JPWO2015068813A1 - チップおよび表面プラズモン増強蛍光測定方法 - Google Patents

Abstract

液体を保持するための液溜部と、前記液溜部の底部に配置された回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体とを有するチップを準備する。液溜部に試料液を導入した後、液溜部内の試料液を別の液体に置換する。回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、液溜部の開口部側から回折格子に励起光を照射するとともに、被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する。蛍光検出時の液溜部内の液体の表面積は、試料液導入時の液溜部内の試料液の表面積よりも大きい。

Description

本発明は、表面プラズモン増強蛍光測定装置で使用されるチップ、および表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。

臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。

被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で光を金属膜に照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む試料液を提供すると、被検出物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された２次抗体を反応場に提供すると、反応場に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。

ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを使用する（特許文献１参照）。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。

これに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（特許文献２参照）。ＧＣ−ＳＰＦＳでは、回折格子を形成された金属膜を使用する。この方法では、回折格子に励起光を照射することで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光は全方向に出射されるのに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光は特定の方向に指向性を持って出射されることが知られている。

特開平１０−３０７１４１号公報 特開２０１１−１５８３６９号公報

ＧＣ−ＳＰＦＳにおいて、回折格子の上に液体を提供して蛍光を検出する場合、液体の上に蓋が存在しないことが好ましい。励起光が蓋を透過する時に蓋の自家蛍光によりバックグラウンドが増大してしまうからである。特に、被検出物質が低濃度の場合、バックグラウンドの増大は被検出物質の検出の失敗に繋がるおそれもある。

一方、蓋を設けずに液体の上部を外部に開放すると、メニスカスにより液体の表面に傾きが生じる。このように液体の表面に傾きが生じると、励起光の入射角および蛍光の出射角にずれが生じてしまい、光検出部に適切に蛍光が到達できず、被検出物質の検出に失敗してしまうおそれがある。蛍光の出射角のずれに対応するためにレンズなどを用いて光検出部の検出範囲を拡げることも考えられるが、バックグラウンドの低減の観点からはレンズなどの使用は好ましくない。

本発明の目的は、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置に用いられるチップおよびＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定方法であって、バックグラウンドの増大を防ぎつつ、蛍光の出射角のずれによる検出精度の低下を抑制することができるチップおよび測定方法を提供することである。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係るチップは、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置で使用されるチップであって、液体を保持するための液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、を有し、前記液溜部の深さ方向の断面における前記液溜部の水平方向の大きさは、上に行くほど大きい。

また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、液体を保持するための液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、を有するチップを準備する工程と、前記液溜部に試料液を導入する工程と、前記液溜部内の前記試料液を別の液体に置換する工程と、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記液溜部の開口部側から前記回折格子に励起光を照射し、前記被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含み、前記蛍光を検出する工程における前記液溜部内の前記液体の表面積は、前記液溜部に前記試料液を導入する工程における前記液溜部内の前記試料液の表面積よりも大きい。

本発明によれば、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法において、被検出物質をより高感度かつ高精度に検出することができる。

表面プラズモン増強蛍光測定装置と、実施の形態１に係るチップの構成を示す模式図である。 図２Ａ，Ｂは、回折格子の斜視図である。 金属膜に対する励起光の入射角を説明するための断面模式図である。 実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の動作を示すフローチャートである。 図５Ａは、試料液を導入した後のチップを示す断面模式図であり、図５Ｂは、蛍光検出時のチップを示す断面模式図である。 図６Ａは、メニスカスが無いと仮定した場合の励起光および蛍光の光路を示す模式図であり、図６Ｂは、メニスカスがある場合の励起光および蛍光の光路を示す模式図である。 図７Ａ，Ｂは、メニスカスの測定結果を示すグラフである。 図８Ａ，Ｂは、チップの変形例を示す断面模式図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

［実施の形態１］
図１は、表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下「ＳＰＦＳ装置」という）１００と、本発明の実施の形態１に係るチップ２００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、光源１１０、コリメートレンズ１２０、励起光フィルター１３０、蛍光フィルター１４０、光検出部１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー（不図示）にチップ２００を装着した状態で使用される。そこで、チップ２００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。

チップ２００は、基板２１０と、回折格子２３０を含む金属膜２２０と、液体を保持するための液溜部２５０を形成する側壁２４０とを有する。金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。回折格子２３０には捕捉体（例えば１次抗体）が固定化されており、回折格子２３０の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図１では、捕捉体および被検出物質を省略している。なお、チップ２００は、好ましくは、各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

基板２１０は、金属膜２２０および側壁２４０の支持部材である。基板２１０の材料は、金属膜２２０および側壁２４０を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板２１０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。

金属膜２２０は、液溜部２５０の底部に位置するように基板２１０上に配置されている。前述のとおり、金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。金属膜２２０に光を照射すると、金属膜２２０中に生じる表面プラズモンと、回折格子２３０により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じる。金属膜２２０の材料は、表面プラズモンを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜２２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜２２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜２２０の厚みは、特に限定されない。たとえば、金属膜２２０の厚みは、３０〜７０ｎｍ程度である。

回折格子２３０は、金属膜２２０に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子２３０の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２３０は、図２Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図２Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図２Ａに示される１次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図２Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２３０の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子のピッチは、ＳＰＲを発生させる観点から、１００〜２０００ｎｍの範囲が好ましい。なお、本明細書において、「回折格子のピッチ」とは、図２Ａ，Ｂに示されるように、凸部の配列方向における凸部の中心間距離Λをいう。

回折格子２３０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板２１０の上に金属膜２２０を形成した後、金属膜２２０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板２１０の上に、金属膜２２０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２３０を含む金属膜２２０を形成することができる。

回折格子２３０（反応場）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。たとえば、回折格子２３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。

捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子２３０の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ膜」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭ膜の例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子２３０に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。

図３に示されるように、励起光αは、所定の入射角θで金属膜２２０（回折格子２３０）に照射される。照射領域では、金属膜２２０で生じた表面プラズモンと、回折格子２３０により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。前述のとおり、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。

側壁２４０は、金属膜２２０を取り囲むように基板２１０上に配置されている。側壁２４０は、金属膜２２０上に液体を保持するための液溜部２５０を形成する。液溜部２５０の開口部は蓋で閉塞されていないため、液溜部２５０内の液体の表面は外部に露出される。したがって、液溜部２５０内の液体の表面は、液体表面の大きさや側壁２４０内面の疎水度、液体の表面張力などに依存してメニスカスを形成する。この後説明するように、本実施の形態に係るチップ２００では、蛍光検出時におけるメニスカスの影響を低減するために、液溜部２５０の深さ方向の断面における液溜部２５０の水平方向の大きさ（互いに対向する側壁２４０間の間隔）は、上に行くほど（金属膜２２０から離れるほど）大きい。より具体的には、液溜部２５０上部における側壁２４０間の間隔は、液溜部２５０下部における側壁２４０間の間隔よりも大きくなっており、液溜部２５０上部の側壁２４０内面と、液溜部２５０下部の側壁２４０内面とは、水平面で接続されている（図１参照）。

側壁２４０の材料は、金属膜２２０上に液体を保持できるものであれば特に限定されず、必要とされる性質（例えば表面の疎水度）などに応じて適宜選択されうる。側壁２４０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。また、側壁２４０は、基板２１０と一体成形されていてもよい。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、光源１１０、コリメートレンズ１２０、励起光フィルター１３０、蛍光フィルター１４０、光検出部１５０および制御部１６０を有する。

光源１１０、コリメートレンズ１２０および励起光フィルター１３０は、励起光照射ユニットを構成する。励起光照射ユニットは、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、チップ２００の金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。また、励起光照射ユニットは、金属膜２２０中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子２３０で生じるように、金属膜２２０に対するＰ波のみを金属膜２２０に向けて出射する。励起光照射ユニットは、励起光αの光軸が、回折格子２３０における周期的構造の配列方向（図２Ａ，Ｂにおけるｘ軸方向）に沿うように、励起光αを金属膜２２０に照射する。したがって、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に垂直な軸（液溜部２５０の高さ方向の軸）をｙ軸とした場合、励起光αの光軸はｘｙ平面に平行である（図１参照）。

光源１１０は、チップ２００の金属膜２２０に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。光源１１０の種類は、蛍光物質を励起できる波長（例えば４００〜１０００ｎｍ）の光を出射できれば特に限定されない。光源１１０の例には、レーザーダイオード、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。

コリメートレンズ１２０は、光源１１０から出射された励起光αをコリメートする。光源１１０から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である場合がある。このため、金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように、光源１１０は所定の姿勢で保持される。

励起光フィルター１３０は、例えば、バンドパスフィルターおよび直線偏光フィルターを含み、光源１１０から出射された励起光αを整波する。光源１１０からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、光源１１０からの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、光源１１０からの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、直線偏光フィルターは、光源１１０からの励起光αを完全な直線偏光の光にする。励起光フィルター１３０は、金属膜２２０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。

金属膜２２０（回折格子２３０）に対する励起光αの入射角θ（図３参照）は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光αの入射角θは、回折格子２３０のピッチΛや励起光αの波長、金属膜２２０を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。たとえば、励起光αの入射角θは、以下の式（１１）を満たすように設定される。

ｋ_０：励起光αの波数＝２π／（λ_０／ｎ）
λ_０：真空中の励起光αの波長
ｎ：回折格子２３０上の媒質（液溜部２５０内の液体）の屈折率
θ：励起光αの回折格子２３０に対する入射角
ｍ：整数
Λ：回折格子２３０のピッチ

ここで、ｋ_ｓｐは、２種類の媒質の界面（金属膜２２０と液溜部２５０内の液体との界面）において励起されるプラズモンの波数であり、以下の式（１２）のように定義される。

ω：励起光αの角周波数
ｃ：光速度
ε_１：回折格子２３０上の媒質（液溜部２５０内の液体）の誘電率＝ｎ^２
ε_２：回折格子２３０を構成する媒質（金属）の誘電率

励起光αの最適な入射角θは、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで入射角θを調整する第１角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、励起光照射ユニットまたはチップ２００を回転させればよい。

蛍光フィルター１４０および光検出部１５０は、蛍光検出ユニットを構成する。蛍光検出ユニットは、励起光照射ユニットに対して、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０に対して垂直な直線を挟むように配置されている。蛍光検出ユニットは、回折格子２３０（反応場）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する。蛍光検出ユニットは、光検出部１５０の検出範囲を拡げるために集光レンズをさらに有していてもよいが、バックグラウンドの低減の観点からは集光レンズを含まない方が好ましい。

蛍光フィルター１４０は、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、光検出部１５０に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、光検出部１５０に到達する光の光量を調整したりする。

光検出部１５０は、金属膜２２０上の蛍光像を検出する。たとえば、光検出部１５０は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。光検出部１５０は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサなどであってもよい。

金属膜２２０の垂線に対する蛍光検出ユニットの光軸の角度は、回折格子２３０（反応場）から放出される蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。したがって、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出ユニットの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニットの光軸の角度を調整する第２角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２角度調整部は、蛍光検出ユニットの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、蛍光検出ユニットまたはチップ２００を回転させればよい。

制御部１６０は、励起光照射ユニット（光源１１０）、蛍光検出ユニット（光検出部１５０）、励起光照射ユニットおよび蛍光検出ユニットの角度調整部（第１角度調整部および第２角度調整部）の動作を制御する。また、制御部１６０は、光検出部１５０からの出力信号（蛍光シグナル）を解析することにより、被検出物質の存在またはその量を分析する。制御部１６０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０（回折格子２３０）上に固定化されている。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置にチップ２００を設置する。また、チップ２００の金属膜２２０上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜２２０上を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、チップ２００の液溜部２５０に試料液を導入して、試料液中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。試料液中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。このとき、図５Ａに示されるように、液溜部２５０の下部にのみ試料液３１０を導入することが好ましい。液溜部２５０の下部の容量は、液溜部２５０の上部の容量よりも小さいため、液溜部２５０の下部にのみ試料液３１０を導入することで、試料液の使用量を低減することができる。この後、液溜部２５０内を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。

試料液は、検体を含む水系の液体である。たとえば、試料液は、液状の検体や、液状の検体を緩衝液などの液体で希釈した希釈液である。試料液は、界面活性剤などを含んでいてもよい。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。

次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を液溜部２５０に導入して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。このときも、図５Ａに示されるように、液溜部２５０の下部にのみ蛍光標識液を導入することが好ましい。この後、液溜部２５０内を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去する。なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を液溜部２５０に導入してもよい。また、液溜部２５０に検体と蛍光標識液を同時に導入してもよい。いずれの場合であっても、液溜部２５０に導入された試料液は、緩衝液などの別の液体に置換される。

次いで、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βの強度を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１６０は、光源１１０に励起光αを出射させる。同時に、制御部１６０は、光検出部１５０に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。光検出部１５０は、測定結果を制御部１６０に出力する。このとき、図５Ｂに示されるように、液溜部２５０の上部まで液体３２０が導入されていることが好ましい。液溜部２５０上部の側壁２４０間の間隔は、液溜部２５０下部の側壁２４０間の間隔よりも大きいため、液溜部２５０の上部まで液体３２０を導入することで、金属膜２２０上部におけるメニスカスに起因する液面の屈曲度を低減することができる。すなわち、金属膜２２０上部の液面形状を平面に近づけて、蛍光βの出射角のずれを低減することができる。

最後に、制御部１６０は、光検出部１５０からの出力信号（蛍光シグナル）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ５０）。

以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。

以上のように、本実施の形態に係るチップ２００は、液溜部２５０の深さ方向の断面における液溜部２５０の水平方向の大きさが上に行くほど（金属膜２２０から離れるほど）大きい。このため、液溜部２５０内の液体の量を多くすることで、液溜部２５０の上にバックグラウンド増大の原因となりうる蓋などを配置することなく、メニスカスに起因する蛍光の出射角のずれを低減することができる。したがって、本実施の形態に係るチップ２００を使用することで、高感度かつ高精度に被検出物質を検出することができる。

また、本実施の形態に係るチップ２００は、液溜部２５０の深さ方向の断面における液溜部２５０の水平方向の大きさが下に行くほど（金属膜２２０に近いほど）小さい。このため、１次反応を行うときの試料液の使用量、および２次反応を行うときの試薬の使用量を減らすことができる。したがって、本実施の形態に係るチップ２００を使用することで、測定コストを低減することができる。

［実施の形態２］
実施の形態２に係るチップ２００は、ＳＰＦＳ装置１００の光検出部１５０の開口数に対応して、液溜部２５０の水平方向の大きさＲと、側壁２４０内面の接触角θ_ｃが設定されている点で実施の形態１に係るチップ２００と異なる。したがって、本実施の形態では、この点についてのみ説明する。

光検出部１５０において蛍光βを正確に検出するためには、蛍光βの出射角がメニスカスに起因してずれても、蛍光βが光検出部１５０の開口部（アパーチャ）内に到達できることが好ましい。すなわち、蛍光βの出射角のずれ幅が、光検出部１５０の開口数と関連付けられる所定の値よりも小さいことが好ましい。

図６Ａは、メニスカスが無いと仮定した場合の励起光αおよび蛍光βの光路を示す模式図である。図中右側の励起光αは、励起光αの反射光である。ここで、θ_１は、励起光αが液体３２０上の媒質（例えば空気）から液体３２０（例えば緩衝液）に入射したときの励起光αの入射角である。θ_１’は、励起光αが液体３２０上の媒質から液体３２０に入射したときの励起光αの屈折角である。θ_２は、蛍光βが液体３２０から液体３２０上の媒質に入射したときの蛍光βの屈折角である。ｈは、液溜部２５０内の液体３２０の深さである。この図に示されるように、蛍光βが液体３２０から液体３２０上の媒質に入射したときの蛍光βの入射角は、２θ_１’で近似されうる。以下の説明では、θ_２を蛍光βの出射角の基準とする。

なお、励起光αの波長や、回折格子２３０のピッチΛ、液体３２０の深さｈ、励起光αの入射角θ_１、液体３２０上の媒質の屈折率ｎ_１および誘電率、液体３２０の屈折率ｎ_２および誘電率などは、蛍光検出時に使用する液体３２０の種類や、蛍光物質の種類、蛍光検出時の雰囲気などに応じて従属的に決まる。

図６Ｂは、メニスカスがある場合の励起光αおよび蛍光βの光路を示す模式図である。ここで、金属膜２２０の面方向をｘ軸とし、液溜部２５０の高さ方向をｙ軸とし、励起光αの光軸と回折格子２３０との交点を原点としたときの、液溜部２５０内の液体３２０のメニスカスの形状を表す関数を以下の式（１３）のように表す。液体３２０の屈折率および誘電率は、水の屈折率および誘電率とほぼ同じであると考えられるため、液体３２０のメニスカスの形状は、液体３２０表面の位置の液溜部２５０の水平方向の大きさＲおよび側壁２４０内面の接触角θ_ｃにより決まる。

図６Ｂにおいて、θ_１”は、励起光αが液体３２０上の媒質から液体３２０に入射したときの、入射点を通りかつ金属膜２２０の表面に垂直な直線に対する液体３２０内の励起光αの角度である。Δθ_１は、励起光αが液体３２０上の媒質から液体３２０に入射したときの入射点における液体３２０表面の傾きを表し、上記式（１３）を利用して以下の式（１４）のように表される。ｘ_１は、入射点のｘ座標の値である。また、Δθ_２’は、蛍光βが液体３２０から液体３２０上の媒質に入射したときの入射点における液体３２０表面の傾きを表し、上記式（１３）を利用して以下の式（１５）のように表される。ｘ_２は、入射点のｘ座標の値である。

この場合、ｘ_１およびｘ_２は、それぞれ以下の式（１６）および式（１７）のように近似される。

スネルの法則より、以下の式（１８）および式（１９）が成立する（図６Ａ参照）。同様に、スネルの法則より、以下の式（２０）および式（２１）が成立する（図６Ｂ参照）。ここで、ｎ_１は、液体３２０上の媒質の屈折率である。ｎ_２は、液体３２０の屈折率である。

上記の式（１８）〜式（２１）に各数値を代入し、これらの式を解くことで、液体３２０のメニスカスに起因する蛍光βの出射角のずれ幅Δθ_２を算出することができる。そして、前述のとおり、光検出部１５０において蛍光βを正確に検出するためには、蛍光βの出射角のずれ幅Δθ_２が、光検出部１５０の開口数ＮＡと関連付けられる所定の値よりも小さいことが好ましい。すなわち、以下の式（２２）が成立することが好ましい。

前述のとおり、液体３２０のメニスカスの形状は、液体３２０表面の位置の液溜部２５０の水平方向の大きさＲおよび側壁２４０内面の接触角θ_ｃにより決まる。したがって、本実施の形態に係るチップ２００では、上記の式（２２）が成立するように、Ｒおよびθ_ｃが設定される。蛍光βを正確に検出する観点からは、Ｒおよびθ_ｃは、蛍光βが液体３２０の表面で全反射しないように設定されることがより好ましい。また、Ｒおよびθ_ｃは、液体３２０の深さが変動しても蛍光βが光検出部１５０に到達できるように設定されることがより好ましい。また、Ｒおよびθ_ｃは、チップ２００の位置ずれが生じても蛍光βが光検出部１５０に到達できるように設定されることがより好ましい。

なお、液溜部２５０内の液体３２０のメニスカスの形状（上記式（１３）の関数）は、例えばレーザー変位計で測定されうる。図７は、ポリテトラフルオロエチレンで側壁２４０を形成した場合のＴＢＳＴ（Tris Buffered Saline with Tween 20）のメニスカスの測定結果を示すグラフである。図７Ａは、液面の高さの液溜部２５０の水平断面の形状が直径１８ｍｍの円形である場合の測定結果を示すグラフであり、図７Ｂは、液面の高さの液溜部２５０の水平断面の形状が直径１０ｍｍの円形である場合の測定結果を示すグラフである。横軸は、液面の中心からの水平方向の距離を示し、縦軸は、液面の中心からの高さを示す。このような測定結果から、上記式（１３）の関数が決定されうる。

以上のように、本実施の形態に係るチップ２００は、ＳＰＦＳ装置１００の光検出部１５０の開口数に対応して、液溜部２５０の水平方向の大きさＲと、側壁２４０内面の接触角θ_ｃが設定される。このため、蛍光βの出射角のずれを、光検出部１５０の開口数よりも小さくすることができる。したがって、本実施の形態に係るチップ２００を使用することで、高感度かつ高精度に被検出物質を検出することができる。

なお、上記各実施の形態では、図５に示されるチップ２００を使用する例について説明したが、本発明に係るチップの液溜部２５０の形状は、これに限定されない。これまで説明したように、液溜部２５０の深さ方向の断面における液溜部２５０の水平方向の大きさが上に行くほど（金属膜２２０から離れるほど）大きければ、本発明の効果を得られる。したがって、図８Ａに示されるように、側壁２４０の内面にＲ面を形成してもよいし、図８Ｂに示されるように、側壁２４０の内面にテーパー面（傾斜面）を形成してもよい。

本出願は、２０１３年１１月７日出願の特願２０１３−２３０９６９に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

１００ 表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０ 光源
１２０ コリメートレンズ
１３０ 励起光フィルター
１４０ 蛍光フィルター
１５０ 光検出部
１６０ 制御部
２００ チップ
２１０ 基板
２２０ 金属膜
２３０ 回折格子
２４０ 側壁
２５０ 液溜部
３１０ 試料液
３２０ 液体
α 励起光
β 蛍光

Claims (3)

1. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置で使用されるチップであって、
   液体を保持するための液溜部と、
   前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、を有し、
   前記液溜部の深さ方向の断面における前記液溜部の水平方向の大きさは、上に行くほど大きい、
   チップ。
2. 前記表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を前記回折格子に照射する光照射部と、蛍光を検出する光検出部と、を有し、
   前記光照射部および前記光検出部を含む前記液溜部の深さ方向の断面における、蛍光検出時の液面位置の前記液溜部の水平方向の大きさＲと、前記液溜部の側壁内面の接触角θ_ｃは、以下の式（１）が成立するように設定されている、
   請求項１に記載のチップ。
   

   

   ［上記式（１）において、Δθ_２は、以下の式（２）〜式（５）により算出される、蛍光が液体から前記液体上の媒質に入射したときの蛍光の屈折角の前記液体のメニスカスに起因する変動幅である。ＮＡは、前記光検出部の開口数である。］
   

   

   

   

   

   ［上記式（２）〜式（５）において、ｎ_１は、前記液体上の媒質の屈折率である。ｎ_２は、前記液体の屈折率である。θ_１は、メニスカスが無いと仮定した場合に励起光が前記液体上の媒質から前記液体に入射したときの励起光の入射角である。θ_１’は、メニスカスが無いと仮定した場合に励起光が前記液体上の媒質から前記液体に入射したときの励起光の屈折角である。θ_２は、メニスカスが無いと仮定した場合に蛍光が前記液体から前記液体上の媒質に入射したときの蛍光の屈折角である。θ_１”は、メニスカスがある場合の励起光が前記液体上の媒質から前記液体に入射したときの、入射点を通りかつ前記金属膜の表面に垂直な直線に対する前記液体内の励起光の角度である。Δθ_１は、以下の式（６）および式（１０）により表される、メニスカスがある場合の励起光が前記液体上の媒質から前記液体に入射したときの入射点における液面の傾きである。Δθ_２’は、以下の式（８）および式（１０）により表される、メニスカスがある場合の蛍光が前記液体から前記液体上の媒質に入射したときの入射点における液面の傾きである。］
   

   

   ［上記式（６）において、ｘ_１は、メニスカスがある場合の励起光が前記液体上の媒質から前記液体に入射したときの入射点のｘ座標であり、以下の式（７）で近似される。］
   

   

   

   ［上記式（８）において、ｘ_２は、メニスカスがある場合の蛍光が前記液体から前記液体上の媒質に入射したときの入射点のｘ座標であり、以下の式（９）で近似される。］
   

   

   

   ［上記式（１０）は、前記断面において、前記金属膜の面方向をｘ軸とし、前記液溜部の高さ方向をｙ軸とし、励起光の光軸と前記回折格子との交点を原点としたときの、Ｒおよびθ_ｃの影響を受けて形成される前記液体のメニスカスの形状を表す関数である。］
3. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
   液体を保持するための液溜部と、前記液溜部の底部に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、を有するチップを準備する工程と、
   前記液溜部に試料液を導入する工程と、
   前記液溜部内の前記試料液を別の液体に置換する工程と、
   前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記液溜部の開口部側から前記回折格子に励起光を照射し、前記被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
   を含み、
   前記蛍光を検出する工程における前記液溜部内の前記液体の表面積は、前記液溜部に前記試料液を導入する工程における前記液溜部内の前記試料液の表面積よりも大きい、
   表面プラズモン増強蛍光測定方法。

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