外来配列を含む小さなRNA (crRNA) に分断される。このRNAは、別のCasタンパク質を外来DNA（またはそれに由来するRNA）に導き、真核生物のRNAiに類似した機構でその機能を抑制する。CRISPR-Casシステムは、細胞および個体レベルにおいてRNA誘導性 (RNA-guided) のゲノム工学に応用されている。

CRISPR-Casシステムについて説明する。切断したい標的遺伝子内のターゲットDNAと相補的なcrRNAと、tracrRNA (trans-activating crRNA)とを接続部を介してを融合させてキメラtracrRNA-crRNAを生成させる。これをガイドRNA (guide RNA; gRNA)と称する。

標的遺伝子内のターゲットDNAの長さは少なくとも15、16、17、18、19、20、25ヌクレオチドであり、例えば10〜30ヌクレオチド、15〜25ヌクレオチド、又は15〜20ヌクレオチドである。これによりヌクレアーゼ (RNA-guided nuclease; RGN)を呼び込み、目的の部位でターゲットDNAを切断することができる。CRISPR/Casには、type I、II、IIIがあるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらtype II CRISPR/Casであり、type IIではこのRGNとしてCas9が使用されている。Streptococcus pyogenesのCas9はNGGという3つの塩基をProto-spacer Adjacent Motif（PAM）として認識するため、グアニンが2つ並んだ配列が存在すれば、その上流を切断することができ、ゲノム上のほぼ任意の全てのDNA配列を標的とすることができる。

CRISPR/Casを用いた方法は、上記の通りターゲットDNA配列と相同な短いgRNAを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるCasタンパク質を用いてゲノムを編集することができる。そのため、以前に開発されたZFN(Zinc Finger Nuclease)やTALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)のようにDNA配列ごとに異なる大きな蛋白を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができるという利点がある。

本発明においては、標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAを使用する（すなわち、１つの標的遺伝子中の３つ以上のターゲットDNAと相補的な配列を有するガイドRNAを使用する）ことを特徴とするが、ガイドRNAの種類は、標的遺伝子１種につき３種以上であればその上限は特に限定されず、４種、５種又はそれ以上のガイドRNAを使用してもよいが、好ましくは３種のガイドRNAを使用することができる。

ガイドRNAは、以下の条件の少なくとも１つ（特にすべて）を満たすことが好ましい。（１）ゲノム内で複数の箇所において正確なマッチを有さないこと。
（２）ターゲットが、オフターゲット部位（標的遺伝子中の目的配列以外の部位）に強く結合するリスクを有する低AT率 (45%未満)を有するターゲット、およびgRNAの二次構造を破壊する傾向のあるTTTTを含有するターゲットではないこと。
（３）ターゲットが、pX330を鋳型にしてPCRベースでgRNA templateを合成する際のリバースプライマー（Wang, H.,他、 (2013). One-step generation of mice carrying mutationsin multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153,
910-918）と類似しすぎないこと。
（４）gRNAの二次構造を計算し、フォールディングエネルギーが-18超(「誤った」構造が非常に不安定であったことを示す)であった場合を除いて、Cas9認識のためのステムループ構造が正しくフォールドできない候補を除外すること。
（５）Zhangツール(非特許文献９)のインプリメンテーションを使用してオフターゲットリスクを評価し、75以上のスコアであること。

Casタンパク質としては、CAS1、CAS1B、CAS2、CAS3、CAS4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1, Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csf1 、Csf2、Csf3、Csf4、そのホモログまたはその改変体を挙げることができるが、特に限定されない。これらの酵素は公知である。Casタンパク質としては、Cas9タンパク質が特に好ましい。

CRISPR-Casシステムを構成する要素は、細胞内においてガイドRNAとCasタンパク質とを生成できるものであれば特に限定されない。

ガイドRNAを生成できる形態としては、ガイドRNA自体をRNAとして細胞に導入してもよいし、ガイドRNAを細胞内で発現できるベクター（DNAベクターなど）として細胞に導入してもよい。ガイドRNA自体をRNAとして細胞に導入する場合には、例えば、ガイドRNAの化学的合成、インビトロ転写による合成によってガイドRNAを得ることができる。ガイドRNAを細胞内で発現できるベクターを使用する場合には、ガイドRNAをコードするDNAと、その上流に発現調節配列（プロモーターなど）とを含む、発現ベクターを使用することが好ましい。

ベクターとしては、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子を広く意味するが、これらに限定されない。ベクターは、DNA、RNA、またはDNAとRNAの両方を含む核酸分子でもよい。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）が挙げられるが、特に限定されない。のベクターは、導入される宿主細胞において自律複製が可能であるものでもよいし、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれるものでもよい。

上記の中でも、CRISPR-Casシステムとしては、標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAと、Casタンパク質をコードするRNAとを含むシステムであることが好ましい。

なお、本発明で使用するCRISPR-Casシステムは、天然には存在しないものであり、人工的に作製したものである。

Casタンパク質を生成できる形態としては、Casタンパク質自体をタンパク質として細胞に細胞に導入してもよいし、Casタンパク質をコードするRNAを細胞に導入してもよいし、又はCasタンパク質を細胞内で発現できるベクター（DNAベクターなど）として細胞に導入してもよい。Casタンパク質をを細胞内で発現できるベクターを使用する場合には、Casタンパク質をコードするDNAと、その上流に発現調節配列（プロモーターなど）とを含む、発現ベクターを使用することが好ましい。

ガイドRNA又はCasタンパク質を発現するベクターにおいて用いる発現調節配列の種類は特に限定されず、発現ベクターが導入される細胞内で機能する発現調節配列を使用することができる。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（IRES）、およびその他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの、転写終止シグナルなど）などを挙げることができるが特に限定されない。発現調節配列は、広範な宿主細胞において遺伝子の構成的発現を誘導するものでもよいし、特定の宿主細胞のみにおいて遺伝子の発現を誘導するものでもよい。特定の宿主細胞のみにおいて遺伝子の発現を誘導する組織特異的プロモーターとしては、筋肉、神経、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）などの所望の組織での発現を誘導することができるものを使用することができる。プロモーターの具体例としては、pol IIIプロモーター、pol IIプロモーター、pol Iプロモーターまたはそれらの組み合わせを挙げることができる。pol IIIプロモーターの具体例としては、U6およびHIプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。polIプロモーターの例としては、レトロウイルスラウス肉腫VIMS（RSV）LTRプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（PGR）プロモーター、およびEFLプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

ガイドRNA又はCasタンパク質を発現する発現ベクターを使用する場合、３種以上のガイドRNAおよびCasタンパク質をそれぞれコードする少なくとも４種のDNAは、単一の発現ベクターに含めてもよいし、異なる発現ベクターにそれぞれ含めてもよい。例えば、
（１）３種以上のガイドRNAおよびCasタンパク質をコードするDNAの全てを含む単一の発現ベクターを使用する場合；
（２）３種以上のガイドRNAをコードするDNAを全て含む発現ベクターと、Casタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターとを使用する場合；および
（３）３種以上のガイドRNAをコードするDNAをそれぞれ別個に含む３種類以上の発現ベクターと、Casタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターとを使用する場合；
などが可能であるが、特にこれらに限定されない。

本発明でCRISPR-Casシステムを導入する細胞の種類は特に限定されず、原核細胞でも真核細胞でもよいが、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは動物細胞である。動物細胞としては、哺乳動物細胞（マウス細胞又はヒト細胞など）が特に好ましい。

また、本発明の方法を利用して標的遺伝子の遺伝子をノックアウトしたノックアウト動物を作製する場合には、細胞として受精卵を使用することができる。ノックアウト動物の作製については後記する。

CRISPR-Casシステムは、細胞に導入する場合の部位は特に限定されず、核に導入してもよいし、細胞質に導入してもよい。CRISPR-CasシステムをRNAの形態で導入する場合には、細胞質に導入することができる。

CRISPR-Casシステムの細胞への導入は、ウイルス粒子、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはコンジュゲーションなどの手法を用いて行うことができる。

本発明による、細胞中の標的遺伝子をノックアウトする方法の用途としては、ノックアウト非ヒト生物の製造、遺伝子治療、薬物スクリーニング、および疾患・予後の診断などを挙げることができるが、好ましくはノックアウト非ヒト生物の製造である。

本発明によれば、上記した本発明による細胞中の標的遺伝子をノックアウトする方法により標的遺伝子をノックアウトした胚を取得し、前記胚を偽妊娠非ヒト動物に移植し、産仔を取得することを含む、ノックアウト非ヒト生物の製造方法が提供される。

非ヒト生物は、動物（哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類）、節足動物（昆虫など）又は植物でもよいが、好ましくは動物であり、より好ましくは哺乳類であり、さらに好ましくはげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど）である。

本発明による細胞中の標的遺伝子をノックアウトする方法により標的遺伝子をノックアウトした胚としては、非ヒト動物の受精卵中の標的遺伝子をノックアウトする方法により標的遺伝子をノックアウトした受精卵を用いることが好ましい。一例としては、Cas9 mRNA、および１種の標的遺伝子に対して３種類以上のgRNAを、受精卵の細胞質内に注射した胚を、所定の条件（37℃、5%のCO₂インキュベーター内等）下において培養した後に、複数個（例えば15〜30個程度）の胚を、偽妊娠の非ヒト動物の輸卵管に移し、出産させることによりノックアウト非ヒト動物を製造することができる。偽妊娠の非ヒト動物として偽妊娠雌マウスを使用する場合には、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより偽妊娠雌マウスを得ることができる。

本発明によるノックアウト非ヒト生物の製造方法においては、標的遺伝子が２対立遺伝子であり、取得した産仔の全体数における全身２対立遺伝子ノックアウト個体数の割合が、９０％以上であることが好ましく、９３％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９７％以上であることが特に好ましい。

さらに好ましくは、標的遺伝子が２種類以上であり、取得した産仔の全体数における全身２対立遺伝子ノックアウト個体数の割合が、前記２種類以上の標的遺伝子のそれぞれについて９０％以上であることが好ましく、９３％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９７％以上であることが特に好ましい。

本発明における標的遺伝子の種類は特に限定されず、所望のガイドRNAを設計できる遺伝子であれば任意の遺伝子を標的遺伝子として選択することができる。好ましくは、標的遺伝子は、ノックアウトすることにより細胞の機能に変化が生じる遺伝子である。ノックアウト非ヒト生物を製造する場合には、標的遺伝子は、好ましくは、ノックアウトすることにより個体の表現型が変化する遺伝子である。この場合、本発明の方法によれば高効率でノックアウト動物を得ることができるので、一世代で表現型の変化を観察することができる。

本発明において好ましくは、標的遺伝子は２種類以上であり、２種類以上の標的遺伝子を本発明の方法によりノックアウトされている。

標的遺伝子の具体例としては、例えば、疾患関連遺伝子、シグナル伝達経路関連遺伝子などが挙げられるが、特に限定されない。疾患関連遺伝子の具体例としては、ＷＯ２０１４／０９３６６１号公報のＴａｂｌｅＡおよびＴａｂｌｅＢに記載されている遺伝子を参照することができ、シグナル伝達経路関連遺伝子としては、ＷＯ２０１４／０９３６６１号公報のＴａｂｌｅＣに記載されている遺伝子を参照することができる。ＷＯ２０１４／０９３６６１号公報のＴａｂｌｅＡ、ＴａｂｌｅＢおよびＴａｂｌｅＣの内容は、本明細書中に引用されるものとする。

以上の通り、本明細書において「ノックアウト」は、CRISPR-Casシステムによるゲノムの切断を介して、細胞が保有しているゲノムに存在する標的遺伝子の機能を破壊することを表すために用いられる。ただし、下記のようにCRISPR-Casシステムを利用して遺伝子の機能破壊のみならず遺伝子の改変、活性化および抑制などの種々の編集が可能であり、本発明はCRISPR-Casシステムを利用して実施可能な任意の遺伝子編集技術に適用できるので、本明細書における「ノックアウト」なる用語は、遺伝子の機能破壊に限らずCRISPR-Casシステムを利用した実施可能な任意の遺伝子編集技術を包含する。実施例に示されている通り、ノックアウトは、CRISPR-Casシステムによるゲノムの切断によって生じる、標的遺伝子本来の塩基配列に対するランダムな変異（例えば、置換、欠失および／または挿入）に起因する。すなわち、当該変異の種類（挿入および置換の場合、挿入または置換される塩基配列）は、人為的に選択されていない。

一方で、上記切断された遺伝子に、人為的に選択された外来性の塩基配列を挿入することによって、標的遺伝子の機能を破壊することは、当該分野において周知の技術である。当該塩基配列は、機能的な遺伝子または非機能的な配列である。上記塩基配列が非機能的な配列である場合、上記切断された遺伝子に当該配列を挿入する目的は、単に当該遺伝子の機能破壊である。上記塩基配列が機能的な遺伝子（外来遺伝子と呼ぶ）である場合、外来遺伝子を挿入する目的は、当該外来遺伝子の発現によって上記標的遺伝子の機能破壊（薬剤耐性の獲得）を確認すること、上記標的遺伝子の発現パターンを外来遺伝子（ＧＦＰ遺伝子など）の発現によって可視化すること、および上記外来遺伝子の発現そのものなどであり得る。

上記外来性の塩基配列の挿入は、CRISPR-Casシステムによる標的遺伝子の切断の後に、例えば、切断部位の周辺にある塩基配列との相補性を利用した相同性組換えによって実施され得る。当該相同性組換えは、CRISPR-Casシステムによって切断された標的遺伝子の切断部位から始まる５’末端側の領域、および当該切断部位から始まる３’末端側の領域をフランキング配列として、挿入されるべき外来性の塩基配列の両端に、備えているポリヌクレオチドを用いて実施され得る。

この他に相同性組換えに非依存な挿入方法も存在する。例えば、ゲノム上の標的配列を認識するgRNAと異なるgRNAによって認識される配列を備えているベクターを細胞に導入した後に、CRISPR-Casシステムによって、細胞およびベクターにおける標的配列をそれぞれ切断させる。一本鎖になった上記ベクターは、細胞のDNA修復機能を介して、ゲノム上の切断部位に挿入される。これらの例のように、外来性の塩基配列を挿入することによって標的遺伝子の機能を破壊することを、遺伝子工学では遺伝子編集と呼び得る。

なお、一例として標的遺伝子に外来遺伝子を挿入することを説明したが、上述の遺伝子編集という観点から、外来遺伝子を挿入する部位は、遺伝子発現に直接的または間接的に関与しないゲノムの領域から選択する場合が考えられる。「標的遺伝子」を、例えば、「ゲノム上の標的領域」に置き換えれば、当業者は、ゲノム上の任意の領域に外来遺伝子を挿入するための情報および手法を、本明細書における他の記載から直ちに理解し得る。

（まとめ）
以上をまとめると、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）１種以上の標的遺伝子を有する細胞中に、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAとCasタンパク質とを生成できるCRISPR-Casシステムを導入することを含む、標的遺伝子がノックアウトされた細胞の製造方法。
（２）３種のガイドRNAが標的遺伝子にターゲッティングし、Casタンパク質が標的遺伝子を切断し、これにより標的遺伝子がノックアウトされる、（１）に記載の方法。
（３）CRISPR-Casシステムが、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAと、Casタンパク質をコードするRNAとを含むシステムである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）標的遺伝子が２種類以上であり、２種類以上の標的遺伝子がノックアウトされる、（１）から（３）の何れか一に記載の方法。
（５）Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、（１）から（４）の何れか一に記載の方法。
（６）細胞が、動物細胞である、（１）から（５）の何れか一に記載の方法。
（７）細胞が、受精卵である、（１）から（６）の何れか一に記載の方法。
（８）CRISPR-Casシステムが細胞の細胞質に導入される、（１）から（７）の何れか一に記載の方法。
（９）（１）から（８）の何れか一に記載の方法により標的遺伝子をノックアウトした胚を取得し、前記胚を偽妊娠非ヒト動物に移植し、産仔を取得することを含む、ノックアウト非ヒト生物の製造方法。
（１０）ノックアウト非ヒト生物が、ノックアウト非ヒト動物である、（９）に記載の方法。
（１１）標的遺伝子が２対立遺伝子であり、取得した産仔の全体数における全身２対立遺伝子ノックアウト個体数の割合が、９０％以上である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）標的遺伝子が２種類以上であり、取得した産仔の全体数における全身２対立遺伝子ノックアウト個体数の割合が、前記２種類以上の標的遺伝子のそれぞれについて９０％以上である、（１１）に記載の方法。
（１３）（９）から（１２）の何れか一に記載の方法により製造されるノックアウト非ヒト生物。

本発明を以下の実施例により説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

＜図面の説明＞
（図１）
(A)トリプルターゲットおよびシングルターゲットCRISPR法の模式図。トリプルターゲット法では、3種のガイドRNA(gRNA)を一遺伝子について設計した(上)。3種のgRNAおよびCas9 mRNAを、前核期のC57BL/6N受精卵の細胞質内に同時注射した。シングルターゲット法では、1種のgRNAを、トリプルターゲット法におけるより3倍高い濃度で注射した(下のパネル)。各方法は、同量の総gRNAを使用する。
(B)異なる数のgRNAが同じターゲット遺伝子に対して使用される場合、１または複数の対立遺伝子がどの程度、効率的に切り出されるかを予測するコンピューターシミュレーション。トリプルターゲット(赤線：上の線)およびシングルターゲット(青線：下の線)法を比較した。一対立遺伝子(上)、二対立遺伝子(すなわち、単一遺伝子２対立遺伝子ノックアウト、中央)、および四対立遺伝子ノックアウト(すなわち、二重遺伝子２対立遺伝子ノックアウト、下)の確率を、漸増する総gRNA濃度に対して計算した。線および線の周囲の網掛け部分は、それぞれ1,000シミュレーションの平均および標準偏差を示す。トリプルターゲットとシングルターゲットのストラテジー間の効率の差異は、増加したターゲット対立遺伝子の数の増加にともなってより明らかになった。トリプルターゲット法のコンピューターモデルは、最低効率を予測する。
(C)チロシナーゼ(Tyr)遺伝子をノックアウトするためのgRNAのターゲット配列。3種の独立したgRNAのターゲット配列は、Tyr遺伝子のエクソン1および5上にあった。マウスゲノム配列データは、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/;(Rhead, B., 他、(2010). The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic acids research 38, D613-619))を介してGRCm38/mm10から得た。短い色付きのバー(青色（左）、橙色（真ん中）、および緑色（右）)は、20塩基ターゲット配列を示す。ターゲット配列は、ゲノムDNAのセンス鎖上にあった(プラス記号は、遺伝子のセンス鎖を指す)。
(D)Tyr遺伝子のgRNAに対するSSAアッセイ。SSAベクター(pSSA-Tyr-1およびpSSA-Tyr-2)からの相対的ルシフェラーゼ活性を測定した。SSAベクターを、空ベクター(-)、いずれのgRNAも含まないpX330 Cas9ベクター(pX330)、またはpX330 Cas9およびTyr gRNA(Tyr-1、Tyr-2、もしくはTyr-3)とともに293T細胞内にトランスフェクトした。各試料の相対的ルシフェラーゼ活性を、空ベクター(-)の活性を１としてスケーリングした。エラーバーは、標準偏差を表す(n=3)。
(E)トリプルターゲット法によって作製したTyrノックアウトマウス。毛色により、２対立遺伝子がノックアウトされたマウスが実証された。
(F)シングルおよびトリプルターゲット法の比較。表は、gRNA注射条件および得られる表現型を示す(図２のGを参照)。Embryos:注射かつ移した胚の数;Pups:生まれた子の数(合計);Albino:アルビノ毛色(２対立遺伝子ノックアウト)を有する子;Pigmented:モザイクまたは野生型の毛色を有する子。

（図２）
(A)異なる数のgRNAが同じターゲット遺伝子に対して使用される場合、１または複数の対立遺伝子がどの程度、効率的に切り出されるかを予測するコンピューターシミュレーション。ノックアウト効率を、漸増する数のターゲット対立遺伝子:単一遺伝子モノ対立遺伝子(一対立遺伝子)、単一遺伝子２対立遺伝子(二対立遺伝子)、二重遺伝子２対立遺伝子(四対立遺伝子)、および三重遺伝子２対立遺伝子ノックアウト(六対立遺伝子)について計算した。各シミュレーションにおいて、シングル(遺伝子1個当たり一ターゲット)、デュアル(二ターゲット)、トリプル(三ターゲット)、六重(六ターゲット)、および十重(十ターゲット)ターゲット法を比較した。各方法は、同量の総gRNAを使用する。異なる方法(シングルターゲット法を除く)のコンピューターモデルは、最低効率を予測する。
(B)CRISPRベースノックアウトのコンピューターシミュレーションで使用したgRNA解離定数(K)の分布(図２のB)。gRNA解離定数(K)の分布は、対数正規分布に従い、幾何平均および幾何標準偏差はそれぞれ、1.0および2.5である。普遍性を失うことなく、gRNA解離定数の対数正規分布における幾何平均について1.0を使用することができる。Tyr遺伝子の3種のgRNAに対するSSAアッセイから3種のgRNA解離定数を推定した(K₁=2.32203、K₂=1.16562、およびK₃=0.369466、図１のＤ)。これらの値の幾何標準偏差は、2.53097であったので、gRNA解離定数の対数正規分布における幾何標準偏差について2.5を使用した。
(C)変異の異なる回復率(α=0.05、0.10、および0.15)ならびに総gRNA濃度(S=5、10、および15)を有する単一遺伝子２対立遺伝子ノックアウトの最低効率(平均±標準偏差)を予測するコンピューターシミュレーション。総gRNA濃度(S)は、gRNA解離定数の幾何平均(1.0)に対する相対値である。
(D)Tyr遺伝子のgRNAのSSAアッセイのために挿入された断片の配列。SSAベクターの断片配列が、それぞれ、Tyr-1、Tyr-2、およびTyr-3 gRNAの3種のターゲット配列とともに示されている。マウスゲノム配列データは、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/; (Rhead, B., 他、(2010). The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic acids research 38, D613-619))を介してGRCm38/mm10から得た。
(E)単鎖アニーリング(SSA)アッセイの模式図。SSA-レポーターベクターは、702bpのダイレクトリピートを共有した5'および3'ルシフェラーゼ遺伝子断片を含有する。これらの断片は、終止コドンおよびgRNAターゲット部位によって分離されている。ターゲット部位におけるgRNA/Cas9媒介二本鎖切断により、相同領域間でSSA反応を誘導し、活性ルシフェラーゼ遺伝子を生成する。
(F)単一または三重gRNAを同じターゲット遺伝子に対して使用する場合、遺伝子の２つの対立遺伝子がどの程度、効率的に切り出されるかを予測する、変異の回復率(α=0.136)および総gRNA濃度(S=5.72)の推定値を用いたコンピューターシミュレーション。Tyr-1、Tyr-2、およびTyr-3に対するSSAアッセイ結果から推定された3つの異なる解離定数(K₁=2.32203、K₂=1.16562、およびK₃=0.369466)を用いて、3つのシングルターゲットCRISPRモデルを構築した。解離定数の値(K₁、K₂、およびK₃)は、SSAアッセイにおけるDNA切断効率に反比例し、解離定数の幾何平均は普遍性を失うことなく1.0に設定される。シングルターゲットCRISPR効率は、それぞれ、Tyr-1(36.0%)、Tyr-2(54.2%)、およびTyr-3(64.7%)であった。シングルターゲットCRISPRモデルおよび実験を比較して、最小二乗法によって変異の回復率の値(α=0.136)、総gRNA濃度(S=5.72)を推定した。トリプルターゲットCRISPR効率は、実験(97.5%)およびシミュレーション(82.6%)であった。
(G)3種の異なるシングルターゲットgRNAで作製されたTryノックアウトマウスの毛色。図１のFも参照。
(H)Tyrノックアウトマウスの遺伝子型判定。各ターゲット配列のインタクトなDNAの相対量を、定量的PCR(qPCR、図２のDを参照)によって測定した。ゲノムDNAは、各マウスの脳、頭皮および尾部から精製した。各ターゲット配列のインタクトなDNAの相対量を、一野生型マウスにおける量が100%となるようにスケーリングした。

（図３）
エクソーム配列読み取りのゲノムアラインメント。３種のgRNAによってターゲットされたゲノム領域を、野生型、Tyrノックアウト＃１および＃２について示す。各パネルの上部は読み取り範囲を示しており、下部は読み取りのアラインメントを示している（薄い塗りつぶしの矩形）。複数の矩形の間における縦線は、読み取りのペアを表している。ターゲット部位に生じた異なる種類の変異（濃い塗りつぶしの矩形）には、それぞれ図面内に説明が付されている。当該変異は、エキソン間の欠失および逆位、エキソン内の欠失および逆位、短い欠失および短い挿入である。

（図４）
(A)トリプルターゲットCRISPR法のターゲットを自動的に選択するためのパイプライン。候補を、これらの配列に基づいて遺伝子のエクソンから最初に抽出し、一連の連続的なフィルタリングステップに付した。候補は、マウスゲノム内で複数回出現した場合、AT含量が45%未満であった場合、これらがTTTTを含有した場合、またはgRNA鋳型構築におけるPCR増幅用のリバースプライマーと類似しすぎる場合には、排除した。対応するgRNAが好ましくない二次構造を有している場合、または配列が高いオフターゲットリスクを有している場合も退けた。これらの基準に合致した候補を、適当なターゲットと見なした。これらは、データベース内に記憶されている。
(B)遺伝子1個当たりのターゲットの数の分布。全マウス遺伝子のうちで、81.2%が少なくとも3つのターゲットを有した。さらに、遺伝子の71.9%は、6超の独立したターゲットを有し、それは、ターゲットがトリプルターゲットCRISPR gRNAの2セット超について適切な配列を有することを意味した。
(C)遺伝子1個当たりのターゲットの数のヒストグラム。
(D)Tyr遺伝子について自動的に選択されたターゲットの実験的検証。追加のトリプルgRNAの2セット(Tyr-4,5,6およびTyr-7,8,9)を試験した。写真は、作製されたマウスの毛色を示す。
(E)表は、gRNAの注射条件および得られる表現型を示す。Embryos:注射かつ移した胚の数; Pups:生まれた子の数(合計);Albino:アルビノ毛色(２対立遺伝子ノックアウト)を有する子;Pigmented:モザイクまたは野生型の毛色を有する子。

（図５）
(A)Tyr遺伝子の代替ターゲット配列。Tyrの代替ターゲット配列の2セットを、トリプルターゲットCRISPR法のデータベースから選択した(図５のＡ)。各セットは、3つのターゲットを有していた。マウスゲノム配列データは、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/;( Rhead, B., 他、(2010). The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic acids research 38, D613-619))を介してGRCm38/mm10から得た。20塩基ターゲット配列を示す。
(B)トリプルターゲット法のCRISPRターゲット配列のデータベースについてのオンラインウェブページ(http://www.crispr.riken.jp)。遺伝子名称を入力し、送信をクリックすることが、要求される最小の行動である。ユーザーは、プローブのターゲット場所または他の出力選択肢を選択することができる。
(C)データベースの結果のページ。結果は、表として表され、CSV形式でダウンロードすることができる(黒色ボックス)。

＜方法＞
（動物）
C57BL/6NJclマウスは、CLEA Japan Inc.から購入し、C57BL/6Jマウスは、Oriental Yeast Co.,Ltdから購入した。すべてのマウスに食物および水を自由に与えた。これらを、50%の相対湿度で、21℃の周囲温度の環境内で保持した。光は、12時間明/12時間暗サイクル下で制御した。動物を伴う手順および動物のケアは、動物実験のRIKEN規定に従って実施した。

（一細胞胚マイクロインジェクション）
C57BL/6N雌(生後4〜6週間)を過排卵させ、C57BL/6N雄と交配させた。顕微解剖によってプラグ形成したC57BL/6N雌の輸卵管の膨大部から受精卵を収集し、37℃で、5%のCO₂インキュベーター内で、KSOM培地(Merck Millipore)中に保持した。Cas9 mRNA(100ng/μl)およびgRNA(合計で150ng/μl)を、室温で、M2培地(Merck Millipore)中の受精卵の細胞質内に同時注射した。細胞質注射の詳細は、既報の通りである(Sumiyama, K., 他、A simple and 1 highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics 95, 306-311)。マイクロインジェクション後、注射した胚を、37℃で、5%のCO₂インキュベーター内で、KSOM培地(Merck Millipore)中で1時間培養し、次いで15〜30個の胚を、偽妊娠のICR雌マウスの輸卵管に移した。

（マルチプルターゲットCRISPR法によって全身ノックアウトマウスを作製するための最低効率を推定するコンピューターモデル）
全身ノックアウトマウスを作製するための様々なCRISPR法の効率を、以下のコンピューターモデルによって推定した。十分なCas9が供給された場合、単一遺伝子モノ対立遺伝子ノックアウトの効率Pは、

と記載することができ、この場合、総gRNA濃度およびgRNAとそのターゲット部位との間の解離定数はそれぞれ、SおよびKと定義される。この単純な現象論モデルは、CRISPR媒介性DNA切断における、観察される飽和の一次近似として採用される。それは、DNA切断の間に行われる公知の生化学的過程（例えば、PAM部位結合、および切断後に両方の鎖における切断ＤＮＡ部位に結合したままのCas9）を機序的に含んでいると意図される、正味の影響を説明している。

単一対立遺伝子が、各gRNAとそのターゲット部位との間の解離定数(K₁、K₂、およびK₃)を有する3つの異なるgRNAによってターゲットにされる場合、単一遺伝子モノ対立遺伝子ノックアウト効率Pは、

と記載することができ、この場合、各gRNAの濃度は、総gRNA濃度をSとして保つためにS/3である。

次に、単一部位損傷からの回復率(α)を含めることが、単一ターゲット部位が損傷した状態からインタクトな状態に回復する確率として導入される。αが考慮されるとき、シングルターゲット法(図１のA、B、および図２のA)の単一遺伝子モノ対立遺伝子ノックアウト効率Pは、

と記載することができる。

同様に、トリプルターゲット法(図１のA、B、および図２のA)の単一遺伝子モノ対立遺伝子ノックアウト効率Pは、

と記載することができる。

単一対立遺伝子がN個の異なる部位によってターゲットにされる場合、各gRNAとそのターゲット部位との間の解離定数は、K_i(i=1・・・N)として定義される。そのとき、Nタプルターゲット法(図２のA)の単一遺伝子モノ対立遺伝子ノックアウト効率Pは、

と記載することができる。

単一遺伝子モノ対立遺伝子ノックアウト効率Pは、それぞれの所与のα、N、およびSについて1,000回計算した。毎回の計算において、一セットのK(シングル、トリプル、Nタプルターゲット法についてそれぞれ、1、3、およびN)を、幾何平均および幾何標準偏差がそれぞれ1.0および2.5である対数正規分布からランダムにピックアップした(図２のB)。普遍性を失うことなく、解離定数Kの分布の幾何平均について1.0を使用することができる。その幾何標準偏差を推定するために、Tyr遺伝子の3種のgRNAに対するSSAアッセイから3つのgRNA解離定数を最初に推定した(Tyr-1、Tyr-2、およびTyr-3についてそれぞれ、K₁=2.32203、K₂=1.16562、およびK₃=0.369466、図１のD)。Kは、SSAアッセイから測定されるDNA切断効率に反比例する値として推定される。これらの推定K値の幾何標準偏差が2.53097であったので、幾何標準偏差として2.5を使用した。単一遺伝子２対立遺伝子ノックアウト、二重遺伝子２対立遺伝子ノックアウト、および三重遺伝子２対立遺伝子ノックアウトの効率を推定するために、それぞれP²、P⁴、およびP⁶を計算した(図１のBおよび図２のA)。図１のBおよび図２のAでは、α=0.10を使用した。in vivoでのαおよびSについて不確定度があったので、αおよびSの異なる値を用いて単一遺伝子２対立遺伝子ノックアウト効率P²を計算した(図２のC、それぞれα=0.05、0.10、0.15、およびS=5、10、15)。DNA修復システムがインタクトな状態に回復することが困難である、マルチプルターゲットCRISPRモデルにおける変異の他のタイプ(例えば、マルチプルターゲットCRISPR法によって誘導される大きな欠失)の確率を含めなかったので、マルチプルターゲット法(N>1)の計算されたノックアウト効率は、ノックアウトの「最低」効率を予測するものである。

αおよびSの現実的な値を推定するために、Tyr-1、Tyr-2およびTyr-3に対するSSAアッセイ結果から推定された異なる解離定数(K₁=2.32203、K₂=1.16562、およびK₃=0.369466)を有する3つのシングルターゲットCRISPRモデルを構築した。これらのモデルを、シングルターゲットCRISPRの実験結果(Tyr-1、Tyr-2およびTyr-3についてそれぞれ、36.0%、54. 2%および64.7%)と比較し、最小二乗法を使用して変異の回復率(α=0.136428)および総gRNA濃度(S=5.7248)の現実的な値をそれぞれ推定した。次に、α=0.136、および図２のB中の対数正規分布からランダムにピックアップしたKを用いて、1,000シミュレーションを実施して、シングルターゲット(N=1)およびトリプルターゲット(N=3)CRISPRモデルの単一遺伝子２対立遺伝子ノックアウト効率(P²)を計算した。その結果、S=5.7248におけるシングルターゲット(N=1)およびトリプルターゲット(N=3)CRISPRモデルの単一遺伝子２対立遺伝子ノックアウト効率(P²)は、それぞれ、0.512±0.138および0.826±0.098(平均±標準偏差)であった(図２のG)。αおよびSについて現実的なパラメータ値を使用した場合、トリプルターゲットCRISPR法は、シングルターゲットCRISPR法よりはるかに効率的であることが示された。さらに、Cas9 mRNAおよび3種のgRNAの混合物を使用するトリプルターゲット法は、ほぼ完全な効率を実現した(97.5%、図１のE、１のF)。これは、予測された最低効率(82.5%)よりはるかに高い効率である(図２のG)。

（gRNAのターゲット配列の設計）
Tyrのターゲット配列(図１のC)を、Jack LinのオンラインCRISPR gRNAファインダー(http://spot.colorado.edu/〜slin/cas9.html)を使用して設計した。各ターゲット配列についてのマウスゲノム内の可能なオフターゲット配列を、CRISPR設計ツール(http://tools.genome-engineering.org)( 非特許文献９)を使用して確認した。

Tyrの代替ターゲット配列(図５のA)を、mm10 CRISPR/Cas9データベース(図４のA、http://www.crispr.rikenjp/)から生じるリストから選択した。
（単鎖アニーリング(SSA)アッセイのためのpGL3-SSAプラスミドの構築）
ルシフェラーゼ遺伝子の5'または3'部分配列を含有するpGL3-対照ベクター(Promega)の2つの部分的な断片を、以下のプライマー（ベクター骨格の一部およびルシフェラーゼ遺伝子の5'部分を増幅するプライマーとしての1)および2)、ならびにベクター骨格の一部およびルシフェラーゼ遺伝子の3'部分を増幅するプライマーとしての3)および4)）、すなわち、
1)フォワード5'-GTAAAATCGATAAGGATCCGTCGAC-3'（配列番号１）(Hokkaido System Science)
2)リバース: 5'-CAGCTGAAACTGCAGAAAGATATCAAAGAATTCTTAATCCAGATCCACAACCTTCGCTTC-3'（配列番号２）
3)フォワード5'-GATATCTTTCTGCAGTTTCAGCTGCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGG-3'（配列番号３）
4)リバース5'-CATCGGTCGACGGATCCTTATCG-3'（配列番号４）
を用いてPCRを使用して増幅させた。両PCR産物をPstlおよびBamHIによって消化し、相互にライゲーションした。5'と3'部分ルシフェラーゼ配列の間に複数のクローニング配列(5'-TAAGAATTCTTTGATATCTTTCTGCAGTTTCAGCTG-3'（配列番号５）:終止-EcoRI-EcoRV-Pstl-Pvull)を含有した得られたベクターをpGL3-SSAと呼ぶ。

（pSSA-Tyr-1およびpSSA-Tyr-2/3プラスミドの構築）
チロシナーゼ(それぞれ、Tyr-1、ならびにTyr-2およびTyr-3の両方)のターゲット配列を含有する199塩基および200塩基の断片を、PCRによってC57BL/6マウスゲノムDNAから増幅した。PCR産物を、Mighty Cloningキット(TaKaRa)用いて5'末端をリン酸化し、pGL3-SSAプラスミドのEcoRV部位内に挿入した(上記を参照)。得られたベクターをそれぞれ、pSSA-Tyr-1およびpSSA-Tyr-2/3と呼ぶ。
ターゲット配列のオリゴヌクレオチド配列(Hokkaido System Science)
pSSA-Tyr-1:
フォワードオリゴヌクレオチド:5'-GGCACCTATGGCCAAATGAACAATGGG-3'（配列番号６）
リバースオリゴヌクレオチド: 5'-GTTCCCACAATAACAAGAAAAGTCTGTGCC-3'（配列番号７）
pSSA-Tyr-2/3:
フォワードオリゴヌクレオチド:5'-TGGAACAAGCCAGTCGTATCTGGCC-3'（配列番号８）
リバースオリゴヌクレオチド:5'-TCACAGATGGCTCTGATACAGCAAGCTG-3'（配列番号９）
（pX330-Tyr-1、pX330-Tyr-2、pX330-Tyr-3プラスミドの構築）
チロシナーゼのターゲット配列(Tyr-1、Tyr-2、Tyr-3)を含有するオリゴヌクレオチド(Hokkaido System Science)をアニールし、pX330プラスミドのU6プロモーターの下流のBbsI部位内に挿入した[Addgene、#42230、(Cong, L., 他、 (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823；非特許文献９]。得られたベクターを、それぞれpX330-Tyr-1、pX330-Tyr-2、pX330-Tyr-3と呼ぶ。

ターゲット配列のオリゴヌクレオチド配列
Tyr-1:
フォワードオリゴヌクレオチド:5'-CACCGTGTCAAGGGACACACTGCT-3'（配列番号１０）
リバースオリゴヌクレオチド:5'-AAACAGCAGTGTGTCCCTTGACAC-3'（配列番号１１）
Tyr-2:
フォワードオリゴヌクレオチド:5'-CACCGTTATTGCTGCAGCTCTCTC-3'（配列番号１２）
リバースオリゴヌクレオチド:5'-AAACGAGAGAGCTGCAGCAATAAC-3'（配列番号１３）
Tyr-3:
フォワードオリゴヌクレオチド:5'-CACCGAAGAAGAAGCAACCCCAGG-3'（配列番号１４）
リバースオリゴヌクレオチド:5'-AAACCCTGGGGTTGCTTCTTCTTC-3'（配列番号１５）
（SSAアッセイ）
10%のFBS(JRH Biosciences)ならびに抗生物質(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン;Life Technologies)を補充したDMEM(Life Technologies)中で293T細胞を維持した。トランスフェクションの1日前に、1ウェル当たり4×10⁵細胞の密度で6ウェルプレート上に細胞を蒔いた。翌日、製造者の指示に従って、図１のDに示した以下のコンストラクト、すなわち、0または2μgのpX330、pX330-Tyr-1、pX330-Tyr-2、またはpX330-Tyr-3プラスミドの存在下で、pSSA-Tyr-1またはpSSA-Tyr-2/3レポータープラスミド1μgとともに、FuGene6(Roche)を使用して細胞をコトランスフェクトした。空ベクターを使用して、DNAの総量を1ウェル当たり3μgにした。さらに、phRL-CMVプラスミド[ウミシイタケルシフェラーゼ(Renilla luciferase、RLuc)レポーターベクター、Promega]50ngを、トランスフェクション効率の内部対照として、各トランスフェクションに含めた。トランスフェクトして48時間後に、細胞を回収し、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)を使用してアッセイした。ルシフェラーゼ活性をRluc活性に対して正規化した。

（Cas9 mRNA合成）
T7プロモーター融合Cas9コード領域を含むp3s-Cas9HC[Addgene、#43945、(Cho, S.W.,他、(2013). Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature biotechnology 31,230-232]をXbal(TaKaRa)で消化し、mMESSAGE mMACHINE T7キット(Life Technologies)を使用するin vitro転写の鋳型として使用した。Cas9 mRNAを、MEGAclearキット(Life Technologies)を使用して精製した。

（gRNA合成）
Tyr(図１のD)のgRNA鋳型を、以下に列挙したプライマー(Hokkaido System Science)(非特許文献４)を用いたPCRによって、T7プロモーターに融合させ、かつpX330-Tyrから増幅させた。

TyrのgRNA鋳型を直接合成し、PCRによってT7プロモーターに融合させた。最初に、各ターゲット配列を含むgRNA鋳型の部分的な断片を、各ターゲット配列について共通のリバースプライマーおよびCommon Reverse primer and Forward primer-1(Hokkaido System Science)を使用したPCRを用いて、pX330プラスミド(Addgene、#42230)から増幅させた。引き続いて、T7プロモーター融合gRNA鋳型を、各ターゲット配列についてCommon Reverse primer and Forward primer-2(Hokkaido System Science)を用いてPCRを使用して、希釈されたPCR産物から増幅させた。

T7g-RNA鋳型のためのオリゴヌクレオチド配列
Tyr(セット-2)
gRNANo.4
1 CACTATAGGGACCTCAGTTCCCCTTCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（配列番号１６）
2 GGGCCTAATACGACTCACTATAGGGACCTCAGTTCCCCTTCAAG（配列番号１７）
gRNANo.5
1 CACTATAGGGTTTGACCCAGTATGAATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（配列番号１８）
2 GGGCCTAATACGACTCACTATAGGGTTTGACCCAGTATGAATCG（配列番号１９）
gRNANo.6
1 CACTATAGGAGTCTCTGTTATGGCCGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（配列番号２０）
2 GGGCCTAATACGACTCACTATAGGAGTCTCTGTTATGGCCGATG（配列番号２１）。

Tyr(セット-3)
gRNANo.7
1 CACTATAGGGTCATCCACCCCTTTGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（配列番号２２）
2 GGGCCTAATACGACTCACTATAGGGTCATCCACCCCTTTGAAGG（配列番号２３）
gRNANo.8
1 CACTATAGGTGTTGACCCATTGTTCATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（配列番号２４）
2 GGGCCTAATACGACTCACTATAGGTGTTGACCCATTGTTCATTG（配列番号２５）
gRNANo.9
1 CACTATAGGAGCCATGGCCAGATACGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC（配列番号２６）
2 GGGCCTAATACGACTCACTATAGGAGCCATGGCCAGATACGACG（配列番号２７）
T7プロモーター融合gRNA PCR断片を、MEGAshortscript T7キット(Life Technologies)を使用するin vitro転写の鋳型として使用した。gRNAを、MEGAclearキット(Life Technologies)を使用して精製した。
T7-gRNAの一般的なリバースオリゴヌクレオチド:
5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3'（配列番号２８）(非特許文献４)
Tyr(セット1)のT7-gRNAのオリゴヌクレオチド配列
Tyr-1フォワードオリゴヌクレオチド:
5'-GGGCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCAAGGGACACACTGCT-3'（配列番号２９）
Tyr-2フォワードオリゴヌクレオチド:
5'-GGGCCTAATACGACTCACTATAGGTTATTGCTGCAGCTCTCTC-3'（配列番号３０）
Tyr-3フォワードオリゴヌクレオチド:
5'-GGGCCTAATACGACTCACTATAGGAAGAAGAAGCAACCCCAGG-3'（配列番号３１）
Tyr(セット2および3)遺伝子のトリプルターゲットgRNA(T7-gRNA)のオリゴヌクレオチド配列は、上記の通りである。

（定量的PCR(qPCR)および配列決定によるTyrノックアウトマウスの遺伝子型判定）
野生型およびTyrノックアウトマウスのゲノムDNAは、製造者の指示に従って、Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega)を使用して、これらのマウスの脳、頭皮および尾部から調製した。これらのマウスの遺伝子型判定のためのqPCRは、ABI PRISM7900(Applied Biosystems)/QuantStudio7 Real-Time PCR System (Life Technologies)、SYBR Premix Ex Taq GC(TaKaRa)および以下のqPCR用のプライマー(Hokkaido System Science)を使用して実施し、それから定量的qPCRの結果が脳、頭皮および尾部から抽出されたゲノムDNAの間において互いに適合していることを確認した。絶対的なターゲット部位の存在量は、野生型ゲノムDNAから得た検量線を使用して計算した。Tbp(Tsujino, K., 他、(2013). Establishment of TSH beta real-time monitoring system in mammalian photoperiodism. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 18, 575-588)の量を定量化し、内部対照として使用した。
定量的PCRで使用されるプライマー配列(Hokkaido System Science)
Tyr-1:
フォワードプライマー:5'-GTGTCAAGGGACACACTGCTTGG-3'（配列番号３２）
リバースプライマー:5'-CTGTGCCAAGGCAGAAACCCTGG-3'（配列番号３３）
Tyr-2:
フォワードプライマー:5'-GTTATTGCTGCAGCTCTCTCTGG-3'（配列番号３４）
リバースプライマー:5'-GTCTTTGTCCATGAGGAGTGGCTG-3'（配列番号３５）
Tyr-3:
フォワードプライマー:5'-GTTATTGCTGCAGCTCTCTCTGG-3'（配列番号３６）
リバースプライマー:5'-TCACAGATGGCTCTGATACAGCAAG-3'（配列番号３７）
Tbp:
フォォワードプライマー:5'-CCCCCTCTGCACTGAAATCA-3'（配列番号３８）
リバースプライマー:5'-GTAGCAGCACAGAGCAAGCAA-3'（配列番号３９）。

（タンパク質の定量化）
TYRタンパク質の絶対量を、selected reaction monitoring (SRM) MSで定量した。MS分析のためのサンプルの処理は、幾つかの改変を加えたphase-transfer surfactant (PTS) プロトコール (Masuda, T., Tomita, M., and Ishihama, Y. (2008). Phase transfer surfactant-aided trypsin digestion for membrane proteome analysis. J Proteome Res 7, 731-740.) に従って行った。TYR存在量を分析するために、変異マウスTyr #3およびTyr #4から得た耳を用いた。簡潔には、ホスファターゼインヒビターカクテル（phosphatase inhibitor cocktail (Nacalai Tesque)）およびプロテアーゼインヒビターカクテル（protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque)）を含んでいるPTSバッファ(12 mMのsodium deoxycholate, 12 mMのsodium N-lauroylsarcosinate, および50 mMのNH₄HCO₃)中での超音波処理によって、この組織をホモジナイズし、10,000×gで10分の遠心分離によって不純物を除去した。得られたホモジネートは、液体窒素中で凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。タンパク質の濃度は、Quick Start Bradford Dye Reagent(Bio-Rad)を用いて決定した。

同位体ラベルしたリジン残基およびアルギニン残基(それぞれ、¹³C₆-Lysおよび¹³C₆ ¹⁵N₄-Arg)を持つ合成ペプチドを、内部標準として加えた。この合成ペプチドは、ターゲットタンパク質の定量用の特定の配列(Tyrタンパク質の定量用にはDTLLGGSEIWR)を製造するために、他所に記載している我々が新たに開発した手法に従って、予備定量および消化を行った。上記タンパク質／内部標準の混合物は、システイン還元（cysteine reduction）およびアルカリ化（alkylation） (10 mMのTCEPで、３７℃下で１時間、および15mMのiodoacetamideで、３７℃下、暗下で、３０分)し、次いで50mMのNH₄HCO₃ 溶液で５倍希釈を行った。次いで、1:50 (w/w) LysCを用いた8時間のインキュベーションと、それに引き続く1:50 (w/w)トリプシンを用いた、３７℃、１６時間のインキュベーションとを行うことによって、タンパク質の酵素分解を行った。0.5%のTFAを含む酢酸エチルを同じ体積量混合することによって、消化（タンパク質の酵素分解）を止めた。サンプル中の界面活性剤は、酢酸エチル相を廃棄することによって除去した。ペプチドを含んでいる、残った水相は、SpeedVac (Thermo Scientific)を用いて乾燥した。乾燥したペプチドの混合物は、分析用バッファ(2%のアセトニトリルおよび0.1%のTFA)中に溶解した。得られたペプチド溶液は、StageTip (Rappsilber, J., Mann, M., and Ishihama, Y. (2007). Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature protocols 2, 1896-1906.)を用いて脱塩した。耳から調製した100μgのペプチド混合物は、StageTip-based fractionation (Wisniewski, J.R., Zougman, A., and Mann, M. (2009). Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome. J Proteome Res 8, 5674-5678.)を用いて６画分に予備分画をし、各画分は、14 - 30μLの分析用バッファに溶解した。

結果として得られた、凡そ１μgのタンパク質に対応するペプチド混合物は、三連四重極型質量分析計(TSQ Vantage EMR mass spectrometer, Thermo Scientific)を用いた液体クロマトグラフィー(LC)-MSによって分析した。このLC-MSは、キャプティブスプレーイオン化源（captive spray ionization source (Michrom Bioresources)）、nano-Advance UHPLC system (Bruker Daltonics)、およびトラップカラム(0.3 x 5 mm, L-column, ODS,Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan)を備えたHTC-PALオートサンプラー（CTC Analysis）を装着している。分析サンプルは逆相クロマトグラフィーによって分離し、この逆相クロマトグラフィーは、2 μmのC18 resin (L-column2, Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan）を充填した、自作のキャピラリーカラム(長さが200 mmで、内径が100 μm)を用いて、0.5%酢酸中の4%〜36%のアセトニトリルの濃度勾配で、300 nL/minの流量において105分にわたって行った。得られた溶出物は、直接、ＭＳ内へエレクトロスプレー(1.6 kV)した。

耳由来のサンプル中のTYRタンパク質を分析するために、重いバージョンのDTLLGGSEIWR、および軽いバージョンのDTLLGGSEIWRを、m/z623.8から804.4 (軽いバージョン用)、およびm/z 628.8から814.4 (重いバージョン用)のSRMトランジションを用いて、LC-SRM-MSでモニタリングした。

（エクソームシーケンシングのためのライブラリの調製）
SureSelectQXT Reagent Kit (Cat. No.G9681A, Agilent Technologies) および SureSelectXT Mouse All Exon Kit V1 (Cat. No.5190-4641, Agilent Technologies)を用いて、キットの指示書に従って、エクソームライブラリを作成した。精製したゲノムDNAサンプルのフラグメンテーション、およびアダプターのタグ付けを、トランスポゼースベースの反応によって行った。アダプターのタグ付けがされたＤＮＡライブラリを増幅した後、AMPure XP beads (Beckman Coulter)を用いて精製を行った。精製を行ったこのライブラリを、SureSelectキャプチャライブラリに対するハイブリダイズに供し、ハイブリダイズしたＤＮＡを、ストレプトアビジン被覆したビーズを用いて回収した。この濃縮したＤＮＡライブラリを、Illumina TruSeq system用のインデックスタグを付加するために、適切なdual indexingプライマのペアを用いて、ＰＣＲ法によって増幅した。各精製の段階において、2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いて、ライブラリ中のDNA分子の長さの分布と濃度とを分析した。

（エクソームシーケンシングおよびIndelの検出）
ライブラリを、TruSeq Rapid PE Cluster Kit (Cat. No. PE-402-4001)を用いたon-board cluster generationおよびIllumina HiSeq 1500 (Illumina)のRapid Run Modeにおけるシーケンシングに供し、３つの50-cycleSBS kits (Cat. No. FC-402-4002)を用いて126サイクルのペアエンド読み取りを得た。ここで、以前に示されたように、余剰な試薬を利用した(Tatsumi K, N.O., Itomi K, Tanegashima C, Kuraku S (2015, in press.). Optimization and cost-saving in tagmentation-based mate-pair library preparation and sequencing. Biotechniques.)）。コントロールとして、5% PhiX spike-in を各レーンに添加した。イメージ分析およびベースコーリングは、HiSeq Control Software (HCS) ver. 2.0.12.0およびReal-Time Analysis (RTA) ver. 1.17.21.3から構成されるstandard Illumina softwareを用いて実行した。シーケンス生データのクオリティは、FastQC ver. 0.11.1(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)でコントロールした。アダプター配列の除去、および低クオリティの読み取りの除去は、Trim Galore ver. 0.3.3 を用いて、パラメータ‘-e 0.1 -q 30’で行った(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)。さらに、average per-base quality scoreが３０以下の読み取りは、オリジナルのスクリプトから除去した。上記のようにフィルタリングした読み取りを、BWA-MEMアルゴリズムを用いたBWA ver. 0.7.10-r789 (Li and Durbin, 2010)によって、ゲノム配列GRCm38/mm10にアラインメントした。マップされたペア読み取り間の潜在的なPCR重複（PCR duplicate）は、Picard Tools ver. 1.122 (http://picard.sourceforge.net/)のMarkDuplicates機能を用いて除去した。読み取りの数、マッピングレート、エクソームオンベイトカバーレージ（exome on-bait coverages）を含むシーケンシングの統計は、Picard ToolsのCalculateHsMetrics機能によってサマライズした。

マップされた読み取りの局所的再アラインメント（Local realignment）は、Genome Analysis Toolkit (GATK) package ver. 3.2-2 (McKenna, A., Hanna, M., Banks, E., Sivachenko, A., Cibulskis, K., Kernytsky, A., Garimella, K., Altshuler, D., Gabriel, S., Daly, M., et al. (2010). The Genome Analysis 41 Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome research 20, 1297-1303.)のRealignerTargetCreatorおよびIndelRealignerによって実行し、BaseRecalibratorおよびPrintReads functionsを用いてper-base quality scoreに基づく再補正（recalibration）を実行した。これらのプロセスのため、Agilent Technologiesによって提供された、100 bp paddingを伴うmm9-ベースのエクソーム領域データ（mm9-based exome region data）を、UCSC LiftOver program (https://genome.ucsc.edu/util.html) (Rhead, B et al., (2010). The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic acids research 38, D613-619)を用いてmm10に変換し、NCBI dbSNP (build 137)から得た挿入変異および欠失変異(indel)を既知の部位として用いた。上述の通り実行される局所的再アラインメント、および再補正を適用した後に、GATKにおけるHaplotypeCallerを用いて、サンプル特異的なindelを呼び出した。

高インパクトなコーディングバリアントを引き起こすindelをフィルターし、アノテーションするために、SnpEff package ver. 4.0E (Cingolani, P., Platts, A., Wang le, L., Coon, M., Nguyen, T., Wang, L., Land, S.J., Lu, X., and Ruden, D.M. (2012). A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly 6, 80-92.)を用いた。１）SnpEff definitionによって‘HIGH’とカテゴライズされたindel、および２）in-frame indelを、高インパクト変異と規定した。コントロールにおけるindelとの対比において、サンプルにもコントロールにも存在するindelは取り除いた。オンターゲットindelおよびオフターゲットindelを、UCSC Integrative Genomics Viewer (IGV) ver. 2.3.36 (Thorvaldsdottir, H., Robinson, J.T., and Mesirov, J.P. (2013). Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics 14, 178-192.)上で可視化し、評価した。エクソームのシーケンスデータは、DNA Data Bank of Japan (DDBJ)にデポジットされ、入手可能である。Tyr KOのアクセッション番号はDRA003478である。

（CRISPR gRNAデータベースの開発）
gRNA部位の自動検出における最初のステップは、候補ターゲットの抽出である。プロセスは、単一遺伝子について記載されており、方法を実施する場合にはすべての遺伝子について繰り返される。ゲノムアノテーションファイルおよびゲノム配列を使用して、遺伝子の全ての公知のアイソフォームによって共有される全エクソン配列を抽出した。これは、ある遺伝子（そのアイソフォームのみではない）を標的化したことを保証するために必要である。次いで、[G、C、またはA]N₂₀GGパターンにマッチした全配列、および相補体がこのパターンにマッチした配列を抽出した。このリストは、遺伝子のすべての可能な候補を表す。次のステップにより、このリストを選別し、適当なターゲットのみを保持した。各ターゲットは、全ステップに合格する必要があり、よって、その順序は、選択に何ら影響しない。これらのステップは、計算的に最も効率のよい順序において実施された。

候補gRNAは、独特の部位をターゲットにする必要がある。Bowtie2(Langmead, B., and Salzberg, S.L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature methods 9, 357-359)を使用して、ゲノム内で複数の正確なマッチを有した(場所に関係なく)全候補を除外した。オフターゲット部位に強く結合するリスクを有する低AT率 (45%未満)を有するターゲット、およびgRNAの二次構造を破壊する傾向のあるTTTTを含有するターゲットも除外した。ターゲットは合成中にフォワードプライマー内で出現するので、これらがリバースプライマーと類似しすぎないことも必要である（上述の「T7-gRNAの一般的なリバースオリゴヌクレオチド」を参照）。これは、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman, S.B., and Wunsch, C.D. (1970). A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of molecular biology 48, 443-453)を使用して実現した。次に、Vienna RNAフォールドパッケージ(Lorenz, R., 他、(2011). ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for molecular biology : AMB 6, 26)を使用してgRNAの二次構造を計算した。フォールディングエネルギーが-18超(「誤った」構造が非常に不安定であったことを示す)であった場合を除いて、Cas9認識のためのステムループ構造がフォールドすることができなかった全候補を除外した(Nishimasu, H., 他、(2014). Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell 156, 935-949)。最後に、Zhangツール(非特許文献９)のインプリメンテーションを使用してオフターゲットリスクを評価した。データベース内に記憶された全ターゲットが可能な限り安全であったことを保証するために、75未満のスコアを有する候補を除外した。

全てのフィルタリングステップに合格した候補を、データベース内に保存および記憶した。これは、http://crispr.riken.jpで、オンラインでアクセス可能である[論文審査中の間、パスワード保護されている。ログイン「DB」およびパスワード「UnderReview」を使用されたい]。

（統計的有意性試験）
統計的有意性は、ダネット検定またはウェルチの二標本t-検定によって評価し、以下のように表した:^*p<0.05、^**p<0.01、^***p<0.001、および有意でない評価について、n.s.。分析は、Microsoft ExcelまたはRバージョン3.1.0を使用して実施した。

＜結果＞
（トリプルターゲットCRISPRは、ほぼ完全なノックアウト効率を実現する）
２対立遺伝子ノックアウトマウスを作製するための高効率的な方法を確立するために、様々なCRISPR法の最小効率を推定する単純なコンピューターモデルを構築した(詳細については上記を参照)。このコンピューターモデルによれば、複数のgRNAが同じ遺伝子をターゲットにするマルチプルターゲットCRISPRストラテジーが、数倍高い濃度の単一gRNAが対象とする遺伝子をターゲットにする高濃度CRISPRストラテジーより効率的である(図1のA、1のB、図２のA、および図２のB)。

本実施例では、ターゲット遺伝子としてTyr、および近交系としてC57BL/6Nを選択した。この遺伝子が２対立遺伝子ともノックアウトされた場合、C57BL/6Nの黒色の毛色が白色になるためである。また、Tyr遺伝子の3種のターゲット配列について3種のgRNAを設計した(それぞれターゲットTyr-1、Tyr-2、およびTyr-3についてgRNA1、gRNA2、およびgRNA3。図１のCおよび図２のD)。設計したgRNAは、一本鎖アニーリング(single strand annealing、SSA)アッセイを使用することによって、少なくともin celluloで高い切断効率(対照と比較して約7倍〜約40倍)を有することを確認した(図１のDおよび図２のE)。SSAアッセイでは、CRISPR/Cas9システムによるDNA切断が、ホタルルシフェラーゼ(Luc)の不完全断片の組換えを誘導し、Luc遺伝子全体および生物発光の増強をもたらした。

受精卵に注射する場合、150ng/μlで3種のgRNAのそれぞれを単独で使用するシングルターゲット法では、中等度の効率であった(それぞれ36.0%、54.2%、および64.7%、図１のFおよび図２のF)。次に、モデルの2つのパラメータである、gRNAの解離定数と比較した有効総gRNA濃度(S=5.72)および変異の回復率(α=0.136)を推定した。これにより、全身２対立遺伝子ノックアウトマウスについてのトリプルターゲットCRISPR法の最小効力は82.6%と予測された(図２のG)。実際、Cas9 mRNA(100ng/μl)、ならびに3種のgRNA(gRNA1、gRNA2、およびgRNA3、それぞれ50ng/μl)の混合物を使用するトリプルターゲットストラテジーは、ほぼ完全な効率を実現した(97.5%、図１のE、１のF、および図２のH)。また、CRISPRターゲット配列を含んでいるターゲット配列のqPCRを実施し、２匹のTyrノックアウトマウスから得た６つのCRISPRターゲット領域のうち５つが、検出不可能であることを確認した。これらの定量的qPCRの結果は、脳、頭皮および尾部から抽出されたゲノムDNAにおいて互いに対応しており（図２のH）、Tyr遺伝子の観察された全身２対立遺伝子ノックアウトの表現型（すなわち白い毛の色）と一致している。観察されたノックアウト効率（97.5%）は、予測された最低効率(82.6%)よりも高い(図２のG)。向上したノックアウト効率は、不可逆的な変異（例えば、複数のCRISPRターゲット部位間における欠失）の結果であると考えられた。

ゲノムへの影響を調べるために、エキソーム配列決定を行い、ここでターゲット塩基の９１．６〜９５．６％が１０回より多くカバーされた。その結果として、種々の長さを有しているゲノム伸長物のオンターゲットの欠失が示され、オフターゲットの変異はもたらされなかった（図３）。したがって、トリプルターゲットCRISPR法は、単回の生成において＞９０％の効率で２対立遺伝子ノックアウトマウス生じさせ得る。さらに、独立して生成された別のトリプルターゲットCRISPRノックアウト系統と比較して、質量分析（MS）によって、TYRタンパク質の発現が検出されないことを確認した（図３）。以上の通り、トリプルターゲットCRISPR法により、一世代で90%を超える効率で２対立遺伝子ノックアウトマウスを作製することができた。トリプルターゲットCRISPR法は、単一遺伝子の２対立遺伝子ノックアウトについて高い効率(９０％超)を実現するので、２遺伝子の２対立遺伝子ノックアウトについてさえ８０％超の効率を実現する可能性を有し、行動表現型の信頼できる分析に有用である。

（トリプルターゲットCRISPR法の公的に利用可能なデータベースの開発）
上記の通り、トリプルターゲットCRISPRによれば、２対立遺伝子ノックアウトマウスを効率的に作製することができる。しかし、この方法を用いて種々のノックアウトマウスを作製したが、同一の遺伝についてトリプルターゲットを手動で設計することは、所定のゲノム配列にとっての候補ターゲット配列の抽出（http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp）（Ma, M., Ye, A.Y., Zheng, W., and Kong, L. (2013). A guide RNA sequence design platform for the CRISPR/Cas9 system for model organism genomes. BioMed research international 2013, 270805.）、および各候補物にとってのオフターゲットリスクの評価（http://tools.genome-engineering.org）（Ran, F.A., Hsu, P.D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D.A., and Zhang, F. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols 8, 2281-2308.）のための既存のツールを用いてさえ、依然として時間がかかった。この手動の設計手順は、単一遺伝子のために数時間を要し、これによって大規模なスクリーニングを実施する可能性を制限する。したがって、さらに、gRNA選択ステップの全てを実施する自動化された方法を開発することを試みた。全マウスゲノムをスキャンし、適当なターゲットは全てオンラインデータベース上にある(図４、詳細については実験プロトコールを参照)。このgRNAデータベースから、マウス遺伝子の81.2%について少なくとも3つのターゲット配列(トリプルターゲットCRISPRのための1セット)を取得することができる。さらに、全マウス遺伝子の71.9%は、6を超えるターゲット配列を有し(トリプルターゲットCRISPRのための複数のセット)、これらも含まれている(図４のBおよび図４のC)。

トリプルターゲットCRISPRデータベースの有用性を検証するために、Tyr遺伝子のトリプルターゲットの2つの独立したセットを選択した(セット2について、Tyr-4、Tyr-5、およびTyr-6ならびにセット3についてTyr-7、Tyr-8、およびTyr-9、図５のA)。これらは、上記実験で使用したTyr-1、Tyr-2、およびTyr-3(セット1)とは異なる(図２のC)。受精卵内に注射した場合、gRNAの両セットを使用するトリプルターゲット法は、ほぼ完全な効率を示し(それぞれ96.6%および100%、図４のDおよび図４のE)、トリプルターゲットCRISPRデータベースの有用性が支持された。このデータベースは公開されている(http://crispr.riken.jp/)。指示書を図５に要約する。簡単に言えば、ユーザーは、検索ボックス内に遺伝子名称を入力し、次に送信ボタンをクリックする(図５のB)。コード領域、5'UTR、3'UTR、またはアイソフォーム特異的領域を選択することによってgRNAのターゲット場所を選択することが可能である(図５のB)。デフォルトの出力情報には、ターゲット配列、場所、および方向、ならびに遺伝子に対するプローブの位置が含まれる。任意選択の情報、例えば、gRNA配列、オフターゲットスコア、およびターゲットのプライマーなども選択できる(図５のB)。検索結果は、表として閲覧することができ、オンデマンドでCSVファイルとしてダウンロードできる(図５のC)。

＜考察＞
（トリプルターゲットCRISPRによれば、一世代において２対立遺伝子ノックアウトマウスを効率的に作製できる）
本発明は、一世代で全身２対立遺伝子ノックアウトマウスを高効率で(90%超)作製することを目的とした。様々なCRISPR法の最小効率を推定するのに単純なコンピューターモデルを使用することによって、マルチプルターゲットCRISPR法によれば、シングルターゲットCRISPRより高い効率で変異マウスを作製できるはずであることを見出した。本発明では、Tyr遺伝子に対する3種の異なるgRNAを設計し、3種のgRNA(Tyr-1、Tyr-2、Tyr-3)の混合物を使用するトリプルターゲット法により、ほぼ完全な効率(97.5%)を達成した。一方、3倍高い濃度のgRNAのいずれかを用いたシングルターゲット法の効率は、中等度であることを確認した。ゲノム検証の結果として、少なくともエクソンにオフターゲット変異はなかった（図３）。エクソーム配列決定（Tyrノックアウト（セット１）を含んでいる）における塩基対（ｂｐ）読み取りの総数は、６５．６Ｇｂｐであった。これは、マウスゲノムにおける全塩基対（２．７Ｇｂｐ）の２４倍を超えている。これは、したがって、トリプルターゲットCRISPRストラテジーのオフターゲット効果が実際に問題にならないことを確信させるに十分なカバーをもたらしている。重要なことに、Tyr-3のDNA切断効率は、Tyr-2のものより3倍超高く(図１のD)、一方、Tyr-3の全身２対立遺伝子ノックアウト効率(64.7%)は、Tyr-2のものと同様であり(54.2%)、in vivoでの制限要因は、CRISPR/Cas9システムによるDNA切断ではなく、DNA修復などの他の要因であることを示し、コンピューターモデルによる予測と一致した。トリプルターゲット法の再現性およびロバスト性を、Tyr遺伝子に対する3種のgRNAの2つの独立したセットを用いた追加の実験によってさらに確認した(図４のDおよびE)。この試験において分析のために用いたすべてのマウスを遺伝型判定することによって、ノックアウト効率を確認した。トリプルターゲットCRISPR法によって生成した１０２匹のマウス（１１匹のシングルノックアウト系統および２匹のダブルノックアウト系統を含んでいる）を、遺伝子型決定した。動物の少なくとも９２．２％（ｎ＝９４）は、qPCRまたは配列決定によってノックアウトマウスと確認された。この効率は、上述のモデルによって予測された最小効率を超えていると確認された。さらに、マウスゲノム中の遺伝子の81.2%以上についてのトリプルターゲット候補gRNAを取得できる公的に利用可能なCRISPRデータベースも提供される(図４)。

本明細書に引用されているすべての文献（刊行物および特許文献）は、参照によって本明細書に組み込まれる。上記文献はいずれも、当該文献を特定している箇所を理解するためだけでなく、本明細書におけるあらゆる開示事項を理解するために参照され得る。

Claims

１種以上の標的遺伝子を有する細胞中に、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAとCasタンパク質とを生成できるCRISPR-Casシステムを導入することを含む、標的遺伝子がノックアウトされた細胞の製造方法。
３種のガイドRNAが標的遺伝子にターゲッティングし、Casタンパク質が標的遺伝子を切断し、これにより標的遺伝子がノックアウトされる、請求項１に記載の方法。
CRISPR-Casシステムが、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAと、Casタンパク質をコードするRNAとを含むシステムである、請求項１又は２に記載の方法。
標的遺伝子が２種類以上であり、２種類以上の標的遺伝子がノックアウトされる、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
細胞が、動物細胞である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
細胞が、受精卵である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
CRISPR-Casシステムが細胞の細胞質に導入される、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
請求項１から８の何れか一項に記載の方法により標的遺伝子をノックアウトした胚を取得し、前記胚を偽妊娠非ヒト動物に移植し、産仔を取得することを含む、ノックアウト非ヒト生物の製造方法。
ノックアウト非ヒト生物が、ノックアウト非ヒト動物である、請求項９に記載の方法。
標的遺伝子が２対立遺伝子であり、取得した産仔の全体数における全身２対立遺伝子ノックアウト個体数の割合が、９０％以上である、請求項９又は１０に記載の方法。
標的遺伝子が２種類以上であり、取得した産仔の全体数における全身２対立遺伝子ノックアウト個体数の割合が、前記２種類以上の標的遺伝子のそれぞれについて９０％以上である、請求項１１に記載の方法。
請求項９から１２の何れか一項に記載の方法により製造されるノックアウト非ヒト生物。