JPWO2015137466A1 - 精子の検査方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
卵管膨大部に到達した精子は、雌の排卵時期に運動性が顕著に上昇し、超活性化様運動を示したものが受精できると考えられている(非特許文献3:Suarez SS.,Int J Dev Biol.52(5−6),455−62 (2008年))。そこで、実際に雌体内の条件を反映させた検査法も考案されている(非特許文献4:Hamanoら、日本畜産学会北陸支部会報81,63−68 (2000年))。また、実際に精子を卵子と受精させる体外受精試験を用いて検査することもできる。
本発明の精子の検査方法は、精子集団に対して検査液に懸濁を行って個々の精子の品質指標の値を測定する工程と、前記品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程とを備えることを特徴とする。
また、精子の品質を評価する工程は、品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、層別化された集団の1又は複数の群の品質指標の値に基づいて評価することを特徴とする。
また、層別化された集団の品質指標の値が、各集団毎の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記層別化が、品質指標の値に基づいて、品質上位群を選択することを特徴とする。
また、前記層別化が、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位50%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位20%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位10%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位5%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位3%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位1%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位0.5%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位0.3%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群の品質指標の値が、品質上位群における品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、生存している精子であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、精子運動性が一定の値以上や一定の範囲であることを特徴とする。
また、前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが6.0〜9.0であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが7.2〜8.2であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが7.4〜7.8であることを特徴とする。
また、前記検査液は、浸透圧が230〜400mmol/kg(mOsm/kg)であることを特徴とする。
また、前記検査液は、33〜43℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、36〜40℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、緩衝剤、糖及び塩を含むことを特徴とする。
また、前記検査液の緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン及びクエン酸であることを特徴とする。
また、前記検査液の糖は、グルコースであることを特徴とする。
また、前記検査液の塩は、塩化ナトリウムであることを特徴とする。
また、前記検査液は、活性化剤を含むことを特徴とする。
また、前記活性化剤は、プロカイン、カフェイン、及び/又はテオフィリンであることを特徴とする。
また、前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする。
また、前記負荷剤は、ポリビニルピロリドンK−90であることを特徴とする。
また、前記懸濁の時間は、懸濁直後〜30分間であることを特徴とする。
また、前記精子運動性の指標は、VAP、VCL、ALH及び/又はBCFであることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、1又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する工程を含むことを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、VCLが150μm/秒以上であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、VCLが200μm/秒以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、所定の品質指標の基準値を超える精子の割合又は精子数に基づくことを特徴とする。
また、所定の品質指標の基準値が、VCL150μm/秒、175μm/秒、及び200μm/秒からなる群から選ばれる値であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、VCLが200μm/秒以上であることを特徴とする。
また、精子の割合が1%以上であることを特徴とする。
また、精子の割合が0.7%以上であることを特徴とする。
また、精子の割合が0.3%以上であることを特徴とする。
また、精子数が1ストローあたり30万精子以上であることを特徴とする。
また、精子数が1ストローあたり10万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の傾きから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の係数から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価する工程は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の切片から求めることを特徴とする。
また、前記精子は、哺乳類の精子であることを特徴とする。
また、前記精子は、牛精子であることを特徴とする。
また、精子品質評価手段は、品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、層別化された集団の1又は複数の群の品質指標の値に基づいて評価することを特徴とする。
また層別化された集団の品質指標の値が、各集団毎の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記層別化が、品質指標の値に基づいて、品質上位群を選択することを特徴とする。
また、前記層別化が、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位50%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位20%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位10%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位5%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位3%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位1%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位0.5%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位0.3%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群の品質指標の値が、品質上位群における品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、生存している精子であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、精子運動性が一定の値以上や一定の範囲であることを特徴とする。
また、前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが6.0〜9.0であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが7.2〜8.2であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが7.4〜7.8であることを特徴とする。
また、前記検査液は、浸透圧が230〜400mmol/kg(mOsm/kg)であることを特徴とする。
また、前記検査液は、33〜43℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、36〜40℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、緩衝剤、糖及び塩を含むことを特徴とする。
また、前記検査液の緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン及びクエン酸であることを特徴とする。
また、前記検査液の糖は、グルコースであることを特徴とする。
また、前記検査液の塩は、塩化ナトリウムであることを特徴とする。
また、前記検査液は、活性化剤を含むことを特徴とする。
また、前記活性化剤は、プロカイン、カフェイン、及び/又はテオフィリンであることを特徴とする。
また、前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする。
また、前記負荷剤は、ポリビニルピロリドンK−90であることを特徴とする。
また、前記懸濁の時間は、懸濁直後〜30分間であることを特徴とする。
また、前記精子運動性の指標は、VAP、VCL、ALH及び/又はBCFであることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、1又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する手段を含むことを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、VCLが150μm/秒以上であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、VCLが200μm/秒以上であることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、所定の品質指標の基準値を超える精子の割合又は精子数に基づくことを特徴とする。
また、所定の品質指標の基準値が、VCL150μm/秒、175μm/秒、及び200μm/秒からなる群から選ばれる値であることを特徴とする。
また、前記所定の品質指標の基準値は、VCLが200μm/秒であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が1%以上であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が0.3%以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が1ストローあたり30万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が1ストローあたり10万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線から求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の傾きから求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の係数から求めることを特徴とする。
また、前記精子品質評価手段は、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の切片から求めることを特徴とする。
また、前記精子は、哺乳類の精子であることを特徴とする。
また、前記精子は、牛精子であることを特徴とする。
検査液中の精子集団における個々の精子の品質指標の値を前記記憶部に記憶し、
前記記憶された品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、
当該層別化された集団の品質指標の値に基づき精子の品質を決定し、
精子の品質の結果を前記出力部に出力する
ことを前記情報処理装置に実行させることを特徴とする。
また、前記情報処理装置は、撮像部をさらに有し、以下の:
前記撮像部が経時的に複数枚の画像を取得し、
複数の画像に基づいて前記品質指標を決定することを特徴とする。
また、前記層別化された集団の1又は複数の群の品質指標の値に基づき精子の品質の決定が、さらに以下の:
層別化された集団の品質指標の値から、品質決定値を算出し、
前記品質決定値に基づき精子の品質を決定する
ことを含むことを特徴とする。
また層別化された集団の品質指標の値が、各集団毎の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記層別化された集団として、品質上位群を選択することを特徴とする。
また、前記層別化が、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位50%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位20%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位10%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位5%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位3%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位1%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位0.5%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群は、上位0.3%以内であることを特徴とする。
また、前記品質上位群の品質指標の値が、品質上位群における品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、生存している精子であることを特徴とする。
また、前記精子集団は、精子運動性が一定の値以上や一定の範囲であることを特徴とする。
また、前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが6.0〜9.0であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが7.2〜8.2であることを特徴とする。
また、前記検査液は、pHが7.4〜7.8であることを特徴とする。
また、前記検査液は、浸透圧が230〜400mmol/kg(mOsm/kg)であることを特徴とする。
また、前記検査液は、33〜43℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、36〜40℃に維持することを特徴とする。
また、前記検査液は、緩衝剤、糖及び塩を含むことを特徴とする。
また、前記検査液の緩衝剤は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン及びクエン酸であることを特徴とする。
また、前記検査液の糖は、グルコースであることを特徴とする。
また、前記検査液の塩は、塩化ナトリウムであることを特徴とする。
また、前記検査液は、活性化剤を含むことを特徴とする。
また、前記活性化剤は、プロカイン、カフェイン、及び/又はテオフィリンであることを特徴とする。
また、前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする。
また、前記負荷剤は、ポリビニルピロリドンK−90であることを特徴とする。
また、前記検査液への精子の懸濁の時間は、懸濁直後〜30分間であることを特徴とする。
また、前記精子運動性の指標は、VAP、VCL、ALH及び/又はBCFであることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、1又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定することを含むことを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、VCLが150μm/秒以上であることを特徴とする。
また、前記品質指標の基準値は、VCLが200μm/秒以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、所定の品質指標の基準値を超える精子の割合又は精子数に基づくことを特徴とする。
また、所定の品質指標の基準値が、VCL150μm/秒、175μm/秒、及び200μm/秒からなる群から選ばれる値であることを特徴とする。
また、前記所定の品質指標の基準値は、VCLが200μm/秒であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が1%以上であることを特徴とする。
また、前記精子の割合が0.3%以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が1ストローあたり30万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子数が1ストローあたり10万精子以上であることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の傾きから求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の係数から求めることを特徴とする。
また、前記精子の品質を評価するは、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列した前記グラフの近似線の切片から求めることを特徴とする。
また、前記精子は、哺乳類の精子であることを特徴とする。
また、前記精子は、牛精子であることを特徴とする。
本発明の精子の検査方法は、以下の工程から構成される。
(1)精子の品質指標の値を測定する工程(S100)
精子集団に対して検査液に懸濁を行って個々の精子の品質指標の値を測定する工程である。
(2)精子の品質を評価する工程(S200)
精子集団の上位の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程である。
(1−1)精子の画像を経時的に複数枚取得する工程(S101)
(1−2)複数枚の画像に基づいて精子の品質指標の値を測定する工程(S102)
を含んでもよい。品質指標の値を測定する工程(S100)は、予め取得され、記憶された品質指標の値の読み出しを行う工程(S199)を行うことで、省略することもできる。
(2)精子の品質を評価する工程は、さらに以下の:
(2−1)品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化する工程(S201)
(2−2)層別化された集団の品質指標の値から、品質決定値を算出する工程(S202)
(2−3)品質決定値から精子の品質を決定する工程(S203)
のうちの1以上、好ましくは全てを含む。
(1)層別化された集団の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値;
(2)層別化された集団において所定の品質指標の基準値を超える又は一定の範囲の基準値の精子の割合又は精子数;及び
(3)層別化された集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから得られる近似線、切片、係数又は傾きからなる群から選択される。(1)〜(3)は各々組み合わせることもできる。品質決定値を、精子集団のサンプル間同士で比較してもよいし、予め受胎性などの精子の品質と相関が示された品質指標の基準値と比較するか、又は予め受胎性が判明している複数の精液を用いて計算された推定式にあてはめることで、精子の品質を評価することができる。
(1)品質決定値が、層別化された集団の品質指標の値の平均値、中央値、又は最頻値である場合
一例として、品質指標がVCLであり、層別化された集団のうち、品質上位群として10%を選択するが、品質指標及び層別化された集団が、これらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる:
品質指標の値(VCL)に基づき精子集団の上位10%の品質上位群を選択し;
品質上位群の品質指標の値(VCL)の平均値、中央値、又は最頻値を算出し;
VCLの平均値、中央値、又は最頻値に基づき、精子の品質を決定する。
算出された平均値、中央値、又は最頻値は、予め受胎性との相関が示された品質指標の基準値、例えば200μm/秒、175μm/秒、150μm/秒などと比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、算出されたVCLの平均値、中央値、又は最頻値を、予め受胎性と、上位10%の品質上位群のVCLの平均値、中央値、又は最頻値との関係を示す推定式と当てはめることにより、精子の品質を決定することができる。
一例として、品質指標としてVCLを選択し、品質指標の基準値として200μm/秒を選択するが、品質指標及び基準値がこれらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる:
品質指標の値(VCL)の基準値(200μm/秒)を超える品質指標の値(VCL)を有する品質上位群を選択し;
品質上位群の精子数又は精子の割合を算出し;
精子数又は精子の割合に基づき、精子の品質を決定する。
算出された精子数又は精子の割合は、予め受胎性との相関が示された精子数又は精子の割合と比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、精子数又は精子の割合を、予め受胎性が判明している複数の精液を用いて計算された精子数又は精子の割合と、受胎性との推定式に当てはめることで、その精子集団の受胎性を決定することができる。
一例として、品質指標がVCLであり、品質上位群として10%を選択するが、品質指標や上位群をこれらのものに限定することを意図するものではない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる:
品質指標の値(VCL)に基づき精子集団の上位10%の品質上位群を選択し;
品質上位群の品質指標の値(VCL)を昇順または降順に配列し、Y軸に品質指標の値、X軸に順位をプロットして得られたグラフの近似線、切片、係数又は傾きを算出し;
近似線、切片、係数又は傾きに基づき、精子の品質を決定する。切片、係数又は傾きは近似線から求めることもできる。なおX軸とY軸へのプロットは逆にプロットしてもよい。近似線は、精子の品質指標の個々の精子の値を順に配列した場合に、概形を把握するための式であり、例えば線形近似、多項式近似、指数近似、対数近似、累乗近似、移動平均、漸近線、接線等が挙げられる。順に配列するとは、個々の精子の値を昇順又は降順に配置することをいい、品質上位群、例えば上位30%以上、好ましくは上位20%以上、より好ましくは上位10%以上、さらにより好ましくは上位8%以上の精子を配列して、近似線を求めることができる。近似線は、主に最小二乗法等の統計学的手法を用いて回帰分析を行って回帰式を算出し、直線、関数、対数、指数、シグモイド曲線等で表す。このような近似線を用いることで、受胎性の予測値を出すことができる。また、予測値は、近似線の切片、係数又は傾きを用いて出すこともできる。さらに、例えば、VCLとALHといった複数の品質指標を基準として用いる場合には、重回帰分析等の多変量解析を行って受胎性の推定式を算出することができる。
一例として、品質指標がVCLであり、層別化された精子集団として品質指標の値が上位80%を10%毎に区切った群を選択するが、品質指標及び精子集団の各群が、これらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる:
品質指標の値(VCL)に基づき精子集団での上位80%の品質上位群を10%毎に区切って8個の群を選択し;
8個の群毎の品質指標の値(VCL)の平均値、中央値、又は最頻値を算出し;
各々のVCLの平均値、中央値、又は最頻値に基づき、精子の品質を決定する。
算出された各々の平均値、中央値、又は最頻値は、予め受胎性との相関が示された品質指標の基準値、例えば200μm/秒、175μm/秒、150μm/秒などと比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、算出されたVCLの平均値、中央値、又は最頻値を、予め受胎性と、精子集団の全体を10%毎に区切った8個の群のVCLの平均値、中央値、又は最頻値との関係を示す推定式や重回帰分析等の多変量解析を行って出した推定式を用いて、精子の品質を決定することができる。
一例として、品質指標としてVCLを選択し、層別化の基準値が200μm/秒以上、150〜200μm/秒、100〜150μm/秒、50〜100μm/秒の場合を選択するが、品質指標及び層別化の基準値がこれらのものに限られることを意図するものはない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる:
品質指標の値(VCL)の基準値を200μm/秒以上、150〜200μm/秒、100〜150μm/秒、50〜100μm/秒に区切って4個の群を選択し;
4個の群毎の精子数又は精子の割合を算出し;
各々の精子数又は精子の割合に基づき、精子の品質を決定する。
算出された精子数又は精子の割合は、予め受胎性との相関が示された精子数又は精子の割合と比較することで、その精子集団の受胎性を決定することができる。また、精子数又は精子の割合を、予め受胎性が判明している複数の精液を用いて計算された精子数又は精子の割合と、受胎性との近似線や重回帰分析等の多変量解析を行って出した推定式に当てはめることで、その精子集団の受胎性を決定することができる。
一例として、品質指標がVCLであり、層別化された精子集団として品質指標の値が上位80%を10%毎に区切った場合を選択するが、品質指標及び精子集団の各群をこれらのものに限定することを意図するものではない。品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程は、以下のように行われる:
品質指標の値(VCL)に基づき精子集団での上位80%の品質上位群を10%毎に区切って8個の群を選択し;
8個の群毎の品質指標の値(VCL)を昇順または降順に配列し、Y軸に品質指標の値、X軸に順位をプロットして得られたグラフの近似線、切片、係数又は傾きを算出し;
近似線、切片、係数又は傾きに基づき、精子の品質を決定する。切片、係数又は傾きは近似線から求めることもできる。なおX軸とY軸へのプロットは逆にプロットしてもよい。近似線は、精子の品質指標の個々の精子の値を順に配列した場合に、概形を把握するための式であり、例えば線形近似、多項式近似、指数近似、対数近似、累乗近似、移動平均、漸近線、接線等が挙げられる。順に配列するとは、個々の精子の値を昇順又は降順に配置することをいう。近似線は、主に最小二乗法等の統計学的手法を用いて回帰分析を行って回帰式を算出し、直線、関数、対数、指数、シグモイド曲線等で表す。さらに、例えば、VCLとALHといった複数の品質指標を基準として用いる場合には、重回帰分析等の多変量解析を行って推定式を算出することができる。このようにして算出された推定式を、予め受胎性と、精子集団の全体を10%毎に区切った8個の群との関係を示す推定式や、さらに重回帰分析等の多変量解析を行って出した推定式を用いて、精子の品質を決定することができる。
本発明の精子の検査装置の構成を図2に示す。精子の検査装置10は、精子の品質指標の値を測定する精子品質測定部11(精子品質測定手段)、測定したデータや演算処理の指示等を与える入力部12(入力手段)、測定したデータや演算処理結果等を記憶する記憶部13(記憶手段)、測定した精子の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する精子品質評価部14(精子品質評価手段)、精子品質の評価結果を出力する出力部15(出力手段)を主に備えている。
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、1000万精子に対して2000rpm、室温、5分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して140.6mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(和光純薬工業)、45.3mMのクエン酸(和光純薬工業)、16.7mMのグルコース(和光純薬工業)、79.2mMの塩化ナトリウム(和光純薬工業)、2mMの塩化カルシウム(和光純薬工業)、0.3%(w/v)のBSA(和光純薬工業)、650U/mlのペニシリンGカリウム(万有製薬)、0.7mg(力価)/mlのストレプトマイシン(明治製薬)、pHを6.0〜9.0まで0.2刻みになるよう1N水酸化ナトリウム又は1N塩酸を用いて調製した検査液を250μl添加した。そして、38℃で10分間インキュベーションを行った。4%(w/v)のポリビニルピロリドンK−90(和光純薬工業)を添加した各々のpHの上記検査液を等量混合し、予め38℃に温めた厚さ20μmのスライドチャンバー(Leja)に滴下し、1/60秒の撮像速度で精子運動解析装置Ceros(Hamilton Thorne)を用いて測定した。
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、1000万精子に対して2000rpm、室温、5分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対してpH7.6に調整した実施例1に記載の検査液を250μl添加した。38℃でインキュベーションを行った。懸濁直後(0)、10、30、60分間経過後、4%(w/v)のポリビニルピロリドンK−90を添加した上記検査液を等量混合し、実施例1に記載の方法で測定した。
受胎率の判明している一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛(n=29又は40)の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、1000万精子に対して2000rpm、室温、5分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例2に記載の検査液を250μl添加した。そして、38℃で10分間インキュベーションを行った。4%(w/v)のポリビニルピロリドンK−90を添加した上記検査液を等量混合し、実施例1に記載の方法で測定した。従来の検査例である精子運動性の指標は、凍結融解後の精子について精子運動解析装置を用いて38℃においてVAP50μm/秒以上の精子の割合(%)で示した。
受胎率の判明している一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛(n=40)の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、1000万精子に対して2000rpm、室温、5分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例2に記載の検査液を250μl添加した。そして、38℃で10分間インキュベーションを行った。4%(w/v)のポリビニルピロリドンK−90を添加した上記検査液を等量混合し、実施例1に記載の方法で測定した。受胎率65%以上(10頭)、55〜65%(10頭)、55%以下(10頭)、低受胎牛(受胎率40%未満:10頭)について、各3ロット測定した。
図12Bは、縦軸にVCL値、横軸に精子集団内の上位10%までを降順で表示し、受胎率65%以上の区は標準偏差を表示した結果を示す。上位0.3〜6%のVCL値は、受胎率65%以上、55〜65%、40〜55%において、受胎率40%未満の低受胎牛の値を上回っていた。このことから、上位0.3〜6%の任意の値のVCL値を比較することで受胎率を予測できた。また、上位3%、2%、1%、0.5%、0.3%以上といったより上位のVCL値を比較することで、より精度高く受胎性を予測できた。
受胎率の判明している一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛(n=40)の射出精液を用いて作製した凍結精液を常法に従って融解し、1000万精子に対して2000rpm、室温、5分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例2に記載の検査液を250μl添加した。そして、38℃で10分間インキュベーションを行った。4%(w/v)のポリビニルピロリドンK−90を添加した上記検査液を等量混合し、実施例1に記載の方法で測定した。層別化された集団の1又は複数の群の品質指標の値に基づいて評価する。
一般社団法人家畜改良事業団で繋養の種雄牛から採取した新鮮射出精液及び常法に従って融解した凍結精液について、1000万精子に対して2000rpm、室温、5分間で遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿に対して実施例2に記載の検査液を250μl添加した。そして、38℃で10分間インキュベーションを行った。4%(w/v)のポリビニルピロリドンK−90を添加した上記検査液を等量混合し、実施例1に記載の方法で測定した。
Claims (26)
- 精子集団に対して検査液に懸濁を行って個々の精子の品質指標の値を測定する工程、
前記精子の品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化する工程、及び
層別化された集団の1又は複数の群の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する工程
を備えることを特徴とする精子の検査方法。 - 前記層別化された集団のうち、品質上位群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項1に記載の精子の検査方法。
- 前記層別化された集団のうち、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項2に記載の精子の検査方法。
- 前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
- 前記検査液は、pHが7.2〜8.2であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
- 前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
- 前記懸濁の時間は、懸濁直後〜30分間であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
- 前記精子の品質を評価する工程が、1又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する工程を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
- 前記精子の品質を評価する工程が、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求める工程を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の精子の検査方法。
- 検査液に懸濁された精子集団の個々の精子の品質指標の値を測定する精子品質測定手段と、前記精子の品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化する層別化手段と、層別化された精子集団の品質指標の値に基づいて精子の品質を評価する精子品質評価手段とを備えることを特徴とする精子の検査装置。
- 前記精子品質評価手段が、前記層別化された集団のうち、品質上位群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項10に記載の精子の検査方法。
- 前記精子品質評価手段が、前記層別化された集団のうち、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項11に記載の精子の検査方法。
- 前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする請求項10〜12のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
- 前記検査液は、pHが7.2〜8.2であることを特徴とする請求項10〜13のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
- 前記検査液は、負荷剤を含むことを特徴とする請求項10〜14のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
- 前記懸濁の時間は、懸濁直後〜30分間であることを特徴とする請求項10〜15のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
- 前記精子品質評価手段が、1又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定する、請求項10〜16のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
- 前記精子品質評価手段が、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを特徴とする請求項10〜17のいずれか一項に記載の精子の検査装置。
- 出力部と、記憶部とを含む情報処理装置に精子の品質を決定させる制御プログラムであって、
精子集団における個々の精子の品質指標の値を前記記憶部に記憶し、
前記記憶された品質指標の値に基づき、前記精子集団を層別化し、
当該層別化された集団の品質指標の値に基づき精子の品質を決定し、
精子の品質の結果を前記出力部に出力する
ことを前記情報処理装置に実行させることを特徴とする、前記制御プログラム。 - 前記情報処理装置は、撮像部をさらに有し、
前記撮像部が複数枚の経時的画像を取得し、
複数の画像に基づいて前記品質指標を決定する
ことを特徴とする、請求項19に記載の制御プログラム。 - 前記精子の品質を決定が、前記層別化された集団のうち、品質上位群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項19又は20に記載の制御プログラム。
- 前記精子の品質を決定が、前記層別化された集団のうち、さらに他の群の品質指標の値に基づいて、精子の品質を評価することを特徴とする、請求項21に記載の制御プログラム。
- 前記品質指標は、精子運動性の指標であることを特徴とする請求項19〜22のいずれか一項に記載の制御プログラム。
- 前記精子の品質を評価するが、1又は複数の群の品質指標の基準値と比較して、精子の品質を決定することを含む、請求項19〜23のいずれか一項に記載の制御プログラム。
- 前記精子の品質を評価するが、前記精子集団の個々の精子における品質指標の値を順に配列したグラフから求めることを含む、請求項19〜24のいずれか一項に記載の制御プログラム。
- 請求項19〜25のいずれか一項に記載の制御プログラムをコードするコンピュータ可読媒体。
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