JPWO2016010114A1 - 腫瘍免疫又は感染免疫を増強させる免疫増強剤 - Google Patents
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Abstract
Description
項1. イマチニブ及び/又はその塩を有効成分として含有する、腫瘍免疫又は感染免疫を増強させる免疫増強剤。
項2. 腫瘍の治療において腫瘍免疫を増強させるために使用される、項1に記載の免疫増強剤。
項3. 固形がんの治療において腫瘍免疫を増強させるために使用される、項1又は2に記載の免疫増強剤。
項4. 感染症の予防又は治療において感染免疫を増強させるために使用される、項1に記載の免疫増強剤。
項5. イマチニブ及び/又はその塩を有効成分として含有する、制御性T細胞の抑制剤。
項6. エフェクター制御性T細胞を抑制するために使用される、項5に記載の制御性T細胞の抑制剤。
項7. 腫瘍免疫又は感染免疫を増強させる免疫増強剤の製造のための、イマチニブ及び/又はその塩の使用。
項8. 腫瘍免疫又は感染免疫の増強が求められている者に、有効量のイマチニブ及び/又はその塩を投与する工程を含む、腫瘍免疫又は感染免疫を増強する方法。
項9. 腫瘍免疫又は感染免疫を増強させる処置に使用されるイマチニブ及び/又はその塩。
項10. イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者において治療有効性の予測のための検査方法であって、
イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者から採取された末梢血に含まれる制御性T細胞を測定し、当該制御性T細胞数に基づいてイマチニブ及び/又はその塩による慢性骨髄性白血病の治療有効性を予測することを特徴とする、検査方法。
項11. 末梢血に含まれるエフェクター制御性T細胞を測定し、当該エフェクター制御性T細胞数に基づいてイマチニブ及び/又はその塩による慢性骨髄性白血病の治療有効性を予測する、項10に記載の検査方法。
項12. 分子遺伝学的完全寛解に至るか否かを予測するための検査方法である、項10又は11に記載の検査方法。
項13. 末梢血に含まれる制御性T細胞からなる、イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者において治療有効性の予測のためのバイオマーカー。
項14. 末梢血に含まれる制御性T細胞を検出する試薬を含む、イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者において治療有効性の予測のための検査キット。
本発明の免疫増強剤は、腫瘍免疫又は感染免疫を増強するために使用される免疫増強剤であって、イマチニブ及び/又はその塩を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の免疫増強剤について詳述する。
本発明の免疫増強剤では、イマチニブ及び/又はその塩を有効成分として使用する。
本発明の免疫増強剤は、腫瘍免疫又は感染免疫を増強する目的で使用される。本発明の免疫増強剤の適用対象者については、腫瘍免疫又は感染免疫の増強が求められていることを限度として特に制限されず、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、マウス、ラット、ウシ、サル等の非ヒト哺乳動物であってもよい。
本発明の免疫増強剤の投与形態については、特に制限されず、全身投与であっても、また局所投与であってもよい。本発明の免疫増強剤の投与形態として、具体的には、経口投与、腹腔内投与、血管内(動脈内又は静脈内)投与、経肺投与、皮下投与、経粘膜投与等が挙げられる。なお、血管内投与には、血管内注射のみならず、持続点滴も含まれる。これらの投与形態の中でも、好ましくは経口投与が挙げられる。
本発明の免疫増強剤の製剤形態については、特に制限されず、投与形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセルを含む)、液剤(シロップ剤、乳剤、懸濁液を含む)等が挙げられる。このような製剤形態は、薬学的に許容される基材や添加剤を用いて調製することができ、当該基材や添加剤の種類や配合量についても、製剤技術の分野で公知である。
本発明は、Tregを減少させるために使用されるTregの抑制剤であって、イマチニブ及び/又はその塩を有効成分とすることを特徴とする。
本発明は、イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者において治療有効性の予測のための検査方法であって、イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者から採取された末梢血に含まれるTregを測定し、当該Treg数に基づいてイマチニブ及び/又はその塩による慢性骨髄性白血病の治療有効性を予測することを特徴とする。
グリベック(ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を投与して治療を行った慢性骨髄性白血病患者(87名、内CMR49名及びNon-CMR38名)について、治療後に採取した末梢血中のTregの割合を測定した。具体的には、末梢血中の末梢血単核細胞を回収し、BD Horizon V500標識抗CD4抗体を使用して、CD4+細胞をゲートし、FITC標識抗CD45RA抗体及びPE標識抗FoxP3抗体を用いて細胞染色を行った。その後、FACS解析によって、CD45RA及びFoxP3の発現量を測定した。また、比較のために、健常人の末梢血中のTregについても同様に測定した。
CMR患者では、Tregの減少、特にエフェクターTregの減少が認められたため、本試験では、Tregの減少がCD8+キラーT細胞に与える影響について検討した。具体的には、前記試験例1で試験したのと同様の慢性骨髄性白血病患者(87名、内CMR49名及びNon-CMR38名)について、治療後に採取した末梢血中のCD8+T細胞の状態を測定した。具体的には、末梢血中の末梢血単核細胞を回収し、PE-Cy7抗CD8抗体を使用して、CD8+T細胞をゲートし、PerCP-Cy5.5標識抗CCR7抗体及びFITC標識抗CD45RA抗体を用いて細胞染色を行った。その後、FACS解析によって、CCR7及びCD45RAの発現量を測定した。また、比較のために、健常人の末梢血中のCD8+T細胞についても同様に測定した。
健常人から採取した末梢血から、APC-Cy7抗CD4抗体を使用して、CD4+細胞を回収した。更に、得られたCD4+細胞から、FITC抗CD45RA抗体及びPE標識抗FoxP3抗体を用いて、CD45RA+FoxP3low細胞(フラクションI:ナイーブTreg)、CD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)、及びCD45RA+FoxP3-細胞(フラクションV)をそれぞれ分取した。また、健常人から採取した末梢血から、BD Horizon V500抗CD8抗体、PerCP-Cy5.5標識抗CCR7抗体、及びBD Horizon V450標識抗CD45RA抗体を用いて、ナイーブCD8+T細胞も分取した。各細胞を20000 cells/200μlとなるようにRPMI1640培地に播種し、更に図5に示す量のイマチニブ量となるようにグリベック(ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を添加して、37℃で5日間培養を行った。培養後、Fixable Viability Dyeを用いて生細胞の染色を行った。
前記試験例3と同様の方法で、健常人の末梢血から、CD45RA+FoxP3low細胞(フラクションI:ナイーブTreg)、CD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)、CD45RA+FoxP3-細胞(フラクションV)、及びナイーブCD8+T細胞を分取した。各細胞を20000cells/200μlとなるようにRPMI1640培地に播種し、更に図6に示す量のイマチニブ量となるようにグリベック(ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を添加して、37℃で5日間培養を行った。培養後、Annexin V及び7-AAD染色にてアポトーシスの測定を行った。
グリベックを投与して治療を行った慢性骨髄性白血病患者において、CMR到達によりエフェクターTregが減少している可能性を否定するために、グリベック投与によりCMR得られず、途中からニロチニブ投与に変更してCMRに到達した患者3名(Case 1, 2, 3)についてTregの割合を検討した。具体的には、グリベック投与を行った後にCMRに到達しなかった際の末梢血におけるエフェクターTregの割合、ニロチニブ投与に変更した後にCMRに到達した際の末梢血におけるエフェクターTregの割合について、前記試験例1と同様の方法で測定した。
イマチニブの投与によりエフェクターTregが減少し、がん抗原特異的免疫応答が賦活化されることをin vitroで検証した。先ず、3名の健康人由来の末梢血(HD1、HD2及びHD3)に、イマチニブが5μMとなるようにグリベック(ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を添加して37℃で1日間培養した後に、がん抗原(Melan-A)を10μMとなるように添加して刺激を行い、37℃で10日間培養した。培養後、前記試験例1と同様の方法で、エフェクターTreg数を測定した。また、培養後に、BD Horizon V500標識抗CD8抗体及びPE標識Melan A/HLA-A*0201テトラマーを用いて特異的CD8+T細胞分析を行い、Melan A特異的CD8+T細胞誘導についても確認した。また、健康人由来の末梢血(HD1)については、前記がん抗原(Melan-A)の代わりに、サイトメガロウィルス抗原を10μMとなるように添加して刺激を行って、前記と同条件で培養し、BD Horizon V500標識抗CD8抗体及びPE標識CMV/HLA-A*0201テトラマーを用いてMelan Aと同様に特異的CD8+T細胞誘導解析を行った。
悪性黒色腫において、イマチニブ投与によりエフェクターTregが減少し、悪性黒色腫に対する免疫応答が賦活化されることをin vitroで検証した。先ず、3名の悪性黒色腫患者由来の末梢血(Pt1、Pt2及びPt3)に、イマチニブが5μMとなるようにグリベック(ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を添加して37℃で1日間培養した後に、がん抗原(Melan-A)を10μMとなるように添加して刺激を行い、37℃で10日間培養した。培養後、前記試験例1と同様の方法で、エフェクターTreg数を測定した。また、培養後に、前記試験例6と同様の方法でテトラマー分析を行い、特異的CD8+T細胞誘導についても確認した。
イマチニブの投与によりエフェクターTregが減少し、感染免疫応答が賦活化されることをin vitroで検証した。具体的には、サイトメガロウィルス抗原の代わりに、インフルエンザウィルス抗原ペプチドを10μMとなるように添加して刺激を行ったことと、及びインフルエンザ特異的テトラマーを使用した以外は、前記試験例6と同様の方法で特異的CD8+T細胞誘導解析を行った。
イマチニブがTregの減少を引き起こす上での標的分子を検討するために以下の試験を行った。先ず、前記試験例3と同様の方法で、健常人の末梢血から、CD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)、CD45RA+FoxP3-細胞(フラクションV)、及びナイーブCD8+T細胞を分取した。各細胞を20000cells/200μlとなるようにRPMI1640培地に播種し、更にイマチニブ濃度として0μM又は10μMとなるようにグリベック(ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を添加して、37℃で1時間培養を行った。培養後、各細胞を回収し、NP-40細胞溶解バッファーで細胞を処理して細胞溶解液を得た。次いで、一次抗体として抗リンパ球チロシンキナーゼ(LCK)抗体(3A5)及び抗リン酸化Src Family(phopsho-Src Family)抗体(ポリクローナル抗体)を用い、更に二次抗体としてHRP標識抗体を用いて、得られた細胞溶解液に対してウエスタンブロットを行った。
イマチニブがTreg減少を引き起こす際に、イマチニブの標的分子となっている可能性が示唆されたLCKについて、CD4+T細胞及びCD8+T細胞における発現を検証した。健常人から採取された末梢血のCD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞を用い作製された遺伝子転写開始点データベース(FANTOM5 deep CAGE database)を使用し、イマチニブと親和性が高い標的遺伝子(ABL1, ABL2, KIT, PDGFRA, LCK, NQO2, DDR1)の発現レベルを解析した。解析には、HeliScope CAGE ライブラリーのCNhs 13223とCNhs12201のデータを用い、転写開始点のタグ数(TSS tag counts)をグラフ化した。
T細胞におけるLCKとその下流分子であるZAP-70の発現レベルを検証した。先ず、健常人から採取した末梢血から、APC抗CD4抗体及びBD Horizon V500抗CD8抗体を使用して、CD4+T細胞及びCD8+T細胞をそれぞれ単離した。また、前記試験例3と同様の方法で、健常人の末梢血から、CD45RA+FoxP3low細胞(フラクションI:ナイーブTreg)、及びCD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)を単離した。得られた各細胞について、LCKとZAP-70 mRNAの発現レベルを、qRT-PCRにより検証した。LCKとZAP-70 mRNAの発現レベルの分析において、GAPDH mRNAをコントロールとして使用した。
ヒトTreg細胞におけるFoxp3結合領域を、SRA(Sequence Read Archive)データベースから解析し、LCK遺伝子とZAP-70遺伝子にマッピングした。解析には、SRAのSRX060160データを使用した。
T細胞におけるLCK及びphospho-LckY394の発現レベル、並びにイマチニブ存在下で培養したT細胞におけるLCK及びphospho-LckY394の発現レベルを検証した。先ず、健常人から採取した末梢血から、BD Horizon V500抗CD8抗体を使用して、CD8+T細胞を単離した。また、健常人から採取した末梢血から、APC-Cy7抗CD4抗体を使用して、CD4+細胞を回収した。更に、得られたCD4+細胞から、FITC抗CD45RA抗体及びPE標識抗FoxP3抗体を用いて、CD45RA+FoxP3low細胞(フラクションI:ナイーブTreg)、CD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)、及びFoxP3-CD4+T細胞をそれぞれ分取した。得られた各T細胞を0μM又は10μMのイマチニブ(グリベック、ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を含むRPMI1640培地にて1時間培養を行った。培養後の各T細胞をNP-40細胞溶解バッファーで細胞を処理した後に、ウエスタンブロットに供し、LCK及びphospho-LckY394の発現レベルを測定した。LCK及びphospho-LckY394の検出には、抗Lck抗体(3A5)及び抗リン酸Src Family抗体(polyclonal)を用いて、HRP標識二次抗体で発色させることにより行った。
イマチニブのTreg細胞に対する阻害作用をin vovoにて検証した。具体的には、BALB/cマウス(8週齢、メス)に、イマチニブが0mg、2mg、又は8mgとなるようにグリベック(ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を添加した生理食塩水を1日1回経口投与又は腹腔内投与しながら1週間飼育を行った。イマチニブの投与開始から1週間後にマウスから脾臓細胞を摘出して、FACS解析を行った。FACSでは、CD4+T細胞におけるFoxp3とCD25の発現の解析、及びCD4+Foxp3+T細胞におけるKi-67とCD44の発現の解析を行った。
T細胞におけるKi-67の発現レベルの発現レベル、並びにイマチニブ存在下で培養したエフェクターTreg細胞におけるKi-67の発現レベルを検証した。先ず、試験例13と同様の方法で、健常人から採取した末梢血から、CD8+T細胞、CD45RA+FoxP3low細胞(フラクションI:ナイーブTreg)、CD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)、及びFoxP3-CD4+細胞をそれぞれ分取した。得られた各細胞について、FACS解析により、Ki-67の発現レベルを測定した。また、CD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)については、10μMのイマチニブ(グリベック、ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を含むRPMI1640培地にて4日間培養を行った後に、FACS解析によりKi-67の発現レベルの測定を行った。また、コントロールとして、イマチニブを添加していない培地を用いたこと以外は前記と同様に試験を行い、Ki-67の発現レベルの測定を行った。
イマチニブによるエフェクターTreg細胞のアポトーシス誘導効果について検証した。先ず、試験例13と同様の方法で、健常人から採取した末梢血から、CD8+T細胞、CD45RA+FoxP3low細胞(フラクションI:ナイーブTreg)、CD45RA-FoxP3high細胞(フラクションII:エフェクターTreg)、及びFoxP3-CD4+T細胞をそれぞれ分取した。得られた各T細胞に、抗CD3抗/抗CD28抗体の共有結合させた磁気ビーズを1:1の割合、及び10μMのイマチニブイマチニブ(グリベック、ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)を含むRPMI1640培地にて4日間培養を行った。培養後に、各T細胞のCaspase 3/7の活性化レベルを、CellEvent Caspase3/7 greenとSYTOX AADvancedにより測定した。また、コントロールとして、イマチニブを添加していない培地を用いたこと以外は前記と同様に試験を行い、Caspase 3/7の活性化レベルを測定した。
胃癌患者由来のヒト末梢血単核球を用いて、イマチニブにより、がん抗原特異的免疫応答が賦活化されることをin vitroで検証した。先ず、胃癌患者由来のヒト末梢血単核球を、5μMのイマチニブ(グリベック、ノバルティスファーマ株式会社、有効成分:メシル酸イマチニブ)、10 IU/mLのIL-2、及び20ng/mLのIL-7を含むを含むRPMI1640培地にて1日間培養した後に、培地中に精巣抗原(HLA-Cw*0304拘束性のNY-ESO-1ペプチドp92-100(LAMPFATPM))を10μg/mLとなるように添加し、NY-ESO-1ペプチドによる抗原刺激を開始した。抗原刺激の開始から3日後に、培地を、5μMのイマチニブ、10 IU/mLのIL-2、20ng/mLのIL-7、及び10μg/mLのがん・精巣抗原(HLA-Cw*0304拘束性のNY-ESO-1ペプチドp92-100(LAMPFATPM))を含むを含むRPMI1640培地に交換し、抗原刺激の開始から6日間培養を行った。培養後、細胞を回収しHLA-Cw*0304 NY-ESO-1 tetramer法によりNY-ESO-1特異的CD8+ T細胞の検出を行った。また、コントロールとして、イマチニブを含まない培地を使用したこと以外は、前記と同様に試験を行い、NY-ESO-1特異的CD8+T細胞の検出を行った。
卵巣癌患者由来のヒト末梢血単核球を用いて、イマチニブにより、がん抗原特異的免疫応答が賦活化されることをin vitroで検証した。具体的な試験方法は、胃癌患者由来のヒト末梢血単核球の代わりに、卵巣癌患者由来のヒト末梢血単核球を使用したこと以外は、前記試験例16と同様である。
Claims (14)
- イマチニブ及び/又はその塩を有効成分として含有する、腫瘍免疫又は感染免疫を増強させる免疫増強剤。
- 腫瘍の治療において腫瘍免疫を増強させるために使用される、請求項1に記載の免疫増強剤。
- 固形がんの治療において腫瘍免疫を増強させるために使用される、請求項1又は2に記載の免疫増強剤。
- 感染症の予防又は治療において感染免疫を増強させるために使用される、請求項1に記載の免疫増強剤。
- イマチニブ及び/又はその塩を有効成分として含有する、制御性T細胞の抑制剤。
- エフェクター制御性T細胞を抑制するために使用される、請求項5に記載の制御性T細胞の抑制剤。
- 腫瘍免疫又は感染免疫を増強させる免疫増強剤の製造のための、イマチニブ及び/又はその塩の使用。
- 腫瘍免疫又は感染免疫の増強が求められている者に、有効量のイマチニブ及び/又はその塩を投与する工程を含む、腫瘍免疫又は感染免疫を増強する方法。
- 腫瘍免疫又は感染免疫を増強させる処置に使用されるイマチニブ及び/又はその塩。
- イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者において治療有効性の予測のための検査方法であって、
イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者から採取された末梢血に含まれる制御性T細胞を測定し、当該制御性T細胞数に基づいてイマチニブ及び/又はその塩による慢性骨髄性白血病の治療有効性を予測することを特徴とする、検査方法。 - 末梢血に含まれるエフェクター制御性T細胞を測定し、当該エフェクター制御性T細胞数に基づいてイマチニブ及び/又はその塩による慢性骨髄性白血病の治療有効性を予測する、請求項10に記載の検査方法。
- 分子遺伝学的完全寛解に至るか否かを予測するための検査方法である、請求項10又は11に記載の検査方法。
- 末梢血に含まれる制御性T細胞からなる、イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者において治療有効性の予測のためのバイオマーカー。
- 末梢血に含まれる制御性T細胞を検出する試薬を含む、イマチニブ及び/又はその塩を投与している慢性骨髄性白血病患者において治療有効性の予測のための検査キット。
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