JPWO2014092164A1 - 外来物質導入装置および外来物質導入細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
PBS緩衝液:D−PBS、0.1mol/lリン酸緩衝生理食塩水、wako
HEK293細胞:ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞株、JCRB9068、JCRB細胞バンク
mouse由来Neuro2A神経腫由来細胞株:IFO50081、JCRB細胞バンク
高齢human(81歳)由来繊維芽細胞株:JCRB0532 TIG−107、JCRB細胞バンク
mouse由来海馬神経初代細胞:MB−X0403、住友ベークライ株式会社
プラスミドDNA1: Venus、黄色(黄緑色)蛍光たんぱくをコードするプラスミドDNA、RIKEN
プラスミドDNA2:EGFP、緑色蛍光たんぱくをコードするプラスミドDNA、clontech
プラスミドDNA3:mcherry、赤色蛍光たんぱくをコードするプラスミドDNA、clontech
トリパンブルー:Trypan Blue、0.4% solution、MP Biomedicals LLC
レチノイン酸:all−trans−Retinoic Acid、wako
外来遺伝子としてプラスミドDNA1が選択され、遺伝子導入操作後の油中液滴はマイクロピペットによって回収された。回収された液滴は、液体培地に移された後、37℃、二酸化炭素5%の条件下で一晩培養された。蛍光顕微鏡(TE−2000U、ニコン社)を用いて、明視野観察にて全細胞数が計測され、蛍光観察で蛍光を発する細胞数(外来遺伝子導入細胞)が計数された。蛍光する細胞数を全細胞数で除して遺伝子導入効率が算出された。
標的細胞の生存率の計測には、死細胞を特異的に染色する色素トリパンブルーが用いられた。遺伝子導入操作後(即ち、所定時間の電圧印加後)の油中液滴は、マイクロピペットによって回収され、PBS緩衝液に懸濁された。その後、液滴内の細胞はトリパンブルーで染色され、Countess Automated Cell Counter(life technologies)又は顕微鏡 (TE−2000U、ニコン社)を用いて明視野で観察された。生細胞数 (染色されない細胞数)と死細胞数 (染色された細胞数)とが各々計数され、生細胞数を全細胞数(生細胞数と死細胞数との和)で除して生存率が算出された。
図1に示す装置1が以下の手順で作成された。幅10mmの分光光度計用ポリスチレン製ディスポーサブルセル(Macro cuvettes、759007、PEQLAB)が容器として用いられた。容器の向かい合う一対の内壁全面に、電極となるアルミテープ(古藤工業株式会社)が貼着された。容器上面の開口部が導電性のクリップで挟持され、アルミテープとクリップとが接触した。クリップと、直流高電圧電源(HAR−30R10、松定プレシジョン)とが導線で接続され、直流高電圧電源とアルミテープとが電気的に接続された。動粘度100cStのシリコーンオイルが容器の7分目まで注がれ、静置された。超純水製造装置(MilliQ、ミリポア社)を用いて製造された超純水が、容器にピペットにより3μl滴下され、シリコーンオイル中で直径約1.8mmの球状の液滴が形成された。次いで、直流高電圧電源によって3.5kV(電界強度3.5kV/cm)の電圧が印加された。液滴の運動は、高速度カメラ(FASTCAM−1280PCI、Photron)で撮影され、撮影動画が低速で再生され、液滴の往復回数が目視でカウントされた。その結果、アルミテープ間で1分間に約100回、液滴が往復移動することおよびアルミテープに接触することが確認された。以下の実施例は、第1実施例と同様のアルミテープと、同様の直流高電圧電源とを用いて行った。
図8に示す装置41が以下のように作成された。内径6.7mmの有底円筒形の容器(ウェル)を96個有する96穴細胞培養プレート(Cat.No.92696、TPP)が処理容器として用いられた。処理容器の1列に含まれる8つの容器のうち、隣接する4つの容器において、幅5mmの2枚のアルミテープ(電極)が容器の内周面に対向するように貼着された。2枚のアルミテープは、2枚のアルミテープのうちの一方が、周方向の両側端部で他方と接触しないように、隙間を形成して配置された。電極間距離は、最も狭いところ(アルミテープの端部間)で6mmであった。各アルミテープは、容器の上方において容器の外側まで引き出され、容器の列間に形成された処理容器の天板に固定された。天板には、容器を挟んで、矩形状の金属箔が、容器の列方向に沿って配設された。各金属箔は、容器の外側に引き出されたアルミテープの上面(接触部)に接触した。一方の金属箔の端部は高電圧電源の正極に電気的に接続された。他方の金属箔の端部は高電圧電源の負極に電気的に接続された。これにより、各容器に電圧が印加され得る。
第2実施例で作製された装置41にて、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞株への外来遺伝子導入試験が実施された。DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium High Glucose、wako)、10%FBS(Fetal bovine serum)、およびPenicillin−Streptomycin(wako)を含む培地(調製培地ともいう。)が調製された。調製培地は、直径10cmのプラスチックシャーレ(Orange scientific、以下単にシャーレという。)に注入された。シャーレに、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞株が1.0×106cells/mlとなるように添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。0.05%トリプシン−0.53mmol/lEDTA−4Na(wako)にてシャーレからはがされたヒト胎児腎臓由来HEK293細胞株は、PBS緩衝液に懸濁された。PBS緩衝液中のヒト胎児腎臓由来HEK293細胞株の濃度は1.0×104cells/droplet(即ち、液滴3μl中に1.0×104cells)に調製された。更に、PBS緩衝液にプラスミドDNA1を濃度が258ng/μlとなるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。絶縁油として動粘度100cStのシリコーンオイルが貯留された容器に、調製された細胞懸濁液が3μl滴下され、直径約1.8mmの球状の液滴が形成された。液滴が形成された容器に、1.0〜4kV、0〜15分(0.5分、1分、2分、3分、4分、5分、15分)の条件で直流高電圧電源から電圧が印加された。生存率測定のため、印加時間30分についても試験が実施された。試験結果は図13および図14に示される。
調製培地が注入されたシャーレにmouse由来Neuro2A神経腫由来細胞株が1.0×106cells/mlとなるように添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。その後更に、シャーレにレチノイン酸が終濃度5μmol/lで添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で一晩培養され、mouse由来Neuro2A神経腫由来細胞株が神経細胞様に分化された。PBS緩衝液に、分化されたmouse由来Neuro2A神経腫由来細胞株が1.0×105cells/droplet(即ち、液滴3μl中に1.0×105cells)となるように添加され、プラスミドDNA1が濃度260ng/μlとなるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。第2実施例で作製された装置41(図8参照)が用いられた。動粘度100cStのシリコーンオイルが貯留された容器に細胞懸濁液が3μl滴下され、シリコーンオイル中に液滴が形成された。一対の電極に、3.8kVで5分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された6well硝子ボトムプレート(EZViewカバーガラスボトム、IWAKI)に、油中から回収した液滴が添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。培養開始1日後、3日後の細胞が顕微鏡を用いて観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、490nm波長付近の励起光がフィルターを介して標的細胞に照射されて、510nm波長付近の蛍光がフィルターを介して観察された。試験結果は図18から図20に示される。
高齢human(81歳)由来繊維芽細胞株が、DMEM(wako)が注入されたシャーレに1.0×106cells/mlで添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。その後、PBS緩衝液に、高齢human(81歳)由来繊維芽細胞株が1.0×104cells/droplet(即ち、液滴3μl中に1.0×104cells)添加され、プラスミドDNA1が濃度が260ng/μlとなるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。第2実施例で作製された装置41が用いられた。動粘度100cStのシリコーンオイルが貯留された容器に3μlの細胞懸濁液が滴下され、3.8kVで5〜30分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された6well硝子ボトムプレートに、油中から回収された液滴が添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。培養開始3日後の細胞は顕微鏡を用いて観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、490nm波長付近の励起光がフィルターを介して標的細胞に照射され、510nm波長付近の蛍光はフィルターを介して観察された。試験結果は図21〜図29に示される。
DMEM(wako)が注入されたシャーレに、mouse由来Neuro2A神経腫由来細胞株が1.0×106cells/mlで添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。その後更に、シャーレにレチノイン酸が終濃度5μmol/lで添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で一晩培養された。PBS緩衝液に、神経細胞様に分化されたmouse由来Neuro2A神経腫由来細胞株が1.0×104cells/droplet(即ち、液滴3μl中に1.0×104cells)となるように添加され、2種類のプラスミドDNAが次の濃度となるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。即ち、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNA2は、濃度200ng/μlとなるよう添加された。赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNA3は、600ng/μlとなるよう添加された。第2実施例で作製された装置41(図8参照)が用いられた。動粘度100cStのシリコーンオイルが貯留された容器に3μlの細胞懸濁液が滴下され、液滴が形成された。一対の電極に、3.8kVで5分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された6well硝子ボトムプレートに、油中から回収された液滴が添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。培養開始2日後の細胞は顕微鏡(オリンパスIX81)を用いて観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、490nm波長付近の励起光がフィルターを介して照射されて、510nm波長付近の緑蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。水銀ランプ光源が光源とされ、590nm波長付近の励起光がフィルターを介して照射され、610nm波長付近の赤蛍光シグナルがフィルターを介して観察された。観察結果は図30から図32に示される。
図10に示す装置61が以下の手順で作成された。8レーンリザ−バー(R08R01S、ビーエム機器株式会社)が処理容器として用いられた。処理容器が備える容器の向かい合う一対の内壁に、電極となるアルミテープ(古藤工業株式会社)が5mm幅で貼着された。各電極部の間隔は5mmとした。各アルミテープは、容器の上方において容器の外側まで引き出され、容器の列間に形成された処理容器の天板に固定された。天板には、容器を挟んで、矩形状の金属箔が、容器の行方向に沿って配設された。各金属箔は、容器の外側に引き出されたアルミテープの上面(接触部)に接触した。一方の金属箔の端部は高電圧電源の正極に電気的に接続された。他方の金属箔の端部は高電圧電源の負極に電気的に接続された。これにより、各容器に電圧が印加され得る。
第1実施例と同様の装置に、動粘度約50cStの菜種油 (ナカライテスク)が容器の7分目まで注がれ、静置された。ピペットによりキシレンシアノール水溶液3μlが容器に供給され、菜種油中で直径約1.8mmの球状の液滴が形成された。次いで、直流高電圧電源によって2.8kV(電界強度2.8kV/cm)の電圧が印加された。液滴の運動の確認は、第1実施例と同様の手法で行われた。
図11に示す装置81が以下の手順で作成された。各容器(ウェル)の幅7mmの8レーンリザ−バー(R08R01S、ビーエム機器株式会社)が容器として用いられた。容器の向かい合う一対の内壁に、電極となるアルミテープ(古藤工業株式会社)が5mm幅で貼着された。容器の開口部からアルミテープの下端までの距離は5mmとした。容器の外側に引き出された一方のアルミテープの上面の端部は高電圧電源の正極に電気的に接続された。他方のアルミテープの上面の端部は高電圧電源の負極に電気的に接続された。これにより、容器に電圧が印加され得る。比重1.0以上のフルオロカーボン(フロリナートFC−75、スリーエム)と、比重0.9から1.0であり、動粘度が30cStのシリコーン油とが容器に注がれ、静置された。フルオロカーボン油と、シリコーン油との比重差によって、容器内にフルオロカーボン油の層の上に、シリコーン油の層が形成された。超純水製造装置(MilliQ、ミリポア社)を用いて製造された超純水は、容器の電極間にピペットを用いて3μl供給され、シリコーン油中に直径約1.8mmの球状の液滴が形成された。直流高電圧電源から2.5kV(電界強度約3.6kV/cm)の電圧が印加された。液滴の運動の確認は、第1実施例と同様の手法で行われた。
パパイン酵素主成分の組織分散液が注入されたシャーレに、ICRマウス(胎生16日)海馬由来神経細胞(住友ベークライト)が1.5×105cells/mlで添加され、分散された。海馬由来神経細胞の濃度は液滴2μl中に1.5×103cellsの濃度に調整された。シャーレに2種類のプラスミドDNAが次の濃度となるように加えられて、細胞懸濁液が調製された。即ち、黄色(黄緑色)蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNA1は、濃度200ng/μlとなるよう添加された。赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNA3は、150ng/μlとなるよう添加された。第2実施例で作製された装置41(図8参照)が用いられた。動粘度30cStのシリコーンオイルが貯留された容器に2μlの細胞懸濁液が滴下され、液滴が形成された。一対の電極に、2.1kVで5分間電圧が印加された。電圧印加後、調製培地が注入された24well硝子ボトムプレート(EZViewカバーガラスボトム、IWAKI)に、油中から回収された液滴が添加され、37℃、二酸化炭素5%の条件下で培養された。
6、46 油
2、12、62、82 容器
5a、5b、15a、15b、25a、25b、35a、35b 電極
5、15、25、35 電極部
9 電源
15a1、15b1、35a1 面状体
45、65 板状体部
45a、45b、65a、65b 板状体
Claims (15)
- 電気的作用によって細胞外から細胞内に外来物質を導入する外来物質導入装置(1、11、41、61、81)において、
外部からの物質供給が可能な開口部(17、18、68、83)を有する1以上の貯留槽(2、12、62、82)と、
前記1以上の貯留槽の各々の内に互いに離間して配置された、水平面に交差する方向に延設された一対の電極(5a、5b、15a、15b、25a、25b、35a、35b)を有する1以上の電極部(5、15、25、35)と、
前記1以上の電極部に、所定時間、直流電圧を印加して電界を発生させるよう構成された電界発生手段であって、絶縁性液体が貯留された前記1以上の貯留槽の各々において、外来物質および細胞を含有し、前記絶縁性液体と混和しない細胞懸濁液を、前記一対の電極の間に供給することにより、前記絶縁性液体中に前記一対の電極の間隔よりも小径の前記細胞懸濁液の液滴を形成させた状態で、前記1以上の電極部に直流電圧を印加した場合に、前記一対の電極間に生じる電界によって、前記液滴を前記一対の電極のうちの前記液滴とは逆の極性を有する電極である逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすよう構成された電界発生手段(9)と
を備えることを特徴とする外来物質導入装置。 - 前記一対の電極は、前記1以上の電極部の各々に直流電圧が印加された場合の前記絶縁性液体の液面に仮想的な複数の電気力線を引いた場合に、当該複数の電気力線の分布が局所的な集中を生じる形状に形成されていることを特徴とする請求項1に記載の外来物質導入装置。
- 前記一対の電極のうちの一方の電極は、水平面に対して略垂直方向に展延された面状体であって、他方の電極に向き合う対向面側が凹となる略円弧形状に湾曲して形成された面状体である第一面状体を有していることを特徴とする請求項2に記載の外来物質導入装置。
- 前記一対の電極のうちの他方の電極は、水平面に対して略垂直方向に展延された面状体であって、前記一方の電極に向き合う対向面側が凹となる略円弧形状に湾曲して形成された面状体である第二面状体を有していることを特徴とする請求項3に記載の外来物質導入装置。
- 前記一対の電極の少なくとも一方は、凹部又は凸部を有することを特徴とする請求項1に記載の外来物質導入装置。
- 前記一対の電極の前記間隔は、1cm以内であり、
前記電界発生手段は、前記一対の電極の間に形成された前記液滴を、前記逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすことを繰り返すことで、前記一対の電極の間を複数回往復移動させるよう構成されたことを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の外来物質導入装置。 - 前記1以上の貯留槽の各々は底面部(4、14、64、84)を有し、
前記絶縁性液体は、前記細胞懸濁液よりも低比重で且つ、前記電界発生手段による直流電圧の印加が終了した際の前記液滴の位置が、前記底面部と、前記絶縁性液体の液面との間の位置となる粘性を備えることを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の外来物質導入装置。 - 前記1以上の貯留槽は並列された複数の貯留槽(12)であり、前記複数の貯留槽の各々には、上面に前記開口部(17)が形成され、1の電極部(15)が設けられており、
前記一対の電極は、各々少なくとも前記開口部まで延設されており、
前記複数の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち一方を前記開口部において電気的に接続する第1接続部(45a)と、
前記複数の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち他方を前記開口部において電気的に接続する第2接続部(45b)とを更に備え、
前記電界発生手段は、前記第1接続部および前記第2接続部を介して、前記複数の貯留槽の各々の前記1の電極部に直流電圧を印加することを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の外来物質導入装置。 - 前記1以上の貯留槽(62)の各々は、互いに間隔をあけて配置された複数の電極部(35)を収容し、
前記一対の電極は、各々少なくとも前記開口部(68)まで延設されており、
前記1以上の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち一方を前記開口部において電気的に接続する第1接続部(65a)と、
前記1以上の貯留槽の各々の前記一対の電極のうち他方を前記開口部において電気的に接続する第2接続部(65b)とを更に備え、
前記電界発生手段は、前記第1接続部および前記第2接続部を介して、前記1以上の貯留槽の各々の前記複数の電極部に直流電圧を印加することを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の外来物質導入装置。 - 細胞と1種類以上の外来物質とを含む細胞懸濁液を、貯留槽に貯留され、該細胞懸濁液と混和しない絶縁性液体中へ供給して前記絶縁性液体中で液滴を形成させる第1工程(S3)と、
前記第1工程にて形成された前記液滴の両側に各々設けられ、前記絶縁性液体の液面に対して交差する方向に延びる一対の電極に所定時間直流電圧を印加して、前記一対の電極のうちの一方の電極と他方の電極との間を前記液滴を往復移動させ、前記液滴を電極に接触させることで、前記液滴中において前記1種類以上の外来物質を前記細胞に導入する第2工程(S4)と
を備えることを特徴とする外来物質導入細胞の製造方法。 - 前記第2工程は、前記1種類以上の外来物質を前記細胞の核に導入する工程であることを特徴とする請求項10に記載の外来物質導入細胞の製造方法。
- 前記第1工程は、複数種類の外来物質を含む細胞懸濁液を前記絶縁性液体中へ供給して液滴を形成させる工程であり、
前記第2工程で前記所定時間直流電圧を印加することで、前記複数種類の外来物質を前記細胞に導入する工程であることを特徴とする請求項10又は11に記載の外来物質導入細胞の製造方法。 - 前記第1工程に使用される前記細胞は、ヒト由来の体細胞およびヒト以外の動物由来の体細胞の少なくとも一方であることを特徴とする請求項10から12のいずれかに記載の外来物質導入細胞の製造方法。
- 前記絶縁性液体は、第一絶縁性液体と、前記第一絶縁性液体よりも比重が軽い第二絶縁性液体とを含み、
前記第1工程の前に、前記第一絶縁性液体と、前記第二絶縁性液体とを前記貯留槽に注入して、前記第一絶縁性液体の層の上に前記第二絶縁性液体の層を形成させる注入工程(S2)を更に備え、
前記第1工程は、前記第二絶縁性液体中で前記液滴を形成させる工程であり、
前記第2工程は、前記一対の電極に前記所定時間直流電圧を印加して、前記第二絶縁性液体中で、前記液滴を往復移動させる工程であることを特徴とする請求項10から13のいずれかに記載の外来物質導入細胞の製造方法。 - 電気的作用によって細胞外から細胞内に外来物質を導入する外来物質導入装置(11、41、81)において、
外部からの物質供給が可能な開口部を有する貯留槽内に互いに離間して配置された場合に、水平面に交差する方向に延設され、且つ、直流電圧が印加された場合の仮想的な複数の電気力線の分布が局所的な集中を生じる形状に形成された一対の電極(15a、15b)を有する電極部(15)と、
前記電極部に、所定時間、直流電圧を印加して電界を発生させるよう構成された電界発生手段であって、絶縁性液体が貯留された前記貯留槽において、外来物質および細胞を含有し、前記絶縁性液体と混和しない細胞懸濁液を、前記一対の電極の間に供給することにより、前記絶縁性液体中に前記一対の電極の間隔よりも小径の前記細胞懸濁液の液滴を形成させた状態で、前記電極部に直流電圧を印加した場合に、前記一対の電極間に生じる電界によって、前記液滴を前記一対の電極のうちの前記液滴とは逆の極性を有する電極である逆極性電極に向かって移動させ、前記逆極性電極に前記液滴を接触させて前記液滴の移動方向の反転を引き起こすよう構成された電界発生手段(9)と
を備えることを特徴とする外来物質導入装置。
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