JPWO2015111248A1 - 単位dna組成物の調製方法及びdna連結体の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記各々の溶液の準備後、前記単位DNAに付加配列が連結された状態で、前記各々の溶液中の単位DNAの濃度を測定し、その結果に基づいて、前記各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位DNAのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する単位DNA組成物の調製方法。
前記単位DNAを含む溶液を準備する工程は、前記集積DNAの配列の塩基長を前記単位DNAの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、前記集積DNAを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として、端部に非回文配列を有する前記単位DNAを設計する工程を含む、(1)から(5)いずれか記載の単位DNA組成物の調製方法。
(1)から(6)いずれかに記載の方法によって、単位DNA組成物を調製する工程と、
前記ベクターDNAを準備する工程と、
調製後の前記溶液中の付加配列が連結された単位DNAから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、
前記除去工程後、前記ベクターDNA及び前記各々の単位DNAを互いに連結する工程と、を有し、
前記ベクターDNA及び前記各々の単位DNAは互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有し、
前記集積DNAは、前記各々の単位DNAが互いに連結したDNAからなる、DNA連結体の作製方法。
本発明の単位DNA組成物の調製方法は、付加配列が連結された複数の単位DNAを該単位DNAの種類毎に含む溶液を準備する工程と、各々の溶液の準備後、単位DNAに付加配列が連結された状態で、各々の溶液中の単位DNAの濃度を測定し、その結果に基づいて、各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位DNAのモル数を互いに同一に近づける工程とを有する。本明細書において、「単位DNA」の種類は、それぞれの塩基配列毎に区別する。また、「単位DNA」には、制限酵素認識部位を付加したものと、付加していないもののいずれも含むものとする。
本発明は、DNA連結体の作製方法も包含する。本発明のDNA連結体の作製方法は、上述の方法による、単位DNA組成物を調製する工程と、ベクターDNAを準備する工程と、調製後の溶液中の付加配列が連結された単位DNAから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、除去工程後、ベクターDNA及び各々の単位DNAを互いに連結する工程と、を有する。
形質転換の対象となる微生物細胞として枯草菌を使用した。枯草菌としては、RM125株(Uozumi, T., et al. Moi. Gen. Genet., 152, 65−69(1977))と、その派生株のBUSY9797株を用いた。枯草菌で複製可能なベクターDNAとして、pGET118(Kaneko, S., et al. Nucleic Acids Res. 31, e112 (2003))を用い、後述のとおりに構築したpGETS118−AarI−pBR(配列番号1を参照)、pGETS151−pBR(配列番号2を参照)を使用した。集積DNAとしては、ラムダファージDNA(東洋紡社製)(配列番号3を参照)と、後述するメバロン酸経路人工オペロン(配列番号4を参照)を用いた。単位DNAを組み込んだプラスミドDNAを有する大腸菌の選択には、抗生物質カルベニシリン(和光純薬工業社)を用いた。枯草菌の選択には、抗生物質テトラサイクリン(シグマ社)を用いた。タイプIIS制限酵素は、AarI(Thermo社)、BbsI(NEB社)、BsmBI(NEB社)、SfiI(NEB社)を用いた。制限酵素HindIII、PvuII、T4 DNA Ligaseは、タカラバイオ社製のものを使用した。大腸菌のプラスミド構築用の一般的なライゲーションには、Takara Ligation Kit (Mighty)(タカラバイオ社)を用いた。単位DNA調製用のPCR反応には、東洋紡社製のKOD plus polymeraseを使用した。プラスミドにクローニングされたDNAの塩基配列決定のためのコロニーPCRには、タカラバイオ社製のEx−Taq HSを用いた。単位DNAを組み込む付加配列であるプラスミドDNAとしては、pMD−19(simple)(タカラバイオ社)を用いた。環状プラスミド精製用酵素Plasmid Safeは、EPICENTER社製のものを使用した。電気泳動用アガロースゲルは、DNA電気泳動用の低融点アガロースゲルである2−Hydroxyethyl agarose(シグマ社)、又はUltraPure Agarose(インビトロジェン社)を使用した。制限酵素の失活には、フェノール:クロロフォルム:イソアミルアルコール 25:24:1と、TE飽和フェノール(8−キノリノール含有)は、ナカライテスク社製のものを使用した。ラムダターミアーゼは、EPICENTER社製のものを使用した。ラムダファージのパッケージングには、アジレント・テクノロジーズ社のGigapack III Plus Packaging Extractを用いた。リゾチームは和光純薬工業社製のものを使用した。LB培地の培地成分及び寒天には、ベクトンディッキントン社製のものを使用した。IPTG(isopropyl s−D−thiogalactopyranoside)は、和光純薬工業社製のものを使用した。上記以外の他の全ての培地成分及び生化学試薬は、和光純薬工業社製のものを使用した。特記以外のプラスミドの構築には、大腸菌DH5α株、JM109株又はTOP10株のいずれかを使用した。構築したプラスミドの大腸菌からの少量精製には、キアゲン社のQIAprep Spin Miniprep Kitを用い、大量精製には、同社のQIAfilter Midi Kitを用いた。酵素反応液からのDNAのクリーンアップには、キアゲン社のMinElute Reaction Cleanup Kit、又はキアゲン社のQIAquick PCR purification Kitを用いた。通常のアガロースゲル電気泳動で分離して得られたゲルブロックを精製する場合は、キアゲン社のMinElute Gel Extraction Kitを用いた。超微量分光光度計は、Thermo社のnano−drop 2000を用いた。塩基配列決定には、アプライドバイオシステムズ社製の蛍光自動シーケンサーの3130xlジェネティックアナライザーを用いた。他の一般的なDNAの操作については、標準プロトコール(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))にしたがって行った。枯草菌の形質転換とプラスミド抽出は、既法のとおり行った(Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res. 31, e133.(2003))。
ラムダファージDNAの集積に用いたベクターDNAであるpGETS118−AarI−pBR(配列番号1)は、大腸菌のF因子の複製開始点oriSと、枯草菌で機能する複製開始点repAを有する大腸菌―枯草菌間シャトルプラスミドベクターpGETS118(Kaneko, et. al., Nucleic Acids Res., 31,e112. (2003).)を元に多段階の過程を経て構築されたプラスミドであり、図1に示す構造である。集積遺伝子のクローニングサイトは、2つのAarI切断部位間となっており、集積の際に取り除くこの2つのAarI切断部位間には、大腸菌中でのベクターの取得を容易にする目的で大腸菌の多コピープラスミドのpBR322の複製開始点と、アンピシリン耐性遺伝子が導入されている。また、pGETS118内部のテトラサイクリン耐性遺伝子中に存在する天然のAarI切断部位については、テトラサイクリン耐性遺伝子(tetL)のアミノ酸配列に影響を与えないような1塩基の変異を導入することにより認識部位を消失させた。メバロン酸経路人工オペロンの集積に用いたベクターDNAであるpGETS151−pBR(配列番号2)は、上述のpGETS118−AarI−pBRのDNAを鋳型に、3組のプライマーPartA(5’−TAGGGTCTCAaagcggccgcaagctt−3’(配列番号5を参照)と5‘−TAGGGTCTCAGCggccaagaaggcc−3’(配列番号6を参照))、PartB(5’−TAGGGTCTCAccGCCCTTCCCGGTCGATAT−3’(配列番号7を参照)と5’−TAGGGTCTCAtaTTAGCTTAATTGTTATCCGCTCACAATTCC−3’(配列番号8を参照))、PartC(5’−TAGGGTCTCAAAtaactggaaaaaattagtgtctcatggttcg−3’(配列番号9を参照)と5’−TAGGGTCTCAgcttaagtggtgggtagttgacc−3’(配列番号10を参照))により増幅した断片を連結することにより作製したベクターDNAであり、元のプラスミドに比較して大腸菌中でしか機能しない遺伝子領域(cat〜oriS間、parA〜parC間)を除去している(図1)。このベクターDNAは、遺伝子を集積した際には、枯草菌中でしか複製できないが、遺伝子集積においては、pGETS118−AarI−pBRと同一の性質を示す。これらのプラスミド溶液約10μl(5μg相当)に、滅菌水29μl、制限酵素に付属する10×Buffer_for_AarIを5μlと、同じく制限酵素に付属する切断活性化用の50×Oligoncleotideを1μl、制限酵素AarI(Thermo社)5μlを添加し37℃で2時間反応を行った。得られた液体を、低融点アガロースゲル電気泳動により分離後、ベクター本体の約15kbの断片(pGETS118−AarI−pBRの場合)、又は4.3kbの断片(pGETS151−pBRの場合)をゲルから切り出し、目的のベクターDNAを精製し、20μlのTEに溶解した。ベクターDNAの濃度の測定は、このTE溶液1μlを取り、超微量分光光度計により測定することにより行った。
4塩基の突出の多様性は、4の4乗で、256とおり存在する。これらのうち本発明に使用する突出配列を以下の基準で選定した。まず、パリンドロームとなる全16配列(グループ0)(AATT,ATAT,TATA,TTAA,CCGG,CGCG,GCGC,GGCC,ACGT,AGCT,TCGA,TGCA,CATG,CTAG,GATC,GTAC)は、これらの配列の相補配列も同一配列となり、同一種断片同士の連結が可能となるため、本発明では使用できない為除外した。残りの240配列については、一方の配列(例えば、CCTA)に対して、その相補配列(TAGG)を包含するため、DNA連結に使用可能な突出配列の組み合わせは理論上、240÷2=120組合せである。これらのうち、GC含量の違いとそのGC塩基の出現順序の違いから、以下の基準で突出組合せのグループ化を行った。
(グループII)AとTの合計が3個でCとGの合計が1個となる全32組合せ(CAAA/TTTG,ACAA/TTGT,AACA/TGTT,AAAC/GTTT,GAAA/TTTC,AGAA/TTCT,AAGA/TCTT,AAAG/CTTT,CAAT/ATTG,ACAT/ATGT,AACT/AGTT,AATC/GATT,GAAT/ATTC,AGAT/ATCT,AAGT/ACTT,AATG/CATT,CATA/TATG,ACTA/TAGT,ATCA/TGAT,ATAC/GTAT,GATA/TATC,AGTA/TACT,ATGA/TCAT,ATAG/CTAT,CTTA/TAAG,TCTA/TAGA,TTCA/TGAA,TTAC/GTAA,GTTA/TAAC,TGTA/TACA,TTGA/TCAA,TTAG/CTAA)。
(グループIII)AとTの合計が2つでCとGの合計が2つとなる全52組合せ中パリンドロームの8組合せを除く44組合せ(AACC/GGTT,AACG/CGTT,AAGC/GCTT,AAGG/CCTT,ACAC/GTGT,ACAG/CTGT,ACCA/TGGT,ACCT/AGGT,ACGA/TCGT,ACTC/GAGT,ACTG/CAGT,AGAC/GTCT,AGAG/CTCT,AGCA/TGCT,AGGA/TCCT,AGTC/GACT,AGTG/CACT,ATCC/GGAT,ATCG/CGAT,ATGC/GCAT,ATGG/CCAT,CAAC/GTTG,CAAG/CTTG,CACA/TGTG,CAGA/TCTG,CATC/GATG,CCAA/TTGG,CCTA/TAGG,CGAA/TTCG,CGTA/TACG,CTAC/GTAG,CTCA/TGAG,CTGA/TCAG,CTTC/GAAG,GAAC/GTTC,GACA/TGTC,GAGA/TCTC,GCAA/TTGC,GCTA/TAGC,GGAA/TTCC,GGTA/TACC,GTCA/TGAC,GTGA/TCAC,TCCA/TGGA)。
(グループIV)AとTの合計が1個でCとGの合計が3個となる全32組合せ中、CとGが3連続で並ばない全16組合せ(CACC/GGTG,CCAC/GTGG,CTCC/GGAG,CCTC/GAGG,CACG/CGTG,CCAG/CTGG,CTCG/CGAG,CCTG/CAGG,CAGC/GCTG,CGAC/GTCG,CTGC/GCAG,CGTC/GACG,GAGC/GCTC,GGAC/GTCC,GTGC/GCAC,GGTC/GACC)。
(グループV)AとTの合計が1個でCとGの合計が3個となる全32組合せ中、CとGが3連続する全16組合せ(ACCC/GGGT,CCCA/TGGG,TCCC/GGGA,CCCT/AGGG,ACCG/CGGT,CCGA/TCGG,TCCG/CGGA,CCGT/ACGG,ACGC/GCGT,CGCA/TGCG,TCGC/GCGA,CGCT/AGCG,AGGC/GCCT,GGCA/TGCC,TGGC/GCCA,GGCT/AGCC)。
(グループVI)突出がCとGのみからなる全6組合せ(CCCC/GGGG,GCCC/GGGC,CGCC/GGCG,CCGC/GCGG,CCCG/CGGG,CGGC/GCCG)。
<ラムダファージ>
ラムダファージは、大腸菌に感染するバクテリオファージで、分子生物学的に最も良く研究されているファージである。ゲノムは全長48502bpの二本鎖DNAからなり、全ての塩基配列が明らかになっている。また、様々な変異体の存在も明らかになっている。本実施例では、1kb程度の短い単位DNAからラムダファージ点突然変異体の作製を行うことを試みた。
ラムダファージは、東洋紡社製のλphageDNAを使用した。本製品は、cosサイトで直鎖状になっている。ファージゲノムの全長の塩基配列を調べたところ、データベースに登録されている塩基配列(アクセッションナンバーJ02459.1)に対して6か所(g.138delG,g.14266_14267insG,g.37589C>T,g.37743C>T,g.43082G>A,g.45352G>A)が異なっていた(配列番号3)(配列番号3の全長は、上記48522pbに更にもう一方の突出末端4塩基を含む全長48526bp)。得られた塩基配列を用いて、全長48522bp(cosサイトの重複を含む)をほぼ均等の長さに分割するために、理想分割境界を970bp毎に設定し、上述の(単位DNA分割領域の設定方法)により行った結果、表1に示す切断部位の右側4塩基により構成される5’末端突出が単位DNA集団中でそれぞれ特異的になるように割り振ることができた。
4塩基の任意の突出配列を生成するタイプIIS制限酵素には、AarI(5’−CACCTGC(N)4/−3’,5’−/(N)8GCAGGTG−3’)、BbsI(5’−GAAGAC(N)2/−3’,5’−/(N)6GTCTTC−3’)、BbvI(5’−GCAGC(N)8/−3’,5’−/(N)12GCTGC−3’)、BcoDI(5’−GTCTCN/−3’,5’−/(N)5GAGAC−3’)、BfuAI(5’−ACCTGC(N)4/−3’,5’−/(N)8GCAGGT−3’)、BsaI(5’−GGTCTCN/−3’,5’−/(N)5GAGACC−3’)、BsmAI(BcoDIのイソジマー)、BsmBI(5’−CGTCTCN/−3’,5’−/(N)5GAGACG−3’)、BsmFI(5’−GGGAC(N)10/−3’,5’−/(N)14GTCCC−3’)、BspMI(BfuAIのイソジマー)、BtgZI(5’−GCGATG(N)10/−3’,5’−/(N)14CATCGC−3’)、FokI(5’−GGATG(N)9/−3’5’−/(N)13CATCC−5’)、SfaNI(5’−GCATC(N)9/−3’,5’−/(N)13GATGC−5’)等が挙げられる。これらの制限酵素のうち、遺伝子断片をサブクローニングするために使用する大腸菌プラスミドベクター(pMD19,Simple,TAKARA)に存在しないか、あるいは、存在しても発生する断片の大きさが理想分割単位よりも十分に大きい断片と十分に小さい断片とを発生させる制限酵素を調べたところ、全く切断サイトのないものが、5種類(AarI,BbsI,BfuAI,BsmFI,BtgZI)と、ベクター内部に認識配列が存在するが、理想分割単位よりも十分に大きい断片と十分に小さい断片とを発生させる制限酵素1種類(BsmBI)とが存在し、合計6種類の候補が存在した。これらの候補の制限酵素サイトについて、第01断片から第50断片のラムダファージ全体に対してその制限酵素サイトの分布を調べたところ、AarIは12か所、BbsIは24か所、BfuAIは41か所、BsmFIは38か所、BtgZIは45か所、BsmBIは14か所であり、いずれの制限酵素についても、ラムダファージゲノムに存在しない制限酵素認識部位はなかった。そこで、単位DNA毎に内部を切断しない制限酵素をそれぞれ選択して用いることにした。使用する制限酵素の種類を出来るだけ少なくするために制限酵素の組合せを検討したところ、BbsI、AarI、BsmBIの3種類のみの使用で十分であることを確認した。各単位DNAの切り出しに用いるタイプIIS制限酵素の割り振りは、以下のようになった。
BbsIで切断するグループは、第01〜08・12・16〜22・24・27・28・33〜39・43・45〜50断片の合計33断片、AarIで切断するグループは、第09〜11・13・23・25.30・32・44断片の合計9断片、BsmBIで切断するグループは、第14・15・26・29・31・40〜42断片の合計8断片とした。
第01断片から第50断片までの全50断片については、PCR法を用いてラムダファージゲノム全長から増幅した。まず、上記で決定した突出組合せ間のDNA配列を増幅するためのプライマーの5’末端に上記で決定した制限酵素認識部位を望ましい突出を切り出す位置に付加し、更に5’末端にTAGの配列を付加したプライマーを使用した。これらのプライマー組を用いて、ラムダファージゲノム全長から指定領域のDNA断片を増幅した。PCRの反応条件は、1反応(50μl)につき、KOD Plus10×buffer Ver.25μl、25mM MgSO43μl、dNTP(2mM each)5μl、KOD Plus(1unit/μl)1μl、ラムダファージDNA(TOYOBO)48pg、プライマー(FプライマーとRプライマーのそれぞれ)15pmol、滅菌水を添加して作製し、GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems社)により、以下のプログラムにより行った。
望ましい配列を有する第01〜50の断片をクローンするプラスミドを有する大腸菌形質転換体全50種類をそれぞれ50mlの100μg/mlのカルベニシリン入りLB培地において37℃、120spmで一晩終夜培養し、得られた菌体を、QIAfilter Plasmid Midi Kit(キアゲン社)を用い、精製した。得られた粗プラスミド溶液50μlに、5μlの3M酢酸カリウム−酢酸緩衝液(pH5.2)と、125μlのエタノールを添加して、20000×gで10min遠心し、DNAをエタノール沈殿させ、得られた沈殿を70%エタノールでリンスした後、残渣を取り除き、50μlのTE(pH8.0)に再溶解した。濃度測定のためにこの粗プラスミド溶液1μlをとり、超微量分光光度計(ND−2000、サーモ社)で、DNA濃度を測定した。この時点で粗プラスミド溶液のDNA量は、概ね0.5〜4μg/μlであった。測定値を参考に、各粗プラスミド溶液から、5μgのDNAを1.5mlチューブに採取し、これに全体積が50μlになるように滅菌水を添加した。これにPlasmid Safe(エピセンタ社)の10×反応バッファーを6μl、25mM ATP溶液を2.4μl、Plasmid Safe酵素溶液を2μl添加して混合し、プログラマブルブロックインキュベーターであるBI−526T(ASTEC社)により、37℃で1h恒温し、続いて酵素失活のために75℃、30min恒温した。得られた溶液を、PCR purification kit(キアゲン社)により精製した。本キット精製最終段階では、カラムに吸着したDNAをキット付属の溶出バッファーではなく、25μlのTEバッファー(pH8.0)により溶出することで、高純度プラスミド溶液を得た。精製前後の第01断片を有するプラスミドと、第21断片を有するプラスミドとを用いDNA電気泳動を行い(UltraPure Agarose、インビトロジェン社)、目的断片(単位DNA)が組み込まれていることを確認した(図3)。
得られたDNA溶液を再度、超微量分光光度計で測定することで、高純度プラスミド溶液の濃度を求めた。各サンプルの濃度は、理論上の最大値の200ng/μlに対して粗プラスミド溶液の精製度合を反映しておおよそ100ng/μl〜200ng/μlの範囲になった。測定結果に基づいて各プラスミド溶液15μlを1.5mlチューブにとり、それぞれの溶液に、それぞれのプラスミドが100ng/μlの濃度になるようにTEを添加し、得られた高純度プラスミド溶液を再度、超微量分光光度計で濃度を測定すると、目標値の100ng/μlに対して数パーセント程度の範囲でズレが存在したので、各高純度プラスミドについて、500ngのDNAの体積量を小数点以下2ケタのμlの精度で計算し、この体積量(約5μl)でそれぞれのDNA溶液を分取し、後の切り出しに用いる制限酵素の種類別(BbsIグループ、AarIグループ、BsmBIグループ)に、それぞれの単位DNAのモル数が略等モルになるように統合した。
統合した等モルプラスミド溶液の合計体積は、BbsIグループが約165μl、AarIグループが約45μl、BsmBIグループが約40μlとなった。各グループに2倍の滅菌水を添加して、それぞれ495、135、120μlの高純度プラスミド溶液を得て、制限酵素の種類毎に以下のように切断した。
確認後、各グループに等量のフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール(25:24:1)(ナカライテスク社)を添加し、よく混合することで制限酵素を失活した。ここで各グループのフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール(25:24:1)混合物を1つのチューブに統合したのち、遠心分離(20,000×g、10min)によりフェノール相と水相に分離し、水相(約900μl)を別の1.5mlチューブに回収した。ここに1−ブタノール(和光純薬工業社)を500μl添加し、よく混合し、遠心分離(20,000×g、1min)により分離し、水分を飽和した1−ブタノールを取り除くという操作を水相の体積が450μl以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、3M酢酸カリウム−酢酸緩衝液(pH5.2)を50μlと、エタノール900μlを添加し、遠心分離(20,000×g、10min)することにより、DNAを沈殿させ、これを70%エタノールでリンスして、20μlのTEに溶解した。これに電気泳動用の10×Dyeを2μl添加し、その全量を0.7%の低融点アガロースゲル(2−Hydroxyethyl Agarose TypeVII,シグマ社)で、1×TAE(Tris−Acetate−EDTA Buffer)バッファー存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置(i−MyRun.N 核酸用電気泳動システム、コスモバイオ社)で、35V(約2V/cm)の電圧を印加し、4h泳動することにより第01〜50断片とプラスミドベクターとを分離した(図5)。この電気泳動ゲルを、1μg/mlの臭化エチジウム(シグマ社)を含む1×TAEバッファー100mlで30min染色し、長波長の紫外線(366mn)で照らすことにより可視化することで、第01〜50断片がなすバンド(約1kb付近)をカミソリで切り出し、1.5mlチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル(約300mg程度)に、1×TAEバッファーを添加することにより全体積を約700μlとし、これを65℃で10min恒温することにより、ゲルを溶解した。得られたゲル溶液に、500μlの1−ブタノールを添加し、遠心分離(20,000×g、1min)により水相とブタノール相を分離し、水飽和ブタノールを捨てることを水相の体積が450μl以下になるまで繰り返した。得られた液体に、50μlの3M酢酸カリウム−酢酸緩衝液(pH5.2)と、900μlのエタノールを添加して、遠心分離(20,000×g、1min)によりDNAの沈殿を得て、これを70%エタノールでリンスした後に、20μlのTEに溶解した。そのうちの1μlを取り、超微量分光光度計で濃度を測定した。
第01〜50断片の等モル混合物のDNA重量濃度は、98ng/μlであり、合計塩基配列は48,522bpで、一方ベクターDNA(pGETS118−AarI/AarI)は、190ng/μlで全長は15,139bpである。この長さの重量の比率にしたがって、両DNAの等モル混合物を得るために、第01〜50断片の等モル混合物6.21μlに対して、ベクターDNAを1.00μlの比率で混合した。得られた等モル混合溶液7.2μlに2×ライゲーションバッファーを8.2μl添加し、全体を37℃で5min間恒温した後、1μlのT4DNAリガーゼ(Takara)を添加して、37℃で4h恒温した。その一部を取って電気泳動することにより、ライゲーションされていることを確認した(図8)。これを8μl新しいチューブに採取し、枯草菌コンピテントセルを100μl添加し、37℃で30minダックローターで回転培養した。その後、300μlのLB培地を添加して、37℃で1hダックローターで回転培養し、その後、培養液を10μg/mlのテトラサイクリン入りLBプレートに広げ、37℃で一晩培養した。コロニーは、250個得られた。
ランダムに12株のコロニーを選択して、2mlの10μg/mlのテトラサイクリン入りLB培地で一晩培養し、内部のプラスミドのコピー数を増幅するためにIPTGを終濃度1mMとなるように添加して更に37℃で3h培養した。得られた菌体からプラスミドを抽出して、制限酵素HindIIIとSfiIによるダブルダイジェスチョンし、電気泳動により確認したところ、12株中4株について望ましい切断パターンを示した(図9)。この4株については、塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法によりプラスミドを大量調製し、プラスミドの構造を13種類の制限酵素を行った後、電気泳動により確認したところ、いずれも予想される断片と一致した(図10)。更に、本プラスミドのベクター部分を除く全領域について塩基配列決定したところ、4株のプラスミドとも予想塩基配列と完全に一致した。
4株のプラスミドについて、ラムダファージとしての機能を確認するために、プラーク形成能の確認を以下のように行った。まず、♯3、♯4、♯6、♯12の各集積プラスミドをラムダターミアーゼ(Lambda terminase,Epicenter社)により切断することで、ベクターと集積遺伝子部分に分割し、これをラムダパッケージングエキストラクト(Gigapack III Plus Packaging Extract、アジレント・テクノロジー社)に添加した。これを大腸菌(VCS257株)に感染させて、LBプレートに広げ37℃で一晩培養したところ、プラークが確認された。得られたプラークの形状は、並行して行ったTOYOBO社製ラムダファージDNAで得られるものと同様の形態であることが確認された(図11)。各プラスミドから得られたプラークからファージDNAを精製し、制限酵素AvaIで切断することにより導入した変異が存在するかどうかを確認したところ、図12に示すようにTOYOBO社製ラムダファージDNAとは異なる切断パターンを示し、全てのファージに予定どおりAvaIサイトが存在していることを確認した。これにより、第01〜50断片の全50断片を集積して作製したラムダファージゲノムが塩基配列とプラーク形成能においてともに完全であることが確認された。
イソプレンの単位を骨格として持つ物質のイソプレノイドには、多くの物質が知られているが、これらはイソペンテニル二リン酸(IPP)という共通の材料から合成される。解糖系からIPPに至る経路には2つの経路、すなわち、メバロン酸経路と非メバロン酸経路とが存在することが知られており、1つの生物の中に両経路を有する生物も存在するが、大腸菌には非メバロン酸経路しか存在しない。大腸菌のIPP生産能を増強する目的で、真核生物である酵母のメバロン酸経路の一部の遺伝子について、大腸菌のコドン使用頻度に適合した人工遺伝子の構築を、合成DNA断片から集積することにより作製することを試みた。
酵母のメバロン酸経路の前半部分となるアセチルCoA〜メバロン酸までの代謝経路に必要な3つの遺伝子(ERG10(1.2kb)、ERG13(1.5kb)、HMG1(3.2kb))を大腸菌のコドン使用頻度に基づいてコドンを変換した3つの人工遺伝子を並べた人工オペロン(5,951bp)(配列番号4)(ただし配列番号4の全長は、突出に用いる4塩基の配列を含む5,955pb)の作製を試みた。酵母遺伝子の大腸菌コドンへの変換は、酵母の同義語コドン中で、酵母全遺伝子中の出現頻度に順位を付け、同様に大腸菌の同義語コドン中で大腸菌全遺伝子中の出現頻度の順位を付け、同じ順位の者同士で変換することにより行った。
同義語コドン変換を行った5,951bpのDNA配列について、実施例1と同様にこれを切断しない制限酵素サイトを検索したところ、制限酵素AarIの認識配列がなく、AarIでは切断されないことが判明したので、全てのクローンはAarIを利用して調製することにした。全長5,951bpを55個の断片に分割すると、平均108bpの断片となるので、この大きさを理想分割単位とし、この分割単位近傍で特定の配列(AとTの合計が2つでCとGの合計が2つとなる全52組合せ中パリンドロームの8組合せを除く44組合せ(前述のグループIII)と、AとTの合計が1個でCとGの合計が3個となる全32組合せ中、CとGが3連続しない全16組合せ(前述のグループIV)との合計60種類)のうち全ての理想分割単位でいずれか1種類の配列が出現するかどうかを調べたところ、理想分割単位から±7bpの範囲で何れか一種の特定配列が出現することが判明した。これを元に全長を55個の98〜115bpの断片に分割した。表2は、実施例2における集積DNAの分割単位及び突出塩基配列を示す表である。なお、メバロン酸遺伝子群と遺伝子集積ベクターの境界については、AとTからのみなる突出(ATTAとAAAA)を利用した。
分割して得られた各断片は、Rossiらの方法(Rossi, J.J., and Itakura, K. 1982. J. Biol. Chem. 257, 9226−9229(1982))により、80塩基の化学合成DNA2本により作製した。具体的には、2つの化学合成DNAが3’末端で数10bpがハイブリダイズするようにし、5’末端には、AarI切断部位よりも5’末端側に上記で設計した突出がAarI消化により出現するように認識部位を付加した。これらの2つの合成DNAのハイブリダイゼーションと続く鋳型依存的伸長反応の結果得られる二本鎖の単位DNAをPCR法により増幅するために、両末端のAarI認識部位にハイブリダイズするように作製したPCRプライマー1種類の計3種類のDNAを添加して、PCRの反応によりAarIの切断サイトに囲まれた単位DNAを得て、これをTAクローニング法により、大腸菌プラスミドベクターpMD19に連結し、大腸菌に形質転換することによりクローニングした。これをシーケンシングすることにより各断片について塩基配列の望ましいクローンを選択した。
得られた望ましいクローンを持つ大腸菌55株を培養し、Plasmid mini−prep(QIAGEN社)によりそれぞれから粗プラスミド溶液50μlを得た。これから各1μlを取り超微量分光光度計によりDNA濃度を測定したところ、82〜180ng/μlであった。概ね各5μgのプラスミドを取りPlasmid Safeにより処理し、酵素の熱失活後、Mini−elute PCR purification Kit(QIAGEN社)により精製して、25μlの高純度プラスミド溶液を得た。このうちの1μlを超微量分光光度計により濃度を測定したところ、108〜213ng/μlの濃度であった。ここから各々20μlの高純度プラスミド溶液を別のチューブに取り、このチューブに各プラスミドの濃度が計算上100ng/μlになるようにTEを添加して希釈した。この精製プラスミド溶液を再度微量分光光度計で濃度を算出し、この濃度に基づいて各高純度プラスミドの重量が500ngになる体積量を小数点以下2ケタのμlの精度で算出し、その体積量(約5μl)をそれぞれのプラスミド溶液から分取し、を一本のチューブにプールした。合計で約275μlの等モルプラスミド混合溶液に2倍溶の滅菌水と137.5μlの10×Buffer_for_AarIと、67.5μlの制限酵素AarIを添加して、37℃で一晩反応させた。
この反応液に等量のフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール(25:24:1)を添加してAarIを失活させた後、遠心し、その上清をエタノール沈殿により精製して、沈殿を20μlのTEに溶解した。これに電気泳動用の色素としてキシレンシアノールを添加して、2.5%アガロースゲルでTAEをバッファーとして100Vで、30分間電気泳動することにより、ベクターDNAのpMD19とインサートの単位DNAとを分離した(図13)。泳動したゲルをカミソリで分割し、その一部をエチジウムブロマイドで染色し、目的の55個の等モル混合断片のバンドの位置を確認しながら、無染色のゲルから目的のDNAのバンドを切り出した。
得られたゲル断片からDNAの精製は、MiniElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて以下に示すように行った。
このDNA濃度を超微量分光光度計により濃度測定を行ったところ、20ng/μlであった。並行して調製したpGET151/AarIの濃度は、67ng/μlであったので、これらの長さの比率(5955bp:4306bp)を考慮に入れて4.63:1の比率になるように55断片等モル混合溶液とpGETS151/AarIとを混合した。
得られた等モル混合溶液5.63μlに2×ライゲーションバッファーを6.63μl添加し、全体を37℃、5min間恒温した後、1μlのT4DNAリガーゼ(Takara)を添加して、37℃で4h恒温した。一部をとって電気泳動することにより、単位DNAとベクターDNAがタンデムリピート状にライゲーションされているか否かを確認した(図14)。ライゲーション後の溶液8μlを別のチューブに採取し、これに枯草菌コンピテントセルを100μl添加し、37℃で30minダックローターで回転培養した。その後、300μlのLB培地を添加して、37℃で1hダックローターで回転培養し、その後、培養液を10μg/mlのテトラサイクリン入りLBプレートに広げた。
得られたコロニー154個から、ランダムに24個のクローンを選択し、10μg/mlのテトラサイクリン入りLBに植菌した。対数増殖期に終濃度1mMとなるようにIPTGを添加して、定常期まで培養後、プラスミドDNAを抽出して制限酵素PvuIIで処理し、電気泳動により切断パターンを調べた(図15)。その結果、2クローン(♯10と#20)について予想される塩基配列と一致することが確認されたので、このプラスミドについて他の制限酵素処理を行い、電気泳動により詳細な構造確認を行ったところ、目的の構造と一致した(図16)。このプラスミドについてシーケンシングすることで、最終的にクローン10と20は、設計とおりの塩基配列を有していたことを確認した。
枯草菌プラスミド形質転換において必要とされる、集積DNAユニットの数の繰り返し数(リダンダンシー)rを確認するために、以下の試験を行った。
(A)のDNAは、リダンダンシーr=1の環状モノマープラスミドDNAである。まず、pGETS118−t0−Pr−SfiI−pBRを大腸菌に形質転換した。この形質転換体から得られるプラスミドは、(A)のDNAが主ではあるが、若干量の多量体(マルチマー)が含まれるので、これらを除去する目的で、このプラスミドを低融点アガロースゲル電気泳動によるDNAサイズ分画により、モノマープラスミドDNAの領域のみゲルより切り出し、精製することによって、(A)のDNAを調製した。
(B)のDNAは、リダンダンシーr=1の直線上のモノマープラスミドDNAである。この(B)のDNAは、上記(A)のDNAを制限酵素BlpI(認識部位は(5’−GC/TNAGC−3‘))により処理することで、調製した。
(C)のDNAは、リダンダンシーr>1のタンデムリピートの直線状マルチマープラスミドDNAである。上記(B)のDNAを調製した際に使用したBlpIは、5‘末端に非パリンドロームの3塩基突出を形成する。よって、上記(B)のDNAを、DNAリガーゼにより連結することによって、プラスミド単位が同一方向に連続した直線状マルチマープラスミドDNAである(C)のDNAを調製した。
(D)のDNAは、リダンダンシーr=1の直線上のモノマープラスミドDNAである。この(D)のDNAは、上記(A)のDNAを制限酵素EcoRI(認識部位は(5’−G/AATTC−3‘である))により処理することで、調製した。
(E)のDNAは、部分的にリダンダンシーr>1の部分を含む、上記(D)のDNAがランダムな向きで連結した直線状マルチマープラスミドDNAである。上記(D)のDNAを調製した際に使用したEcoRIは、5’末端にパリンドロームの3塩基突出を形成する。EcoRIで切断したプラスミドDNAを連結すると、プラスミド単位が、ランダムな向きで連結したマルチマープラスミドDNAを作製することが可能となる。(E)のDNAは、上記(D)のDNAを、DNAリガーゼにより連結することによって調製した。
(F)のDNAは、(A)のDNAを1か所のみ切断する制限酵素KasIで切断し、脱リン酸化した後にその近傍のBlpIで切断したDNA断片と、(A)のDNAを1か所でのみ切断する制限酵素AfeIで切断し、脱リン酸化した後にその近傍のBlpIで切断したDNAとを等量混合した、r≒1直鎖状準モノマー混合物である。この(F)の混合物中のいずれのDNA断片もリダンダンシーrは、1を若干下回っている。
(G)のDNAは、上記(F)の2つのDNA断片をDNAリガーゼにより連結することによって、BlpIサイトのみで方向性を指定した連結されたリダンダンシーr=1.98の直線上の準ダイマープラスミドDNAである。
上記(B)と(D)は、互いに切断サイトが離れている。(H)のDNAは、これら(B)と(D)のDNAを等モルとなるように、連結せずに混合した混合物である。
上記(A)〜(H)のDNAを、枯草菌コンピテントセルに形質転換して、得られたテトラサイクリン耐性株の出現数を指標に1μg当たりの形質転換体を求めた。(A)〜(H)のDNAはライゲーション反応の有無にかかわらず、ライゲーションバッファー中に溶解し、形質転換に用いた。(A)〜(H)のDNAの電気泳動の写真を図17に示し、(A)〜(H)のDNAの枯草菌コンピテントセルの形質転換体出現数を、図18に示す。なお、図17の電気泳動写真において、(C)と(E)のDNAは、様々なサイズのものがレーン上の広い範囲で分布しているため、バンドが判別しにくくなっている。また、図17の「G」において、上のバンドが、リダンダンシーr=1.97の(G)のDNAであり、下のバンドが、(G)のDNAに混ざっていたリダンダンシーr=0.95のDNAである。
<ライゲーションシミュレーションアルゴリズムの設定>
シミュレーションプログラミングは、表計算ソフトExcel(登録商標)2007のVBAを用いて行った。仮想ライゲーション中のDNA断片Fは、3つのパラメーターFi(Ni,Li,Ri)を用いて表現した。ここで、「i」は断片識別番号を意味し、より具体的には、Excel上のi列セルを意味する。「N」は、仮想ライゲーション中のライゲーションDNA断片1分子中に含まれる単位DNA断片数を示し、「L」はライゲーション産物の左側の突出末端の配列を任意の自然数で数値化したものを示し、「R」は、「L」と同じくライゲーション産物の右側の突出末端の配列を任意の自然数で数値化したものを示す。ここで、L=Rである場合、2つの突出配列は相補関係にあり、L=Rは、ライゲーション可能であることを定義する。ライゲーションのシミュレーションは以下のように行った。
mmin=(総単位DNA断片数)―(L=Rを満たす関係にある2種類の単位DNA断片のうち少ない単位DNAの断片数の、系全体における合計数)
6断片、13断片、26断片、51断片集積までの各集積規模において、同一単位DNA断片数の平均640で、0〜20%の範囲で1%刻みに設定した変動係数(CV)を持つ仮想単位DNA断片集団は以下のように作製した。
上記のライゲーションシミュレーションの数値解析から、ライゲーションのメカニズムについて一般化された式を求めるにあたって、各集積規模の各CV値におけるライゲーション産物の分布のフィッティングカーブを算出可能か否かを検証した。6断片集積平均640断片の場合についての、CV=20%におけるライゲーション産物の単位DNA断片含有数の分布を図20に示す。図20において、各リダンダンシー(0<r<1、1<r<2、2<r<5、5<r<10)中の各棒グラフの模様は、各模様毎にそれぞれのリダンシーのNをrで割った際に区別される成分(6断片集積の場合、余りが0、1、2、3、4、5の6成分のうち、N値が0のため対数変換が出来ない余り0の成分を除いた5成分)の種類を示し、異なるリダンダンシーにおいて、同一の模様である棒グラフは、Nをrで割った際に区別される成分が同一の種類であることを示す。また、図20のグラフ中の線形近似曲線は、それぞれの模様の成分の種類毎に求められたものである。
上記のライゲーションシミュレーションは、正規な突出組合せ同士のライゲーションが全て完了した状態を想定したものである。これに対し、実際に遺伝集積する際のライゲーション反応条件がどの程度シミュレーションの反応条件に近いのかを検討するために、ライゲーション反応のキネティックスを調べた。
より詳細にライゲーションの状況を確認するために、上記のλファージゲノム再構成の実験において得られた集積体のうち、全塩基配列を完全決定した#3、#4、#6、#12を除く全てのクローンについて(#1、#2、#5、#7、#8、#9、#10、#11)、誤った組み合わせでライゲーションされている箇所の同定を目的として塩基配列決定を行った。それぞれのクローンについてのミスライゲーションサイトを、図22に示す。この結果から、#11クローンを除く7クローンについては、その内部に1個もしくは2個のミスライゲーションが存在していることが確認され、全てのミスライゲーションを同定できた。一方、#11クローンについては、集積DNA内に同じ単位DNA断片が繰り返し存在していることが確認され、完全な構造確認を行うことはできなかったが、全6か所のミスライゲーションサイトが存在していることが確認された。#11は、詳細な単位DNA断片数が不明であるため、#11は除外して、全てのクローンのミスライゲーション出現頻度を算出した結果、連結点46箇所に1箇所程度の割合でミスライゲーションが存在していることが確認され、2.2%程度という比較的低い割合でミスライゲーションが出現することが確認された。この結果は、上記の定量PCRの結果と矛盾しない結果であった。
上記ミスライゲーション割合の推定と、ライゲーションの反応速度の定性的解析の2つの検証によって、実際のライゲーション反応においては、4時間という十分な時間が経過した後では、略全てのライゲーションが完了しており、またミスライゲーションが生じる確率は少ないと推定された。そこで、初発の単位DNA断片に濃度のバラつきが存在する実際の単位DNA断片集団について、シミュレーションによって実際のライゲーション産物の大きさ分布が予測可能か否かを以下の方法で検証した。
実際に集積に用いる単位DNA断片は、濃度のバラつきが避けられないが、実際にはどの程度の単位DNA断片の濃度のバラつきに抑えなければならないのかを、上記で求められた一般式f(N)=0.0058*CV(%)*exp(−0.0058*CV(%)*N)を用いて総括した図を、図25に示す。現在の遺伝子集積実験では、概ねDNA濃度のバラつきがCV(%)=6.6程度であるが、図25によると、CV(%)=6.6の場合、51断片の集積において、用いた単位DNA断片の約40%が、r値が1より大きいライゲーション産物に取り込まれていることが示される。また、図25によると、仮に、これの2倍の集積規模の102断片集団による新規な遺伝子集積を計画する場合、51断片と同程度の集積効率を期待するなら、CV(%)=3.3を実現する必要があることが示された。また、一般式f(N)=0.0058*CV(%)*exp(−0.0058*CV(%)*N)を用いて、単位DNA断片の濃度のバラつきと1ライゲーション産物の平均単位DNA断片数との関係を求めた。その結果を図26に示す。これにより、一般式f(N)=0.0058*CV(%)*exp(−0.0058*CV(%)*N)を用いることで、CV(%)値による、1ライゲーション産物中の平均単位DNA断片含有数を容易に推測することが可能となることが示された。
Claims (12)
- 付加配列が連結された複数の単位DNAを該単位DNAの種類毎に含む溶液を準備する工程と、
前記各々の溶液の準備後、前記単位DNAに付加配列が連結された状態で、前記各々の溶液中の単位DNAの濃度を測定し、その結果に基づいて、前記各々の溶液を分取して、各々の溶液中の単位DNAのモル数を互いに同一に近づける工程と、を有する単位DNA組成物の調製方法。 - 前記付加配列が連結された単位DNAが環状構造を有し、前記付加配列が複製開始点を有するプラスミドDNA配列である請求項1記載の単位DNA組成物の調製方法。
- 前記単位DNAの各々の塩基長と、各々の単位DNAに連結された付加配列の塩基長との合計長さの分布の標準偏差が、平均の前記合計長さに対して±20%以内である請求項1又は2記載の単位DNA組成物の調製方法。
- 前記各々の単位DNAに連結された付加配列の平均塩基長が、前記単位DNAの平均塩基長の2倍以上である、請求項1から3いずれか記載の単位DNA組成物の調製方法。
- 前記単位DNAの各々の長さが1600bp以下である請求項1から4いずれか記載の単位DNA組成物の調製方法。
- 前記単位DNAは、該単位DNAによって構成される集積DNAを含むDNA連結体を作製するために用いられるものであり、
前記単位DNAを含む溶液を準備する工程は、前記集積DNAの配列の塩基長を前記単位DNAの種類の数で割った場合に各々の塩基長が等しくなるように、前記集積DNAを等分した位置にある配列近傍の非回文配列を境界として、端部に非回文配列を有する前記単位DNAを設計する工程を含む、請求項1から5いずれか記載の単位DNA組成物の調製方法。 - 宿主微生物中で有効な複製開始点を含むベクターDNAと集積DNAとからなる集積DNAユニットを、1を超えて含む微生物細胞形質転換用DNA連結体の作製方法であって、
請求項1から6いずれかに記載の方法によって、単位DNA組成物を調製する工程と、
前記ベクターDNAを準備する工程と、
調製後の前記溶液中の付加配列が連結された単位DNAから制限酵素を用いて各々の付加配列を除去する工程と、
前記除去工程後、前記ベクターDNA及び前記各々の単位DNAを互いに連結する工程と、を有し、
前記ベクターDNA及び前記各々の単位DNAは互いに順序を保ったまま繰り返し連結し得る構造を有し、
前記集積DNAは、前記各々の単位DNAが互いに連結したDNAからなる、DNA連結体の作製方法。 - 集積ユニットを構成する単位DNAの数と集積ユニットの数との積で表される標的連結数のDNA断片の収率と、該DNA断片の濃度の変動係数との関係式に基づいて、前記連結工程における前記ベクターDNA及び前記各々の単位DNAの濃度の変動係数を調節する工程を含む、請求項7記載のDNA連結体の作製方法。
- 前記制限酵素は、タイプII制限酵素である請求項7又は8記載のDNA連結体の作製方法。
- 前記除去工程の前に、調製後の単位DNAを含む溶液のうち、2種以上の単位DNAを含む溶液を混合する工程を更に有する、請求項7から9いずれかに記載のDNA連結体の作製方法。
- 前記除去工程後、前記連結工程の前に、前記制限酵素を失活させる工程を更に有する、請求項7から10いずれかに記載のDNA連結体の作製方法。
- 前記微生物が枯草菌である請求項7から11いずれか記載のDNA連結体の作製方法。
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