JPWO2014080766A1 - Nucleic acid linker - Google Patents
Nucleic acid linker Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2014080766A1 JPWO2014080766A1 JP2014548509A JP2014548509A JPWO2014080766A1 JP WO2014080766 A1 JPWO2014080766 A1 JP WO2014080766A1 JP 2014548509 A JP2014548509 A JP 2014548509A JP 2014548509 A JP2014548509 A JP 2014548509A JP WO2014080766 A1 JPWO2014080766 A1 JP WO2014080766A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- protein
- acid linker
- mrna
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 317
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 317
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 243
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 241
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 158
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 60
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 45
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 45
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 39
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 36
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 31
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 27
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 claims description 19
- 238000002060 fluorescence correlation spectroscopy Methods 0.000 claims description 18
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 16
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 238000003498 protein array Methods 0.000 claims description 8
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- RYSMHWILUNYBFW-GRIPGOBMSA-N 3'-amino-3'-deoxy-N(6),N(6)-dimethyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(N(C)C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N)[C@H]1O RYSMHWILUNYBFW-GRIPGOBMSA-N 0.000 claims description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 197
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 5
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 5
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 description 4
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- -1 antibodies Substances 0.000 description 2
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 102000021527 ATP binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011108 ATP binding proteins Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052866 Amino Acyl-tRNA Synthetases Human genes 0.000 description 1
- 108700028939 Amino Acyl-tRNA Synthetases Proteins 0.000 description 1
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical compound C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010085330 Estradiol Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101000638240 Mus musculus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100037601 P2X purinoceptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010085249 Purinergic P2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101150042244 SEC11A gene Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- LEKJTGQWLAUGQA-JVVVGQRLSA-N acetyl iodide Chemical group [11C](C)(=O)I LEKJTGQWLAUGQA-JVVVGQRLSA-N 0.000 description 1
- 239000002115 aflatoxin B1 Substances 0.000 description 1
- OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B1 Chemical compound C=1([C@@H]2C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 1
- 229930020125 aflatoxin-B1 Natural products 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000005311 autocorrelation function Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- VYVRIXWNTVOIRD-UHFFFAOYSA-N ciguatoxin Natural products O1C(C(C(C)C2OC3CC(C)CC4OC5(C)C(O)CC6OC7C=CC8OC9CC%10C(C(C%11OC(C=CCC%11O%10)C=CC(O)CO)O)OC9C=CC8OC7CC=CCC6OC5CC4OC3CC2O2)O)C2C(C)C(C)C21CC(O)CO2 VYVRIXWNTVOIRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000010379 pull-down assay Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
- G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
簡便に合成可能で、標識ペプチド又は標識タンパク質を迅速かつ簡単に調整できる核酸リンカーを提供する。本発明の核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなることを特徴とする。Provided is a nucleic acid linker which can be synthesized easily and can adjust a labeled peptide or labeled protein quickly and easily. The nucleic acid linker of the present invention is a nucleic acid linker for producing a complex of mRNA and a protein or peptide encoded by the mRNA, and a polynucleotide portion capable of hybridizing with at least a partial sequence of the mRNA. And an arm part having a linking part with the protein or peptide at the end thereof forms a single chain.
Description
本発明は、核酸リンカー、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法、核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、分子間相互作用解析方法、プレイタンパク質のスクリーニング方法に関する。
本願は、２０１２年１１月２１日に、日本に出願された特願２０１２−２５５７３７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。The present invention relates to a method for producing a nucleic acid linker, mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex, mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex, nucleic acid linker fragment- The present invention relates to a method for producing a protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex, a protein array or a peptide array, an intermolecular interaction analysis method, and a prey protein screening method.
This application claims priority on November 21, 2012 based on Japanese Patent Application No. 2012-255737 for which it applied to Japan, and uses the content here.
新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。 New functional proteins are expected to contribute to various bioapplication fields such as pharmaceuticals, detergents, food processing, R & D reagents, clinical analysis, bioenergy, biosensors, and so on.
新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であった。しかし、より有用なタンパク質を取得するためには、従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要がある。したがって、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。 When acquiring new functional proteins, protein engineering techniques designed by human knowledge from protein structure information have been the mainstream. However, in order to obtain a more useful protein, it is necessary to screen more efficiently than conventional methods. Therefore, an evolutionary molecular engineering technique that repeats random molecular structure modification and wrinkling of proteins is expected.
進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、前記核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。 The cDNA display method, which is one of the evolutionary molecular engineering methods, is a method of genotype-phenotype association. The nucleic acid linker is a protein (phenotype), mRNA encoding the same, reverse-transcribed cDNA. (Genotype). Since the mRNA / cDNA-protein conjugate structure is very stable, the use of the nucleic acid linker enabled screening in various environments.
ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。The cDNA display method is characterized by puromycin that is contained in a nucleic acid linker that links a protein and a polynucleotide encoding the protein (see Patent Document 1).
Puromycin is a protein synthesis inhibitor having a structure similar to the 3 ′ terminus of aminoacyl-tRNA, and specifically binds to the C terminus of a growing protein on a ribosome under certain conditions.
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いた有用タンパク質のスクリーニング方法は、以下の一連の工程を有する。
先ず、ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを連結させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成する。これにより、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
次いで、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを製造する。製造したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを製造する。
次いで、このｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを用いて、所望の機能をもつタンパク質を選択し、選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択した後でもよい（非特許文献２参照）。The useful protein screening method using the cDNA display method has the following series of steps.
First, a nucleic acid linker having puromycin and mRNA are linked, and a protein is synthesized from the mRNA using a cell-free translation system. As a result, a complex (mRNA-nucleic acid linker-protein complex) in which the synthesized protein and mRNA encoding the protein are bound via puromycin is generated (see Non-Patent Document 1).
A library of this mRNA-nucleic acid linker-protein complex is then produced. The prepared mRNA-nucleic acid linker-protein complex is reverse transcribed with reverse transcriptase to synthesize cDNA, thereby producing an mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex library.
Next, using this library of mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex, a protein having a desired function is selected, and the base sequence of cDNA in the selected mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex is analyzed. To identify the protein. The timing of reverse transcription may be after selecting a protein (see Non-Patent Document 2).
また、上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを基板上に固定したタンパク質チップは、網羅的解析により、短期間で機能タンパク質を取得するためのツールとして重要である。このような網羅的解析をするにあたり、アレイを構成する個々のタンパク質が、基板上に適当量固定されている必要がある。さらに、タンパク質相互作用解析の様に、高感度検出を必要とする繊細なアッセイを行う場合には、基板上のタンパク質が、蛍光分子等の所定量の標識物質によって、適切に標識されている必要がある。 A protein chip in which the library of the mRNA / cDNA-nucleic acid linker-protein complex is immobilized on a substrate is important as a tool for obtaining a functional protein in a short period of time by comprehensive analysis. In performing such a comprehensive analysis, it is necessary that an appropriate amount of each protein constituting the array is fixed on the substrate. Furthermore, when performing sensitive assays that require highly sensitive detection, such as protein interaction analysis, the protein on the substrate must be appropriately labeled with a predetermined amount of a labeling substance such as a fluorescent molecule. There is.
従来、タンパク質相互作用解析用に用いられるペプチドやタンパク質は、ペプチド固相合成法や大腸菌タンパク質発現系を利用することにより製造されてきた。しかし、ペプチド固相合成法においては、合成可能なアミノ酸残基数に限度があり、大腸菌発現系においては、精製タンパク質を得るまでの時間を要しているという問題点があった。また、タンパク質相互作用解析に用いられるペプチドやタンパク質は、数μｇ程度合成されれば足りるが、これらの製造方法によると、数ｍｇ程度合成され、無駄が多く、コスト面で難がある。 Conventionally, peptides and proteins used for protein interaction analysis have been produced by utilizing a peptide solid phase synthesis method or an E. coli protein expression system. However, in the peptide solid phase synthesis method, there is a limit to the number of amino acid residues that can be synthesized, and the E. coli expression system has a problem that it takes time to obtain a purified protein. Moreover, it is sufficient that about several μg of peptide or protein used for protein interaction analysis is synthesized. However, according to these production methods, about several mg is synthesized, which is wasteful and difficult in terms of cost.
これに対して、無細胞タンパク質合成系において、蛍光標識されたビオチン化ピューロマイシンを用いる方法が提案されている（非特許文献３参照）。この方法は、タンパク質合成の際に、ビオチン化ピューロマイシンを取り込ませることにより、自動的に合成タンパク質が蛍光標識される点で優れている。 On the other hand, a method using fluorescently labeled biotinylated puromycin in a cell-free protein synthesis system has been proposed (see Non-Patent Document 3). This method is excellent in that a synthetic protein is automatically fluorescently labeled by incorporating biotinylated puromycin during protein synthesis.
しかしながら、非特許文献３に記載された方法では、合成したタンパク質の精製の際に、合成に用いられなかったピューロマイシンを除く必要がある。
一例には、無細胞翻訳系において、ヒスチジンタグ融合タンパク質を合成した反応液をＲＮａｓｅで処理し、ヒスチジンタグ融合タンパク質精製用バッファーで透析した後、ニッケルカラムを用いてアフィニティー精製を行い、更にアビジン精製を行うことにより蛍光標識された精製タンパク質を得る。このように、非特許文献３に記載された方法では、精製工程が複雑であり、収率及び簡便性という点から難がある。However, in the method described in Non-Patent Document 3, it is necessary to remove puromycin that has not been used for synthesis when purifying the synthesized protein.
For example, in a cell-free translation system, a reaction solution in which a histidine tag fusion protein is synthesized is treated with RNase, dialyzed against a histidine tag fusion protein purification buffer, affinity purified using a nickel column, and further avidin purified. To obtain a fluorescent-labeled purified protein. Thus, in the method described in Non-Patent Document 3, the purification process is complicated, and there are difficulties in terms of yield and simplicity.
更に、従来の核酸リンカーは、構造が複雑であるため、より簡便に合成可能な単純化されたものが求められている。 Furthermore, since conventional nucleic acid linkers have a complicated structure, there is a demand for simplified nucleic acid linkers that can be synthesized more easily.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便に合成可能で、標識ペプチド又は標識タンパク質を迅速かつ簡単に調整できる核酸リンカーを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a nucleic acid linker that can be synthesized easily and can adjust a labeled peptide or labeled protein quickly and easily.
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーを一本鎖とすることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１１）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなることを特徴とする。In order to solve the above-described problems, the present inventors have conducted extensive research and found that the problem can be solved by using a single-stranded nucleic acid linker. One embodiment of the present invention provides the following (1) to (11).
(1) The nucleic acid linker in one embodiment of the present invention is a nucleic acid linker for producing a complex of mRNA and a protein or peptide encoded by the mRNA,
A polynucleotide portion capable of hybridizing to at least a partial sequence of the mRNA;
The arm portion having a terminal linking portion with the protein or peptide forms a single chain.
（２）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドと、を連結してなることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体は、先に記載の核酸リンカーを１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位で切断することにより生じる二つの断片のうち、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を含む断片と、前記タンパク質又はペプチドと、からなることを特徴とする。(2) The mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in one embodiment of the present invention comprises the mRNA and the protein encoded by the mRNA via the nucleic acid linker described above. Or it connects with a peptide, It is characterized by the above-mentioned.
(3) The nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex in one embodiment of the present invention is obtained by cleaving the nucleic acid linker described above at a single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or a photocleavage site. Of the two generated fragments, the fragment comprises a fragment containing a linking moiety with the protein or peptide, and the protein or peptide.
（４）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、を有することを特徴とする。 (4) The method for producing mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in one embodiment of the present invention is the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker described above. A method for producing a peptide complex, comprising: (a) annealing the mRNA and the nucleic acid linker; and (b) ligating the end of the mRNA and the end of the nucleic acid linker after the step (a). And (c) after the step (b), a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and the C of the protein or peptide is prepared. An mRNA-nucleus by binding the terminal and the linking portion of the nucleic acid linker with the protein or peptide Linker - protein complex or mRNA- nucleic acid linker - and having a step of producing a peptide complex, a.
（５）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカー、とをそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、を有することを特徴とする。 (5) The method for producing an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in one embodiment of the present invention is the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker described above. A method for producing a peptide complex, comprising: (a1) separately annealing a plurality of types of mRNA and a plurality of types of nucleic acid linkers having different types of labeling substances; and (b1) the step (a1) And ligating the ends of the plurality of types of mRNA and the ends of the plurality of types of nucleic acid linkers separately to produce a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes, respectively (c1) After the step (b1), the plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed to produce a cell-free protein. A protein or peptide is synthesized from the mRNA using a translation system, and the C-terminal of the protein or peptide and the linking portion of the nucleic acid linker with the protein or peptide are combined to produce a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein. And a step of producing a complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in the same reaction solution.
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ２）前記工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。 (6) The method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex according to one embodiment of the present invention is the method of the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex described above. (A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker; (b) ligating the end of the mRNA and the end of the nucleic acid linker after the step (a) A step of producing a nucleic acid linker complex, and (c) after step (b), a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and the C-terminus of the protein or peptide and the nucleic acid By linking the linker to the protein or peptide linking moiety, mRNA-nucleic acid linker-protein complex A body or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex, and (d2) after the step (c), by acting a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme, or by light irradiation, mRNA-nucleic acid linker- Cleaving the nucleic acid linker in the protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex at the single-stranded nucleic acid cleaving enzyme site or the photocleavage site, and (e2) the step (d2) And then purifying the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex from the cleavage product.
（７）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ３）前記工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。 (7) The method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex according to one embodiment of the present invention is the method of the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex described above. (A1) a step of separately annealing a plurality of types of mRNA and a plurality of types of nucleic acid linkers having different types of labeling substances, and (b1) after the step (a1), Ligating the ends of the plurality of types of mRNA and the ends of the plurality of types of nucleic acid linkers separately to produce each of a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes; and (c1) the step (b1) ) And then mixing the plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes, and using the cell-free protein translation system, the mR A protein or peptide is synthesized from A, and the C-terminal of the protein or peptide and the linking portion of the nucleic acid linker with the protein or peptide are combined to produce a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid. A step of producing a linker-peptide complex in the same reaction solution, and (d3) after the step (c1), by acting a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme or by light irradiation, a plurality of types of mRNA- Cleaving a nucleic acid linker in a nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex at the single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or the photocleavage site to obtain a plurality of types of cleavage products; (e3 ) After the step (d3), the plurality of types of nucleic acid linker fragments-protein complexes from the plurality of types of cleavage products And having a step of purifying the peptide complex, the - nucleic acid linker fragments.
（８）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とする。 (8) The protein array or peptide array in one embodiment of the present invention is characterized in that the protein complex or peptide complex described above is immobilized on a substrate.
（９）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体を標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体又はペプチド複合体との相互作用を解析することを特徴とする。 (9) In the molecular interaction analysis method according to one embodiment of the present invention, the protein complex or peptide complex described above is contacted with a target molecule, and the target molecule and the protein complex or peptide complex are contacted with each other. It is characterized by analyzing the interaction.
（１０）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記標識されたプレイタンパク質を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。 (10) The molecular interaction analysis method according to one embodiment of the present invention includes: (a) an immobilization step of immobilizing the protein or peptide complex on a solid phase as a bait protein; (B) a reaction step of reacting the bait protein with a labeled prey protein to generate a bait protein-prey protein conjugate, and (c) a detection step of detecting the labeled prey protein. It is characterized by that.
（１１）本発明の一実施態様におけるプレイタンパク質のスクリーニング方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記ベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を集める収集工程と、（ｄ）前記収集されたベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と、 を有することを特徴とする。 (11) A prey protein screening method according to an embodiment of the present invention includes: (a) an immobilization step of immobilizing the protein or peptide complex on a solid phase as a bait protein; b) a reaction step of reacting the bait protein with a labeled prey protein to produce a bait protein-prey protein conjugate; (c) a collecting step of collecting the bait protein-prey protein conjugate; And elution step of washing the collected bait protein-prey protein conjugate to elute the prey protein.
本発明によれば、ペプチド又はタンパク質を簡単に調整できる核酸リンカーが得られる。 According to the present invention, a nucleic acid linker capable of easily adjusting a peptide or protein is obtained.
≪核酸リンカー≫［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーである。本実施形態の核酸リンカーの構造について、図１を用いて説明する。
図１中、Ｐｕはピューロマイシン、ＡＴＣＧはＤＮＡ配列を示している。また、ｓｐｃ１８はアーム部分を構成するスペーサーを示し、ｒＧはＲＮＡ配列を示している。<< Nucleic acid linker >> [First embodiment]
The nucleic acid linker of this embodiment is a nucleic acid linker for producing a complex of mRNA and a protein or peptide encoded by the mRNA. The structure of the nucleic acid linker of this embodiment will be described with reference to FIG.
In FIG. 1, Pu represents puromycin and ATCG represents a DNA sequence. Spc18 represents a spacer constituting the arm portion, and rG represents an RNA sequence.
本実施形態の核酸リンカー２は、５’側にスクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分５１ａと、前記タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａを３’末端に有するアーム部分５１ｂと、を有し、これらが一本鎖を形成している。 The nucleic acid linker 2 of the present embodiment has a polynucleotide portion 51a capable of hybridizing with at least a partial sequence of mRNA 23 to be screened on the 5 ′ side and a linking portion 2a between the protein or peptide 33 at the 3 ′ end. Arm part 51b, and these form a single strand.
ポリヌクレオチド部分５１ａは、ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。
修飾ＤＮＡとしては、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど，当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。The polynucleotide portion 51a may be DNA or a nucleic acid derivative such as PNA (polynucleopeptide), and is preferably modified DNA imparted with nuclease resistance.
As the modified DNA, any modified DNA known in the art, such as DNA having an internucleoside bond such as phosphorothioate, DNA having a sugar modification such as 2′-fluoro, 2′-O-alkyl, etc. may be used. .
アーム部分５１ｂは、ｍＲＮＡ２３とタンパク質又はペプチドとの連結部分２ａとを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部分５１ｂの５’末端は、ポリヌクレオチド部分５１aの３’末端と結合し、アーム部分５１ｂの３’末端はタンパク質連結部分２ａを有する。 The arm portion 51b functions as a spacer that holds the mRNA 23 and the connecting portion 2a of the protein or peptide at a desired distance. The 5 'end of the arm portion 51b binds to the 3' end of the polynucleotide portion 51a, and the 3 'end of the arm portion 51b has a protein linking portion 2a.
従来の核酸リンカーにおいては、アーム部分の５’末端は、ポリヌクレオチド部分の３’末端から数塩基５’側の位置でポリヌクレオチド部分と結合し、Ｔ字型の構造を形成していた。スクリーニングすべきタンパク質をコードするｍＲＮＡを逆転写させる必要がある場合には、逆転写の際にポリヌクレオチド部分の３’末端がプライマーとして機能するからである。
しかしながら、本実施形態においては、ｍＲＮＡを逆転写させる必要がないため、ポリヌクレオチド部分５１aと、アーム部分５１ｂが連結して一本鎖を形成している。本実施形態の核酸リンカー２は、一本鎖という単純な構造を有しているため、従来の核酸リンカーと比較して容易に製造できる。In the conventional nucleic acid linker, the 5 ′ end of the arm portion is bonded to the polynucleotide portion at a position several bases 5 ′ from the 3 ′ end of the polynucleotide portion to form a T-shaped structure. This is because when it is necessary to reverse transcribe mRNA encoding the protein to be screened, the 3 ′ end of the polynucleotide portion functions as a primer during reverse transcription.
However, in this embodiment, since there is no need to reverse-transcribe mRNA, the polynucleotide portion 51a and the arm portion 51b are connected to form a single strand. Since the nucleic acid linker 2 of this embodiment has a simple structure of a single strand, it can be easily produced as compared with a conventional nucleic acid linker.
３’末端を除くアーム部分５１ｂは、標識物質２ｄを用いて標識されてもよい。標識物質２ｄとしては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
本実施形態においては、アーム部分５１ｂが、標識物質２ｄを、後述する切断部位２ｅ（１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位）よりも、タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａ側に有する。標識物質２ｄにより核酸リンカー２が標識される結果、タンパク質又はペプチド３３が標識物質２ｄで標識されたことになる。標識物質２ｄの分子数は合成により適宜変更することができるため、本実施形態によれば、例えば蛍光相関分光法に必要とされる蛍光１分子でラベル化されたペプチドやタンパク質を迅速かつ簡単に調整できる。The arm portion 51b excluding the 3 ′ end may be labeled with the labeling substance 2d. Examples of the labeling substance 2d include fluorescent dyes, fluorescent beads, quantum dots, biotin, antibodies, antigens, energy absorbing substances, radioisotopes, chemiluminescent substances, enzymes, and the like.
Fluorescent dyes include FAM (carboxyfluorescein), JOE (6-carboxy-4 ′, 5′-dichloro2 ′, 7′-dimethoxyfluorescein), FITC (fluorescein isothiocyanate), TET (tetrachlorofluorescein), HEX ( 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite), Cy3, Cy5, Alexa568, Alexa647 and the like.
In this embodiment, the arm part 51b has the labeling substance 2d on the side of the connecting part 2a to the protein or peptide 33 rather than the cleavage site 2e (single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or photocleavage site) described later. As a result of labeling the nucleic acid linker 2 with the labeling substance 2d, the protein or peptide 33 is labeled with the labeling substance 2d. Since the number of molecules of the labeling substance 2d can be appropriately changed by synthesis, according to the present embodiment, for example, a peptide or protein labeled with one fluorescent molecule required for fluorescence correlation spectroscopy can be quickly and easily obtained. Can be adjusted.
アーム部分５１ｂの３’末端にはタンパク質又はペプチド３３の連結部分２ａが存在する。タンパク質又はペプチド連結部分２ａとは、所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質又はペプチド３３のＣ末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質３３の連結部分２ａとしては、伸張中のタンパク質又はペプチド３３のＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）などのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
ＰＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ＡＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などを挙げることができる。The connecting portion 2a of the protein or peptide 33 is present at the 3 ′ end of the arm portion 51b. The protein or peptide linking moiety 2a means a structure having a property of specifically binding to the C-terminal of the extending protein or peptide 33 on the ribosome under a predetermined condition, and puromycin is representative.
Puromycin is a protein synthesis inhibitor having a structure similar to the 3 ′ end of aminoacyl-tRNA. As the linking portion 2a of the protein 33, any substance can be used as long as it has a function of specifically binding to the C-terminus of the extending protein or peptide 33. 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside ( A puromycin derivative such as PANS-amino acid) or 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside (AANS-amino acid) can be used.
Examples of the PANS-amino acids include PANS-Gly whose amino acid part is glycine, PANS-Val which is valine, PANS-Ala which is alanine, or a PANS-amino acid mixture whose amino acid part corresponds to all the respective amino acids.
Examples of the AANS-amino acid include AANS-Gly having an amino acid part of glycine, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, or an AANS-amino acid mixture in which the amino acid part corresponds to each amino acid of all amino acids.
Examples of aminoacyl tRNA 3 ′ terminal analogs that can be suitably used in addition to puromycin include ribocytidylpuromycin (rCpPur), deoxydylpuromycin (dCpPur), deoxyuridylpuromycin (dUpPur) and the like.
アーム部分５１ｂは、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。
アーム部分５１ｂにはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や、複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。The arm portion 51b may be composed of a nucleic acid or a nucleic acid derivative as long as it functions as a spacer, or may be composed of a polymer such as polyethylene glycol.
The arm portion 51b may be further modified with a modification for enhancing the stability of puromycin and a label for detecting the complex.
本実施形態の核酸リンカー２は、切断部位２ｅとして、１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位を、標識物質２ｄの結合位置よりも５’側に含む。切断部位２ｅで核酸リンカー２を切断することにより、タンパク質３３を分子間相互作用解析に用いる際に、標識物質２ｄが結合している部分のみを残し、立体障害を起こす可能性のある他の核酸部分を除外することができる。
１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。本実施形態においては、ＲＮａｓｅＴ１によって切断される部位としてｒＧが設けられている。
また、光切断性部位とは，紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいう。かかる基を用いたものとして、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）などが挙げられる。
光切断性部位としては、当該技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよい。The nucleic acid linker 2 of this embodiment includes a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme site or a photocleavage site 5 ′ from the binding position of the labeling substance 2d as the cleavage site 2e. By cleaving the nucleic acid linker 2 at the cleavage site 2e, when using the protein 33 for intermolecular interaction analysis, only the portion to which the labeling substance 2d is bound remains, and other nucleic acids that may cause steric hindrance Part can be excluded.
The single-stranded nucleic acid cleaving enzyme cleavage site refers to a nucleic acid group that can be cleaved by a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme such as deoxyribonuclease and ribonuclease, and includes nucleotides and derivatives thereof. In this embodiment, rG is provided as a site cleaved by RNase T1.
The photocleavable site means a group having a property of being cleaved when irradiated with light such as ultraviolet rays. Examples of the group using such a group include PC Linker Phosphoramidite (Glen research), a composition for photocleavage of nucleic acid containing fullerene (composition for photocleavage of nucleic acid: JP-A-2005-245223), and the like. It is done.
As the photocleavable site, any group that is commercially available or known in the art may be used.
本実施形態の核酸リンカー２は、ｍＲＮＡ２３の３’末端側との結合部位２ｆを、ポリヌクレオチド部分５１ａの５’末端側に有する。結合部位２ｆは、核酸リンカー２の末端側とｍＲＮＡ２３の末端側とをライゲーション又はハイブリダイズ可能な部位であれば特に限定されないが、図１に示すように、ｍＲＮＡ２３の塩基と相補的な塩基からなるもの（例えば、ｍＲＮＡ２３の３’末端がｐｏｌｙＡである場合には、ｐｏｌｙＡと相補的な塩基であるｐｏｌｙＴ）であることが好ましい。
結合部位２ｆを有することにより、核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３との結合の安定度を増すことができる。The nucleic acid linker 2 of the present embodiment has a binding site 2f to the 3 ′ end side of the mRNA 23 on the 5 ′ end side of the polynucleotide portion 51a. The binding site 2f is not particularly limited as long as it can ligate or hybridize the terminal side of the nucleic acid linker 2 and the terminal side of the mRNA 23. As shown in FIG. 1, the binding site 2f consists of a base complementary to the base of the mRNA 23. For example, when the 3 ′ end of mRNA 23 is polyA, it is preferably polyT that is a base complementary to polyA.
By having the binding site 2f, the stability of binding between the nucleic acid linker 2 and the mRNA 23 can be increased.
本実施形態の核酸リンカー２は、一本鎖という単純な構造を有しているため、従来の核酸リンカーと比較して容易に製造できる。このため、この核酸リンカーを用いることにより、ペプチド又はタンパク質を迅速かつ簡単に調整できる。更に、本実施形態の核酸リンカー２は、アーム部分５１ｂを標識物質２ｄにより標識可能である。また、標識物質２ｄの分子数を合成により適宜変更可能である。従って、本実施形態によれば、例えば蛍光相関分光法に必要とされる蛍光１分子でラベル化されたペプチドやタンパク質を迅速かつ簡単に調整できる。 Since the nucleic acid linker 2 of this embodiment has a simple structure of a single strand, it can be easily produced as compared with a conventional nucleic acid linker. For this reason, a peptide or protein can be prepared quickly and easily by using this nucleic acid linker. Furthermore, the nucleic acid linker 2 of the present embodiment can label the arm portion 51b with the labeling substance 2d. Further, the number of molecules of the labeling substance 2d can be appropriately changed by synthesis. Therefore, according to this embodiment, for example, a peptide or protein labeled with one fluorescent molecule required for fluorescence correlation spectroscopy can be quickly and easily adjusted.
［第２実施形態］
本実施形態の核酸リンカー１２の構造について、図２を用いて説明する。
図２において、図１の核酸リンカー２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。[Second Embodiment]
The structure of the nucleic acid linker 12 of this embodiment will be described with reference to FIG.
In FIG. 2, the same components as those shown in the schematic diagram of the nucleic acid linker 2 of FIG.
本実施形態の核酸リンカー１２は、第１実施形態と同様に、５’側にスクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分５１ａと、前記タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａを３’末端に有するアーム部分５１ｂ’と、を有し、これらが一本鎖を形成している。また、アーム部分とポリヌクレオチド部分とがホスホジエステル結合により連結している。
本実施形態においては、アーム部分５１ｂ’が、核酸又は核酸誘導体のみからなる。即ち、本実施形態の核酸リンカー１２は、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体がホスホジエステル結合のみにより連結されてなる。本実施形態の核酸リンカー１２は、核酸又は核酸誘導体のみの一本鎖から構成されているため、第１実施形態に加えて、更に容易に製造することができる。As in the first embodiment, the nucleic acid linker 12 of this embodiment is a linkage between the polynucleotide or 51a that can hybridize to at least a partial sequence of mRNA 23 to be screened on the 5 ′ side and the protein or peptide 33. And an arm portion 51b ′ having a portion 2a at the 3 ′ end, which form a single strand. Further, the arm portion and the polynucleotide portion are linked by a phosphodiester bond.
In this embodiment, arm part 51b 'consists only of a nucleic acid or a nucleic acid derivative. That is, the nucleic acid linker 12 of this embodiment is formed by connecting nucleotides or nucleotide derivatives only by phosphodiester bonds. Since the nucleic acid linker 12 of this embodiment is composed of only a single strand of nucleic acid or nucleic acid derivative, it can be more easily produced in addition to the first embodiment.
≪ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体及びその製造方法≫
［第１実施形態］
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体は、本実施形態の核酸リンカーを用いて製造される。
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を作製する工程と、を有することを特徴とする。
以下、図３を用いて各工程について説明する。<< mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex and method for producing the same >>
[First Embodiment]
The mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex of this embodiment is produced using the nucleic acid linker of this embodiment.
The production method of the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex of this embodiment includes (a) a step of annealing the mRNA and the nucleic acid linker, and (b) the step (a). Thereafter, the step of ligating the end of the mRNA and the end of the nucleic acid linker to produce an mRNA-nucleic acid linker complex, and (c) after step (b), using a cell-free protein translation system A protein or peptide is synthesized from the mRNA, and a C-terminal of the protein or peptide is joined to a linking portion of the nucleic acid linker with the protein or peptide, so that an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker- And a step of producing a peptide complex.
Hereinafter, each process is demonstrated using FIG.
工程（ａ）において、ｍＲＮＡ２３と核酸リンカー２とをアニールさせる。まず、工程（ａ）に用いられるｍＲＮＡの調製について説明する。
ｍＲＮＡ２３は、スクリーニングすべきタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを調製し、そのＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、標的分子との結合に関して調べたい任意のＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを利用することができる。例えば、サンプル組織から得たｃＤＮＡライブラリー、配列をランダムに合成したＤＮＡライブラリー、配列の一部を変異させたＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
作製されるタンパク質又はペプチドを精製しやすいように、ＰＣＲ等で予めＤＮＡの末端にポリヒスチジンやＦＬＡＧ等のタグをコードする塩基配列を付加しておくことが好ましい。In step (a), mRNA 23 and nucleic acid linker 2 are annealed. First, preparation of mRNA used in step (a) will be described.
The mRNA 23 is obtained by preparing DNA encoding a protein or peptide to be screened and transcribe the DNA with RNA polymerase. Examples of the RNA polymerase include T7 RNA polymerase.
As the DNA, any DNA or DNA library to be examined for binding to a target molecule can be used. For example, a cDNA library obtained from a sample tissue, a DNA library obtained by randomly synthesizing a sequence, a DNA library obtained by mutating a part of the sequence, and the like can be used.
In order to facilitate purification of the produced protein or peptide, it is preferable to add a base sequence encoding a tag such as polyhistidine or FLAG to the end of the DNA in advance by PCR or the like.
次にｍＲＮＡ２３の３’末端領域と核酸リンカー２の５’末端領域とをアニールさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡ２３を変性させた後、１時間かけて２５℃まで冷却することによりｍＲＮＡ２３が核酸リンカー２に確実にハイブリダイズされる。 Next, the 3 'end region of mRNA 23 and the 5' end region of nucleic acid linker 2 are annealed. For example, the mRNA 23 is reliably hybridized to the nucleic acid linker 2 by heating to 90 ° C. to denature the mRNA 23 and then cooling to 25 ° C. over 1 hour.
次に工程（ｂ）において、前記工程（ａ）の後、ｍＲＮＡ２３の３’末端と核酸リンカー２の５’末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する。
ライゲーションに際し、前記ｍＲＮＡの３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。Next, in the step (b), after the step (a), the 3 ′ end of the mRNA 23 and the 5 ′ end of the nucleic acid linker 2 are ligated to produce an mRNA-nucleic acid linker complex.
At the time of ligation, it is necessary to phosphorylate the 3 ′ end of the mRNA using an enzyme such as T4 polynucleotide kinase. As an enzyme used for ligation, RNA ligase is preferable, and for example, T4 RNA ligase can be mentioned.
次に工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡ２３からタンパク質又はペプチド３３を合成し、タンパク質又はペプチド３３のＣ末端と核酸リンカー２のタンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａとを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を作製する。 Next, in the step (c), after the step (b), a protein or peptide 33 is synthesized from the mRNA 23 using a cell-free protein translation system, and the protein or peptide of the C-terminal of the protein or peptide 33 and the nucleic acid linker 2 The linking portion 2a to 33 is bound to prepare an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or an mRNA-nucleic acid linker-peptide complex.
無細胞タンパク質翻訳系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。
このような系を用いることにより、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体が製造される。A cell-free protein translation system is a protein translation system composed of components having the ability to synthesize proteins extracted from appropriate cells. This system includes ribosomes, translation initiation factors, translation elongation factors, dissociation factors, aminoacyl tRNA synthetases. Etc., and elements necessary for translation are included. Examples of such protein translation systems include Escherichia coli extract, rabbit reticulocyte extract, and wheat germ extract.
Furthermore, there is a reconstituted cell-free protein synthesis system in which elements necessary for translation consist only of independently purified factors. Since the reconstituted cell-free protein synthesis system can more easily prevent nuclease and protease from being mixed than when a conventional cell extract is used, translation efficiency can be improved.
By using such a system, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex is produced.
［第２実施形態］
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカー、とをそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程、を有する。[Second Embodiment]
The production method of mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex of this embodiment includes (a1) plural kinds of mRNA and plural kinds of nucleic acid linkers having different kinds of labeling substances, Respectively, and (b1) after the step (a1), the ends of the plurality of types of mRNA and the ends of the plurality of types of nucleic acid linkers are separately ligated to form a plurality of types of mRNA- A step of separately producing a nucleic acid linker complex, and (c1) after the step (b1), the plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed, and a protein is produced from the mRNA using a cell-free protein translation system. Alternatively, a peptide is synthesized, and the C-terminal of the protein or peptide and the protein of the nucleic acid linker It is coupled to the coupling portion between the peptide, a plurality of types of mRNA- nucleic acid linker - having step of producing peptide complex in the same reaction solution, the - protein complex or mRNA- nucleic acid linker.
上述した第１実施形態におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法によれば、ｍＲＮＡから翻訳したタンパク質又はペプチドのＣ末にピューロマイシンを含む核酸リンカーが結合することにより、蛍光色素等の標識物質を導入することができる。
かかる方法は、タンパク質又はペプチドと標的分子の相互作用を、例えば蛍光色素を使用して測定する際に非常に有用な標識方法を提供するものである。
更に、本実施形態におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、上記蛍光色素を使用して分子間相互作用を解析する場合において、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）を使用するときに、有用性を発揮する。
以下、図４を用いて各工程について説明する。According to the method for producing the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in the first embodiment described above, the nucleic acid linker containing puromycin binds to the C terminus of the protein or peptide translated from mRNA. By doing so, a labeling substance such as a fluorescent dye can be introduced.
Such a method provides a very useful labeling method when measuring the interaction between a protein or peptide and a target molecule, for example, using a fluorescent dye.
Furthermore, in the production method of the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in the present embodiment, when analyzing the intermolecular interaction using the fluorescent dye, fluorescence correlation spectroscopy ( This is useful when using Fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
Hereinafter, each process is demonstrated using FIG.
本実施形態においては、簡略化のため２種類のｍＲＮＡ５３，６３と、互いに異なる種類の標識物質２２ｄ，３２ｄを有する２種類の核酸リンカー２２，３２について説明する。
工程（ａ１）は、２種類のｍＲＮＡ５３，６３と、互いに異なる種類の標識物質２２ｄ，３２ｄを有する２種類の核酸リンカー２２，３２とを、それぞれ別の反応容器中に用意し、別個にアニールさせる工程である。
用いられる標識物質としては、蛍光色素が好ましく、例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。In the present embodiment, for simplification, two types of nucleic acid linkers 22 and 32 having two types of mRNAs 53 and 63 and different types of labeling substances 22d and 32d will be described.
In the step (a1), two types of mRNAs 53 and 63 and two types of nucleic acid linkers 22 and 32 having different types of labeling substances 22d and 32d are prepared in separate reaction vessels, and are annealed separately. It is a process.
The labeling substance used is preferably a fluorescent dye, for example, FAM (carboxyfluorescein), JOE (6-carboxy-4 ′, 5′-dichloro2 ′, 7′-dimethoxyfluorescein), FITC (fluorescein isothiocyanate), TET (tetrachlorofluorescein), HEX (5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite), Cy3, Cy5, Alexa568, Alexa647, etc. are mentioned.
工程（ｂ１）は、前記工程（ａ１）の後、ｍＲＮＡ５３，６３の３’末端と核酸リンカー２２，３２の５’末端とをライゲーションさせて、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程である。ライゲーションの詳細については、第１実施形態の工程（ｂ）と同様である。工程（ｂ１）により、例えば、Ａ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体とＢ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体がそれぞれ別個に製造される。 In the step (b1), after the step (a1), the 3 ′ ends of the mRNAs 53 and 63 and the 5 ′ ends of the nucleic acid linkers 22 and 32 are ligated to individually separate the two types of mRNA-nucleic acid linker complexes. It is a manufacturing process. The details of the ligation are the same as in step (b) of the first embodiment. By the step (b1), for example, an mRNA-nucleic acid linker complex to which an A-color fluorescent dye is bound and an mRNA-nucleic acid linker complex to which a B-color fluorescent dye is bound are separately produced.
工程（ｃ１）は、前記工程（ｂ１）の後、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いてｍＲＮＡ５３，６３からタンパク質又はペプチド１３３，２３３を合成し、タンパク質又はペプチド１３３，２３３のＣ末端と核酸リンカー２２，３２のタンパク質又はペプチドとの連結部分２２ａ，３２ａとを各々結合させて、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程である。
無細胞タンパク質翻訳系の詳細については、第１実施形態の工程（ｃ）と同様である。
工程（ｃ１）により、例えば、Ａ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体とＢ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体が同一反応液中に製造される。
蛍光色素を使用して、分子間相互作用等を解析する場合、数種類のタンパク質分子又はペプチド分子に、それぞれ異なる色の蛍光標識をそれぞれ施すことにより、同時に数種類の分子における分子間相互作用等の解析が可能となる。
本実施形態においては、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造することにより、この反応混合液を、その後の分子間相互作用解析に用いることができる。
本実施形態によれば、複数種類のタンパク質分子又はペプチド分子に比較的容易に、様々な色の蛍光標識を、簡便に、確実に標識できる。In step (c1), after step (b1), two kinds of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed, and a protein or peptide 133, 233 is synthesized from mRNA 53, 63 using a cell-free protein translation system. Alternatively, two kinds of mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide are prepared by binding the C-terminal of peptides 133 and 233 and the connecting portions 22a and 32a of the protein or peptide of nucleic acid linker 22 and 32, respectively. In this step, the complex is produced in the same reaction solution.
The details of the cell-free protein translation system are the same as in step (c) of the first embodiment.
In step (c1), for example, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex to which an A-color fluorescent dye is bound or an mRNA-nucleic acid linker-protein complex to which an mRNA-nucleic acid linker-peptide complex and a B-color fluorescent dye are bound. Alternatively, mRNA-nucleic acid linker-peptide complex is produced in the same reaction solution.
When analyzing intermolecular interactions using fluorescent dyes, analysis of intermolecular interactions among several types of molecules at the same time by applying fluorescent labels of different colors to several types of protein molecules or peptide molecules. Is possible.
In the present embodiment, two types of mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex are produced in the same reaction solution, and this reaction mixture is subjected to subsequent intermolecular interaction analysis. Can be used.
According to this embodiment, fluorescent labels of various colors can be easily and reliably labeled on a plurality of types of protein molecules or peptide molecules relatively easily.
≪核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法≫
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体は、核酸リンカーを１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位で切断することにより生じる二つの断片のうち、タンパク質又はペプチドとの連結部分を含む断片と、タンパク質又はペプチドと、からなる。かかる核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法としては、特に限定されないが、好ましい実施形態について以下、説明する。<< Method for Producing Nucleic Acid Linker Fragment-Protein Complex or Nucleic Acid Linker Fragment-Peptide Complex >>
The nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex of this embodiment is a protein or peptide of two fragments generated by cleaving a nucleic acid linker at a single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or a photocleavage site. And a protein or peptide. A method for producing such a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex is not particularly limited, but preferred embodiments will be described below.
［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ２）前記工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有する。
以下、図５を用いて各工程について説明するが、図５において、図３のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。[First Embodiment]
The method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex of the present embodiment includes (a) a step of annealing the mRNA and the nucleic acid linker, and (b) after the step (a). Ligating the end of the mRNA and the end of the nucleic acid linker to produce an mRNA-nucleic acid linker complex, and (c) after the step (b), using the cell-free protein translation system, the mRNA. A protein or peptide is synthesized, and the C-terminal of the protein or peptide and the linking portion of the nucleic acid linker with the protein or peptide are bound together to produce an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex. And (d2) after the step (c), a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme is allowed to act. Or by light irradiation, the nucleic acid linker in the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex is cleaved at the single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or the photocleavage site. And (e2) after the step (d2), purifying the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex from the cleavage product.
Hereinafter, each step will be described with reference to FIG. 5. In FIG. 5, the steps shown in the schematic diagram of the method for producing the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex of FIG. The same components are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
工程（ａ）〜工程（ｃ）は、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の第１実施形態の工程と同様である。
工程（ｄ２）は、工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカー２を、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程である。Step (a) to step (c) are the same as the steps of the first embodiment of the method for producing the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex.
In the step (d2), after the step (c), in the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex by acting a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme or by light irradiation, In this step, the nucleic acid linker 2 is cleaved at the single-stranded nucleic acid cleaving enzyme site or the photocleavage site to obtain a cleaved product.
工程（ｄ２）における１本鎖核酸切断酵素の作用方法は、ＲＮａｓｅＴ１等の酵素の至適ｐＨ、至適温度等を考慮して定法に従った方法が挙げられる。
また、光照射方法としては、紫外線等の光切断部位を切断し得る波長の光を照射する方法が挙げられる。
ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断することにより、切断産物として、タンパク質又はペプチド３３との連結部分を含む断片（核酸リンカー断片６６）とタンパク質又はペプチド３３とからなる核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体、及び、切断部位より５’末端側の核酸リンカー断片（その他の核酸リンカー断片６８）とｍＲＮＡ２３との複合体が得られる。Examples of the action method of the single-stranded nucleic acid cleaving enzyme in the step (d2) include a method according to a conventional method in consideration of the optimum pH, the optimum temperature and the like of an enzyme such as RNase T1.
Moreover, as a light irradiation method, the method of irradiating the light of the wavelength which can cut | disconnect light cutting parts, such as an ultraviolet-ray, is mentioned.
By cleaving the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex at the single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or the photocleavage site, the ligation part of the protein or peptide 33 is obtained as a cleavage product. A nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex comprising a fragment (nucleic acid linker fragment 66) and a protein or peptide 33, and a nucleic acid linker fragment (other nucleic acid linkers on the 5 ′ end side from the cleavage site) A complex of fragment 68) and mRNA 23 is obtained.
工程（ｅ２）は、前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程である。
工程（ｅ２）において、切断産物として存在する、切断部位より５’末端側の核酸リンカー断片（その他の核酸リンカー断片６８）とｍＲＮＡとの複合体、及び、前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体とから、核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体のみを精製する。切断産物中には、複合体を形成しなかったフリーのｍＲＮＡや核酸リンカーの切断産物も含まれるため、精製により、併せてこれらも除去する。Step (e2) is a step of purifying the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex from the cleavage product after the step (d2).
In step (e2), a complex of a nucleic acid linker fragment (other nucleic acid linker fragment 68) at the 5 ′ end side of the cleavage site and mRNA, which is present as a cleavage product, and the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid Only the nucleic acid linker fragment-protein complex or the nucleic acid linker fragment-peptide complex is purified from the linker fragment-peptide complex. Since the cleavage products include free mRNA that did not form a complex and cleavage products of the nucleic acid linker, these are also removed together by purification.
精製方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン精製交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等、クロマトグラフィーを用いた精製方法が挙げられる。中でも、簡便且つ精製効率が高いという観点から、アフィニティークロマトグラフィーを用いた精製方法が好ましい。
アフィニティークロマトグラフィーとしては、スクリーニングすべきｍＲＮＡがコードするタンパク質又はペプチドを構成するアミノ酸配列に応じて適宜選択される。ｍＲＮＡに、ポリヒスチジンやＦＬＡＧ等のタグをコードする塩基配列が付加されている場合には、これらのタグ配列に親和性を示す物質を用いることができる。例えば、スクリーニングすべきｍＲＮＡがポリヒスチジンをコードする塩基配列を有している場合には、ニッケルカラムやコバルトカラムを用いることができる。ここで、ニッケルカラムやコバルトカラムを用いる場合には、カラムにキレートしているニッケルやコバルトの脱離を防止するために、透析等、バッファー交換を行い予め切断産物から還元剤を除いておくことが好ましい。
また、精製方法としては、樹脂担体をそのまま用いたバッチ精製法でもよい。
工程（ｅ２）により、核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体が得られる。これら複合体は、三次元構造を形成することによりアプタマーとして機能するおそれのあるｍＲＮＡを排除してあるため、分子間相互作用解析に好適に用いられる。Examples of the purification method include purification methods using chromatography, such as affinity chromatography, ion purification exchange chromatography, gel filtration chromatography and the like. Of these, a purification method using affinity chromatography is preferred from the viewpoint of simplicity and high purification efficiency.
The affinity chromatography is appropriately selected according to the amino acid sequence constituting the protein or peptide encoded by the mRNA to be screened. When a base sequence encoding a tag such as polyhistidine or FLAG is added to mRNA, a substance showing affinity for these tag sequences can be used. For example, when the mRNA to be screened has a base sequence encoding polyhistidine, a nickel column or a cobalt column can be used. Here, when a nickel column or cobalt column is used, in order to prevent the elimination of nickel or cobalt chelating to the column, the reducing agent is removed from the cleavage product in advance by exchanging the buffer such as dialysis. Is preferred.
The purification method may be a batch purification method using the resin carrier as it is.
By the step (e2), a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex is obtained. Since these complexes exclude mRNAs that may function as aptamers by forming a three-dimensional structure, they are suitably used for intermolecular interaction analysis.
［第２実施形態］
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ３）前記工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有する。
以下、図６を用いて各工程について説明するが、図６において、図４のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。[Second Embodiment]
The method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex of this embodiment comprises: (a1) a plurality of types of mRNA and a plurality of types of nucleic acid linkers having different types of labeling substances; (B1) After the step (a1), a plurality of types of mRNA-nucleic acid linkers are prepared by separately ligating the ends of the plurality of types of mRNA and the ends of the plurality of types of nucleic acid linkers. A step of separately producing the complex, and (c1) after the step (b1), the plural types of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed, and a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system. And the protein or peptide of the protein or peptide and the nucleic acid linker of the protein or peptide A step of producing a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complexes or mRNA-nucleic acid linker-peptide complexes in the same reaction solution, and (d3) after the step (c1) Nucleic acid linkers in a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complexes or mRNA-nucleic acid linker-peptide complexes are allowed to act on the single-stranded nucleic acid by acting a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme or by light irradiation. A step of obtaining a plurality of types of cleavage products by cleaving at a cleavage enzyme site or the photocleavage site; and (e3) after the step (d3), the plurality of types of nucleic acid linker fragments-protein complexes from the plurality of types of cleavage products. Or purifying the nucleic acid linker fragment-peptide complex.
Hereinafter, each step will be described with reference to FIG. 6. In FIG. 6, the steps shown in the schematic diagram of the method for producing the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex of FIG. The same components are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
工程（ａ１）〜工程（ｃ１）は、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の第２実施形態の工程と同様である。
工程（ｄ３）は、工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程である。Step (a1) to step (c1) are the same as the steps of the second embodiment of the method for producing the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex.
In the step (d3), after the step (c1), a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme is allowed to act, or by light irradiation, in the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex. In this step, a nucleic acid linker is cleaved at the single-stranded nucleic acid cleaving enzyme site or the photocleavage site to obtain a cleavage product.
工程（ｄ３）における１本鎖核酸切断酵素の作用方法及び光照射方法は、第１実施形態における工程（ｄ２）におけるものと同様である。
工程（ｄ３）により、例えば、Ａ色の蛍光色素又はＢ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断することにより、切断産物として、タンパク質又はペプチドとの連結部分を含む断片（核酸リンカー断片１６６，２６６）と、タンパク質又はペプチド１３３，２３３と、からなるＡ色の蛍光色素又はＢ色の蛍光色素が結合した核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体、及び、切断部位より５’末端側の核酸リンカー断片（その他の核酸リンカー断片１６８，２６８）とｍＲＮＡ５３，６３との複合体を一度に得られる。The method of action of the single-stranded nucleic acid cleaving enzyme and the light irradiation method in the step (d3) are the same as those in the step (d2) in the first embodiment.
By the step (d3), for example, an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex to which an A-color fluorescent dye or a B-color fluorescent dye is bound is converted into a single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or the above-mentioned By cleaving at the photocleavage site, as a cleavage product, a fluorescent dye of color A or B comprising a fragment (nucleic acid linker fragment 166, 266) containing a protein or peptide linking moiety and a protein or peptide 133, 233 Nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex to which a color fluorescent dye is bound, and a nucleic acid linker fragment (other nucleic acid linker fragments 168, 268) on the 5 ′ end side from the cleavage site and mRNA 53, 63 A complex with can be obtained at once.
工程（ｅ３）は、前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程である。
工程（ｅ３）における精製方法は、第１実施形態における工程（ｅ２）におけるものと同様である。
工程（ｅ３）により、例えば、Ａ色の蛍光色素又はＢ色の蛍光色素が結合した核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体が一度に得られる。
これら複合体は、三次元構造を形成することによりアプタマーとして機能するおそれのあるｍＲＮＡを排除してあるため、これら複合体をそのまま分子間相互作用解析に供することができる。Step (e3) is a step of purifying the plurality of types of nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex from the plurality of types of cleavage products after the step (d3).
The purification method in the step (e3) is the same as that in the step (e2) in the first embodiment.
By the step (e3), for example, a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex to which an A color fluorescent dye or a B color fluorescent dye is bound is obtained at a time.
Since these complexes exclude mRNAs that may function as aptamers by forming a three-dimensional structure, these complexes can be directly subjected to intermolecular interaction analysis.
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイ≫
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、上述したタンパク質複合体又はペプチド複合体をマイクロアレイ基板上に固定化されてなるものである。用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。本実施形態のタンパク質複合体又はペプチド複合体に、固相結合部位を設け、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、タンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化する。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、スクシンイミジル基等の活性エステル基／アミノ基、ヨウ化アセチル基／アミノ基、マレイミド基／チオール基（‐ＳＨ）、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、使い勝手の良さからストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。≪Protein array or peptide array≫
The protein array or peptide array of this embodiment is formed by immobilizing the above-described protein complex or peptide complex on a microarray substrate. Examples of the substrate used include a glass substrate, a silicon substrate, a plastic substrate, and a metal substrate. The protein complex or peptide complex of the present embodiment is provided with a solid phase binding site, and the protein complex is converted using the binding between the solid phase binding site and the solid phase binding site recognition site bound to the substrate. Immobilize on the microarray substrate.
Such combinations of solid phase binding sites / solid phase binding site recognition sites include biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin / biotin, active ester groups such as succinimidyl groups / amino groups, acetyl iodide groups / amino groups, Maleimide group / thiol group (-SH), maltose binding protein / maltose, G protein / guanine nucleotide, polyhistidine peptide / metal ions such as nickel or cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione, DNA binding protein / DNA, antibody / Various receptor proteins such as antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin-binding peptide, ATP-binding protein / ATP, or estradiol receptor protein / estradiol Such as soil and the like.
Among these, combinations of solid phase binding site / solid phase binding site recognition site include biotin binding protein / biotin such as avidin and streptavidin, maltose binding protein / maltose, polyhistidine peptide / nickel or metal ions such as cobalt Glutathione-S-transferase / glutathione, antibody / antigen molecule (epitope) and the like are preferable, and a combination of streptavidin / biotin is most preferable in terms of ease of use.
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法である。固相がスチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。 In addition, the said combination can also be used by reversing a solid-phase binding site and a solid-phase binding site recognition site. The immobilization means is an immobilization method using two substances having affinity for each other. If the solid phase is a plastic material such as a styrene substrate, a part of the linker can be directly covalently bonded to the solid phase using a known method as necessary (see Qiagen, LiquidChip Applications Handbook, etc.). ).
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイが、上述した核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を固相に固定したものである場合には、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を切断する際、切断除去されるｍＲＮＡを別途回収して、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ上の各スポットの遺伝情報を集積しておく必要がある。固相の例として、ビーズや基板が挙げられる。
なお、核酸リンカー−タンパク質複合体又は核酸リンカー−ペプチド複合体を固相に固定する場合には、固相結合部位は核酸リンカーのポリヌクレオチド部分またはアーム部分に設けてもよい。When the protein array or peptide array of the present embodiment is the above-described nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex immobilized on a solid phase, a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme is allowed to act. When the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex is cleaved by light irradiation, the cleaved and removed mRNA is separately collected, and each protein array or peptide array It is necessary to accumulate genetic information of spots. Examples of the solid phase include beads and a substrate.
When the nucleic acid linker-protein complex or the nucleic acid linker-peptide complex is immobilized on the solid phase, the solid phase binding site may be provided in the polynucleotide portion or arm portion of the nucleic acid linker.
≪分子間相互作用解析方法≫
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を用いて、標的分子との相互作用を解析することができる。また、本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を用いて、標的分子との相互作用を解析することができる。「標的分子」とは、本実施形態において合成されるタンパク質又はペプチドと相互作用するか否かを調べるための物質を意味し、有機化合物、無機化合物、あるいはこれらの複合体を示し、一例として、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等が挙げられる。
この際、餌となるタンパク質側を「ベイト（ｂａｉｔ）」といい、釣られるタンパク質側を「プレイ（ｐｒｅｙ、餌食）」という。ここで、ベイトタンパク質（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）としては、所望のタンパク質を使用することができる。また、プレイタンパク質（ｐｒｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）としては、例えば、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれることが好ましく、サバイビンモノマー又はサバイビンダイマーであることが、特に好ましい。ここで、上記「低分子化合物」とは、分子量３０〜１，５００の範囲にある化合物をいい、糖鎖の有無を問わない。例えば、アフラトキシンＢ１、シガトキシン、フルオロセイン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等を挙げることができる。たとえば、標識したプレイタンパク質（例として蛍光標識したプレイタンパク質）とタンパク質複合体又はペプチド複合体を反応させ、結合体を生成し、標識したプレイタンパク質を検出することで、その結合体の相互作用を解析することができる。≪Intermolecular interaction analysis method≫
The interaction with the target molecule can be analyzed using the nucleic acid linker fragment-protein complex or the nucleic acid linker fragment-peptide complex of the present embodiment. In addition, the interaction with the target molecule can be analyzed using the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex of the present embodiment. The “target molecule” means a substance for examining whether or not it interacts with the protein or peptide synthesized in this embodiment, and indicates an organic compound, an inorganic compound, or a complex thereof. Examples include proteins, peptides, nucleic acids, and low molecular weight compounds.
At this time, the protein side serving as a bait is referred to as “bait”, and the protein side to be caught is referred to as “play”. Here, a desired protein can be used as the bait protein. The play protein is preferably selected from the group consisting of survivin monomer, survivin dimer, and low molecular weight compound, and particularly preferably survivin monomer or survivin dimer. Here, the “low molecular weight compound” refers to a compound having a molecular weight in the range of 30 to 1,500, regardless of the presence or absence of sugar chains. For example, aflatoxin B1, ciguatoxin, fluorescein, N-acetyl-D-glucosamine and the like can be mentioned. For example, by reacting a labeled prey protein (eg, fluorescently labeled prey protein) with a protein complex or peptide complex to form a conjugate, and detecting the labeled prey protein, the interaction of the conjugate can be determined. Can be analyzed.
分子間相互作用を測定する手法としては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）等が挙げられ、蛍光相関分光法を用いることが好ましい。 Methods for measuring intermolecular interactions include fluorescence resonance energy transfer (FRET method), evanescent field molecular imaging method, fluorescence imaging analysis method, solid-phase enzyme immunoassay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)), fluorescence depolarization Method, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), and the like, and it is preferable to use fluorescence correlation spectroscopy.
蛍光相関分光法は、蛍光分子が微小な焦点領域を出入りする際に生じる「蛍光強度のゆらぎ」を解析することで、その蛍光分子の持つ「動き」と「数」という動的な情報を得ることができる方法である。
本実施形態のタンパク質複合体又はペプチド複合体は、蛍光１分子でラベル化されたペプチドやタンパク質を迅速かつ簡単に調整できるため、蛍光相関分光法に好適に用いられる。Fluorescence correlation spectroscopy obtains dynamic information such as “movement” and “number” of a fluorescent molecule by analyzing “fluctuation of fluorescence intensity” that occurs when the fluorescent molecule enters and exits a small focal region. Is a way that can be.
The protein complex or peptide complex of the present embodiment can be suitably used for fluorescence correlation spectroscopy because a peptide or protein labeled with one fluorescent molecule can be quickly and easily prepared.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to a following example.
［実験例１］（核酸リンカーの合成１）
以下に示す材料をジーンワールド社より購入した。
（１）ＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒ［配列：５’−Ｘ１−（Ａｌｅｘａ４８８）−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、Ｘ１は以下の配列を表す。
ＣＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＡＡ（ｒＧ）ＴＣ（配列番号１：２８ｍｅｒ）
また、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、（ｓｐｃ１８）は（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）である。これらは、いずれもＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製である。[Experimental Example 1] (Synthesis 1 of nucleic acid linker)
The following materials were purchased from Gene World.
(1) FCS Linker [sequence: 5′-X1- (Alexa488)-(spc18) -CC- (Puro) -3 ′]
Here, X1 represents the following sequence.
CCCACCCCGCCGCCCCCCGTCCTAA (rG) TC (SEQ ID NO: 1: 28mer)
Also, (Puro) is Puromycin CPG, and (spc18) is (18-O-Dimethyltriethylhexylylene, 1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidite). These are all manufactured by Glen Research.
（ｍＲＮＡの合成）
５’上流にＴ７プロモーター配列と翻訳促進配列、３’側下流にスペーサー領域及びＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒとの相補鎖領域を有する配列を付加したＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎ（以下、ＢＤＡという。配列番号２：３６７ｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲにより得られたＤＮＡからＴ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って５〜３０ｐｍｏｌ／μｌのｍＲＮＡを合成した（３３７ｂ）。(Synthesis of mRNA)
Protein A B-domain (hereinafter referred to as BDA, hereinafter referred to as BDA; SEQ ID NO: 367 bp) to which a T7 promoter sequence and a translation promoting sequence are added 5 ′ upstream and a sequence having a spacer region and a complementary chain region to FCS Linker are added downstream. Was amplified by PCR.
Using T7 RiboMAX Express Large Scale Production System (manufactured by Promega), 5-30 pmol / μl of mRNA was synthesized from the DNA obtained by PCR according to the attached protocol (337b).
（ｍＲＮＡと核酸リンカーの結合）
前記ｍＲＮＡ５ｐｍｏｌと、前記ＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒ １０ｐｍｏｌをＴ４ ＲＮＡＬｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ (タカラバイオ社製)中で混合し、９０℃に加熱した後、１５分間かけて２５℃まで冷却した。この溶液に、０．５μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ、東洋紡績社製)と、０．５μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製)を加えて混合し、２５℃で１５分間反応させた。
反応産物を８Ｍ尿素８％変性アクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲＧＯＬＤ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色した。また、核酸リンカーは、Ａｌｅｘａ４８８により蛍光標識されており、この標識を指標に、蛍光イメージを取得した。結果を図７に示す。
レーン１はＦＣＳ ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン２はｍＲＮＡ（ＢＤＡ）を泳動したものである。
矢印はｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ−ＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒ、又はＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒを示す。左図及び右図の電気泳動結果は、同一のゲルを異なるイメージング法を用いて解析したものである。左図は、Ａｌｅｘａ４８８による蛍光イメージを取得した結果であり、右図は、ＳＹＢＲＧＯＬＤを用いて核酸を染色した結果である。(Binding of mRNA and nucleic acid linker)
5 pmol of the mRNA and 10 pmol of the FCS Linker were mixed in a T4 RNAligase buffer (Takara Bio Inc.), heated to 90 ° C., and then cooled to 25 ° C. over 15 minutes. To this solution, 0.5 μl of T4 polynucleotide kinase (10 U / μl, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and 0.5 μl of T4 RNA ligase (40 U / μl, manufactured by Takara Bio Inc.) were added and mixed at 25 ° C. The reaction was allowed for 15 minutes.
The reaction products were separated by 8M urea 8% denaturing acrylamide gel electrophoresis and stained with SYBRGOLD (Invitrogen). The nucleic acid linker is fluorescently labeled with Alexa 488, and a fluorescent image was obtained using this label as an index. The results are shown in FIG.
Lane 1 is a ligation product of FCS Linker and mRNA (BDA), and Lane 2 is an electrophoresis of mRNA (BDA).
Arrows indicate mRNA, mRNA-FCS Linker, or FCS Linker. The electrophoresis results in the left and right diagrams are obtained by analyzing the same gel using different imaging methods. The left figure shows the result of acquiring a fluorescence image with Alexa 488, and the right figure shows the result of staining nucleic acid using SYBRGOLD.
レーン１において、未反応のＢＤＡのｍＲＮＡが検出されないことから、本実施形態の核酸リンカーを用いた場合のライゲーション効率は高いことが分かる。 Since no unreacted BDA mRNA is detected in lane 1, it can be seen that the ligation efficiency is high when the nucleic acid linker of this embodiment is used.
（無細胞タンパク質翻訳系による翻訳）
上記のように合成した、核酸リンカーとｍＲＮＡの複合体に無細胞タンパク質翻訳系（Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３０μｌ加え、３０℃、３０分翻訳反応を行った。その後、３Ｍ ＫＣｌを１０μｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ２を３μｌ加えて３７℃で４０分間放置し、０．４Ｍ ＥＤＴＡを１０μｌ加え、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した。(Translation by cell-free protein translation system)
30 μl of a cell-free protein translation system (Wheat Germ Extract Plus, Promega) was added to the nucleic acid linker / mRNA complex synthesized as described above, and a translation reaction was performed at 30 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 10 μl of 3M KCl and 3 μl of 1M MgCl 2 were added and left at 37 ° C. for 40 minutes, and 10 μl of 0.4M EDTA was added to synthesize mRNA-nucleic acid linker-protein complex.
（Ｎｉカラムによる核酸リンカー断片−タンパク質複合体の精製）
上記のように合成したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体にＲＮａｓｅＴ１を添加し、３７℃、３０分間インキュベーションした。次いで、この反応溶液を、平衡化バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール；ｐＨ ７．４）で平衡化した簡易カラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ ６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてバッファー交換をした。
Ｎｉカラムを平衡化バッファーを用いて平衡化した後、バッファー交換をしたｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体分解物（核酸リンカー断片−タンパク質複合体）をＮｉカラムに添加した。
次いで、洗浄バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、４０ｍＭ イミダゾール；ｐＨ ７．４）を添加して、Ｎｉカラムから夾雑物を取り除いた後、溶出バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、３００ｍＭ イミダゾール；ｐＨ ７．４）を添加し、精製された核酸リンカー断片−タンパク質複合体を回収した。
上記に従って精製した核酸リンカー断片−タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行った。核酸リンカーは、Ａｌｅｘａ４８８により蛍光標識されているため、泳動後、この標識を指標に、蛍光イメージを取得した。
結果を図８に示す。(Purification of nucleic acid linker fragment-protein complex by Ni column)
RNaseT1 was added to the mRNA-nucleic acid linker-protein complex synthesized as described above and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was then buffered using a simple column (Micro Bio-spin 6, Bio-Rad) equilibrated with equilibration buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 20 mM imidazole; pH 7.4). I exchanged it.
After equilibrating the Ni column with the equilibration buffer, the mRNA-nucleic acid linker-protein complex degradation product (nucleic acid linker fragment-protein complex) whose buffer was exchanged was added to the Ni column.
Subsequently, washing buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 40 mM imidazole; pH 7.4) was added to remove contaminants from the Ni column, and then elution buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 300 mM). Imidazole; pH 7.4) was added, and the purified nucleic acid linker fragment-protein complex was recovered.
The nucleic acid linker fragment-protein complex purified according to the above was subjected to electrophoresis using SDS-PAGE. Since the nucleic acid linker is fluorescently labeled with Alexa 488, after electrophoresis, a fluorescent image was obtained using this label as an index.
The results are shown in FIG.
図８中、レーン１はＮｉカラムで精製後の核酸リンカー断片−タンパク質複合体（３ｐｍｏｌ）、レーン２は精製前のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体分解物（０．５ｐｍｏｌ）、レーン３は核酸リンカーのみの分解物（１ｐｍｏｌ）を泳動したものである。矢印は核酸リンカー断片−タンパク質複合体（ＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒ−Ｂ ｄｏｍａｉｎ複合体）、核酸リンカー（ＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒ）、又は核酸リンカー断片（ＦＣＳ Ｌｉｎｋｅｒ断片）を示す。レーン１に示されるように、精製された核酸リンカー断片−タンパク質複合体の純度は非常に高いことが確認された。 In FIG. 8, lane 1 is a nucleic acid linker fragment-protein complex (3 pmol) after purification on a Ni column, lane 2 is an mRNA-nucleic acid linker-protein complex degradation product (0.5 pmol) before purification, and lane 3 is a nucleic acid. A degradation product (1 pmol) of only the linker was electrophoresed. An arrow indicates a nucleic acid linker fragment-protein complex (FCS Linker-B domain complex), a nucleic acid linker (FCS Linker), or a nucleic acid linker fragment (FCS Linker fragment). As shown in lane 1, the purity of the purified nucleic acid linker fragment-protein complex was confirmed to be very high.
（ＦＣＳによる核酸リンカー断片−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ複合体とＩｇＧ間の相互作用解析）
サンプル容器に、核酸リンカー断片−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ複合体１．５９ｎＭと、ＢＤＡと強い相互作用を示すことが知られているＩｇＧを、それぞれ０ｎＭ，０．１７ｎＭ，０．３３ｎＭ，１．６７ｎＭ，３．３３ｎＭ，１６．７ｎＭ，３３．３ｎＭ，１６７ｎＭ，３３３ｎＭ添加し、各試料の測定を行った。
各試料の実測データより自己相関関数を演算し、フィッティングカーブをとった結果を図９〜図１１に示す。また、各ＩｇＧ濃度における拡散時間を表１に示す。(Interaction analysis between nucleic acid linker fragment-B-domain complex and IgG by FCS)
In a sample container, 1.59 nM of a nucleic acid linker fragment-B-domain complex and IgG known to exhibit a strong interaction with BDA are respectively added to 0 nM, 0.17 nM, 0.33 nM, 1.67 nM, 3 .33 nM, 16.7 nM, 33.3 nM, 167 nM and 333 nM were added, and each sample was measured.
The autocorrelation function is calculated from the measured data of each sample, and the results of taking fitting curves are shown in FIGS. In addition, Table 1 shows the diffusion time at each IgG concentration.
表１に示すように、ＦＣＳの結果よりフリーのＢＤＡの拡散時間は、０．０９３９８３ ｍｓであった。フリーのＢＤＡとＩｇＧ−ＢＤＡ複合体の分子量の差は１６１１６９／１１１６９＝１４．４３０倍であるため、それぞれのタンパク質が球状と仮定すると、拡散時間は１４．４３１／３＝２．４３６倍となり、０．２２３３９５７１ ｍｓとなる。
結合率ｘ％は拡散時間をｔｍｓとすると、ｘ＝(ｔ−０．０９３９８３)／（０．２２３３９５７１−０．０９３９８３)で求められる。図１２は、ＩｇＧとＢＤＡのモル比と結合率のプロットである。ＢＤＡ＝１．５９ｎＭであるため結合率５０％の濃度（Ｋｄ値）は１．５９×６．８１６＝１０．８ｎＭとなる。As shown in Table 1, the diffusion time of free BDA from the result of FCS was 0.093983 ms. Since the difference in molecular weight between free BDA and IgG-BDA complex is 161169/11169 = 14.430 times, assuming that each protein is spherical, the diffusion time is 14.43 1/3 = 2.436 times. , 0.22339571 ms.
The coupling rate x% is obtained by x = (t−0.093983) / (0.22335711-0.093983) where the diffusion time is tms. FIG. 12 is a plot of IgG to BDA molar ratio and binding rate. Since BDA = 1.59 nM, the concentration (Kd value) at a binding rate of 50% is 1.59 × 6.816 = 10.8 nM.
また、各ＩｇＧ濃度に基づくＫｄ値は、
Ｋｄ＝［フリーなＡ分子］［フリーなＢ分子］／［結合したＡ分子］で求められる。各ＩｇＧ濃度に基づくＫｄ値を表２に示す。The Kd value based on each IgG concentration is
Kd = [free A molecule] [free B molecule] / [bound A molecule] Table 2 shows the Kd values based on each IgG concentration.
各ＩｇＧ濃度に基づくＫｄ値は、図１２から算出された値とほぼ一致していることが確認された。 It was confirmed that the Kd value based on each IgG concentration almost coincided with the value calculated from FIG.
以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーによれば、簡便に合成可能で、標識ペプチド又は標識タンパク質を迅速かつ簡単に調整することができる。よって、本実施形態の核酸リンカーを用いて得られたタンパク質を用いて、分子間相互作用解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。 From the above results, according to the nucleic acid linker of the present embodiment, it is possible to synthesize easily, and the labeled peptide or labeled protein can be adjusted quickly and easily. Therefore, it is clear that intermolecular interaction analysis can be performed quickly and easily using the protein obtained using the nucleic acid linker of the present embodiment.
［実験例２］
下記の核酸リンカーを用いて分子間相互作用解析（ｂａｉｔタンパク質とｐｒｅｙタンパク質との相互作用解析）を行った。図１３に、実験例２の模式図及び核酸リンカーのコンストラクトを示す。分子間相互作用解析としてプルダウン法を用い、相互作用を示すことが知られている３種類の組み合わせ（ＢＤＡとＩｇＧ；ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ抗体；マウスＦａｓリガンド（以下、ＦａｓＬという。）と抗ＦａｓＬモノクローナル抗体）について評価した。
ＢＤＡ、ＦＬＡＧタグ、ＦａｓＬを、磁気ビーズにｂａｉｔタンパク質として固定した。図１３に示すように、ｂａｉｔタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｔ７プロモーター配列、オメガ配列、コザック配列、ｂａｉｔタンパク質コード領域、及び核酸リンカーとハイブリダイズする領域（以下、ＨＲという。）から構成される。ｂａｉｔタンパク質をコードするＤＮＡをＴ７ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、添付のプロトコールに従ってｍＲＮＡを合成し、ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。[Experiment 2]
Intermolecular interaction analysis (interaction analysis between bait protein and prey protein) was performed using the following nucleic acid linker. FIG. 13 shows a schematic diagram of Experimental Example 2 and a nucleic acid linker construct. A pull-down method is used as an intermolecular interaction analysis, and three types of combinations known to show interaction (BDA and IgG; FLAG tag and anti-FLAG antibody; mouse Fas ligand (hereinafter referred to as FasL)) and anti-FasL Monoclonal antibodies) were evaluated.
BDA, FLAG tag, and FasL were immobilized on a magnetic bead as a bait protein. As shown in FIG. 13, the DNA encoding the bait protein is composed of a T7 promoter sequence, an omega sequence, a Kozak sequence, a bait protein coding region, and a region that hybridizes with a nucleic acid linker (hereinafter referred to as HR). The DNA encoding the bait protein was synthesized using T7 RiboMAX Express Large Scale Production System (Promega) according to the attached protocol and purified using RNA purification kit (Qiagen).
（核酸リンカーの合成２）
以下に示す材料をジーンワールド社より購入した。
（１）ビオチン化核酸リンカー［配列：５’−ＣＣＧＣ−（Ｂ）−Ｘ２−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、Ｘ２は以下の配列を表す。
ＣＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ（配列番号３：２２ｍｅｒ）
また、（Ｂ）はＢｉｏｔｉｎＴＥＧで修飾されたＴ、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、（ｓｐｃ１８）は（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）である。これらは、いずれもＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製である。(Synthesis of nucleic acid linker 2)
The following materials were purchased from Gene World.
(1) Biotinylated nucleic acid linker [sequence: 5'-CCGC- (B) -X2- (spc18) -CC- (Puro) -3 ']
Here, X2 represents the following sequence.
CGACCCCGCCGCCCCCCGTCCT (SEQ ID NO: 22: 22mer)
(B) is T modified with BiotinTEG, (Puro) is Puromycin CPG, (spc18) is (18-O-Dimethyltriethylethyleneglycol, 1-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl). ). These are all manufactured by Glen Research.
（ｍＲＮＡと核酸リンカーの結合）
上述した精製ｍＲＮＡと、ビオチン化核酸リンカーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いて結合（ライゲーション）させた。(Binding of mRNA and nucleic acid linker)
The purified mRNA described above and a biotinylated nucleic acid linker were bound (ligated) using T4 polynucleotide kinase and T4 RNA ligase.
（無細胞タンパク質翻訳系による翻訳）
ライゲーション産物に対して、Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ ｋｉｔを用いて、翻訳反応を行い、ｍＲＮＡ−ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した。翻訳反応産物にＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ，ｐＨ８．０）を加え、ｍＲＮＡ−ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体に結合しているリボソームを取り除いた。次いで、ＲＮａｓｅ Ｏｎｅ（プロメガ社製）を加え、ｍＲＮＡ−ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体中のｍＲＮＡを分解した。磁気ビーズとしてＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１（インビトロジェン社製)を用いて、各ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体溶解液からビオチン化ｂａｉｔタンパク質を捕捉した。(Translation by cell-free protein translation system)
The ligation product was subjected to a translation reaction using Retic Lysate IVT kit to synthesize mRNA-biotinylated nucleic acid linker-protein complex. An EDTA solution (0.5 M, pH 8.0) was added to the translation reaction product to remove ribosomes bound to the mRNA-biotinylated nucleic acid linker-protein complex. Subsequently, RNase One (manufactured by Promega) was added to degrade the mRNA in the mRNA-biotinylated nucleic acid linker-protein complex. Using Dynabeads MyOne streptavidin C1 (manufactured by Invitrogen) as a magnetic bead, biotinylated bait protein was captured from each biotinylated nucleic acid linker-protein complex solution.
（プルダウンアッセイ）
各ｐｒｅｙタンパク質（ＩｇＧ：シグマーアルドリチ社製、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体：シグマーアルドリチ社製、ハムスターモノクローナル抗ＦａｓＬ抗体：医学生物学研究所製）をＮ―ヒドロキシスクシニミド−フルオロセイン（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で標識した。フルオロセイン標識ｐｒｅｙタンパク質溶解液（２００ｎＭ又は４００ｎＭ）をビオチン化ｂａｉｔタンパク質が結合した磁気ビーズに加え、２５℃で３０分インキュベーションを行った後、この磁気ビーズを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという。）で３回洗浄した。洗浄後の磁気ビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁し、９０℃で５分インキュベーションを行い、磁気ビーズ上に残ったｐｒｅｙタンパク質−ビオチン化ｂａｉｔタンパク質複合体を溶出した。
溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行った。泳動後、ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（バイオラッド社製）を用いて蛍光イメージを取得した。結果を図１４に示す。図１４上段は、プルダウンされたｐｒｅｙタンパク質の蛍光イメージを示し、図１４下段は、各イメージ（バンド）の蛍光強度を定量化したグラフである。図１４に示されるように、相互作用を示すことが知られている組み合わせにおいては、ビオチン化ｂａｉｔタンパク質によりｐｒｅｙタンパク質がプルダウンされることが確認された。また、ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ抗体との結合の度合いは、ＦａｓＬと抗ＦａｓＬモノクローナル抗体の結合の度合いより強い等、プルダウンされたｐｒｅｙタンパク質の蛍光強度は、概ね各相互作用における解離定数に依存していた。
更に、プルダウンされたｐｒｅｙタンパク質の分子数がＩｎｐｕｔされるｐｒｅｙタンパク質の濃度に依存するかどうかを、２種類の異なる濃度（２００ｎＭ，４００ｎＭ）の抗ＦＬＡＧ抗体を用いて評価した。図１４上段に示されるように、４００ｎＭの抗ＦＬＡＧ抗体を用いた場合は、２００ｎＭの抗ＦＬＡＧ抗体を用いた場合よりも、より多分子数のｐｒｅｙタンパク質がプルダウンされることが分かった。(Pull-down assay)
Each prey protein (IgG: manufactured by Sigma Aldrich, mouse monoclonal anti-FLAG antibody: manufactured by Sigma Aldrich, hamster monoclonal anti-FasL antibody: manufactured by Institute of Medical Biology) N-hydroxysuccinimide-fluorescein (Pierce) ). A fluorescein-labeled prey protein lysate (200 nM or 400 nM) was added to the magnetic beads to which the biotinylated bait protein was bound, and incubated at 25 ° C. for 30 minutes. The magnetic beads were then added to PBS containing 0.01% Tween 20 (hereinafter, Washed 3 times with PBST). The magnetic beads after washing were suspended in SDS-PAGE sample buffer and incubated at 90 ° C. for 5 minutes to elute the prey protein-biotinylated bait protein complex remaining on the magnetic beads.
The eluate was subjected to electrophoresis using SDS-PAGE. After electrophoresis, a fluorescence image was obtained using a fluorimager (Bio-Rad). The results are shown in FIG. The upper part of FIG. 14 shows the fluorescence image of the pulled-down prey protein, and the lower part of FIG. 14 is a graph in which the fluorescence intensity of each image (band) is quantified. As shown in FIG. 14, it was confirmed that the prey protein was pulled down by the biotinylated bait protein in the combination known to show the interaction. Further, the degree of binding between the FLAG tag and the anti-FLAG antibody is stronger than the degree of binding between FasL and the anti-FasL monoclonal antibody. For example, the fluorescence intensity of the pulled-down prey protein generally depends on the dissociation constant in each interaction. It was.
Furthermore, whether or not the number of molecules of the pulled-down play protein depends on the concentration of the input play protein was evaluated using two different concentrations (200 nM, 400 nM) of anti-FLAG antibodies. As shown in the upper part of FIG. 14, when 400 nM anti-FLAG antibody was used, it was found that a larger number of prey proteins were pulled down than when 200 nM anti-FLAG antibody was used.
以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーによれば、分子間相互作用解析に必要な量のｂａｉｔタンパク質を迅速かつ簡単に低コストで調整することができる。よって、本実施形態の核酸リンカーを用いて得られたタンパク質を用いて、分子間相互作用解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。 From the above results, according to the nucleic acid linker of this embodiment, the amount of bait protein necessary for the intermolecular interaction analysis can be quickly and easily adjusted at low cost. Therefore, it is clear that intermolecular interaction analysis can be performed quickly and easily using the protein obtained using the nucleic acid linker of the present embodiment.
本発明によれば、ペプチド又はタンパク質を簡単に調整できる核酸リンカーが得られる。したがって、本発明は相互作用解析等に好適に利用でき、産業上極めて重要である。 According to the present invention, a nucleic acid linker capable of easily adjusting a peptide or protein is obtained. Therefore, the present invention can be suitably used for interaction analysis and the like and is extremely important in industry.
２，１２，２２，３２…核酸リンカー
２ａ，２２ａ，３２ａ…連結部分
２ｄ, ２２ｄ，３２ｄ…標識物質
２ｅ…切断部位
２ｆ…結合部位
２３，５３，６３…ｍＲＮＡ
３３，１３３，２３３…タンパク質又はペプチド
５１ａ…ポリヌクレオチド部分
５１ｂ，５１ｂ’…アーム部分
６６，１６６，２６６…核酸リンカー断片
６８，１６８，２６８…その他の核酸リンカー断片2, 12, 22, 32 ... Nucleic acid linkers 2a, 22a, 32a ... Linking portions 2d, 22d, 32d ... Labeling substance 2e ... Cleavage site 2f ... Binding sites 23, 53, 63 ... mRNA
33,133,233 ... protein or peptide 51a ... polynucleotide part 51b, 51b '... arm part 66,166,266 ... nucleic acid linker fragment 68,168,268 ... other nucleic acid linker fragment
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーを一本鎖とすることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１０）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、 前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、 前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有することを特徴とする。
In order to solve the above-described problems, the present inventors have conducted extensive research and found that the problem can be solved by using a single-stranded nucleic acid linker. One embodiment of the present invention provides the following (1) to (1 0 ).
(1) The nucleic acid linker according to one embodiment of the present invention is a nucleic acid linker for producing a complex of mRNA and a protein or peptide encoded by the mRNA, and the sequence of at least a part of the mRNA a polynucleotide portion capable of hybridizing, an arm portion having a connecting portion between said protein or peptide terminus, Ri but greens to form a single strand, the binding site of the terminus of the mRNA, the polynucleotide portion It has at the end side, characterized Rukoto that have a solid phase binding site on the binding site.
（２）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドと、を連結してなることを特徴とする。 (2) The mRNA-nucleic acid linker-protein complex or the mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in one embodiment of the present invention comprises the mRNA and the protein encoded by the mRNA via the nucleic acid linker described above. Or it connects with a peptide, It is characterized by the above-mentioned .
（３）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ）前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有する核酸リンカーと、をアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、 （ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、を有することを特徴とする。 ( 3 ) The method for producing mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in one embodiment of the present invention is the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker described above. A method for producing a peptide complex , comprising : (a) the mRNA , a polynucleotide portion capable of hybridizing to at least a partial sequence of the mRNA, and an arm portion having a terminal linking portion with the protein or peptide; Forming a single strand , annealing a nucleic acid linker having a binding site with the end of the mRNA at the end of the polynucleotide portion and having a solid phase binding site at the binding site And (b) after the step (a), the end of the mRNA and the end of the nucleic acid linker are ligated. And (c) after the step (b), a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and the C of the protein or peptide is prepared. (D) the step (c), wherein the terminal and the linking part of the nucleic acid linker with the protein or peptide are combined to produce an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex; ), And then purifying the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex by binding to a solid phase having a solid-phase binding site recognition site. .
（４）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有し、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ１）前記工程（ｃ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、を有することを特徴とする。 ( 4 ) The method for producing mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex in one embodiment of the present invention is the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker described above. A method for producing a peptide complex, comprising : (a1) an arm having at the end a plurality of types of mRNA, a polynucleotide portion capable of hybridizing to at least a partial sequence of the mRNA, and a linking portion of the protein or peptide And a portion that forms a single strand, has a binding site with the end of the mRNA at the end of the polynucleotide portion, has a solid phase binding site at the binding site , a step of separately annealed respectively plural kinds of nucleic acid linker, a having a labeling substance, (b1) the step ( (1) and then ligating the ends of the plurality of types of mRNA and the ends of the plurality of types of nucleic acid linkers separately to produce a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes, respectively (c1) ) After the step (b1), the plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed, a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and the C-terminus of the protein or peptide and the (D1) producing a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complexes or mRNA-nucleic acid linker-peptide complexes in the same reaction solution by binding the nucleic acid linker to the protein or peptide linking moiety. ) After the step (c1), the plural types of mRNA-nucleic acid linker-protein complex or m NA- nucleic acid linker - peptide complexes, characterized in that it comprises a step, it is purified by binding to a solid phase having a solid phase binding site recognition site.
（５）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ２）前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有する核酸リンカーと、をアニールさせる工程と、（ｂ２）前記工程（ａ２）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ２）前記工程（ｂ２）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ２）前記工程（ｃ２）の後、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、（ｆ２）前記工程（ｅ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。 ( 5 ) The method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex according to one embodiment of the present invention is the method of the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex described above. A production method comprising: (a 2 ) one of the mRNA , a polynucleotide portion capable of hybridizing with at least a partial sequence of the mRNA, and an arm portion having a terminal linking portion with the protein or peptide. it forms a stranded, the binding site of the terminus of the mRNA, have the ends of the polynucleotide portion side, and a step of annealing, a nucleic acid linker with solid phase binding site in the binding site, ( b 2) after the step (a 2), by ligating the ends of said nucleic acid linker with the ends of the mRNA, mR A step of producing a nucleic acid linker conjugate A-, (c 2) after the step (b 2), to synthesize a protein or peptide from the mRNA using a cell-free protein translation system, C-terminal, of said protein or peptide And (d2) the step (c2) , wherein the nucleic acid linker is linked to the protein or peptide linking moiety of the nucleic acid linker to produce an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex. And then purifying the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex by binding to a solid phase having a solid phase binding site recognition site, and ( e2 ) the step ( d2 ) ) After that, the mRNA-nucleic acid linker-tamper is caused by the action of a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme or by light irradiation. Quality complexes or mRNA- nucleic acid linker - and the nucleic acid linker of a peptide in the complex, obtaining a cleavage product was digested with the single-stranded nucleic acid cleaving enzyme site or the photocleavage site process, (f 2) the step (e And 2), purifying the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex from the cleavage product.
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ３）複数種類のｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有し、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ３）前記工程（ａ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ３）前記工程（ｂ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ３）前記工程（ｃ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、（ｆ３）前記工程（ｅ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。 ( 6 ) The method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex according to one embodiment of the present invention is the method of the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex described above. A production method comprising : (a 3 ) a plurality of types of mRNA ; a polynucleotide part capable of hybridizing with at least a part of the sequence of the mRNA; and an arm part having a terminal part of a linking part of the protein or peptide; Is formed in a single strand, has a binding site with the end of the mRNA at the end of the polynucleotide portion side, a solid phase binding site at the binding site, and different types of labeling substances. a step of separately annealed respectively plural kinds of nucleic acid linker, a having, after (b 3) the step (a 3), said plurality Class of mRNA terminal and said plurality of types of nucleic acid linker-terminal and the respectively allowed separately ligated, the steps of separately producing a plurality of types of mRNA- nucleic acid linker conjugate, respectively, (c 3) the step (b 3 ), The plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed, a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and the C-terminal of the protein or peptide and the protein of the nucleic acid linker Or a step of producing a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complexes or mRNA-nucleic acid linker-peptide complexes in the same reaction solution by binding to a linking moiety with a peptide, and (d3) the step (c3) ) And the plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complexes or mRNA-nucleic acid linkers. - peptide complexes, and purifying by binding to a solid phase having a solid phase binding site recognition site, by the action of (e 3) after the step (d3), 1-stranded nucleic acid cleaving enzyme, or The nucleic acid linker in a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex is cleaved by light irradiation at the single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or the photocleavage site. a peptide complex purification - obtaining a cleavage product, (f 3) after said step (e 3), said plurality of types wherein a plurality of types of cleavage products of the nucleic acid linker fragments - protein complex or nucleic acid linker fragment And a process.
（７）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とする。 ( 7 ) The protein array or peptide array in one embodiment of the present invention is characterized in that the protein complex or peptide complex described above is immobilized on a substrate.
（８）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体を標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体又はペプチド複合体との相互作用を解析することを特徴とする。 ( 8 ) In the molecular interaction analysis method according to one embodiment of the present invention, the protein complex or peptide complex described above is contacted with a target molecule, and the target molecule and the protein complex or peptide complex are contacted with each other. It is characterized by analyzing the interaction.
（９）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記標識されたプレイタンパク質を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。 ( 9 ) An intermolecular interaction analysis method according to an embodiment of the present invention includes: (a) an immobilization step of immobilizing the protein or peptide of the protein complex or peptide complex on a solid phase as a bait protein; (B) a reaction step of reacting the bait protein with a labeled prey protein to generate a bait protein-prey protein conjugate, and (c) a detection step of detecting the labeled prey protein. It is characterized by that.
（１０）本発明の一実施態様におけるプレイタンパク質のスクリーニング方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記ベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を集める収集工程と、（ｄ）前記収集されたベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と、 を有することを特徴とする。 (1 0 ) The screening method for prey protein in one embodiment of the present invention comprises (a) an immobilization step of immobilizing the protein or peptide complex on a solid phase as a bait protein, (B) a reaction step of reacting the bait protein with a labeled prey protein to produce a bait protein-prey protein conjugate; (c) a collecting step of collecting the bait protein-prey protein conjugate; d) an elution step of washing the collected bait protein-prey protein conjugate to elute the prey protein.
Claims (20)
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなることを特徴とする核酸リンカー。a nucleic acid linker for producing a complex of mRNA and a protein or peptide encoded by the mRNA,
A polynucleotide portion capable of hybridizing to at least a partial sequence of the mRNA;
A nucleic acid linker, wherein an arm part having a terminal part of a connecting part with the protein or peptide forms a single chain.
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、
を有することを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法。A method for producing the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex according to claim 10,
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) after the step (a), ligating the end of the mRNA and the end of the nucleic acid linker to produce an mRNA-nucleic acid linker complex;
(C) After the step (b), a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and a linking portion between the C-terminus of the protein or peptide and the protein or peptide of the nucleic acid linker; To produce an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex;
A method for producing an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or an mRNA-nucleic acid linker-peptide complex characterized by comprising:
（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカー、とをそれぞれ別個にアニールさせる工程と、
（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、
（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、
を有することを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法。A method for producing the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex according to claim 10,
(A1) separately annealing a plurality of types of mRNA and a plurality of types of nucleic acid linkers having different types of labeling substances;
(B1) After the step (a1), the ends of the plurality of types of mRNA and the ends of the plurality of types of nucleic acid linkers are separately ligated to individually manufacture a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes. And a process of
(C1) After the step (b1), the plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed, a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and the C-terminal of the protein or peptide And linking the nucleic acid linker to the protein or peptide linking moiety to produce a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complexes or mRNA-nucleic acid linker-peptide complexes in the same reaction solution;
A method for producing an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or an mRNA-nucleic acid linker-peptide complex characterized by comprising:
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、
（ｄ２）前記工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、
（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法。A method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex according to claim 11,
(A) annealing the mRNA and the nucleic acid linker;
(B) after the step (a), ligating the end of the mRNA and the end of the nucleic acid linker to produce an mRNA-nucleic acid linker complex;
(C) After the step (b), a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and a linking portion between the C-terminus of the protein or peptide and the protein or peptide of the nucleic acid linker; To produce an mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex;
(D2) After the step (c), the nucleic acid linker in the mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex is caused by acting a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme or by light irradiation. Cutting the single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or the photocleavage site to obtain a cleavage product;
(E2) After the step (d2), the step of purifying the nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex from the cleavage product. Or nucleic acid linker fragment-peptide complex production method.
（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、
（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、
（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、
（ｄ３）前記工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、
（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法。A method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex according to claim 11,
(A1) separately annealing a plurality of types of mRNA and a plurality of types of nucleic acid linkers having different types of labeling substances;
(B1) After the step (a1), the ends of the plurality of types of mRNA and the ends of the plurality of types of nucleic acid linkers are separately ligated to individually manufacture a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes. And a process of
(C1) After the step (b1), the plurality of types of mRNA-nucleic acid linker complexes are mixed, a protein or peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free protein translation system, and the C-terminal of the protein or peptide And linking the nucleic acid linker to the protein or peptide linking moiety to produce a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complexes or mRNA-nucleic acid linker-peptide complexes in the same reaction solution;
(D3) After the step (c1), in a plurality of types of mRNA-nucleic acid linker-protein complex or mRNA-nucleic acid linker-peptide complex by acting a single-stranded nucleic acid cleaving enzyme or by light irradiation Cleaving the nucleic acid linker at the single-stranded nucleic acid cleavage enzyme site or the photocleavage site to obtain a plurality of types of cleavage products;
(E3) After the step (d3), the step of purifying the plurality of types of nucleic acid linker fragment-protein complex or nucleic acid linker fragment-peptide complex from the plurality of types of cleavage products. A method for producing a nucleic acid linker fragment-protein complex or a nucleic acid linker fragment-peptide complex.
（ａ）請求項１０に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、
（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、
（ｃ）前記標識されたプレイタンパク質を検出する検出工程と、
を有することを特徴とする分子間相互作用解析方法。 A molecular interaction analysis method,
(A) an immobilization step of immobilizing the protein or peptide complex according to claim 10 on a solid phase as a bait protein;
(B) a reaction step of reacting the bait protein with a labeled prey protein to produce a bait protein-prey protein conjugate;
(C) a detection step of detecting the labeled prey protein;
A method for analyzing an intermolecular interaction, comprising:
（ａ）請求項１０に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、
（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、
（ｃ）前記ベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を集める収集工程と、
（ｄ）前記収集されたベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と、
を有することを特徴とするプレイタンパク質のスクリーニング方法。A screening method for prey proteins,
(A) an immobilization step of immobilizing the protein or peptide complex according to claim 10 on a solid phase as a bait protein;
(B) a reaction step of reacting the bait protein with a labeled prey protein to produce a bait protein-prey protein conjugate;
(C) a collecting step of collecting the bait protein-prey protein conjugate;
(D) an elution step of washing the collected bait protein-prey protein conjugate to elute the prey protein;
A prey protein screening method comprising:
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012255737 | 2012-11-21 | ||
| JP2012255737 | 2012-11-21 | ||
| PCT/JP2013/080097 WO2014080766A1 (en) | 2012-11-21 | 2013-11-07 | Nucleic acid linker |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2014080766A1 true JPWO2014080766A1 (en) | 2017-01-05 |
| JP6194894B2 JP6194894B2 (en) | 2017-09-13 |
Family
ID=50775951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014548509A Expired - Fee Related JP6194894B2 (en) | 2012-11-21 | 2013-11-07 | Nucleic acid linker |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6194894B2 (en) |
| WO (1) | WO2014080766A1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003048363A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-12 | Keio University | Complex of assigned molecule with c-end labeled protein, assigned molecule complex and methods of analyzing interaction between proteins using these complexes |
| JP2008253176A (en) * | 2007-04-03 | 2008-10-23 | Janusys Kk | Linker for obtaining highly affinitive molecule |
| JP2011087573A (en) * | 2009-09-24 | 2011-05-06 | Saitama Univ | METHOD FOR EFFICIENTLY SYNTHESIZING cDNA/mRNA-PROTEIN CONJUGATE |
-
2013
- 2013-11-07 WO PCT/JP2013/080097 patent/WO2014080766A1/en active Application Filing
- 2013-11-07 JP JP2014548509A patent/JP6194894B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003048363A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-12 | Keio University | Complex of assigned molecule with c-end labeled protein, assigned molecule complex and methods of analyzing interaction between proteins using these complexes |
| JP2008253176A (en) * | 2007-04-03 | 2008-10-23 | Janusys Kk | Linker for obtaining highly affinitive molecule |
| JP2011087573A (en) * | 2009-09-24 | 2011-05-06 | Saitama Univ | METHOD FOR EFFICIENTLY SYNTHESIZING cDNA/mRNA-PROTEIN CONJUGATE |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014080766A1 (en) | 2014-05-30 |
| JP6194894B2 (en) | 2017-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11932902B2 (en) | Barcoded beads and method for making the same by split-pool synthesis | |
| EP1816192B1 (en) | LINKER FOR CONSTRUCTING mRNA-PUROMYCIN-PROTEIN CONJUGATE | |
| He et al. | In situ synthesis of protein arrays | |
| CN110637086B (en) | Method for producing complex of RNA molecule and peptide, and use thereof | |
| US20150011433A1 (en) | Bis-biotinylation tags | |
| JP6057185B2 (en) | Nucleic acid linker | |
| US10995362B2 (en) | Methods of identifying multiple epitopes in cells | |
| JP6506838B2 (en) | High-speed photocrosslinkable co-linker for in-vitro sputum and intermolecular interaction analysis, in-vitro sputum method using the linker | |
| US20220056515A1 (en) | Methods of identifying multiple epitopes in cells | |
| US20200157603A1 (en) | Methods of identifying multiple epitopes in cells | |
| JP5733784B2 (en) | Efficient synthesis of cDNA / mRNA-protein conjugates | |
| JP6020865B2 (en) | Nucleic acid linker | |
| JP5759678B2 (en) | Nucleic acid linker | |
| US11560585B2 (en) | Methods of identifying multiple epitopes in cells | |
| JP6048975B2 (en) | Protein-immobilized solid phase, polynucleotide-immobilized solid phase, and nucleic acid recovery method | |
| JP6194894B2 (en) | Nucleic acid linker | |
| JP6478392B2 (en) | Nucleic acid linker | |
| JPWO2003048363A1 (en) | Complex of mapping molecule and C-terminal labeled protein, complex of mapping molecule, and protein-protein interaction analysis method using the complex | |
| JP4747292B2 (en) | Translation templates and libraries thereof, proteins and protein libraries synthesized from them, elements constituting them, and methods for producing and using them | |
| WO2023150742A2 (en) | Methods for generating nucleic acid encoded protein libraries and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161213 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170206 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170704 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170731 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6194894 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |