JP4747292B2 - Translation templates and libraries thereof, proteins and protein libraries synthesized from them and elements constituting them, as well as their preparation and usage - Google Patents

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    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C12N15/1062Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently

Description

技術分野現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。 Art Currently, base sequences of various organisms genome is about to be decrypted. ゲノムシーケンスの研究では、第2幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析(Saegusa A.Japan boosts proteomics and cell biology...Nature 401,6751(1999),Dalton R,Abbott A.Can researchers find recipe for proteins and chips? Nature 402,6763(1999))、および蛋白質間、核酸−蛋白質間相互作用解析などが期待されている(宮本悦子、柳川弘志(2000)シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学3:プロテオミクス,pp.136−145;宮本悦子、柳川弘志(20 In the study of the genome sequence, as a study of the post-sequence of the second act, study to analyze its meaning from the deciphering genomic information, ie, the structure and functional analysis of genes and proteins (Saegusa A.Japan boosts proteomics and cell biology .. .Nature 401,6751 (1999), Dalton R, Abbott A.Can researchers find recipe for proteins and chips Nature 402,6763 (1999)), and protein-protein, nucleic acid -? such as protein-protein interaction analysis has been expected (Etsuko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa (2000) Series post sequence of the genome science 3: proteomics, pp.136-145; Etsuko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa (20 1)蛋白質・核酸・酵素、46(2),pp.138−147)。 1) protein-nucleic acid-enzyme, 46 (2), pp.138-147). これらの構造および機能解析には、蛋白質の大量発現が重要となってくる。 These structural and functional analysis, large-scale expression of the protein is important. 蛋白質の大量発現が可能な無細胞翻訳系とともに、蛋白質の大量発現が可能で安定な翻訳テンプレートの開発が所望されている(白水美香子、木川隆則、横山茂之(2000)シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学3:プロテオミクス,pp.197−205)。 Along with the large-scale expression is cell-free translation system capable of protein, large-scale expression is possible the development of a stable translation template is desired (white water Mikako, Takanori Kikawa, genome science of Shigeyuki Yokoyama (2000) Series Post sequence of the protein 3: proteomics, pp.197-205).
ポストゲノム機能解析によって、重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創製など、医療、食料、エネルギー、環境など多くの分野の産業の基本ツールとして積極的に利用可能である。 By post-genome function analysis, such as the creation of pharmaceuticals due to important of biological enzyme discovery, medical, food, energy, it is actively available as a basic tool of many areas of industry, such as environment.
背景技術ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。 Various things as a tool of the background art post-genome structure and function analysis research have been developed. どのような解析方法であっても、蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、蛋白質の合成工程であり、さまざまな生物種のゲノムやcDNAから一万種類以上の蛋白質を発現させねばならない。 Whatever the analysis method, indispensable in common to the analysis of protein, a synthetic process of the protein must be expressed ten thousand or more proteins from various species of genomic or cDNA . そのためには、ハイスループットで強力な無細胞翻訳系が開発されてきた。 To do this, a powerful cell-free translation systems have been developed in a high-throughput. 大腸菌内での発現方法と比較した利点は、(1)発現ベクターにクローニングすることなく、直線状DNA断片や転写したmRNAから直接目的の蛋白質が発現可能、(2)短時間の反応で大量発現が可能、(3)凝集しやすい性質や毒性を持つような発現の難しい蛋白質も生産可能、などが挙げられる。 The advantage compared to the method of expressing in E. coli, (1) without cloned into an expression vector, linear DNA fragments and proteins of the direct object from transcribed mRNA is expressible, (2) large quantities expressed in short reaction possible, (3) difficulty protein expression, such as with aggregation prone nature and toxicity can be produced, and the like.
これまで、無細胞翻訳系として小麦胚芽の系(Madin K,Sawasaki T,Ogasawara T,Endo Y.A highly efficient and robust cell−free protein synthesis system prepared from wheat embryos:plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes.Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Jan 18;97(2):559−64.)、および大腸菌の系(Shimizu Y,Inoue A,Tomari Y,Suzuki T,Yokogawa T,Nishikawa K,Ueda T.Cell−free transl So far, wheat germ of the system as a cell-free translation system (Madin K, Sawasaki T, Ogasawara T, Endo Y.A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes . .Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Jan 18; 97 (2): 559-64), and E. coli systems (Shimizu Y, Inoue a, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T. Cell-free transl ation reconstituted with purified components.Nat Biotechnol.2001 Aug;19(8):751−5.)において、蛋白質の大量発現が研究されてきている。 . Ation reconstituted with purified components.Nat Biotechnol.2001 Aug; 19 (8): 751-5 in), large-scale expression of proteins have been studied. それに伴い、蛋白質の大量発現が可能な安定した翻訳テンプレートの開発として、mRNAの安定性向上と翻訳効率向上のために、一般的には3'UTRが使われるが(Sachs A.B.,Sarnow P.,and Hentzw M.W.Starting at the Beginning,Middle,and Ena;Translation Initiation in Eukaryotes.(1997)Cell 89,831−838)、mRNAの化学構造の置換や修飾などの方法(Ueda T,Tohda H,Chikazumi N,Eckstein F,Watanabe K.,Cell−free translation system using phosphorothioate−containing m Along with this, as the development of abundant expression capable stable translation template protein, to improve stability and translation efficiency of mRNA, although in general 3'UTR is used (Sachs A.B., Sarnow P., and Hentzw M.W.Starting at the Beginning, Middle, and Ena;. Translation Initiation in Eukaryotes (1997) Cell 89,831-838), methods such as replacement or modification of the chemical structure of mRNA (Ueda T, Tohda H, Chikazumi N, Eckstein F, Watanabe K., Cell-free translation system using phosphorothioate-containing m NA.Nucleic Acids Symp Ser.1991;(25):151−2.)を用いることなどが考案されている。 NA.Nucleic Acids Symp Ser.1991; (25):. 151-2) and the use of a has been devised.
また、ポストゲノム機能解析研究のために開発されてきたいろいろな解析ツールにも無細胞翻訳系による蛋白質合成が重要な役割を占めている。 In addition, protein synthesis is an important role by cell-free translation system are also a variety of analysis tools that have been developed for the post-genome function analysis research. その主なものを以下に挙げる。 It listed the main ones below. いずれも、蛋白質の大量発現が不可欠である。 In any case, it is essential to large-scale expression of the protein.
分子間相互作用の検出方法として、これまで表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光偏光解消法、エバネッセント場イメージング法、蛍光相関分光法、蛍光イメージング法、固相酵素免疫検定法などが知られている。 Detection methods for intermolecular interactions, which until the surface plasmon resonance, fluorescence resonance energy transfer, fluorescence depolarization method, evanescent field imaging method, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging method, and enzyme linked immunosorbent assay known It is. とりわけ、蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS)は、測定に必要な試料量が少なく(およそフェムトリットル)、測定時間が短く(およそ10秒)、HTSのための自動化が容易である(実際にEVOTEC社では1日で10万検体以上のスクリーニングを行うウルトラHTSを目指した装置の開発を行なっている)等の長所があり、検出系として優れている(金城政孝(1999)蛋白質核酸酵素44:1431−1438)。 Especially, fluorescence correlation spectroscopy (Fluorescence Correlation Spectroscopy: FCS) has less amount of sample required for measurement (approximately femtoliter), short measurement time (approximately 10 seconds), it is easy automation for HTS (actual to have advantages of being), and performing the development of devices aimed at ultra HTS performing 100,000 specimens over screening in one day at EVOTEC Inc., is excellent as a detection system (Masataka Kinjo (1999) protein, nucleic acid and enzyme 44 : 1431-1438). さらに2種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross−Correlation Spectroscopy:FCCS)では、1種類の蛍光色素を用いるFCSでは困難であった同程度の大きさをもつ分子間の相互作用も検出が可能であり、タンパク質相互作用のHTSへの応用が期待されている。 Further fluorescence cross-correlation spectroscopy using two kinds of fluorescent dye (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy: FCCS) So also the interaction between molecules with one fluorochrome comparable size has been difficult in the FCS used it can be detected, application to HTS protein interactions are expected.
一般に、タンパク質相互作用の検出系では、固相化のためのタグや蛍光色素等のプローブでタンパク質を修飾する必要がある。 In general, the detection system of protein interactions, it is necessary to modify the protein in the probe, such as a tag or fluorescent dyes for immobilization. 本発明者等は、ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中でタンパク質のC末端を修飾する方法を先に提案している(特開平11−322781、特開2000−139468)。 The present inventors have proposed a method for modifying the C-terminus of the protein in the translation system using a nucleic acid derivative such as puromycin previously (JP-A 11-322781, JP-2000-139468). この方法は、従来の化学修飾法や蛍光タンパク質融合法に比べて、タンパク質の機能を損ないにくい等の利点がある。 This method, compared to conventional chemical modification method or fluorescent protein fusion method, there are advantages such as less likely impair the function of the protein.
一方、進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子(遺伝子型)と蛋白質(表現型)の対応付け」を応用して、ポストゲノム機能解析における蛋白質間相互作用を網羅的に解析する方法として、in vitro virus法(Miyamoto−Sato E,et al.The constraction of the virus type assignment molecule in evolutionary molecular engineering.Viva Origino 25,35(1997),Nemoto N,et al.In vitro virus:Bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'−terminal end to the C−terminal end of i On the other hand, by applying the "association of genes (genotype) and protein (phenotype)" I was born as a tool of evolutionary molecular engineering, as a way to exhaustively analyze the interaction between the protein in the post-genome functional analysis, in vitro virus method (Miyamoto-Sato E, et al.The constraction of the virus type assignment molecule in evolutionary molecular engineering.Viva Origino 25,35 (1997), Nemoto N, et al.In vitro virus: Bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of i s encoded protein on the ribosome in vitro.FEBS Lett.414,405(1997),WO98/16636)、STABLE法(Doi N,Yanagawa H.STABLE:protein−DNA fusion system for screening of combinatorial protein libraries in vitro.FEBS Lett.457,227(1999))、ファージディスプレー法(Smith G.P.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science228,1315(1985))、リボソーム・ディスプレイ法(Mattheakis,L.C.et a s encoded protein on the ribosome in vitro.FEBS Lett.414,405 (1997), WO98 / 16636), STABLE method (Doi N, Yanagawa H.STABLE: protein-DNA fusion system for screening of combinatorial protein libraries in vitro.FEBS Lett.457,227 (1999)), phage display method (Smith G.P.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science228,1315 (1985)), ribosome display method (Mattheakis, L.C.et a .(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,9022−9026,Mattheakis,L.C.& Dower,W.J.(1995)WO95/11922))、mRNA−peptide fusion(mRNA display)法(Roberts R.W,Szostak J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,12297)などである。 . (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,9022-9026, Mattheakis, L.C. & Dower, W.J. (1995) WO95 / 11922)), mRNA-peptide fusion (mRNA display) method (Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,12297), and the like.
発明の開示ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されてきている。 Various things as disclosure post-genome structure and function analysis research of the tool of the invention have been developed. どのような解析方法であっても、蛋白質の解析に共通して欠かせないものは、蛋白質の合成工程であり、さまざまな生物種のゲノムやcDNAから一万種類以上の蛋白質を発現させねばならない。 Whatever the analysis method, indispensable in common to the analysis of protein, a synthetic process of the protein must be expressed ten thousand or more proteins from various species of genomic or cDNA . その目的で、ハイスループットで強力な無細胞翻訳系が開発されてきた。 For that purpose, a powerful cell-free translation systems have been developed in a high-throughput. 大腸菌内での発現方法と比較した利点は、(1)発現ベクターにクローニングすることなく、直線状DNA断片や転写したmRNAから直接目的の蛋白質が発現可能、(2)短時間の反応で大量発現が可能、(3)凝集しやすい性質や毒性を持つような発現の難しい蛋白質も生産可能、などが挙げられる。 The advantage compared to the method of expressing in E. coli, (1) without cloned into an expression vector, linear DNA fragments and proteins of the direct object from transcribed mRNA is expressible, (2) large quantities expressed in short reaction possible, (3) difficulty protein expression, such as with aggregation prone nature and toxicity can be produced, and the like. ここで、mRNAの安定性向上と翻訳効率向上のために一般的に3'UTRが使われるが(Sachs A.B.,Sarnow P.,and Hentzw M.W.Starting at the Beginning,Middle,and Ena;Translation Initiation in Eukaryotes.(1997)Cell 89,831−838)、3'UTRは数百ベースと長いので、PCRで簡単にプライミングでつけることは出来ない。 Here, although generally 3'UTR to improve the stability and translation efficiency of mRNA is used (Sachs A.B., Sarnow P., and Hentzw M.W.Starting at the Beginning, Middle, and Ena;. Translation Initiation in Eukaryotes (1997) Cell 89,831-838), 3'UTR because several hundred base and long, can not be put in easily primed with PCR. そこで、せっかく無細胞翻訳系を利用するのに3'UTRを持つベクターに組み込んで利用することになる(Madin K,Sawasaki T,Ogasawara T,Endo Y.A highly efficient and robust cell−free protein synthesis system prepared from wheat embryos:plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes.Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Jan 18;97(2):559−64.)。 So, it will be used by incorporating into a vector with a 3'UTR to take advantage of the long-awaited cell-free translation system (Madin K, Sawasaki T, Ogasawara T, Endo Y.A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes.Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Jan 18; 97 (2): 559-64).. しかしながら、最近の研究で3'UTRの機能は翻訳量の調節にあることがわかってきており(Boucher N.et al.A common mechanism if stage−regulated gene expression in Leishmania mediated by a conserved 3'UTR element.J.Biol.Chem.2002 Mar 23;[epub ahead of print])、一概に翻訳を増加させるだけではなく抑制する場合も考えられるなどの問題点も抱えている。 However, 3'UTR of the function in the recent research has been found that the regulation of the translation amount (Boucher N.et al.A common mechanism if stage-regulated gene expression in Leishmania mediated by a conserved 3'UTR element .J.Biol.Chem.2002 Mar 23; [epub ahead of print]), has categorically also suffer from problems such as the case may be considered to suppress not only increase the translation. また、mRNAの化学構造の置換や修飾などの方法(Ueda T,Tohda H,Chikazumi N,Eckstein F,Watanabe K.,Cell−free translation system using phosphorothioate−containing mRNA.Nucleic Acids Symp Ser.1991;(25):151−2.)では、化学構造を置換した材料が高価であったり、安定性は得られるが、翻訳に支障を来す可能性があるなどの問題点が挙げられる。 Also, methods such as substitution or modification of the chemical structure of mRNA (Ueda T, Tohda H, Chikazumi N, Eckstein F, Watanabe K., Cell-free translation system using phosphorothioate-containing mRNA.Nucleic Acids Symp Ser.1991; (25 ):. 151-2), the or a expensive material obtained by replacing the chemical structure, although the stability obtained, problems such could interfere with the translation and the like.
本発明の目的は、以上の問題を解決するために、作成方法が簡単で安定でかつ高効率に蛋白合成を行える翻訳テンプレートを提供することである。 An object of the present invention, in order to solve the above problems, is to provide a translation template capable of performing protein synthesis in a stable and highly efficient and easy way to create. この翻訳テンプレートによって、ポストゲノム構造および機能解析をハイスループットに行うことが出来る。 This translation template, post-genome structure and function analysis can be performed in high throughput. また、この翻訳テンプレートの利用により、C末端ラベル化蛋白質(Labeled protein and its producing method,labeling compound to be used in the method for analyzing function of genes,2001,U.S.Patent 6,228,994,H.Yanagawa,N.Nemoto,E.Miyamoto)による蛋白質の相互作用解析、および対応付け分子(Molecule that homologizes genotype and phenotype and utilization thereof,1998,PCT/JP97/03766(WO98/16636)H.Yanagawa,N.Nemot In addition, through the use of the translation template, C-terminal labeled protein (Labeled protein and its producing method, labeling compound to be used in the method for analyzing function of genes, 2001, U.S.Patent 6,228,994, H .Yanagawa, N.Nemoto, interaction analysis of proteins by E.Miyamoto), and assigning molecules (molecule that homologizes genotype and phenotype and utilization thereof, 1998, PCT / JP97 / 03766 (WO98 / 16636) H.Yanagawa, N .Nemot ,E.Miyamoto,Y.Fusimi)によるゲノム機能解析、進化分子工学への応用などの解析能力を従来よりもいっそう向上させることが出来る。 , E.Miyamoto, Y.Fusimi) by functional genomics, the analysis capabilities, such as application to evolutionary molecular engineering can be further improved than in the past.
本発明の第一の発明は、蛋白質に翻訳される情報を含むコード部の3'末端にPEGスペーサー部をライゲーションした翻訳効率の高い翻訳テンプレートとその合成方法であり、そのPEGスペーサー部に機能性修飾物質を持たせることが可能な構成を特徴とし、およびそのテンプレートによって合成された蛋白質やそのライブラリーを提供するものである。 The first invention of the present invention, the translation efficient translation template were ligated PEG spacer portion at the 3 'end of the coding part including the information for translation into a protein and a synthesis thereof, functionality to the PEG spacer portion a can be provided with a modulator structure and features, and there is provided a protein or its library synthesized by the template. また、第二の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートを用いて合成されたC末端ラベル化蛋白質とその合成方法であり、特に、翻訳テンプレートのコード部の3'末端に特別な配列(XA配列)を用いることが特徴であり、また、そのC末端修飾剤に機能性修飾物質を持たせることが可能な構成を特徴とし、およびそのテンプレートによって合成されたC末端修飾された蛋白質とそのライブラリーを提供するものである。 The second invention is the first C-terminal labeled proteins using a translation template synthesized in the invention are methods for their synthesis, in particular, a special sequence to the 3 'end of the coding portion of the translation template (XA is it is characterized with a sequence), also the live and characterized by its C-terminal modifying agent capable to provide a functional modifier substance configured, and a C-terminal modified protein synthesized by the template there is provided a rally. 第三の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートを用いて合成された翻訳テンプレートC末端修飾された蛋白質(対応付け分子)またはPEGスペーサー部でC末端修飾された蛋白質、とそれらの合成方法であり、特に、翻訳テンプレートのコード部の3'末端に特別な配列(A配列)を用いることが特徴であり、また、そのPEGスペーサー部に機能性修飾物質を持たせることが可能な構成を特徴とし、およびそのテンプレートによって合成されたC末端修飾された蛋白質とそのライブラリーを提供するものである。 In the third invention, the first translational template C-terminal modified protein synthesis using a translation template invention of (assigning molecule) or PEG spacer portion at the C-terminal modified proteins, and their synthesis methods There, in particular, it is characterized to use a special sequence (a sequence) at the 3 'end of the coding portion of the translation template, also characterized by configured to be capable to have a functional modifier material to the PEG spacer portion and then, and there is provided combined C-terminal modified protein and the library by that template.
本発明の第一の発明は、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とPEGスペーサー部からなることを特徴とする翻訳テンプレートに関するものである。 The first invention of the present invention relates to translation template characterized by comprising a code portion and a PEG spacer portion having information for translation into a protein. コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の3'末端領域にアクセプター領域(A配列)を持つ、または、コード部の3'末端領域にアクセプター領域(A配列)を持ち、かつA配列の5'上流に翻訳増強配列(X配列)を持つことを特徴とする。 Code portion is information that is translated into protein, and it may be any sequence, preferably, 3 code portion 'end region with acceptor region (A sequence), or, 3 of the code portion' terminal region to have an acceptor region (a sequence), and characterized by having a 5 'upstream translation enhancing sequences of a sequence (X sequence). コード部のA配列として、短いポリA配列を含む。 As A sequence of the coding portion, a short poly-A sequence. X配列として、C(またはG)NNC(またはG)配列を有する配列、たとえば、XhoI配列を有することを特徴とする。 As X sequence, C (or G) NNC (or G) sequence with the sequence, for example, and having a XhoI sequence. PEGスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、コード部と連結するためのドナー領域、および3'末端にCCA領域を持つ。 PEG spacer portion, PEG region containing polyethylene glycol as a main component, a donor region for connecting a code portion, and the 3 'end with a CCA region. PEGスペーサー部は、ドナー領域のみ、CCA領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域を含む構成をとる。 PEG spacer portion, donor region only, but may be only in the CCA region, preferably has a configuration that includes a PEG region containing polyethylene glycol as a main component. CCA領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とし得る。 CCA region, a protein translated by the translation template can be characterized as not having a function of binding by peptide transfer reaction. PEG領域のポリエチレングリコールの分子量は、400以上であることを特徴とし得る。 The molecular weight of the polyethylene glycol PEG region can be characterized as 400 or more. また、ドナー領域および/またはCCA領域において、少なくとも1つの機能付与ユニット(F)を含むことを特徴とし得る。 Further, in the donor region and / or CCA region, it may be characterized in that it comprises at least one function-imparting unit (F). 機能付与ユニット(F1および/またはF2)が、該翻訳テンプレートおよび/または該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。 Function-imparting unit (F1 and / or F2) can be characterized in that immobilizing or fluorescent labeled proteins translated from said translation template and / or said translation template. 固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン,Cy5,またはローダミングリーン(RhG)などが考えられる。 Such as biotin can be considered as an immobilized substance, as a fluorescent substance, fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) is considered. これらのコード分子や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。 These coding molecule and translation templates, and libraries thereof, further relates to proteins and the library translated on the ribosome. 翻訳テンプレートはコード部のみからなるもの(コード分子)であってもよい。 Translation template may be made of only the code portion (coding molecule).
本発明の第二の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートにより翻訳され、修飾剤によってC末端ラベル化された蛋白質に関するものである。 A second aspect of the present invention is translated by the translation template of the first invention is related to C-terminal labeled are proteins by modification agent. 翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とポリエチレングリコールを主成分としたPEGスペーサー部からなる。 Translation template consists PEG spacer portion composed mainly of code portion of polyethylene glycol having information for translation into a protein. コード部は、A配列とX配列を有し、A配列として、短いポリA配列を含む。 Code portion has an A sequence and X sequences, as the A sequence and comprises a short poly-A sequence. X配列として、C(またはG)NNC(またはG)配列を有する配列、たとえば、XhoI配列を有することを特徴とする。 As X sequence, C (or G) NNC (or G) sequence with the sequence, for example, and having a XhoI sequence. PEGスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域において、ポリエチレングリコールの分子量が400以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および/またはCCA領域において、少なくとも1つの機能付与ユニット(F)を含むことを特徴とし得る。 PEG spacer portion, in the PEG region containing polyethylene glycol as a main component, wherein the molecular weight of the polyethylene glycol is 400 or more, in the donor region and / or CCA region, at least one function-imparting unit (F ) it can be characterized as including. CCA領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とし得る。 CCA region, a protein translated by the translation template can be characterized as not having a function of binding by peptide transfer reaction. 機能性修飾物質(F1および/またはF2)が、該翻訳テンプレートおよび/または該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。 Functional modifiers (F1 and / or F2) can be characterized in that immobilizing or fluorescent labeled proteins translated from said translation template and / or said translation template. 固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン,Cy5,またはローダミングリーン(RhG)などが考えられる。 Such as biotin can be considered as an immobilized substance, as a fluorescent substance, fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) is considered. また、修飾剤は、蛋白質のC末端を標識する修飾部とピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部、およびそれらを連結するヌクレオチドのリンカー、からなる。 Further, modifier, peptide acceptor unit comprising the modified portion and puromycin labeling the C-terminus of the protein, and nucleotide linker connecting them, consisting of. また、修飾剤は、修飾部に、機能性修飾物質(F3)を含むことを特徴とし得る。 Further, modifier, the modified portion can be characterized as including functional modifying substance (F3). 該F3が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする。 The F3, characterized in that the immobilizing or fluorescent labeled a translated protein by the translation template. 固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン,Cy5,またはローダミングリーン(RhG)などが考えられる。 Such as biotin can be considered as an immobilized substance, as a fluorescent substance, fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) is considered. これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質および蛋白質のライブラリーに関するものである。 These code part and translation template, and libraries thereof, in the presence of a modifying agent, to a library of proteins and proteins, characterized in that it is synthesized by being translated on the ribosome.
本発明の第三の発明は、翻訳テンプレートによってC末端修飾された蛋白質(=対応付け分子)に関するものである。 A third aspect of the present invention relates to C-terminal modified protein by translation template (ie, assigning molecule). 翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とPEGスペーサー部からなる。 Translation template consists code portion and a PEG spacer portion having information for translation into a protein. コード部の3'末端にA配列を有し、A配列は、短いポリA配列を含む。 An A sequence at the 3 'end of the coding unit, A sequence comprises a short poly-A sequence. PEGスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域において、ポリエチレングリコールの分子量が400以上であることを特徴とする、また、ドナー領域および/またはCCA領域において、少なくとも1つの修飾物質(F1および/またはF2)を含むことを特徴とし得る。 PEG spacer portion, in the PEG region containing polyethylene glycol as a main component, wherein the molecular weight of the polyethylene glycol is 400 or more, in the donor region and / or CCA region, at least one modifier (F1 and / or characterized in that it comprises an F2). また、CCA領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはCCA領域にピューロマイシンを有する。 Further, CCA region, and said translation template protein translated by characterized by having a function of binding by peptide transfer reaction, typically having a puromycin CCA region. また、修飾物質(F1および/またはF2)が、該翻訳テンプレートおよび/または該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。 Furthermore, modulator (F1 and / or F2) can be characterized in that immobilizing or fluorescent labeled proteins translated from said translation template and / or said translation template. 固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン,Cy5,またはローダミングリーン(RhG)などが考えられる。 Such as biotin can be considered as an immobilized substance, as a fluorescent substance, fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) is considered. これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質(=対応付け分子)および蛋白質(=対応付け分子)のライブラリーに関するものである。 These code part and translation template, and libraries, to a library of proteins synthesized by being translated on the ribosome (ie, assigning molecule) and proteins (ie, assigning molecule).
これら3つの発明を応用した発明として、コード分子および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーを用いて、無細胞翻訳系、および細胞での蛋白質の大量合成が可能であり、蛋白質の構造と機能解析が実現できる。 An invention which applies the three invention, by using the coding molecule and translation templates, and libraries thereof, cell-free translation system, and is capable of mass production of proteins in a cell, the structure and functional analysis of proteins achieved it can. また、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質(=蛋白質、C末端ラベル化蛋白質、対応付け分子)およびそのライブラリーのいろいろな組み合わせを用いて、in vitroまたはin vivoで蛋白質と物質の相互作用解析が可能である。 Furthermore, proteins synthesized by being translated on the ribosome (= protein, C-terminal, labeled proteins, assigning molecule) with various combinations of and libraries thereof of the proteins and substances in vitro or in vivo interaction analysis is possible. たとえば、対応付け分子は、分子進化工学的な機能物質の創製やゲノム機能解析に利用できる(図4)。 For example, assigning molecules can be used to create and functional genomics of molecular evolution engineering functional material (Figure 4). 蛋白質と物質の相互作用解析において、翻訳テンプレートとそのライブラリーおよび/または蛋白質とそのライブラリーを蛍光ラベル化および/または固定化することを特徴とする蛋白質と物質の相互作用解析も可能である(図5)。 In interaction analysis of proteins and substances are also possible interaction analysis of proteins and substances, characterized in that the fluorescently labeled and / or immobilized translation template and the library and / or protein libraries thereof ( Figure 5). たとえば、各種のアフィニティー・スクリーニング、マイクロアレイやプロテインチップは、固定化の例であり、FCCS解析などは、蛍光ラベル化の例である(図5)。 For example, various affinity screening microarrays and protein chips is an example of immobilization, etc. FCCS analysis, an example of a fluorescently labeled (Figure 5). 以上の解析は、in vitroにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。 Or more of the analysis, can also be used in combination with a co-translation and co-translation screening method in in vitro.
本発明は、より詳細には、以下のものを提供する。 The present invention is more particularly, provides the following.
1. 1. 蛋白質に翻訳される情報を持つORF領域およびその3'末端領域を有し、3'末端領域は、アクセプター領域と、アクセプター領域の5'上流に、配列SNNSを含む翻訳増強配列とを含むことを特徴とするコード分子。 'I have a terminal region, 3' ORF region and 3 with information for translation into a protein-terminal region, and the acceptor region, the 5 'upstream of the acceptor region to include a translation enhancing sequences comprising the sequence SNNS code molecules characterized.
2. 2. アクセプター領域が、長さ2〜10塩基のポリA配列を含むことを特徴とする1記載のコード分子。 Acceptor region, coding molecule of 1, wherein the comprises a poly A sequence of length 2 to 10 bases.
3. 3. X配列がSNNS配列であることを特徴とする1または2記載のコード分子。 Coding molecule of 1 or 2, wherein the X sequence is SNNS sequence.
4. 4. X配列がXhoI配列であることを特徴とする1または2記載のコード分子。 Coding molecule of 1 or 2, wherein the X sequence is XhoI sequences.
5. 5. 1〜4のいずれか1項に記載されたコード分子のライブラリー。 A library of coding molecule according to any one of 1 to 4.
6. 6. 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結するためのドナー領域を持つPEGスペーサー部を含み、コード部が1〜4のいずれか1項に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。 Includes a PEG spacer portion having a donor area for connecting at least the code portion and the code portion having the information for translation into a protein, the code portion is derived from the coding molecule described item 1 or one of the 1-4 Translation template.
7. 7. スペーサー部が、コード部と連結するためのドナー領域、およびポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、および3'末端にCCA領域を持つことを特徴とするPEGスペーサー分子に由来する6記載の翻訳テンプレート。 Spacer unit is a donor region for connecting a code portion, and polyethylene glycol PEG region as a main component, and 3 'translational template terminus wherein 6 derived from the PEG spacer molecule characterized by having a CCA region .
8. 8. ポリエチレングリコールの分子量が400以上であることを特徴とする7記載の翻訳テンプレート。 Translation template 7, wherein the molecular weight of the polyethylene glycol is 400 or more.
9. 9. CCA領域が、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする7記載の翻訳テンプレート。 CCA region, the translation and protein translated by the template, translation templates 7, wherein a does not have the function of binding by peptide transfer reaction.
10. 10. CCA領域にピューロマイシンを有することを特徴とする9記載の翻訳テンプレート。 9 wherein the translation template, characterized in that it comprises a puromycin CCA region.
11. 11. ドナー領域に機能付与ユニットF1および/またはCCA領域に機能付与ユニットF2を含むことを特徴とする7〜10のいずれか1項に記載の翻訳テンプレート。 Translation template according to any one of 7 to 10, characterized in that it comprises a function-imparting unit to the donor regions F1 and / or function-imparting unit F2 in the CCA region.
12. 12. 機能付与ユニットF1および/またはF2が、該翻訳テンプレートを固定化および/または蛍光ラベル化するものであることを特徴とする11に記載の翻訳テンプレート。 Function-imparting unit F1 and / or F2 is, translation template according to 11, characterized in that the immobilization and / or fluorescently labeled the translation template.
13. 13. 機能付与ユニットF1および/またはF2がビオチンであることを特徴とする12記載の翻訳テンプレート。 12 translation template according to function-imparting unit F1 and / or F2 is equal to or is biotin.
14. 14. 機能付与ユニットF1および/またはF2が、フルオレセイン、Cy5、またはローダミングリーンであることを特徴とする12記載の翻訳テンプレート。 Function-imparting unit F1 and / or F2 are fluorescein, Cy5 or translation template 12 wherein the rhodamine green.
15. 15. 6〜14のいずれか1項に記載された翻訳テンプレートのライブラリー。 Library of translation templates according to any one of 6-14.
16. 16. 6〜14のいずれか1項に記載された翻訳テンプレートがリボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。 Protein, characterized in that it is synthesized by translation template according to any one of 6 to 14 is translated on the ribosome.
17. 17. 15に記載された翻訳テンプレートのライブラリーがリボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。 Protein libraries, characterized in that it is synthesized by a library of translation templates described in 15 is translated on the ribosome.
18. 18. 6〜14のいずれか1項に記載された翻訳テンプレートが、修飾部と、ピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部と、それらを連結するヌクレオチドのリンカーとを含む、蛋白質のC末端を標識する修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。 Any one translation template described in the 6 to 14, the modified portion and the peptide acceptor unit containing puromycin, and a linker nucleotide connecting them, modifying agent to label the C-terminus of the protein in the presence of protein, characterized in that it is synthesized by being translated on the ribosome.
19. 19. 修飾部において、少なくとも1つの機能付与ユニットF3を含むことを特徴とする18に記載の蛋白質。 In the modified portion, the protein according to 18, characterized in that it comprises at least one function-imparting unit F3.
20. 20. 機能付与ユニットF3が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする19記載の蛋白質。 Function-imparting unit F3 is, protein 19, wherein the immobilizing or fluorescent labeled a translated protein by the translation template.
21. 21. 機能付与ユニットF3がビオチンであることを特徴とする20記載の蛋白質。 Protein according 20 to function-imparting unit F3 is characterized in that it is a biotin.
22. 22. 機能付与ユニットF3が、フルオレセイン,Cy5,またはローダミングリーンであることを特徴とする20記載の蛋白質。 Function-imparting unit F3 is, fluorescein, Cy5, or protein 20 wherein the rhodamine green.
23. 23. 15に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、修飾部と、ピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部と、それらを連結するヌクレオチドのリンカーとを含む、蛋白質のC末端を標識する修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。 Libraries of translation templates described in 15, the modified portion, and the peptide acceptor unit containing puromycin, and a linker nucleotide connecting them, in the presence of a modifying agent to label the C-terminus of the protein , protein libraries, characterized in that it is synthesized by being translated on the ribosome.
24. 24. 修飾部において、少なくとも1つの機能付与ユニットF3を含むことを特徴とする23に記載の蛋白質のライブラリー。 In the modified portion, protein library of 23, characterized in that it comprises at least one function-imparting unit F3.
25. 25. 機能付与ユニットF3が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする24記載の蛋白質のライブラリー。 Function-imparting unit F3 is, protein library of 24, wherein the immobilizing or fluorescent labeled a translated protein by the translation template.
26. 26. 機能付与ユニットF3がビオチンであることを特徴とする25記載の蛋白質のライブラリー。 Protein library of 25, wherein the function-imparting unit F3 is biotin.
27. 27. 機能付与ユニットF3が、フルオレセイン,Cy5,またはローダミングリーンであることを特徴とする25記載の蛋白質のライブラリー。 Function-imparting unit F3 is, fluorescein, Cy5 or protein library of 25, wherein the rhodamine green.
28. 28. 蛋白質に翻訳される情報を持つORF領域およびその3'末端領域を有し、3'末端領域は、長さ2〜10塩基のポリA配列を含むアクセプター領域を含むことを特徴とするコード分子。 'Has a terminal region, 3' ORF region and 3 with information for translation into a protein-terminal region, encoding molecules comprising an acceptor region including a poly (A) sequence of length 2 to 10 bases.
29. 29. 28に記載されたコード分子のライブラリー。 A library of coding molecules described 28.
30. 30. 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結するためのドナー領域を持つPEGスペーサー部を含み、コード部が28に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。 Includes a PEG spacer portion having a donor area for connecting at least the code portion and the code portion having the information for translation into a protein, the code portion is from a code molecule according to 28 translation template.
31. 31. スペーサー部が、コード部と連結するためのドナー領域、およびポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、および3'末端にCCA領域を持つことを特徴とするPEGスペーサー分子に由来する30記載の翻訳テンプレート。 Spacer unit is a donor region for connecting a code portion, and the PEG region containing polyethylene glycol as a main component, and 3 'translational template 30, wherein from PEG spacer molecule, characterized in that the end with the CCA region .
32. 32. CCA領域が、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とする31記載の翻訳テンプレート。 CCA region, translation template feature to 31, wherein further comprising a protein translated by the translation template, the function of binding by peptide transfer reaction.
33. 33. CCA領域にピューロマイシンを有することを特徴とする32記載の翻訳テンプレート。 32 Translation template, wherein a has a puromycin CCA region.
34. 34. 30〜33のいずれか1項に記載された翻訳テンプレートのライブラリー。 And libraries of translation template according to any one of 30 to 33.
35. 35. 30〜33のいずれか1項に記載された翻訳テンプレートが、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。 Translation template according to any one of 30 to 33, protein characterized in that it is synthesized by being translated on the ribosome.
36. 36. 34に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。 Library of translation templates described in 34, protein libraries, characterized in that it is synthesized by being translated on the ribosome.
37. 37. コード部を持たないことを特徴とする35記載の蛋白質。 Protein 35, wherein the no-coding unit.
38. 38. 蛋白質がコード部を持たないことを特徴とする36記載の蛋白質のライブラリー。 Protein library of 36 protein is characterized in that no code portion.
39. 39. 37に記載された蛋白質または38記載のライブラリーにおけるコード部を、RNaseによって切断することを特徴とする蛋白質またはそのライブラリーの製造法。 Protein or preparation of the library, characterized in that cutting the cord section in the library have been protein or 38, wherein wherein the RNase to 37.
40. 40. 16、18〜23、35および37のいずれか1項に記載の蛋白質、または、17、23〜27、36および38のいずれか1項に記載の蛋白質のライブラリーと物質を相互作用させて相互作用を解析することを含む、蛋白質と物質の相互作用解析方法。 16,18~23,35 and 37 proteins according to any one of, or each other to interact with the library and the substance of the protein according to any one of 17,23~27,36 and 38 It comprises analyzing the action, interaction analysis method of protein and substance.
41. 41. 相互作用の解析が、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、または、固相酵素免疫検定法により行われる、40記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。 Analysis of interaction, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer method, evanescent field molecular imaging method, fluorescence depolarization method, surface plasmon resonance, or enzyme linked immunosorbent assay, protein and interaction analysis method for a substance of 40 described.
42. 42. 35に記載の蛋白質、または、36記載の蛋白質のライブラリーにおいて、該蛋白質のC末端に結合したコード部の塩基配列の増幅により蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。 Protein described in 35, or in a library of protein according 36, a method of detecting interaction of the protein and substance by amplification of the nucleotide sequence of the coding portion which is attached to the C-terminus of the protein.
43. 43. 無細胞共翻訳法または無細胞共翻訳スクリーニング法を用いることを特徴とする42記載の蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。 Method of detecting interaction of the protein and substance 42, wherein the use of cell-free cotranslation method or cell-free cotranslation screening methods.
44. 44. 相互作用の解析において、翻訳テンプレートとそのライブラリーを蛍光ラベル化および/または固定化することを特徴とする、41記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。 In the analysis of the interaction, the translation templates and characterized by fluorescent labeling and / or immobilization of the library, protein and interaction analysis method for a substance according 41.
45. 45. 相互作用の解析において、蛋白質とそのライブラリーを蛍光ラベル化および/または固定化することを特徴とする、40記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。 In the analysis of the interaction, characterized by fluorescent labeling and / or immobilization proteins and libraries thereof, 40 protein and interaction analysis method for a substance according.
46. 46. 相互作用の解析において、in vitroで蛋白質と物質の相互作用を解析する40載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。 In the analysis of the interaction, a method for analyzing the interaction of protein and substance 40 mounting analyzing protein interactions and substances in vitro.
47. 47. 相互作用の解析において、in vitroで共翻訳法を利用することを特徴とする46記載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。 In the analysis of the interaction, a method for analyzing the interaction of protein and substance 46, wherein utilizing the co-translational process in in vitro.
48. 48. 1〜4および28のいずれか1項に記載されたコード分子もしくは6〜14および30〜33のいずれか1項に記載された翻訳テンプレートまたはそのライブラリーをリボソーム上で翻訳することを含む蛋白質またはそのライブラリーの製造方法。 Protein or a translating translation template or the library according to any one of code molecule or 6-14 and 30-33 recited in any one of 1 to 4 and 28 on the ribosome manufacturing method of the library.
発明を実施するための最良の形態本発明の翻訳テンプレートがリボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質のうち、翻訳テンプレートと結合している蛋白質(対応付け分子)、さらに修飾剤の存在下で同様に合成される蛋白質(C末端ラベル化蛋白質)に関して、まず、本発明を説明する。 Of the proteins synthesized by the translation template of the best mode invention for carrying out the invention is translated on the ribosome, the protein (assigning molecule) which joins the translation template, the presence of a further modifying agent proteins synthesized in the same manner in respect (C-terminal labeled protein), first described the present invention. なお、本明細書において塩基を表す記号は、特記しない限り、WIPO Standard ST. Symbols representing the base in the present specification, unless otherwise indicated, WIPO Standard ST. 25の定義によるものである。 It is due to the definition of 25. <1>対応付け分子本明細書において、対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。 <1> In assigning molecule present specification, the assigning molecule means a molecule that associates with the phenotype and genotype. 対応付け分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現型の発現に関与するタンパク質を含む表現型分子とが結合してなる。 Assigning molecules, and genetic type molecule comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence reflecting the genotype, and phenotype molecule comprising a protein involved in phenotypic expression is bound. 遺伝子型分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を、その塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。 Genotype molecule, a nucleotide sequence reflecting the genotype, and the coding molecule comprising in a form such that nucleotide sequence can be translated, made by bonding a spacer portion.
対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。 In assigning molecule, moiety derived from a phenotype molecule, moiety derived from the spacer molecule, and each portion derived from the coding molecule, decoding unit, called a spacer part and a coding part. また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。 Further, in the genotype molecule, moiety derived from the spacer molecule, and each portion derived from the coding molecule, called a spacer part and a coding part.
図19に、対応付け分子、スペーサー分子およびコード分子の一例の大まかな構成を示す。 Figure 19 illustrates the assigning molecule, a rough structure of an example of a spacer molecule and the coding molecule. この対応付け分子は、ピューロマイシンを含むスペーサー(スペーサー部と呼ぶ)と表現型のコードを反映する塩基配列(コード部と呼ぶ)からなる。 The assigning molecule consists spacer (referred to as the spacer portion) and the nucleotide sequence to reflect the phenotype of code containing puromycin (referred to as code portion). この対応付け分子は、コード分子に何らかの方法によってピューロマイシンを含むスペーサー部を結合して遺伝子型分子とし、無細胞翻訳系において、リボソーム上で表現型分子と連結した構成をもつ。 The assigning molecule combines the spacer portion comprising a puromycin some way to the coding molecule and the genotype molecule in a cell-free translation system, with the configuration in conjunction with a phenotype molecule on the ribosome. スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、少なくともピューロマイシンまたはピューロマイシンと1残基以上のDNAおよび/またはRNAからなるCCA領域、少なくとも1残基以上のDNAおよび/またはRNAを含むドナー領域、さらに、少なくとも1残基のDNAおよび/またはRNAの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニット(X)からなる。 Spacer molecules are, PEG region containing polyethylene glycol as a main component, a donor containing at least puromycin or puromycin and 1 or more residues of DNA and / or CCA region consisting RNA, of at least one or more residues DNA and / or RNA region, further comprising at least one residue of DNA and / or function-imparting unit which has been subjected to functional modified RNA nucleotide (X). コード分子は、デコード部の一部の配列からなるDNAおよび/またはRNAのポリA配列を含む3'末端領域、および、DNAおよび/またはRNAからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ5'UTR、さらに、主として表現型分子の配列からなるORF領域から構成される。 Coding molecule is 3 'end region including a poly (A) sequence of DNA and / or RNA consisting of a portion of the sequence of the decoding unit, and, 5'UTR including a transcription promoter and a translation enhancer consisting of DNA and / or RNA, Furthermore, it consists ORF region mainly consisting of the sequence of phenotype molecule. 以下、この例を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 Will now be described with reference to this example, the present invention is not limited thereto.
<1−1>スペーサー分子スペーサー分子は、核酸の3'末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域と、PEG領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。 <1-1> spacer molecule spacer molecule is a donor region that can be attached to the 3 'end of the nucleic acid, bound to the donor area, the PEG region containing polyethylene glycol as a main component, attached to the PEG region, by peptide transfer reaction and a peptide acceptor region containing a group capable of binding with the peptide.
核酸の3'末端に結合できるドナー領域は、通常、1以上のヌクレオチドからなる。 Donor region that can be attached to the 3 'end of the nucleic acid usually consists of one or more nucleotides. ヌクレオチドの数は、通常には1〜15、好ましくは1〜2である。 The number of nucleotides, usually 1 to 15, preferably 1 to 2. ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。 Nucleotides may be deoxyribonucleotides also a ribonucleotide.
ドナー領域の5'末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。 Sequence of the 5 'end of the donor region affects the ligation efficiency. コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも1残基のdC(デオキシシチジル酸)または2残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。 To ligate the code portion and the spacer portion, it is necessary to include at least one or more residues, for an acceptor having a poly-A sequence and at least one residue of dC (deoxycytidylic acid) or 2 residues dCdC (dideoxycytidylic acid) are preferred. 塩基の種類としては、C>UまたはT>G>Aの順で好ましい。 The type of base, preferred in the order of C> U or T> G> A.
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。 PEG region is mainly composed of polyethylene glycol. ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20bp以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が400以上であることを意味する。 Here, the main component, the total number of nucleotides contained in the PEG region 20bp less, or is meant the average molecular weight of the polyethylene glycol is 400 or more. 好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10bp以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が1000以上であることを意味する。 Preferably the total number of nucleotides is 10bp less, or is meant the average molecular weight of the polyethylene glycol is 1000 or more.
PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400〜30,000、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜8,000である。 Average molecular weight of the polyethylene glycol in the PEG region is usually 400~30,000, preferably 1,000 to 10,000, more preferably 2,000 to 8,000. ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが(Liu,R.,Barrick,E.,Szostak,J.W.,Roberts,R.W.(2000)Methods in Enzymology,vol.318,268−293)、分子量1000以上、より好ましくは2000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。 Here, the molecular weight of the polyethylene glycol is less than about 400, when translated associates genotype molecule containing a spacer portion derived from the spacer molecule, it is possible to post-assigning translation is required ( Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology, vol.318,268-293), molecular weight of 1,000 or more, more preferably 2000 or more PEG with, since it is associated with a high efficiency only assigning translation, post-translation is not required. また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。 Further, the molecular weight of the polyethylene glycol increases, there is a tendency to increase stability of the genotype molecule, is good in particular molecular weight of 1000 or more, it may become unstable regardless so that DNA spacer and nature at the molecular weight of 400 or less .
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのC末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3'−N−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド(3'−N−Aminoacylpuromycin aminonucleoside,PANS−アミノ酸)、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS−Gly、バリンのPANS−Val、アラニンのPANS−Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS−全アミノ酸が利用できる。 Peptide acceptor region is not particularly limited as long as it can bind to the C-terminus of the peptide, e.g., puromycin, 3'-N-aminoacyl puromycin aminonucleoside (3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS- amino) , for example PANS-Gly in the amino acid portion is glycine, valine PANS-Val, alanine PANS-Ala, other, corresponding to the entire amino acid PANS- total amino acids can be utilized. また、化学結合として3'−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'−N−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド(3'−Aminoacyladenosine aminonucleoside,AANS−アミノ酸)、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS−Gly、バリンのAANS−Val、アラニンのAANS−Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS−全アミノ酸が利用できる。 Moreover, 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside (3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside the carboxyl group of the amino group with amino acids 3'-amino adenosine as a chemical bond is connected by an amide bond formed result dehydration condensation, AANS-amino ), for example AANS-Gly of the amino acid portion is glycine, valine AANS-Val, alanine AANS-Ala, other, corresponding to the entire amino acid AANS- total amino acids can be utilized. また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。 Further, such as those resulting from binding of a nucleoside or nucleoside and amino acid ester it can also be used. その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。 Other can utilize all if a substance having a chemical structure similar to a nucleoside or nucleoside, a substance having a chemical structure similar to an amino acid or amino acid that chemically bondable bonding mode.
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、または、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは2残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。 Peptide acceptor region preferably comprises puromycin or a derivative or, preferably made of deoxyribonucleotides or ribonucleotides puromycin or a derivative thereof and one or two residues. ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのC末端に結合できる誘導体を意味する。 Here, the derivative means a derivative that can bind to the C-terminus of the peptide in a protein translation system. ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。 Puromycin derivatives include not limited to those completely have a puromycin structure, even those portions of the puromycin structure is missing. ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANS−アミノ酸、AANS−アミノ酸などが挙げられる。 Specific examples of the puromycin derivative, PANS-amino acids, such as AANS- amino acids.
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5'側に1残基以上のDNAおよび/またはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。 Peptide acceptor region may have a structure of puromycin alone, it preferably has a nucleotide sequence consisting of 1 or more residues of DNA and / or RNA to 5 'side. 配列としては、dC−ピューロマイシン,rC−ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC−ピューロマイシン,rCrC−ピューロマイシン,rCdC−ピューロマイシン,dCrC−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−tRNAの3'末端を模倣したCCA配列(Philipps,G.R.(1969)Nature 223,374−377)が適当である。 The sequence, dC-puromycin, etc. rC- puromycin, more preferably dCdC- puromycin, RCrC- puromycin RCdC- puromycin, an array of such dCrC- puromycin, a 3 'end of the aminoacyl -tRNA mimicking CCA sequence (Philipps, G.R. (1969) Nature 223,374-377) are suitable. 塩基の種類としては、C>UまたはT>G>Aの順で好ましい。 The type of base, preferred in the order of C> U or T> G> A.
スペーサー分子は、ドナー領域とPEG領域との間に、少なくとも1つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。 Spacer molecules are, between the donor region and the PEG region, preferably includes at least one function-imparting unit. 機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも1残基のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。 Function-imparting unit are preferably those subjected to base function modifier deoxyribonucleotides or ribonucleotides at least one residue. 例えば、機能修飾物質として、固定化や蛍光ラベル化のための物質が挙げられる。 For example, the functional modifier include substances for immobilization or fluorescent labeling is. 具体例としては、図20に示した蛍光物質、ビオチン、またはHis−tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。 As a specific example, it is possible that by introducing a fluorescent substance, biotin, or His-tag and various separation tags, shown in FIG. 20.
図20に、スペーサー分子の一例の詳細な構成を示す。 Figure 20 shows a detailed structure of an example of a spacer molecule. スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域、ピューロマイシンまたはピューロマイシンと少なくとも1残基のDNAおよび/またはRNAからなるCCA領域、少なくとも1残基以上のDNAおよび/またはRNAを含むドナー領域、さらに、少なくとも1残基のDNAおよび/またはRNAの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニット(X)からなる。 Spacer molecules are, PEG region containing polyethylene glycol as a main component, CCA region consisting of DNA and / or RNA of at least one residue and puromycin or puromycin, donor region comprising the least one or more residues DNA and / or RNA further comprising at least one residue of DNA and / or function-imparting unit which has been subjected to functional modified RNA nucleotide (X). ここでは、機能付与ユニット(X)として蛍光物質T(F1)とビオチンT(Bio)が用いられている。 Here, the fluorescent substance T (F1) and biotin T (Bio) is used as the function-imparting unit (X).
<1−2>コード分子コード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'側に結合した、アクセプター領域(通常にはポリA配列)および、必要によりその5'側に翻訳増強配列(例えば制限酵素XhoIが認識する配列)を含む3'末端領域を含む核酸である。 <1-2> coding molecule encoding molecule, 'untranslated regions, 5' 5 comprising a transcription promoter and a translation enhancer linked to the 3 'side of the untranslated region, an ORF region encoding a protein, 3 of the ORF region 'attached to the side, (poly a sequence usually) acceptor region and its 5 necessary' is a nucleic acid containing a 3 'end region including translation enhancement sequences to side (e.g., restriction enzyme XhoI recognizes sequences).
コード分子は、DNAでもRNAでもよく、RNAの場合、5'末端にCap構造があってもなくても良い。 The coding molecule is, DNA even better even RNA, the case of RNA, the 5 'end may or may not have a Cap structure. また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。 Further, the coding molecule may be as incorporated into any vector or plasmid.
3'末端領域は、例えば、XhoI配列とその下流にポリA配列を含む。 3 'terminal region, for example, include a poly-A sequence and downstream thereof XhoI sequences. スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては3'末端領域のポリA配列が重要であり、ポリA配列は、少なくとも2残基以上のdAおよび/またはrAの混合または単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは6以上、さらに好ましくは8残基以上のポリA連続鎖である。 Factors affecting the ligation efficiency of the spacer molecule and the coding molecule is important poly A sequence at the 3 'end region, a poly A sequence, mixing or single at least 2 residues or more dA and / or rA poly a is continuous chain, preferably, 3 or more residues, more preferably 6 or more, still more preferably 8 or more residues of the poly a continuous chain.
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5'UTR、および、ポリA配列を含む3'末端領域の組み合わせがある。 Factors that affect the translational efficiency of the coding molecule, 5'UTR comprising a transcription promoter and a translation enhancer, and a combination of 3 'end region containing a poly A sequence. 3'末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。 3 'The effect of the poly A sequence of the terminal region is usually exerted by the following 10 residues. 5'UTRの転写プロモーターはT7/T3またはSP6などが利用でき、特に制限はない。 Transcriptional promoter 5'UTR are available and T7 / T3 or SP6, is not particularly limited. 好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。 Preferably SP6, especially when using a sequence comprising a portion of the omega sequence and omega sequence as the translation enhancer sequence are particularly preferably used SP6. 翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列(Gallie D.R.,Walbot V.(1992)Nucleic Acids Res.,vol.20,4631−4638)の一部(029)を含んだものが好ましい。 Translation enhancer is preferably a part of the omega sequence, as part of the omega sequence is, omega sequence of TMV (Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol.20,4631-4638 ) of those containing a part (029) is preferred.
また、翻訳効率に関し、3'末端領域においては、XhoI配列とポリA配列の組み合わせが重要となる。 Also relates to translation efficiency, 3 'in the end region, the combination of the XhoI sequence and a poly A sequence is important. また、ORF領域の下流部分、すなわちXhoI配列の上流に親和性タグがついたものとポリA配列の組み合わせも重要となる。 Also, the combination of the downstream portion of the ORF region, ie, those with affinity tags upstream of XhoI sequence and a poly A sequence is also important. 親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。 The affinity tag sequence such as an antigen-antibody reaction, may be a sequence for using any means proteins can detect, it is not limited. 好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag−tag配列である。 Preferably, a Flag-tag sequence, which is a tag for affinity separation analysis by an antigen-antibody reaction. ポリA配列効果としては、Flag−tag等の親和性タグにXhoI配列がついたものとそこへさらにポリA配列がついたものの翻訳効率が上昇する。 The poly (A) sequence effects, translation efficiency although affinity tag further poly A sequence thereto to those with a XhoI sequence with such Flag-tag is increased.
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。 Configuration which is effective relates to the aforementioned translation efficiency is also effective in assigning efficiency.
ORF領域については、DNAおよび/またはRNAからなるいかなる配列でもよい。 The ORF region, may be any sequence comprising DNA and / or RNA. 遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。 Gene sequences, exon sequences, intron sequences, random sequences, or sequences of any nature, are capable artificial sequence, and the sequence is not limited. また、コード分子の5'UTRをSP6+029とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+A (n=8)とすることで、各長さは、5'UTRで約60bp、3'末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。 Further, the 5'UTR of the coding molecule and SP6 + 029, 'the end region, for example, by a Flag + XhoI + A n (n = 8), each length of about 60 bp, 3 at 5'UTR' 3 about at the end region a 40 bp, the length that can be incorporated as an adapter region primers for PCR. このため、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5'UTRと3'末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。 Therefore, by PCR from any vector or plasmid or cDNA library may easily create coding molecule having a 5'UTR and 3 'terminal region. コード分子において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。 In coding molecule, the translation may be beyond the ORF region. すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。 That is, there may be no termination codon at the end of the ORF region.
図21に、コード分子の一例の詳細な構成を示す。 Figure 21 shows a detailed structure of an example of a coding molecule. コード分子は、3'末端領域と、DNAおよび/またはRNAからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'UTRと、デコード部の配列情報からなる、すなわち表現型タンパク質をコードするORF領域とからなる。 Coding molecule consists of three 'and terminal region, a 5'UTR comprising a transcription promoter and a translation enhancer consisting of DNA and / or RNA, consisting of the sequence information of the decoding unit, i.e. the ORF region encoding a phenotype protein. ここでは、3'末端領域として、DNAおよび/またはRNAからなる親和性タグ配列、XhoI配列、ポリA配列を含み、Flag−tag配列を用いている。 Here, as the 3'-terminal region, an affinity tag sequence consisting of DNA and / or RNA, XhoI sequence comprises a poly A sequence, we are used Flag-tag sequence. 5'UTRとして、転写プロモーターのSP6、翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部である029を含む配列を用いている。 As 5'UTR, it is using an array containing the SP6 transcriptional promoter, which is part of the omega sequence of translational enhancer 029.
<1−3>遺伝子型分子およびその製造方法遺伝子型分子(翻訳テンプレート)は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含む核酸であるコード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域とが結合してなる。 <1-3> genotype molecule and its manufacturing method genotype molecule (translation template) is' untranslated regions, 5 '5 comprising a transcription promoter and a translation enhancer linked to the 3' side of the untranslated region, a protein and ORF region encoding, 'bound to side, 3 comprises a poly a sequence 3' of the ORF region 3 'and end of the coding molecule is a nucleic acid comprising a terminal region formed by bonding the donor region of the spacer molecule.
遺伝子型分子を構成するコード分子は、コード分子について説明したとおりである。 Coding molecule constituting the genotype molecule is as described coding molecule. しかしながら、必要により発現増強配列を有することが好ましい。 However, it is preferable to have expression enhancing sequences necessary.
遺伝子型分子は、上記コード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。 Genotype molecule, 3 'and end of the coding molecule, the donor region of the spacer molecule, can be prepared by binding by conventional ligase reaction. 反応条件としては、通常、4〜25℃で4〜48時間の条件が挙げられ、PEG領域を含むスペーサー分子のPEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、15℃で0.5〜4時間に短縮することも可能である。 The reaction conditions generally include conditions 4 to 48 hours at 4 to 25 ° C., in the case of adding polyethylene glycol having the same molecular weight as polyethylene glycol PEG region of the spacer molecule containing a PEG region to the reaction system it is also possible to shorten the 0.5-4 hours at 15 ° C..
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。 The combination of the spacer molecule and the coding molecule results in a significant effect on ligation efficiency. アクセプターにあたるコード部の3'末端領域において、少なくとも2残基以上、好ましくは3残基以上、さらに好ましくは6〜8残基以上のDNAおよび/またはRNAのポリA配列があること、さらに、5'UTRの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列(029;図21)が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも1残基のdC(デオキシシチジル酸)または2残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。 At the 3 'end region of the coding portion corresponding to the acceptor, at least 2 residues or more, preferably 3 or more residues, there is more preferably 6-8 residues or more DNA and / or RNA of poly (A) sequence, further, 5 'the UTR translational enhancer, a partial sequence of the omega sequence; preferably (029 FIG. 21), as a donor region of the spacer portion and at least one residue of dC (deoxycytidylic acid) or two residues dCdC (dideoxy cytidylic acid) are preferred. このことによって、RNAリガーゼを用いることでDNAリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を60〜80%に保つことができる。 This allows to avoid the problems of DNA ligase by using RNA ligase, and the efficiency can be kept at 60-80%.
遺伝子型分子がRNAである場合には、(a)転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含むコード分子の3'末端と、(b)上記のスペーサー分子のドナー領域であってRNAからなるものとを、スペーサー分子内のPEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、RNAリガーゼにより結合させることが好ましい。 When genotype molecule is RNA, and (a) a transcriptional promoter and 5 'untranslated regions, 5' containing a translational enhancer linked to the 3 'side of the untranslated region, ORF region encoding the protein, ORF 'attached to the side, 3 comprises a poly a sequence 3' region 3 'and end of the coding molecule comprising a terminal region and made of RNA a donor region of (b) above spacer molecules, the spacer molecules in the presence of free polyethylene glycol having the same molecular weight as polyethylene glycol constituting the PEG region of the inner, it is preferred to attach the RNA ligase.
ライゲーション反応時に、PEG領域を含むスペーサー部のPEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が80〜90%以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。 During the ligation reaction, by the addition of polyethylene glycol having the same molecular weight as PEG region of the spacer portion containing the PEG region, ligation efficiency irrespective of the molecular weight of the polyethylene glycol spacer portion is increased to more than 80-90%, after the reaction it is possible to omit the separation process.
<1−4>対応付け分子およびその製造方法対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結してなるものである。 <1-4> assigning molecule and its manufacturing method assigning molecules, the genotype molecule, a peptide transfer reaction, in conjunction with the phenotype molecule is a protein encoded by the ORF region in the genotype molecule it become one.
対応付け分子は、遺伝子型分子を、リボゾーム上で翻訳(例えば無細胞翻訳系で翻訳)することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結することにより。 Assigning molecules, the genotype molecule, by translating on ribosomes (e.g. translation in a cell-free translation system), peptide transfer reactions, a phenotype molecule is a protein encoded by the ORF region in the genotype molecule by linking.
無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球のものである。 Cell-free translation system is preferably of wheat germ or rabbit reticulocytes. 翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。 Conditions of the translation may be the conditions are commonly employed. 例えば、25〜37℃で15〜240分の条件が挙げられる。 For example, conditions of 15 to 240 minutes at 25 to 37 ° C..
無細胞翻訳系については、これまで大腸菌(E.coli)、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系で対応付け分子の形成が検討され、ウサギ網状赤血球の系でのみ対応付け分子が確認されていたが(Nemoto,N.,Miyamoto−Sato,E.,Yanagawa,H.(1997)FEBS Lett.414,405;Roberts,R.W,Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,12297)、この態様によれば、PEG領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子として、小麦胚芽の系でも対応付け分子の形成を行うことができる。 The cell-free translation system, which until E. (E. coli), rabbit reticulocytes, formation of assigning molecules in the system of wheat germ is considered, although the assigning molecule only in a system of rabbit reticulocyte has been confirmed (Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H (1997) FEBS Lett.414,405;.. Roberts, R.W, Szostak, J.W (1997) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94,12297), according to this embodiment, as the assigning molecule having a spacer portion containing the PEG region, it is possible to form molecular associates in the system of wheat germ. また、これまでウサギ網状赤血球の系では遺伝子型分子の安定性を欠くために実用性に乏しく、短い鎖長の遺伝子型分子にのみ適用されてきたが(Roberts,R.W,Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,12297;Nemoto,N.,Miyamoto−Sato,E.,Yanagawa,H.(1997)FEBS Lett.414,405)、PEG領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子は、小麦胚芽の系ではより安定であり長い鎖長を取り扱える実用的な系である。 Moreover, heretofore in a system in rabbit reticulocyte poor in practicality due to lack of stability of the genotype molecule, have been applied only to the genotype molecule chain length (Roberts, R.W, Szostak, J. W. (1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,12297;. Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H (1997) FEBS Lett.414,405), a spacer comprising PEG region assigning molecule having parts are by practical systems capable of handling long chain length is more stable in the system of wheat germ.
<2>C末端ラベル化蛋白質C末端ラベル化蛋白質は、C末端が修飾された蛋白質であり、図22のAに示すように、ラベル化剤が蛋白質のC末端に結合した構成をもっている。 <2> C-terminal labeled protein C-terminal labeled proteins are proteins which C-terminus is modified, as shown in A of FIG. 22, it has a configuration in which labeling agent bound to the C-terminus of the protein. すなわち、C末端ラベル化蛋白質は、蛋白質とラベル化剤とにより構成される。 Ie, C-terminal labeled protein is composed of a protein and the labeling agent.
C末端ラベル化蛋白質を構成する「蛋白質」とは、その機能が既知または未知である相互作用の解析対象として用いる蛋白質を意味する。 Constituting the C-terminal labeled protein and "protein" means a protein using its features as an analysis target of the interaction are known or unknown. 本発明のC末端ラベル化蛋白質は、この蛋白質と後述する標的分子との相互作用の有無の測定に使用できる。 C-terminal labeled protein of the present invention can be used to measure the presence or absence of interaction with the target molecule to be described later with this protein.
この蛋白質は、天然蛋白質またはその変異体、および人工蛋白質またはその変異体の何れでもよい。 This protein, native protein or a variant thereof, and may be any of artificial protein or a variant thereof. 天然蛋白質は、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するcDNAライブラリーから転写および翻訳される、多様性を有する蛋白質のライブラリーをも含むものである。 Natural proteins, but also includes a library of various organisms organs, is transcribed and translated from a cDNA library derived from tissues or cells, proteins with diversity. 人工蛋白質は、天然蛋白質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、またはランダムなアミノ酸配列を含むものである。 Artificial proteins are those comprising the sequence combining all natural protein or subsequence, or random amino acid sequences.
C末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は、全長蛋白質であることが好ましい。 Proteins constituting C-terminal labeled protein is preferably a full-length protein. 本明細書において「全長蛋白質」とは、C末端が完全に翻訳されている蛋白質、すなわち、その蛋白質をコードする塩基配列の終止コドンの一つ前までのコドンが翻訳されて得られた蛋白質を意味する。 The "full-length protein" as used herein, a protein C-terminus is fully translated, i.e., a protein previous previous codon was obtained been translation termination codon of the nucleotide sequence encoding the protein means. 全長蛋白質のN末端は、シグナルペプチドの切断等何らかのプロセシングを受けていてもよい。 N-terminus of the full-length protein may undergo cleavage or the like processing some of the signal peptide.
また、C末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は親和性タグと融合した蛋白質であってもよい。 Also, proteins constituting C-terminal labeled protein may be a protein fused with an affinity tag. 親和性タグの例としては、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、プロテインA、マルトース結合蛋白質、カルモジュリン結合ペプチド等が挙げられる。 Examples of affinity tags include poly-histidine peptide and epitope peptide, glutathione -S- transferase, protein A, maltose-binding protein, calmodulin-binding peptide, and the like.
C末端ラベル化蛋白質は、ラベル化剤存在下で、翻訳テンプレートを翻訳系で発現させて蛋白質合成を行わせ、合成された蛋白質を精製することにより製造することができる。 C-terminal labeled protein in the presence labeling agent, a translation template may be expressed in a translation system to perform protein synthesis, it can be produced by purifying the synthesized protein. 以下、ラベル化剤、翻訳テンプレートおよび製造の例について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, labeling agent, is described an example of a translation template and manufacture, the present invention is not limited thereto.
<2−1>ラベル化剤ラベル化剤は、図22のBに示すように、蛋白質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基(残基を含む)をもつペプチドアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。 <2-1> labeling agent labeling agent, as shown in B of FIG. 22, peptide transfer reaction a protein translation system, i.e., groups capable of binding to a protein by a peptide transfer reaction on the ribosome (remaining peptide acceptor unit with containing group), with a structure coupled with modified portions via a nucleotide linker. このラベル化剤の存在下で蛋白質合成を行い、得られるC末端ラベル化蛋白質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、蛋白質相互作用の検出が可能となる。 Perform protein synthesis in the presence of the labeling agent, and purifying the C-terminal labeled protein obtained by using a detection system of molecular interaction, it is possible to detect protein interactions.
修飾部に含まれる修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。 Specific examples of the modifier contained in the modified part, fluorescent, non-fluorescent modifiers and the like. 蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Cy3、Cy5、エオシン系列、NBD系列等の蛍光色素や、緑色蛍光蛋白質(GFP)等の蛍光性蛋白質がある。 The fluorescent substance, fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin sequence, or fluorescent dyes such NBD series, there is a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。 As the non-fluorescent substance, coenzymes such as biotin, proteins, peptides, saccharides, lipids, dyes, polyethylene glycol, and the like, may be any compound that can be some mark.
C末端ラベル化剤においては、修飾部が蛍光基、蛋白質と結合する基(例えばビオチニル基やイミノビオチニル基)、または、その両方をもつことが好ましい。 In C-terminal labeling agent, radical modification unit is attached fluorescent group, a protein (e.g., biotinyl group or iminobiotinyl group), or, it is preferable to have both. 特に、ビオチニル基やイミノビオチニル基を有することは、本発明C末端ラベル化剤による修飾の効率が上昇するため、好ましい。 In particular, it has a biotinyl group or iminobiotinyl group, the efficiency of the modification according to the invention C-terminal labeling agent is increased, preferred.
ペプチドアクセプター部は、蛋白質の翻訳系で、ペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシンまたはその誘導体の残基をもつ。 Peptide acceptor unit is a protein translation system, has a group capable of binding with proteins by peptide transfer reaction, preferably has a residue of puromycin or a derivative thereof.
ピューロマイシンはアミノアシルtRNAと類似した構造をもち、蛋白質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度では蛋白質のC末端に結合することが知られている(Miyamoto−Sato,E.et al.(2000)Nucleic Acids Res.28:1176−1182)。 Puromycin has a similar structure to aminoacyl tRNA, are known as antibiotics that inhibit protein synthesis, low concentrations are known to bind to the C-terminus of the protein (Miyamoto-Sato, E.et . al (2000) Nucleic Acids Res.28: 1176-1182). 本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、蛋白質のC末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。 Puromycin derivatives which can be used in the present invention has a similar structure to puromycin, it may be any substance capable of binding to the C-terminus of the protein. 具体例としては、3'−N−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、3'−N−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。 Specific examples, 3'-N-aminoacyl puromycin aminonucleoside, 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside, and the like.
修飾部とペプチドアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが1個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド(−rC−)またはデオキシリボヌクレオチド(−dC−)が1個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。 The nucleotide linker that connects between the modified portion and the peptide acceptor unit, specifically, ribonucleotides or deoxyribonucleotides is one or a plurality linked nucleic acid or nucleic acid derivative, particularly preferred examples, the cytosine base ribonucleotide (-rC-) or a compound deoxyribonucleotides (-dC-) led one to several, including the like. その他、修飾部とペプチドアクセプター部との間に挿入することによって修飾蛋白質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。 Other, it may be any substance which can increase the yield of modified protein by inserting between the modified portion and the peptide acceptor unit.
ラベル化剤においては、ヌクレオチドリンカーが2'−デオキシシチジル酸、2'−デオキシシチジル−(3',5')−2'−デオキシシチジル酸、リボシチジル酸、または、リボシチジル−(3',5')−リボシチジル酸であることが好ましい。 In labeling agent, nucleotide linker 2'deoxycytidylate, 2'deoxycytidylic - (3 ', 5') - 2'-deoxycytidylic acid, Riboshichijiru acid or a Riboshichijiru - (3 ' , 5 ') - is preferably a Riboshichijiru acid.
ラベル化剤は、上記修飾部とペプチドアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。 Labeling agent can be prepared by the above-mentioned modified portion and the peptide acceptor unit through the desired nucleotide linker, to bind by themselves known chemical binding method. 具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記ペプチドアクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機等を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したヌクレオチドホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。 Specifically, for example, by binding the peptide acceptor portion which is protected with a suitable protecting group on the solid support, nucleotide phosphoramidite as a nucleotide linker using a nucleic acid synthesizer or the like, and deoxynucleotide phosphoramidite, modified after the nucleotide phosphoramidite coupled a fluorescent substance and biotin as substances are sequentially coupled, it can be produced by performing a deprotection. 上記各部の種類、または結合の種類によっては液相合成法で結合させるかまたは両者を併用することもできる。 Type of the respective parts or by the type of binding, may also be used in combination or both is combined in the liquid phase synthesis method. また、修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。 In the case of using a metal ion such as nickel as a modifier substance, to bind the chelating reagent, such as nitrilotriacetic acid and iminodiacetic acid metal ions can coordinate, then it is possible to coordinate a metal ion.
<2−2>翻訳テンプレート翻訳テンプレートは、本発明修飾蛋白質を製造する際に利用できる翻訳テンプレートであり、図22のCに示すように、ポリA配列を含む3'末端領域、転写プロモーターを含んだ5'非翻訳領域(5'UTR)、および、蛋白質のコードされたORF領域から構成される。 <2-2> Translation template translation template is a translation template that can be utilized in preparing the modified protein of the present invention, as shown in C of FIG. 22, 3 'terminal region containing the poly-A sequence, including transcriptional promoter 5 'untranslated region (5'UTR), and consists of the encoded ORF region of the protein. 翻訳テンプレートはDNAでもRNAでもよい。 The translation template may be RNA even DNA.
さらに詳細には、翻訳テンプレートは、蛋白質をコードするORF領域と、ORF領域の5'側に位置する、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ5'UTRと、ORF領域の3'側に位置する、ポリA配列(polyA)を含んだ3'末端領域から構成される。 More particularly, the translation template, an ORF region encoding a protein, 5 in the ORF region 'located side, and 5'UTR including a transcription promoter and a translation enhancer, 3 of the ORF region' located on the side, containing poly a sequence (polyA) 3 'consists terminal region.
さらに好ましい翻訳テンプレートは、5'UTRの転写プロモーターとしてSP6 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含み、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルス(TMV)のオメガ配列の一部(029)を含む。 Further preferred translation template comprises a promoter sequence of SP6 RNA polymerase as a transcription promoter 5'UTR, including part of the omega sequence of tobacco mosaic virus (TMV) as translational enhancer (029). また、ORF領域がその下流部分に親和性タグ配列を含むことが好ましい。 Further, it is preferable that the ORF region comprises an affinity tag sequence to the downstream portion. 親和性タグ配列は、上述の親和性タグをコードする配列であり、好ましくはHis−tag(ポリヒスチジンタグ)配列を含む。 Affinity tag sequence is a sequence encoding an affinity tag described above, preferably comprises a His-tag (poly-histidine tag) sequences. 本発明翻訳テンプレートを用いて製造された本発明修飾蛋白質をポリヒスチジンタグを用いて製造する場合には、ポリヒスチジンタグは長い方が、ニッケルキレート樹脂による回収率が向上するため、好ましい。 When producing the modified protein of the present invention produced using the present invention translation template using a polyhistidine tag, a polyhistidine tag longer is, to improve the recovery rate by nickel chelate resins, preferred. ポリヒスチジンタグの好ましい長さの範囲は、修飾される蛋白質の種類や標識の種類により変化し得るが、通常には、8〜12残基である。 The preferred length of the range of polyhistidine tag may vary by protein types and signs of the type to be modified, it is usually 8-12 residues.
なお、本明細書において「上流」および「下流」とは、転写または翻訳の方向におけるものを意味する。 In this specification, "upstream" and "downstream" means that in the direction of transcription or translation.
翻訳テンプレートは、DNAである場合、上記の領域を適当なDNAベクターまたはプラスミドに導入することにより得られたDNAベクターまたはプラスミドであってもよい。 Translation template, if it is DNA, it may be a DNA vector or plasmid obtained by introducing the above-mentioned regions a suitable DNA vector or plasmid. また、翻訳テンプレートは、RNAである場合、5'末端にCap構造があってもなくてもよい<2−3>C末端ラベル化蛋白質の製造C末端ラベル化蛋白質の製造に用いられる翻訳系としては、無細胞蛋白質合成系や細胞発現系が挙げられる。 Moreover, the translation template, if RNA, the as translation system used in the production of 5 'may not have a Cap structure at the terminal <2-3> C-terminal labeled protein production C-terminal labeled protein the cell-free protein synthesis system or cellular expression systems. 無細胞蛋白質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌S30抽出液等が挙げられる。 Specific examples of cell-free protein synthesis system, a wheat germ extract, rabbit reticulocyte lysate, Escherichia coli S30 extract, and the like. これらの無細胞蛋白質合成系の中に、上記翻訳テンプレートを加え、同時に1〜100μMの修飾剤を加え、25〜37℃で1〜数時間保温することによってC末端修飾蛋白質が合成される。 Among these cell-free protein synthesis system, the translation template is added, the modifying agent 1~100μM added simultaneously, the C-terminal modified protein is synthesized by 1 incubated for several hours at 25 to 37 ° C.. 合成された修飾蛋白質は、そのまま次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。 Synthesized modified protein can be directly subjected to the subsequent purification process or detection process. 一方、細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等の細胞に至るまで、遺伝子導入が可能な細胞であればいかなるものでもよい。 On the other hand, specific examples of cell expression systems leads Escherichia coli, Bacillus subtilis, thermophilic bacteria, from bacteria such as yeast, insect cells, cell cultures of mammals or the like, nematode, Drosophila, zebrafish, a cell such as a mouse up, it may be any cell capable of gene transfer. これらの細胞の中に、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、同時に1〜100μMの本発明修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾蛋白質が合成される。 In these cells, by introducing the present invention translation template, electroporation of the present invention modifying agent 1~100μM simultaneously introduced into cells by microinjection, etc., the number of optimum growth temperature of the cell modified protein is synthesized by incubation time. 合成された修飾蛋白質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。 Synthesized modified protein can be recovered by disrupting the cells subjected to the subsequent purification process or detection process. また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。 It is also possible to provide the detection process it in the cell. 翻訳テンプレートは、用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。 Translation template selects the appropriate in accordance with the translation system used.
C末端ラベル化蛋白質を精製する方法としては、アフィニティー、ゲルろ過、イオン交換等のクロマトグラフィーや、電気泳動、沈澱、透析等、一般に蛋白質の精製に用いられるあらゆる方法が利用可能である。 As a method for purifying C-terminal labeled proteins, affinity, gel filtration, and chromatography such as ion-exchange, electrophoresis, precipitation, dialysis or the like, generally any method used for the purification of proteins are available. 好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィー、電気泳動、沈殿、透析、および、それらの任意の組合せが挙げられる。 Preferably, affinity chromatography, gel filtration, ion chromatography, electrophoresis, precipitation, dialysis, and any combination thereof. 特に好ましい例として、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、プロテインA、マルトース結合蛋白質、カルモジュリン結合ペプチド等の親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で精製し、さらに未反応の修飾剤を完全に除去するためにゲルろ過カラムに数回かける方法がある。 Particularly preferable examples include poly-histidine peptide and epitope peptide, glutathione -S- transferase, protein A, maltose-binding protein, a modified protein fused affinity tag, such as calmodulin binding peptide was purified by affinity resin, further unreacted there is a method of applying several times to a gel filtration column in order to completely remove the modifier.
また、上記の親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で予め精製した後、修飾部のビオチニル基またはイミノビオチニル基とアビジンまたはストレプトアビジンの親和性を利用して、未修飾蛋白質を完全に除き、100%修飾された蛋白質を得る方法もある。 Further, after the pre-purification of the modified protein fused affinity tag of the affinity resin, by utilizing the affinity of biotinyl group or iminobiotinyl group and avidin or streptavidin modified portion, the unmodified protein completely except, there is a method of obtaining a 100% modified protein.
<3>本発明のより具体的な態様の説明第一の発明の翻訳テンプレート(図1のA)は、コード分子(図1のB)に由来するコード部とPEGスペーサー分子(図1のC)に由来するPEGスペーサー部からなる。 <3> a more specific aspect of the description the first translation template invention of the present invention (A in Figure 1), the code portion and the PEG spacer molecule derived from the coding molecule (B in FIG. 1) (in FIG. 1 C consisting of PEG spacer portion derived from). 本発明は、基本的にはコード部の配列によらず、コード部にPEGスペーサー部を連結(ライゲーション)することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。 The present invention is basically irrespective of the sequence of the coding portion, by connecting the PEG spacer portion to the code unit (ligation) stability thereof can be improved translation efficiency is improved. しかしながら、さらにコード部の構成やPEGスペーサー部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。 However, the further type of configuration and the PEG spacer portion of the code portion, it is possible to further improve the translation efficiency. 以下にその詳細を記載する。 The following describes the details.
本発明コード部(図1のB)は、5'末端領域、ORF領域、3'末端領域からなり、5'末端にCap構造があってもなくてもよい。 The present invention code part (B in FIG. 1) the 5 'end region, ORF region, 3' consists terminal region may or may not have a Cap structure at the 5 'end. また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクターやプラスミドに組み込まれた遺伝子やランダム配列などの利用が考えられる。 Further, no particular restriction on the sequence of the coding portion, the use of such any vector or plasmid integrated gene or random sequence is considered. また、コード部の3'末端領域には、A配列としてポリAx8配列、またはX配列としてXhoI配列や4塩基以上で(CまたはG)NN(CまたはG)の配列を持つもの(すなわち、XhoI配列およびその他の4塩基以上でSNNSの配列を持つもの)、およびA配列とX配列の組み合わせとしてのXA配列がある。 In addition, the 3 'end region of the coding unit, which has an array of poly Ax8 sequence as the A sequence, or as the X sequence with XhoI sequence and four or more base (C or G) NN (C or G) (i.e., XhoI those having sequences and other sequences SNNS at four or more base), and there is XA sequences as a combination of (a) sequence and X sequences. A配列、X配列、またはXA配列の上流に親和性タグ配列としてFlag−tag配列、からなる構成が考えられる。 A sequence, X sequence, or Flag-tag sequence as an affinity tag sequence upstream of XA sequence consists configurations are contemplated. ここで、親和性タグ配列としてはHA−tagやIgGのprotein A(zドメイン)などの抗原抗体反応を利用したものやHis−tagなど、蛋白質を検出または精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。 Here, like protein A (z domain) that utilizes an antigen-antibody reaction, such as and His-tag of the HA-tag or IgG as affinity tag sequences, in sequence for using any means capable of detecting or purifying protein It does not matter. ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、XA配列の組み合わせが重要であり、X配列のなかで、最初の4塩基が重要であり、SNNSの配列を持つものが好ましい。 Here, the range affecting the translation efficiency, a combination of XA sequence is important, among X sequence, the first four bases are important, preferably those having the sequence SNNS. X配列の長さの上限は、翻訳増強の効果が得られる限り特に限定されないが、通常には、15塩基以下、好ましくは6塩基以下である。 The upper limit of the length of the X sequence, the effect of translation enhancement is not particularly limited so long as the resulting, usually, 15 bases or less, preferably 6 bases or less. また、5'末端領域は、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはT7/T3またはSP6などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモーターとしては、SP6を用いることが好ましい。 Further, 5 'terminal region consists transcription promoter and translation enhancers, transcription promoters are available and T7 / T3 or SP6, is not particularly limited, in the cell-free translation system of wheat, omega sequence as an enhancer sequence translation it is preferred to use a sequence comprising a part of or omega sequence, the promoter, it is preferable to use SP6. 翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部(029)は、TMVのオメガ配列(Gallie D.R.,Walbot V.(1992)Nucleic Acids Res.,vol.20,4631−4638)の一部を含んだものである。 Part of the omega sequence translational enhancer (029), the omega sequence of TMV (Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol.20,4631-4638) those containing a part of the it is. コード部のORF領域については、DNAおよび/またはRNAからなるいかなる配列でもよい。 The ORF region of the coding unit, may be any sequence comprising DNA and / or RNA. 遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。 Gene sequences, exon sequences, intron sequences, random sequences, or sequences of any nature, are capable artificial sequence, and the sequence is not limited.
本発明PEGスペーサー部(図1のC)は、CCA領域、PEG領域、ドナー領域からなる。 The present invention PEG spacer portion (C in Fig. 1) is, CCA region, PEG region, consisting of a donor region. 最低限必要な構成は、ドナー領域である。 Minimum required configuration, the donor area. 翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずPEGスペーサー部を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。 The range that affect translation efficiency, preferably those having a PEG spacer portion not only donor region, it is preferable to further have a no puromycin the ability to bind to amino acids. PEG領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、400〜30,000で、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜6,000である。 Molecular weight range of the polyethylene glycol in the PEG region, in 400~30,000, preferably 1,000 to 10,000, more preferably 2,000 to 6,000. また、CCA領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン(Puromycin)、3'−N−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド(3'−N−Aminoacylpuromycin aminonucleoside,PANS−アミノ酸)、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS−Gly、バリンのPANS−Val、アラニンのPANS−Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS−全アミノ酸が利用できる。 Moreover, the CCA region are possible structure does not include a configuration including puromycin, for puromycin, puromycin (Puromycin), 3'-N- aminoacyl puromycin aminonucleoside (3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS- amino), for example PANS-Gly in the amino acid portion is glycine, valine PANS-Val, alanine PANS-Ala, other, corresponding to the entire amino acid PANS- total amino acids can be utilized. また、化学結合として3'−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'−N−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド(3'−Aminoacyladenosine aminonucleoside,AANS−アミノ酸)、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS−Gly、バリンのAANS−Val、アラニンのAANS−Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS−全アミノ酸が利用できる。 Moreover, 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside (3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside the carboxyl group of the amino group with amino acids 3'-amino adenosine as a chemical bond is connected by an amide bond formed result dehydration condensation, AANS-amino ), for example AANS-Gly of the amino acid portion is glycine, valine AANS-Val, alanine AANS-Ala, other, corresponding to the entire amino acid AANS- total amino acids can be utilized. また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。 Further, such as those resulting from binding of a nucleoside or nucleoside and amino acid ester it can also be used. その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。 Other can utilize all if a substance having a chemical structure similar to a nucleoside or nucleoside, a substance having a chemical structure similar to an amino acid or amino acid that chemically bondable bonding mode. 本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたCCA領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。 In this translation template, any material amino group of the above puromycin derivative lacking the ability to bind to amino acids, and CCA region lacking puromycin is also conceivable, but comprises a binding non puromycin and proteins on ribosomes that is, it is increased more translation efficiency. その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。 The reason is not clear, there is a possibility that the protein and non-binding of puromycin turnover is accelerated by stimulating ribosomes. CCA領域(CCA)の5'側に1残基以上のDNAおよび/またはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。 It preferably has a nucleotide sequence consisting of 1 or more residues of DNA and / or RNA 5 'to the CCA region (CCA). 塩基の種類としては、C>UまたはT>G>Aの順で好ましい。 The type of base, preferred in the order of C> U or T> G> A. 配列としては、dC−ピューロマイシン,rC−ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC−ピューロマイシン,rCrC−ピューロマイシン,rCdC−ピューロマイシン,dCrC−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−tRNAの3'末端を模倣したCCA配列(Philipps G.R.(1969)Nature 223,374−377)が適当である。 The sequence, dC-puromycin, etc. rC- puromycin, more preferably dCdC- puromycin, RCrC- puromycin RCdC- puromycin, an array of such dCrC- puromycin, a 3 'end of the aminoacyl -tRNA mimicking CCA sequence (Philipps G.R. (1969) Nature 223,374-377) are suitable. 第一の発明では、これらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。 In the first invention, the puromycin is impossible coupled with an amino acid in some way.
本発明PEGスペーサー部は修飾物質(F1および/またはF2)を有する構成が可能である。 The present invention PEG spacer portion configurations are possible with modifications substance (F1 and / or F2). このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、または固定化などのためのタグとして利用することが出来る。 Thereby, the translation templates recovered, reuse by purification, or can be used as a tag for such immobilization. 少なくとも1残基のDNAおよび/またはRNAの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはHis−tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。 As at least one residue of DNA and / or base Modulators of RNA, it is possible that by introducing a fluorescent substance, biotin, or His-tag and various separation tags, such as. また、コード部の5'末端領域をSP6+029とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+A (n=8)とすることで、各長さは、5'末端領域で約60bp、3'末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として設計可能な長さである。 Further, 5 of the code part 'end region and SP6 + 029, 3' end region, e.g., by a Flag + XhoI + A n (n = 8), each length 'about 60bp at the end region, 3' 5 end region in about 40 bp, it is possible length designed as an adapter region primers for PCR. これによって新たな効果が生み出された。 This new effect has been created by. すなわち、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、本発明の5'末端領域と3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、3'UTRの代わりとしてPEGスペーサー部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。 That is, by PCR from any vector or plasmid or cDNA libraries, easily allows to create a 5 'end region and 3' coding portion having a distal region of the present invention, this code portion, PEG as an alternative to the 3'UTR by ligating the spacer portion, resulting the high translation efficiency translation template.
本発明PEGスペーサー部とコード部のライゲーションは、その方法については、一般的なDNAリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。 Ligation of the present invention PEG spacer portion and a code portion, for the method, a general DNA ligase well anything like connection by using one or photoreaction, is not particularly limited. RNAリガーゼを用いるライゲーションでは、コード部でライゲーション効率に影響を与える範囲としては3'末端領域のA配列が重要であり、少なくとも2残基以上のdAおよび/またはrAの混合または単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは6から8残基以上のポリA連続鎖である。 The ligation using an RNA ligase, as the range that affects the ligation efficiency in the code section is important A sequence at the 3 'end region, mixing or single poly A at least 2 residues or more dA and / or rA a continuous chain, preferably, 3 or more residues, more preferably a poly a continuous chain of more than 8 residues 6. PEGスペーサー部のドナー領域の5'末端のDNAおよび/またはRNA配列は、ライゲーション効率を左右する。 DNA and / or RNA sequence of the 5 'end of the donor region of PEG spacer portion affects the ligation efficiency. コード部とPEGスペーサー部を、RNAリガーゼでライゲーションするためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも1残基のdC(デオキシシチジル酸)または2残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。 The code portion and a PEG spacer portion, in order to ligate an RNA ligase, it is necessary to include at least one or more residues, for an acceptor having a poly-A sequence and at least one residue of dC (Deokishishichi dCdC Jill acid) or 2 residues (dideoxycytidylic acid) are preferred. 塩基の種類としては、C>UまたはT>G>Aの順で好ましい。 The type of base, preferred in the order of C> U or T> G> A. さらに、ライゲーション反応時に、PEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。 Furthermore, during the ligation reaction, it is preferable to add polyethylene glycol having the same molecular weight as PEG region.
第二の発明は、修飾剤の存在下で、第一の発明の翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、修飾剤でC末端修飾された蛋白質(図2のA)であり、翻訳テンプレート(図2のB)と、修飾剤(図2のC)からなる。 The second invention is, in the presence of a modifying agent, was synthesized by translation using translation template of the first invention, a C-terminal modified protein in modifying agent (A in FIG. 2), the translation template ( and Figure 2 B), consisting of modifying agent (C in FIG. 2). ここでの特徴は、特に翻訳テンプレートのコード部の構成にある。 Here features in, especially in the configuration of the coding portion of the translation template. 以下詳細に記述する。 The following described in detail.
本発明翻訳テンプレート(図2のB)のPEGスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結出来ないことを特徴とし、第一の発明と同様である。 PEG spacer portion of the present invention the translation template (B in FIG. 2) is characterized by puromycin can not be linked to the amino acids are the same as in the first invention. また、コード部も第一の発明と同様であるが、特に、C末端ラベル化に適した構成としては、3'末端領域が、XA配列であることが重要であり、X配列のなかで、最初の4塩基が重要で、SNNSの配列を持つものが好ましい。 Although the code portion is also the same as the first invention, in particular, as a configuration suitable for C-terminal labeling, 3 'terminal region, it is important that an XA sequence, among X sequence, the first four bases is important and preferably those having a sequence of SNNS. ここでも、コード部の5'末端領域をSP6+029とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+A (n=8)とすることで、各長さは、5'末端領域で約60bp、3'末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。 Again, 5 code section 'end region and SP6 + 029, 3' end region, e.g., by a Flag + XhoI + A n (n = 8), each length 'end about 60 bp, 3 at the end region 5' about 40bp area, the length can be designed as an adapter region primers for PCR. これによって、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、本発明の5'末端領域と3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に3'UTRの代わりとしてPEGスペーサー部をライゲーションすることで、C末端ラベル化に適した翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。 Thus, by PCR from any vector or plasmid or cDNA libraries, easily it allows to create a 5 'end region and 3' coding portion having a distal region of the present invention, PEG as an alternative the 3'UTR in the code portion by ligating the spacer portion, resulting translational efficient translation template suitable for C-terminal labeled.
本発明修飾剤(図2のC)は、タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基(残基を含む)をもつペプチドアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。 Modifying agent of the present invention (C in FIG. 2) is a peptide transfer reaction of a protein translation system, i.e., a peptide acceptor unit having a group capable of binding with proteins by a peptide transfer reaction on the ribosome (including residues) but it has a structure coupled with modified portions via a nucleotide linker. この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、得られるC末端修飾タンパク質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、タンパク質相互作用の検出が可能となる。 Perform protein synthesis in the presence of the modifying agent, to purify the C-terminal modified protein obtained by the use of a detection system of molecular interaction, it is possible to detect protein interactions. 修飾部には、第一の発明のPEGスペーサー部と同様に修飾物質(F3)が含まれる。 The modified portions are included like the PEG spacer portion of the first invention modifier (F3) is. 修飾物質として、非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。 As modifiers, specific examples of non-radioactive modifying substance, fluorescent, non-fluorescent modifiers and the like. 蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Cy3、Cy5、エオシン系列、NBD系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光性タンパク質がある。 The fluorescent substance, fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin sequence, or fluorescent dyes such NBD series, there is a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。 As the non-fluorescent substance, coenzymes, proteins, peptides, saccharides, lipids, such as biotin, a dye, polyethylene glycol, and the like, may be any compound that can be some mark. 本発明修飾剤においては、修飾部が蛍光基、タンパク質と結合する基、または、その両方をもつことが好ましい。 In the modifying agent of the present invention, based on the modified portion is attached fluorescent group, a protein, or, it is preferable to have both. ペプチドアクセプター部は、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシンまたはその誘導体の残基をもつ。 Peptide acceptor unit is a protein translation system, has a group capable of binding with proteins by a peptide transfer reaction, preferably with puromycin or residues of derivatives thereof. ピューロマイシンはアミノアシルtRNAと類似した構造をもち、タンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度ではタンパク質のC末端に結合することが知られている(Miyamoto−Sato,E.et al.(2000)Nuclcic Acids Res.28:1176−1182)。 Puromycin has a similar structure to aminoacyl tRNA, is known as an antibiotic that inhibits protein synthesis, at low concentrations is known to bind to the C-terminus of the protein (Miyamoto-Sato, E.et . al (2000) Nuclcic Acids Res.28: 1176-1182). 本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、タンパク質のC末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。 Puromycin derivatives which can be used in the present invention has a similar structure to puromycin, it may be any substance capable of binding to the C-terminus of the protein. 具体例としては、3'−N−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、3'−N−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。 Specific examples, 3'-N-aminoacyl puromycin aminonucleoside, 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside, and the like. 修飾部とアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが1個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド(−rC−)またはデオキシリボヌクレオチド(−dC−)が1個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。 The nucleotide linker that connects between the modified portion and the acceptor portion, specifically, ribonucleotides or deoxyribonucleotides is one or a plurality linked nucleic acid or nucleic acid derivative, particularly preferred examples include a cytosine base ribo nucleotides (-rC-) or a compound deoxyribonucleotides (-dC-) led one or a plurality thereof. その他、修飾部とアクセプター部との間に挿入することによって修飾タンパク質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。 Other, it may be any substance which can increase the yield of modified protein by inserting between the modified portion and the acceptor portion. 本発明修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが2'−デオキシシチジル酸、2'−デオキシシチジル−(3',5')−2'−デオキシチジル酸、リボシチジル酸、または、リボシチジル−(3',5')−リボシチジル酸であることが好ましい。 In the modifying agent of the present invention, the nucleotide linker 2'deoxycytidylate, 2'deoxycytidylic - (3 ', 5') - 2'-Deokishichijiru acid, Riboshichijiru acid or a Riboshichijiru - (3 ', 5 ') - it is preferably a Riboshichijiru acid.
本発明の修飾剤は、上記修飾部とアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。 Modifier of the present invention can be prepared by the above-mentioned modified portion and an acceptor portion through a desired nucleotide linker, to bind by themselves known chemical binding method. 具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記アクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、機能性修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。 Specifically, for example, by binding the acceptor portion which is protected with a suitable protecting group on the solid support, nucleotide phosphoramidite as a nucleotide linker using a nucleic acid synthesizer, and deoxynucleotide phosphoramidite, functional modifier after the fluorescent substances and by including sequentially binding a phosphoramidite bound biotin as can be produced by performing a deprotection. 上記各部の種類、または結合の種類によっては液相合成法で結合させるかまたは両者を併用することもできる。 Type of the respective parts or by the type of binding, may also be used in combination or both is combined in the liquid phase synthesis method. また、機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。 In the case of using a metal ion such as nickel as a functional modifier can be attached to chelating reagents such as nitrilotriacetic acid and iminodiacetic acid metal ions can coordinate, followed by coordinating the metal ions .
第三の発明は、第一の発明の翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでC末端修飾された蛋白質(図3のA;対応付け分子)と翻訳テンプレート(図3のB)を除去した、PEGによってC末端修飾された蛋白質(図3のC)の構成を持つ。 A third aspect of the present invention were synthesized by translation using translation template of the first invention, C-terminal, modified protein translation template (in Fig. 3 A; assigning molecule) and the translation template (B in FIG. 3) It was removed, with the configuration of the C-terminal modified protein by PEG (C in FIG. 3). 以下詳細に記述する。 The following described in detail.
翻訳テンプレート(図3のB)のPEGスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は第一の発明と同様である。 PEG spacer portion of the translation template (B in FIG. 3), except that wherein the puromycin be coupled with an amino acid is the same as in the first invention. また、コード部も第一の発明と同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、3'末端領域をA配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減することが確認された。 Although the code portion is also the same as the first invention, in particular, as a configuration suitable for mapping, 3 'end region is important to the A sequence, assignment efficiency of the total protein is significantly it was confirmed that the amount of free protein improves drastically reduced. ここでも、コード部の5'末端領域をSP6+029とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+A (n=8)とすることで、各長さは、5'末端領域で約60bp、3'末端領域で約40bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。 Again, 5 code section 'end region and SP6 + 029, 3' end region, e.g., by a Flag + XhoI + A n (n = 8), each length 'end about 60 bp, 3 at the end region 5' about 40bp area, the length can be designed as an adapter region primers for PCR. これによって、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、本発明の5'末端領域と3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、PEGスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。 Thus, by PCR from any vector or plasmid or cDNA libraries, easily it allows to create a 5 'end region and 3' coding portion having a distal region of the present invention, by ligating the PEG spacer portion, correspondence efficient translation template is obtained. また、本発明のPEGによってC末端修飾された蛋白質(図3C)は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、FCCS測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、RNase Aなどで意図的に切断することが好ましい。 Further, C-terminal, modified proteins with PEG of the present invention (FIG. 3C), in such interaction detection of proteins, if not using code portion, for example, FCCS measurement, fluorescence reader, to applications such as protein chips , it is preferable to intentionally cut like in RNase A. 切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。 By cutting, difficulty of detection of protein-protein interaction by interference of the coding portion can be eliminated.
対応付け分子は、進化分子工学として、ダーウイン進化機構を利用して、「変異(Mutation)」、「選択(Selection)」、「増幅(Amplification)」の3つの単位操作を繰り返すことで、ランダムライブラリーなどから、漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することで工学的に応用することが可能である(図4)。 Assigning molecules, as directed evolution, by utilizing the Darwin evolution mechanism, "mutation (Mutation)", "selection (Selection)", by repeating the three unit operations "amplification (Amplification)" Random live etc. Larry progressively evolved, it is possible to engineered applications by creating the acquired material the desired function (Fig. 4). また、ゲノム機能解析への応用として、cDNAライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である(図4)。 As an application to functional genomics, which is the group of gene sequences with interaction with the desired material and proteins from a cDNA library comprehensively parsable (Figure 4). さらに、図4のスクリーニングを一次スクリーニング後に、二次スクリーニングとして、図5に示したように物質や蛋白質と相互作用の詳細をFCCSやマイクロアレイなどにより解析することが可能である。 Further, after the primary screening Screening of FIG. 4, as a secondary screening, it is possible to analyze due FCCS or microarray interaction information and the substance and protein, as shown in FIG. 以上の解析は、in vitroにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。 Or more of the analysis, can also be used in combination with a co-translation and co-translation screening method in in vitro. また、一次スクリーニングで対応付け分子を利用するときはA配列のコード部を利用し、二次スクリーニングでは、対応付け分子を利用するときはA配列のコード部、C末端ラベル化蛋白質を利用するときはXA配列のコード部をプライミングによって変更して使用することで、それぞれの効果を使い分けることが出来る。 Further, by using the code section of the A sequence when utilizing the assigning molecules in the primary screening, the secondary screen, when using the assigning molecules when using the code section, C-terminal, labeled protein A sequences than be used to change the prime code portion of XA sequence can selectively use each effect.
無細胞タンパク質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌S30抽出液等が挙げられる。 Specific examples of cell-free protein synthesis system, a wheat germ extract, rabbit reticulocyte lysate, Escherichia coli S30 extract, and the like. これらの無細胞タンパク質合成系の中に、上記翻訳テンプレートを加え、C末端ラベル化の場合は、同時に1〜100μMの修飾剤を加え、25〜37℃で1〜数時間保温することによってC末端修飾タンパク質が合成される。 Among these cell-free protein synthesis system, the translation template is added, in the case of C-terminal labeling, the C-terminus by simultaneously 1~100μM modifier are added to 1 incubated for several hours at 25 to 37 ° C. modified protein is synthesized. 対応付けの場合は、上記翻訳テンプレートを加えて、25〜37℃で1〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。 For correspondence, in addition to the translation template, assigning molecule is synthesized only by 1 incubated for several hours at 25 to 37 ° C.. 合成された両修飾タンパク質は、そのまま次の精製プロセスまたは検出プロセス、または直接細胞への導入に供することができる。 Both modified proteins synthesized may be directly subjected to the next purification process or detection process or introduced directly into cells. 細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。 Specific examples of expression systems include E. coli, Bacillus subtilis, thermophilic bacteria, from bacteria such as yeast, insect cells, cell cultures of mammals or the like, nematode, Drosophila, zebrafish, in any cell until the mouse or the like good. これらの細胞の中に、上記C末端ラベル化または対応付けされた両修飾タンパク質を直接導入することもできるし、または、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、C末端ラベル化の場合は、同時に1〜100μMの本発明修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾タンパク質が合成される。 Some of these cells, the C-terminal labeled or to both modified proteins correspondence can be introduced directly, or by introducing the present invention the translation template, in the case of C-terminal labeling, at the same time 1 electroporation of the present invention modifying agent ~100MyuM, introduced into a cell by microinjection, etc., modified protein is synthesized by incubating for several hours at optimum growth temperature of the cell. 対応付けの場合は、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。 For association, introducing the present invention translation template, assigning molecule is synthesized by incubating for several hours at optimum growth temperature of the cell. 合成された両修飾タンパク質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。 Both modified proteins synthesized can be recovered by disrupting the cells subjected to the subsequent purification process or detection process. また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。 It is also possible to provide the detection process it in the cell. 翻訳テンプレートは、用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。 Translation template selects the appropriate in accordance with the translation system used.
本発明は、本発明翻訳テンプレートから合成されたC末端修飾タンパク質(修飾剤でC末端修飾された蛋白質(図2のA)、翻訳テンプレートでC末端修飾された蛋白質(図3のA;対応付け分子)、PEGによってC末端修飾された蛋白質(図3C))を利用したタンパク質と標的分子との間の相互作用の解析方法、すなわち、タンパク質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該タンパク質を含む本発明修飾タンパク質を用いることを特徴とする方法を提供する(図5)。 The present invention, C-terminal, modified proteins at the C-terminal modified protein (modifier synthesized from translation template of the present invention (A in Figure 2), C-terminal, modified proteins in the translation template (A in Figure 3; association molecules), the method analyzes of the interaction between the C-terminal modified protein (FIG. 3C)) protein and a target molecule using the PEG, namely, in a method for analyzing an interaction between a protein and a target molecule there are, a method which comprises using the modified protein of the present invention containing the protein (Fig. 5).
<4>解析方法本発明の解析方法においては、通常には、上記で得られた本発明修飾タンパク質と標的分子を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該本発明修飾タンパク質または該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析する。 In the analysis method of <4> Analysis The present invention, usually, the present invention modified protein and a target molecule obtained above, contacted combined as appropriate by the type and the kind of the reaction system modifier, main in the invention modified protein or target molecule emits signals a change in the signal generated based on the interaction between both molecules analyzing the interaction by measuring. 相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、または、固相酵素免疫検定法により行われる。 Analysis of the interaction, for example, the row fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer method, evanescent field molecular imaging method, fluorescence depolarization method, surface plasmon resonance, or by enzyme linked immunosorbent assay divide. 以下これらの方法の詳細については記述する。 The following detailed described for these methods.
「標的分子」とは、本発明修飾タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。 A "target molecule" means a molecule that acts modified protein of the present invention and another, in particular proteins, nucleic acids, sugar chains, like low molecular weight compound. タンパク質としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。 The protein is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention may be a partial peptide may be a full length protein, including a binding active site. またアミノ酸配列、およびその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。 The amino acid sequence or function is known protein, it may be unknown protein. これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、またはcDNAライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。 They synthesized peptide chains, proteins purified from the biological or from a cDNA library or the like, using a suitable translation system to translate, can be used as a target molecule in purified protein and the like. 合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。 Synthesized peptide chain may be glycoprotein sugar chain bound thereto. これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、またはcDNAライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製されたタンパク質を用いることができる。 Among these can be preferably used translated protein and purified using a suitable method from either protein amino acid sequence is known purification or cDNA library or the like.
核酸としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、DNAまたはRNAも用いることができる。 The nucleic acid so long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention is not particularly limited, it is possible to use DNA or RNA also. また、塩基配列または機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。 Further, the base sequence or function in a known nucleic acid, may be unknown nucleic acid. 好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、および塩基配列が既知のものか、またはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。 Preferably, functions as a nucleic acid having binding ability to protein and nucleotide sequences can be used which have cut isolated using known ones or restriction from a genomic library or the like enzyme, or the like. 糖鎖としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列または機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。 The sugar chain, so long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention is not particularly limited, and the saccharide sequence or function may be unknown sugar chain in a known sugar chains. 好ましくは、既に分離解析され、糖配列または機能が既知の糖鎖が用いられる。 Preferably, an already isolated and analyzed saccharide sequence or function is known sugar chains are used. 低分子化合物としては、本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はない。 The low molecular compound so long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention is not particularly limited. 機能が未知のものでも、またはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。 Function can be used even what is already known ability to bind to well or proteins not known.
これら標的分子が本発明修飾タンパク質と行う「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも1つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 To these target molecules makes the modified protein of the present invention "interaction", typically a covalent bond between the protein and a target molecule, hydrophobic bond, hydrogen bond, van der Waals bond, and at least one of the binding by electrostatic force shows the effect by the force acting between the resulting molecule from, this term should be construed in the broadest sense, it should not be construed in any limitative way. 共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。 The covalent bond, coordinate bond, containing dipolar coupling. また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。 The binding caused by electrostatic force, other capacitive coupling, also contains electrical repulsion. また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。 The binding reactions resulting from the action, synthesis reaction, decomposition reaction are also included in the interaction.
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合および解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、または糖鎖とタンパク質との間の結合および解離が挙げられる。 Specific examples of the interaction, binding and dissociation between an antigen and an antibody, binding and dissociation between proteins receptor and ligand, binding and dissociation of an adhesion molecule and a partner molecule, binding and dissociation between an enzyme and a substrate, binding and dissociation between proteins that bind nucleic acids thereto, binding and dissociation between proteins with each other in an information transmission system, binding and dissociation between binding and dissociation, or a sugar chain and a protein between the glycoprotein and the protein and the like.
用いられる標的分子は、態様に応じて修飾物質により修飾して用いることができる。 Target molecule used can be used modified by modifying substance in accordance with the embodiment. 修飾物質は、通常、蛍光性物質などの非放射性修飾物質から選択される。 Modifying substance is usually selected from non-radioactive modifying substance such as a fluorescent substance. 蛍光物質としては、フリーの官能基(例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など)を持ち、タンパク質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミン系列、Cy3、Cy5、エオシン系列、NBD系列などのいかなるものであってもよい。 The fluorescent substance, free functional groups (e.g. carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group) has, protein, etc. of the various connectable with the target substance of the nucleic acid fluorescent dye, such as fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5 , eosin sequence may be any such NBD series. その他、色素など修飾可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさは問わない。 Other, if such modified compound capable dyes, the kind of the compound, regardless the size.
これらの修飾物質は、標的分子と本発明修飾タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定または解析方法に適したものが適宜用いられる。 These modulators are suitable for measurement or analysis method of the change of the signal generated on the basis of the interaction between the target molecule and the modified protein of the present invention is appropriately used.
上記修飾物質の標的分子への結合は、それ自体既知の適当な方法を用いて行うことができる。 Binding to the target molecule of the modifier substance can be carried out using a suitable method known per se. 具体的には、例えば、標的分子がタンパク質の場合、上記に記載したC末端を修飾する方法等を用いることができる。 Specifically, when the target molecule is a protein, it is possible to use a method such as modifying the C-terminus as described above. また標的分子が核酸の場合は、予め修飾物質を共有結合などで結合させたオリゴDNAプライマーを用いたPCRを行う方法などによって簡便に修飾することができる。 Further, when the target molecule is a nucleic acid, it can be easily modified by a method of performing a pre-modified material was used an oligo DNA primers bound by such covalent bond with PCR.
また、本発明修飾タンパク質または本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、固相に結合させる場合があるが、固相に結合させる方法としては、修飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。 Also, the target molecule used in the present invention the modified protein or the present invention in accordance with the embodiment, there is a case to be bound to a solid phase, as a method of binding to the solid phase, and that is bound via the modification substance, it It includes those which bind the portions other than.
修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子(以下、「リガンド」と称することがある。)であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド(以下、「アダプタータンパク質」と称することがある)を結合させる。 Modifying substance used in binding via the modification substance is usually a molecule specifically binding to a specific polypeptide (hereinafter sometimes referred to as "ligand".), And the solid surface the specific polypeptide that binds to said ligand to bind (hereinafter sometimes referred to as "adapter protein"). アダプタータンパク質には、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体なども含まれる。 The adapter protein, binding protein, receptor proteins that comprise the receptor, antibodies, etc. also.
アダプタータンパク質/リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質/ビオチン、マルトース結合タンパク質/マルトース、Gタンパク質/グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド/ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/グルタチオン、DNA結合タンパク質/DNA、抗体/抗原分子(エピトープ)、カルモジュリン/カルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質/ATP、またはエストラジオール受容体タンパク質/エストラジオールなどの各種受容体タンパク質/そのリガンドなどが挙げられる。 Examples of the combination of the adapter protein / ligand, e.g., avidin and biotin-binding protein / biotin streptavidin etc., maltose binding protein / maltose, G protein / guanine nucleotide, polyhistidine peptide / metal ion such as nickel or cobalt ion, glutathione -S - transferase / glutathione, DNA binding protein / DNA, antibody / antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin-binding peptide, and various receptor proteins / their ligands such as ATP binding protein / ATP or estradiol receptor protein / estradiol is cited It is.
これらの中で、アダプタータンパク質/リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質/マルトース、ポリヒスチジンペプチド/ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/グルタチオン、抗体/抗原分子(エピトープ)、などが好ましく、特にストレプトアビジン/ビオチンの組み合わせが最も好ましい。 Among these, the combination of the adapter protein / ligand, avidin and biotin binding proteins such as streptavidin, maltose binding protein / maltose, polyhistidine peptide / metal ion such as nickel or cobalt ion, glutathione -S- transferase / glutathione, antibody / antigen molecule (epitope) is preferable, and particularly combinations of streptavidin / biotin is most preferred. これらの結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タンパク質をコードするDNAは既にクローニングされている。 These binding proteins are those known per se, DNA encoding the protein has been cloned.
アダプタータンパク質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−2,4−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、またはホスホアミダイドに変換可能な水酸基またはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。 Binding to the solid phase surface of the adapter proteins, it can be used per se known method, specifically, for example, tannic acid, formalin, glutaraldehyde, pyruvic aldehyde, bis - diazotised Benjizon, toluene - 2,4-diisocyanate, amino group, etc. can be converted carboxyl group to an active ester or convertible hydroxyl group or an amino group into phosphoramidite, it can be used a method of utilizing.
修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常タンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−2,4−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、またはホスホアミダイドに変換可能な水酸基またはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。 If to be bound to the solid phase by a portion other than the modifying substance, usually a protein, nucleic acid, sugar chain, known methods used for coupling to a solid phase of low molecular compounds, specifically, for example, tannic acid, formalin, glutaraldehyde, pyruvic aldehyde, bis - diazotised Benjizon, use a method of utilizing toluene-2,4-diisocyanate, amino group, can be converted carboxyl group to an active ester or the like convertible hydroxyl group or amino group phosphoramidite and be able to.
「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 A means for collecting the change in the signals used for analysis as "measurement", should not be construed in any limitative way. 用いられる測定法としては、例えば、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、蛍光イメージングアナライズ法、表面プラズモン共鳴法、固相酵素免疫検定法など、分子間相互作用を検出できるあらゆる系が利用可能である。 As the measurement method used, for example, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer method, evanescent field molecular imaging method, fluorescence depolarization method, the fluorescence imaging analysis method, surface plasmon resonance, such as enzyme linked immunosorbent assay, the molecule any system capable of detecting between interactions are available.
蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy(FCS):Eigen,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,5740−5747(1994))は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、または拡散率、容積収縮等を測定する方法であり、本発明においては、本発明修飾タンパク質(C末端修飾タンパク質)と標的分子間の相互作用により元の修飾分子1分子の並進ブラウン運動の変化を測定することにより、相互作用する分子を測定することができる。 Fluorescence correlation spectroscopy (Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS):. Eigen, M., et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91,5740-5747 (1994)), under such a confocal laser microscope , flow rate of the particles or spreading factor, is a method of measuring the volume contraction, in the present invention, the modified protein of the present invention (C-terminal modified protein) and by the interaction between the target molecules of the original modified molecule 1 molecule by measuring the change in translational Brownian motion, it is possible to measure the interacting molecules. 具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。 Specifically in sample particles are excited by the excitation light, fluorescence and emits in a partial volume of a sample solution to obtain a photon ratio measures this emitted light. この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。 This value will vary with the number of particles present in the space volume observed at a particular time. 上述した種々のパラメータは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。 Various parameters described above can be calculated from the change of the signal using an autocorrelation function. このFCSを行う為の装置もカールツァイス(Zeiss)社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。 Apparatuses for carrying out FCS are also commercially available from Carl Zeiss (Zeiss) companies, etc., also in this method can be analyzed using these devices. この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、C末端修飾タンパク質または標的分子のいずれも溶液として供することが必要である(液相法)。 Protein using this method - the case of measuring or analysis between the target molecule interactions, it is required to provide any of the C-terminal modified protein or target molecule as a solution (liquid phase method). 標的分子は修飾の必要はない。 The target molecule does not need to be qualified. また相互作用を調べようとするC末端修飾タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、C末端修飾タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。 The molecule having a molecular weight extremely smaller than the C-terminal modified proteins to be tested for interaction, not suitable in this method because it does not affect the Brownian motion of the C-terminal modified protein.
しかし、2種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法(FCCS)は、1種類の蛍光色素を用いるFCSでは困難であった同じくらいの分子量をもつタンパク質間の相互作用も検出できる。 However, two types of fluorescent dye fluorescence cross-correlation spectroscopy using (FCCS) is one kind of fluorescent dye can be detected interaction between proteins with a molecular weight of as much difficult the FCS used. 2種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法が知られているが、FRETが生じるためには2つの蛍光色素が40〜50Å以内に近接する必要があり、タンパク質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもFRETが観測されない危険性がある。 Although as another method using two kinds of fluorescent dyes are known fluorescence resonance energy transfer (FRET) methods, for FRET occurs must two fluorescent dyes are close within 40~50A, protein size and depending on the position marked with a fluorescent dye, there is a risk that even if an interaction FRET is not observed. FCCS法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。 Since the FCCS method detection of the cross correlation does not depend on the distance between the fluorescent dye, there is no such problem. 一方、他の検出系である蛍光偏向解消法と比較すると、FCCS法は必要なサンプル量が少なく、検出時間が短く、HTSのための自動化が容易等の長所がある。 On the other hand, when compared with the fluorescence depolarization method, which is another detection system, FCCS method has less amount of sample required, shorter detection time, automation has advantages of easy or the like for HTS. さらにFCCS法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的な情報が得られるので、表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。 Since very basic information such as size and number of the fluorescent labeled molecule can be obtained in addition FCCS method, it may be available for general purpose like the surface plasmon resonance method. 両者の違いは、表面プラズモン共鳴法ではタンパク質が固定化された状態で相互作用を検出するのに対して、FCCS法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点にある。 The difference is, with respect to an interaction is detected in the state in which the protein is immobilized on the surface plasmon resonance method, in that it can be seen more interaction near solution to the native state in the FCCS method . FCCS法では、タンパク質の固定化が必要ないかわりに、タンパク質を蛍光色素で標識する必要があるが、本発明により、この課題を克服することが可能となった。 The FCCS method, instead protein immobilization is not necessary, but the protein has to be labeled with a fluorescent dye, the present invention makes it possible to overcome this problem.
本方法においてC末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販のFCS用装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でC末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。 As method in which contacting the target molecule in the C-terminal modified protein in this method, both molecules but may be any so long as it is a method for contacting enough to interact, preferably a commercially available FCS equipment how the measurement wells in normal charged a solution obtained by C-terminal modified protein dissolved in biochemically appropriate concentration in a buffer or the like used to further charged a solution of the target molecule at an appropriate concentration in the same buffer It is carried out by.
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記FCS用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のC末端修飾タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、または特定のC末端修飾タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。 Or In this method, as a method of simultaneously performing multiple analyzes, for example, a plurality of C-terminal modified proteins different to each measurement well of the FCS measurement device is turned on, turning on the particular target molecule solution thereto, or a particular C-terminal modified protein was charged, and further introducing used plural kinds of target molecules solutions different in each well.
蛍光イメージングアナライズ法は、固相化された分子に、修飾分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固相化された分子上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定または解析する方法である。 Fluorescence imaging analysis method, solid-to-phased molecules, contacted the modifier molecules, the interaction of both molecules, the fluorescence emitted from the modified molecules remained on the immobilized molecule, commercially available fluorescent imaging analyzer a method of measuring or analysis used.
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、C末端修飾タンパク質または標的分子のいずれか一方は上記した方法により固相化されていることが必要である。 Protein using this method - the case of measuring or analysis of the interaction between the target molecules, one of the C-terminal modified protein or target molecule is required to have been immobilized by the aforementioned method. 標的分子は固相化して用いる場合には修飾されているものと、されていないもののどちらも利用可能である。 Target molecule are both available and those that are modified, it has not been although when used in immobilized. また、固相化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。 Further, it is necessary that has been modified by the aforementioned modifying substance if used without immobilization. C末端修飾タンパク質は、修飾部を介して固定化されているものも、修飾部以外の部分で固定化されているものも用いることができる。 C-terminal modified protein, also those which are immobilized through the modification unit, it can also be used those which are fixed at a portion other than the modified portion.
C末端修飾タンパク質、または標的分子を固相化するための基板としては、通常タンパク質や核酸等を固定化するのに用いられるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、またはプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。 The substrate for immobilizing the C-terminal modified protein or target molecule, also be used nitrocellulose membranes, nylon membranes are used the normal proteins and nucleic acids such as to immobilize or plastic microplates, etc. it can.
本方法において修飾標的分子またはC末端修飾タンパク質を固相化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子またはC末端修飾タンパク質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に接触させる方法が好ましい。 As method in which contacting the modified target molecule or C-terminal modified protein in the present method to a solid phase molecule, although both molecules may be any so long as it is a method for contacting enough to interact, preferably preferred is a method to create a solution at an appropriate concentration in a buffer usually used for biochemical purpose the modified target molecule or C-terminal modified protein, thereby it is contacted to the solid surface.
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する修飾標的分子またはC末端修飾タンパク質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標的分子またはC末端修飾タンパク質の修飾物質から発せられる蛍光信号、または固相化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定または解析することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。 After bringing the both molecules into contact with, preferably followed by step of excessively washed with existing modified target molecule or C-terminal modified protein of the same buffer solution, the target molecule or C-terminal modified protein which remained on the solid phase modulators the fluorescence signal or a signal fluorescence was mixed emanating from modified molecules remained fluorescence and solid phase emanating from modified molecules are immobilized, emanating from measured or analyzed using a commercially available imaging analyzer it is thereby possible to identify molecules that interact with the immobilized molecules.
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のC末端修飾タンパク質または修飾もしくは非修飾標的分子を番地付けして固相化する方法、または1種類のC末端修飾タンパク質または修飾もしくは非修飾標的分子に固相化されていない複数種のC末端修飾タンパク質または修飾標的分子を接触させる方法等が用いられる。 In this way, at the same time as a method for performing multiple analyzes, for example, above a solid surface, the method for immobilization to put addresses several C-terminal modified protein or modified or unmodified target molecule or one C, the method of contacting the C-terminal modified proteins or modified target molecule of a plurality of types that have not been immobilized on the terminal modified protein or modified or unmodified target molecule or the like is used. 複数種のC末端修飾タンパク質または修飾標的分子を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。 When contacting the C-terminal modified proteins or modified target molecule multiple species, the molecules remained on the solid phase by dissociating acquired by the difference or the like of the concentration of the buffer, by analyzing this by known methods It can be identified.
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法は、2種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法としてよく知られている。 Fluorescence resonance energy transfer (FRET) method is well known as two among other molecules using fluorescent dye interaction detection method. FRETとは、2種類の蛍光色素の一方(エネルギー供与体)の蛍光スペクトルと、もう一方(エネルギー受容体)の吸収スペクトルに重なりがあるとき、2つの蛍光色素間の距離が十分小さいと、供与体からの発光が起こらないうちに、その励起エネルギーが受容体を励起してしまう確率が高くなる現象をいう。 The FRET, and fluorescence spectra of one of the two fluorescent dyes (energy donor), when there is an overlap in the absorption spectra of the other (energy acceptor), the distance between the two fluorescent dyes is sufficiently small, the donor while emission from the body does not occur, a phenomenon in which the probability of the excitation energy will excite the acceptor is high. したがって、相互作用を検出したい2つのタンパク質を、それぞれ供与体および受容体となる蛍光色素で標識しておき、供与体を励起すれば、2つのタンパク質が相互作用しない場合は、蛍光色素間の距離が大きいためFRETは起こらず、供与体の蛍光スペクトルが観察されるが、2つのタンパク質が相互作用して蛍光色素間の距離が小さくなると、FRETにより受容体の蛍光スペクトルが観察されるので、蛍光スペクトルの波長の違いからタンパク質間相互作用の有無を判別することができる。 Thus, the two proteins to be detected interactions, leave each labeled with a donor and acceptor become fluorescent dye, if exciting the donor, if the two proteins do not interact, the distance between the fluorescent dye since large FRET does not occur, although the fluorescence spectrum of the donor is observed, the distance between the fluorescence two proteins interact dye is reduced, because the fluorescence spectrum of the acceptor is observed by FRET, fluorescence it is possible to determine the presence or absence of protein-protein interactions due to the difference in wavelength of the spectrum. 蛍光色素としては、供与体がフルオレセイン、受容体がローダミンという組み合わせがよく用いられている。 As the fluorescent dye, donor fluorescein, receptors are often used combination of rhodamine. また最近では、蛍光緑色タンパク質(GFP)の波長の異なる変異体の組み合わせにより、細胞の中でFRETを観察し相互作用を検出する試みがなされている。 Recently also a combination of different variants of the wavelength of the fluorescent green protein (GFP), an attempt to detect the observe interaction FRET in cells have been made. この方法の欠点としては、FRETが生じるために2つの蛍光色素が40〜50Å以内に近接する必要があるため、タンパク質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもFRETが観測されない危険性があるという点が挙げられる。 The disadvantage of this method, since the FRET two fluorochromes to occur it is necessary to close within 40~50A, the position marked with the size and fluorescent dyes proteins also interact FRET there can be mentioned that there is a risk that not observed.
エバネッセント場分子イメージング法とは、Funatsu,T. The evanescent field molecular imaging method, Funatsu, T. ,et al. , Et al. ,Nature,374,555−559(1995)等に記載されている方法で、ガラス等の透明体に固相化した分子に溶液として第2の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定または解析する方法である。 , Nature, in the manner described in 374,555-559 (1995) or the like, the angle which contacted the second molecule as a solution to the immobilized molecules on a transparent material such as glass, the evanescent field is generated in this in irradiating a light source such as a laser beam, a method of measuring or analyzed by the detector evanescent light generated. これらの操作は、それ自体既知のエバネッセント場蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。 These operations can be performed using a per se known evanescent field fluorescence microscope.
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、C末端修飾タンパク質または標的分子のいずれか一方は上記した方法により固相化されていることが必要である。 Protein using this method - the case of measuring or analysis of the interaction between the target molecules, one of the C-terminal modified protein or target molecule is required to have been immobilized by the aforementioned method. 標的分子は固相化する場合は修飾の必要はないが、固相化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。 It is not necessary modifications if a target molecule to immobilized, it is necessary that it is modified with the aforementioned modifying substance if used without immobilization.
C末端修飾タンパク質、または標的分子を固相化するための基板としては、ガラス等の材質の基板が用いられ、好ましくは石英ガラスが用いられる。 C-terminal modified protein or as a substrate for immobilizing a target molecule, the substrate material such as glass is used, preferably quartz glass. また、レーザー光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。 Further, it is preferable that ultrasonic cleaning surfaces in order to prevent scattering of laser light or the like.
本方法において固相化していないC末端修飾タンパク質または修飾標的分子を固相化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは固相化していないC末端修飾タンパク質または修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に滴下する方法が好ましい。 As method in which contact the C-terminal modified proteins or modified target molecules not immobilized in the process to immobilized molecules, both molecules can be any so long as it is a method for contacting enough to interact it may also be, but preferably creates a biochemically solution dissolved at an appropriate concentration in a buffer usually used a C-terminal modified proteins or modified target molecules not immobilized, dropping it to a solid surface methods are preferred.
両分子を接触せしめた後、エバネッセント場照明により励起された蛍光をCCDカメラ等の検出器を用いて測定することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。 After bringing the both molecules into contact with, by measuring the fluorescence excited by the evanescent field illumination using a detector such as a CCD camera, it is possible to identify molecules that interact with the immobilized molecules.
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基板に、複数のC末端修飾タンパク質または修飾標的分子を番地付けして固相化する方法等が用いられる。 In this method, as a method of simultaneously performing multiple analyzes, for example, on the substrate, and a method for immobilization to put addresses several C-terminal modified proteins or modified target molecule is used.
蛍光偏光法(Perran,J.,et al.,J.Phys.Rad.,1,390−401(1926))は、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する方法である。 Fluorescence polarization (Perran, J., et al., J.Phys.Rad., 1,390-401 (1926)) is kept fluorescent molecules excited by fluorescence polarization during the excited state, a steady state If it is but emits fluorescence in the same plane of polarization, when the excited molecule was rotary Brownian motion or the like during the excited state, the emitted fluorescence to become different plane from the excitation light it is a method to use. 分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合には、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光を保ったままになっているのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏光が解消される。 Movement of the molecule is affected by the size, whereas when the fluorescent molecule is a polymer, the molecular motion between the excited state almost no emitted light is left keeping the polarization Te, in the case of fluorescent molecules of the low molecular, the emitted light is depolarized to faster movement speed. そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合からこの分子の運動性およびその存在状態に関する情報が得られるものである。 Therefore, the intensity of fluorescence emitted from fluorescent molecules excited by plane polarized light, measured in the original plane and a plane perpendicular thereto, relates motility and its state of existence of this molecule from the ratio of the fluorescence intensity of both planes one in which information is obtained. この方法によれば、夾雑物があってもこれに影響されることなく、蛍光修飾された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。 According to this method, without even being affected by contaminants which can track the behavior of a target molecule that interacts with the fluorescent modified molecule. これは蛍光修飾された分子と標的分子が相互作用するときにのみ、偏光度の変化として測定されるからである。 This is because molecules with a target molecule which is fluorescent modified only when interacting, is measured as a change in polarization degree.
この方法を行うための装置としては例えばBECON(Panyera社製)等が市販されており、本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。 As an apparatus for performing this method are commercially available, for example BECON (Panyera Co., Ltd.), and this method can be carried out by using these devices.
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、C末端修飾タンパク質または標的分子のいずれも溶液として供する必要である。 Protein using this method - the case of measuring or analysis of the interaction between the target molecule, it is necessary to provide as none of the C-terminal modified protein or target molecule solution. 標的分子は修飾の必要はない。 The target molecule does not need to be qualified. また相互作用を調べようとするC末端修飾タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、C末端修飾タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。 The molecule having a molecular weight extremely smaller than the C-terminal modified proteins to be tested for interaction, not suitable in this method because it does not affect the Brownian motion of the C-terminal modified protein.
本方法においてC末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でC末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。 As method in which contacting the target molecule in the C-terminal modified protein in this method, both molecules may be any as long as it is a method for contacting enough to interact, but preferably a commercially available fluorescence polarization solution of C-terminal modified protein at the appropriate concentration to the normal biochemical buffers such as used in the measuring well of the apparatus was placed, and further charged a solution of the target molecule at an appropriate concentration in the same buffer It is carried out by the method.
本方法において測定するC末端修飾タンパク質および標的分子との間の相互作用は、必ずしも抗原抗体方法ほど特異性は高くないことが考えられるため、最適の組み合わせを検出するためには、相互作用の程度を数値化することが有効である。 Interaction between the C-terminal modified protein and the target molecule is measured in this method is that not always is contemplated that is not as high specificity as methods antigen-antibody, to detect the combination of the optimal degree of interaction it is effective to quantify. 相互作用の程度を示す指標としては、例えば一定濃度のC末端修飾タンパク質に対して、極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができる。 As an index indicating the degree of interaction, for example with respect to the C-terminal modified protein of a fixed concentration, it is possible to use the value of the minimum target substance concentration providing the maximum fluorescence polarization.
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記蛍光偏光解消法測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のC末端修飾タンパク質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、または特定のC末端修飾タンパク質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。 In this method, as a method of simultaneously performing multiple analyzes, for example, a different plurality of C-terminal modified protein in each measurement well of the fluorescence depolarization method measuring device is turned on, turning on the particular target molecule solution to this or a particular C-terminal modified protein was charged, and further introducing used plural kinds of target molecules solutions different in each well.
表面プラズモン共鳴法とは、金属/液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する方法である(Cullen,D.C.,et al.,Biosensors,3(4),211−225(1987−88))。 The surface plasmon resonance, surface plasmon is excited by a molecule that interacts with a metal / liquid interface, a method of measuring an intensity change of the reflected light it (Cullen, D.C., et al., Biosensors, 3 (4), 211-225 (1987-88)). この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、C末端修飾タンパク質は上記した方法により固相化されていることが必要であるが、標的分子の修飾は必要ない。 Protein using this method - the case of measuring or analysis between the target molecule interactions, although C-terminal modified protein is required to have been immobilized by the method described above, modification of the target molecule is not required.
C末端修飾タンパク質を固相化するための基板としては、ガラスの等の透明基板上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。 The substrate for immobilizing the C-terminal modified protein, gold on a transparent substrate such as glass, silver, those metal thin film of platinum or the like is formed is used. 透明基板としては、通常表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるものであってもよく、レーザー光に対して透明な材料からなるものとして一般的にはガラス等からなるものであり、その厚さは0.1〜5mm程度のものが用いられる。 As the transparent substrate, as long as usually used for a surface plasmon resonance device may be any one, generally as comprising a material transparent to a laser beam and made of glass, its thickness is of about 0.1~5mm is used. また金属薄膜の膜厚は100〜2000Å程度が適当である。 The thickness of the metal thin film is suitably about 100 to 2,000 Å. このような表面プラズモン共鳴装置用固基板として市販されているものも用いることができる。 It can also be used those commercially available as a solid substrate for such a surface plasmon resonance device. C末端修飾タンパク質の上記基板への固相化は前述した方法により行うことができる。 Immobilized to the substrate of the C-terminal modified protein can be carried out by the method described above.
本方法において標的分子をC末端修飾タンパク質へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液に固相化されたC末端タンパク質を接触させる方法を用いることができる。 As method in which contacting the target molecule in the present methods to C-terminal modified protein, both molecules may be any so long as it is a method for contacting enough to interact, but preferably biochemical target molecules it can be used to process that normally contacting the C-terminal protein buffer was immobilized to a solution with a suitable concentration for use.
これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばBIAcore2000(Pharmacia Biosensor社製)によってもよい。 These stroke commercially available surface plasmon resonance apparatus, for example by BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor, Inc.). 両分子を接触せしめた後、それ自体既知の表面プラズモン共鳴装置を用いて、それぞれの反射光の相対強度の時間的変化を測定することにより、固相化されたC末端修飾タンパク質と標的分子の相互作用が解析できる。 After contacted with both molecules using per se known surface plasmon resonance device, by measuring the temporal change in the relative intensities of the reflected light, the immobilized C-terminal modified protein and the target molecule interaction can be analyzed.
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記表面プラズモン共鳴装置に用いられる基板に、複数のC末端修飾タンパク質を番地付けして固相化するか、または1種類の固相化されたC末端修飾タンパク質に複数種の標的分子を接触させる方法等が用いられる。 In this method, as a method of simultaneously performing multiple analyzes, for example, a substrate used for the surface plasmon resonance device, or immobilized to put addresses a plurality of C-terminal modified protein, or one immobilized and a method of contacting the target molecule of plural kinds are used in the C-terminal modified proteins.
固相酵素免疫検定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA):Crowther,J.R.,Methods in Molecular Biology,42(1995))は、固相上に固定化した抗原に対し、抗体を含む溶液を接触せしめ、両分子の相互作用(抗原抗体反応)により、固相化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する修飾分子(IgG等)から発せられる蛍光、または修飾分子を基質とする色素から発せられる信号を、市販の検出器(ELISAリーダー)を用いて測定または解析する方法である。 Enzyme linked immunosorbent assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Crowther, J.R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995)), compared immobilized antigen on the solid phase, a solution containing the antibody contact allowed, the interaction of both molecules (antigen-antibody reaction), fluorescence emitted from the modified molecule (IgG, etc.) that specifically bind to this antibody was only the immobilized on an antigen or a modified molecule substrates, the signal emitted from the dye to a method of measuring or analysis using a commercially available detector (ELISA reader).
この方法を用いてタンパク質−標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、抗原となるC末端修飾タンパク質を上記した方法により固相化されていることが必要である。 Protein using this method - the case of measuring or analysis of the interaction between the target molecule, it is necessary to have a C-terminal modified protein of the antigen is immobilized by the aforementioned method. また抗体となる標的分子は上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。 Targeted molecules of the antibody also is required to have been modified with the aforementioned modifying substance.
抗原となるC末端修飾タンパク質を固相化するための基板としては、通常ELISAに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。 The substrate for immobilizing the C-terminal modified protein of the antigen, can be used a plastic microplate used in normal ELISA or the like.
本方法において抗体となる修飾標的分子を固相分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これをマイクロプレートに注入する方法が好ましい。 As method in which contacting the modified target molecule of antibody in the present method to the solid molecules are both molecules may be any so long as it is a method for contacting enough to interact, preferably modified target how molecules created biochemically solution dissolved at an appropriate concentration in a buffer that is normally used to inject it into microplates are preferred.
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する固相化分子に結合していない修飾分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販のELISAリーダー等を用いて測定または解析することにより、固相化された抗原分子と相互作用する分子を同定することができる。 After contacted both molecules, the fluorescence is preferably subjected to washing with excess immobilized is not bound to molecular modifications molecule same buffer exists like, generated from the modified molecules which remained on the solid phase by measuring or analyzed using a commercially available ELISA reader or the like, it is possible to identify molecules that interact with the immobilized antigen molecules.
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記マイクロプレートの各穴にそれぞれ異なる複数の修飾標的分子を固相化する方法が用いられる。 In this method, as a method of simultaneously performing multiple analyzes, for example, a method of immobilizing a plurality of different modified target molecule in each well of the microplate is used.
相互作用する分子の同定方法としては、上記のそれぞれの方法により測定されC末端修飾タンパク質との間に相互作用が認められた標的分子は、該分子の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法により、その一次構造を解析することができる。 The method of identifying a molecule that interacts, target molecule interaction was observed between each of the methods is determined by the C-terminal modified protein described above, if the primary structure of the molecule is unknown, known per se in a suitable manner, it is possible to analyze the primary structure. 具体的には、相互作用を認められた標的分子がタンパク質の場合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、一次構造を特定することができる。 Specifically, if the target molecule for which an interaction is recognized is a protein, the amino acid sequence was analyzed by amino acid analyzer and the like, it is possible to identify the primary structure. また、標的分子が核酸の場合には、塩基配列決定方法により、オートDNAシーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することができる。 Also, when the target molecule is a nucleic acid, a nucleotide sequence determination method, it is possible to determine the nucleotide sequence using an automatic DNA sequencer or the like.
C末端修飾タンパク質の固相化のための装置としては、上記に記載したC末端修飾タンパク質の修飾部を介した固相への固定化方法を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。 The device for immobilization of C-terminal modified protein, in order to perform a method for immobilizing to a solid phase via a modification of the C-terminal modified proteins described above, a combination of known suitable means device it is also possible to build. 本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基板の保持、C末端修飾タンパク質溶液の添加、洗浄等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。 Each unit itself in this device is of known respectively, in these means, the holding of the substrate, the addition of C-terminal modified protein solution, the operations such as washing may be performed by methods known per se. これらの操作を組み合わせ、全自動または半自動の、C末端修飾タンパク質の固相化のための装置を構築することができる。 The combination of these operations, the fully automatic or semi-automatic, can be constructed a device for immobilization of C-terminal modified protein.
タンパク質−標的分子間相互作用測定のための装置としては、上記に記載したタンパク質−標的分子間相互作用測定を行うために、既知の適切な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。 Protein - as a device for the target molecule interaction measurements, protein described above - in order to perform the interaction measured between the target molecule, it is also possible to construct a device by combining known appropriate means. 本装置における各手段自体はそれぞれ既知のものであり、これらの手段における、基板の保持、標的分子の添加、洗浄、信号検出等の各操作は、それ自体既知の方法により行えばよい。 Each unit itself in this device is of known respectively, in these means, the holding of the substrate, the addition of the target molecule, washing, each operation of the signal detection or the like may be performed by methods known per se. これらの操作を組み合わせ、全自動または半自動の、タンパク質−標的分子間相互作用測定のための装置を構築することができる。 The combination of these operations, the fully automatic or semi-automatic, protein - can be constructed a device for target molecule interaction measurements.
実施例以下、具体的に本発明の翻訳テンプレート、C末端修飾蛋白質、翻訳テンプレートによるC末端ラベル化法および対応付け方法についての実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。 Examples Hereinafter, specific translation template of the present invention, C-terminal modified protein, that describes an example of the C-terminal labeling method and the association process according to the translation template, specific for the following examples the present invention should be construed as an aid to obtain the recognition, the scope of the present invention is not limited in any way by the following examples.
実施例1 翻訳テンプレートの作成とその翻訳(C末端ラベル化) Preparation and translation of Example 1 Translation template (C-terminal labeled)
コード分子は、マウス由来のc−junまたはc−fos(Gentz R,Rauscher FJ 3d,Abate C,Curran T(1989)Science 243:1695−9;Neuberg M,Schuermann M,Hunter JB,Muller R(1989)Nature 338:589−90)の組み込まれているプラスミド(c−junは、pEU−T7JunFlag(配列番号1);c−fosは、pCMVFosCBPzz(配列番号2))からPCRで作成した。 Coding molecule is mouse-derived c-jun or c-fos (Gentz ​​R, Rauscher FJ 3d, Abate C, Curran T (1989) Science 243: 1695-9; Neuberg M, Schuermann M, Hunter JB, Muller R (1989 ) Nature 338: 589-90) with built-in plasmid (c-jun is, pEU-T7JunFlag (SEQ ID NO: 1); c-fos were generated by PCR from PCMVFosCBPzz (SEQ ID NO: 2)). PCRのプライマーとしては、c−junでは5'UTR領域について1種類(プライマー;5'SP6−029(配列番号3))と3'末端領域については13種類(プライマー;3'A8=A(配列番号6)、3'X(CTCGAG)(配列番号7)、3'X(CTCGAG)A8=XA(配列番号8)、3'X(CTCGCC)A8(配列番号9)、3'X(CTCG)A8(配列番号10)、3'X(CTC)A8(配列番号11)、3'X(CTCT)A8(配列番号12)、3'X(TTCG)A8(配列番号13)、3'X(GTCC)A8(配列番号14)、3'X(CATG)A8(配列番号15)、3'X(CTCC)A8(配列番号16)、3'X(GTCG)A8(配列番号17)、3'none(配列番号5))、c−fosでは5'U The primer PCR, 1 type for 5'UTR region in c-jun (primer; 5'SP6-029 (SEQ ID NO: 3)) and 3 'for terminal region 13 type (primer; 3'A8 = A (SEQ No. 6), 3'X (CTCGAG) (SEQ ID NO: 7), 3'X (CTCGAG) A8 = XA (SEQ ID NO: 8), 3'X (CTCGCC) A8 (SEQ ID NO: 9), 3'X (CTCG) A8 (SEQ ID NO: 10), 3'X (CTC) A8 (SEQ ID NO: 11), 3'X (CTCT) A8 (SEQ ID NO: 12), 3'X (TTCG) A8 (SEQ ID NO: 13), 3'X ( GTCC) A8 (SEQ ID NO: 14), 3'X (CATG) A8 (SEQ ID NO: 15), 3'X (CTCC) A8 (SEQ ID NO: 16), 3'X (GTCG) A8 (SEQ ID NO: 17), 3 ' none (SEQ ID NO: 5)), 5'U the c-fos R領域について1種類(プライマー;5'T7(0')−bait(配列番号4))と3'末端領域については2種類(プライマー;3'baitFosD(配列番号18),3'baitFosDA(配列番号19))を用い、計15種類のDNAテンプレートを調製し、QIAquick PCR Purification Kits(QIAGEN)で精製した。 For R region one (primer; 5'T7 (0 ') - bait (SEQ ID NO: 4)) and 3' two for terminal region (primer; 3'BaitFosD (SEQ ID NO: 18), 3'baitFosDA (SEQ ID NO: with 19)), a total of 15 different DNA template was prepared and purified by the QIAquick PCR purification Kits (QIAGEN). これらのDNAテンプレートを、RiboMAX TM Large Scale RNA Production Systems(Promega)をもちいて転写(37℃,2h)し、合成したmRNAをRNeasy Mini Kits(QIAGEN)で精製し、mRNAテンプレート(コード分子)を得た。 These DNA templates, RiboMAX TM Large Scale RNA Production transfer using a Systems (Promega) (37 ° C., 2h), and the synthesized mRNA was purified with RNeasy Mini Kits (QIAGEN), to give a mRNA template (coding molecule) It was.
まず、得られたmRNAテンプレートを翻訳テンプレートとして用いて、翻訳を行った。 First, by using the obtained mRNA template as a translation template, it was translation. 翻訳テンプレート2pmolを用いて、Wheat Germ Extract(Promega)の10μlの系で翻訳(26℃,60min)を行い、翻訳と同時に、修飾剤として240pmolのFluor−dCpPuroを用いて、蛋白質のラベル化(Miyamoto−Sato,E.,Nemoto,N.,Kobayashi,K.,and Yanagawa,H.(2000)Nucleic Acids Res.28:1176−1182;Nemoto,N.,Miyamoto−Sato,E.and Yanagawa,H.(1999)FEBS Lett.,462:43−46)を行い、15%SDS−PAGEで電気泳動し、バンドの蛍光(フルオレセイン)をマルチ画像解析装置、Molecular Ima Using translation template 2pmol, Wheat Germ Extract (Promega) Translation (26 ° C., 60min) with 10μl of the system performs a co-translationally with Fluor-dCpPuro of 240pmol as modifier, protein labeling (Miyamoto . -Sato, E., Nemoto, N., Kobayashi, K., and Yanagawa, H (2000) Nucleic Acids Res.28: 1176-1182; Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E.and Yanagawa, H. (1999) FEBS Lett, 462:. 43-46) performs, electrophoresed in 15% SDS-PAGE, the multi-image analyzer band fluorescence (fluorescein), Molecular Ima ger FX(Bio−Rad)で測定した。 It was measured in the ger FX (Bio-Rad). その結果をまとめたグラフを図6に示す。 The graph summarizing the results shown in FIG.
図6から、ポリA配列(A配列)よりSNNS配列(X配列)を有する場合に、さらにSNNS−ポリA配列(XA配列)を有する場合に、翻訳量が増加することが示された。 6, when having a poly A sequence (A sequence) than SNNS sequence (X sequence), further SNNS- when having poly A sequence (XA sequence), translation level was shown to increase. このことから、XA配列を持つ翻訳テンプレートは、一般的な翻訳やC末端ラベル化により好ましいといえる。 Therefore, the translation template with XA sequence, be preferred by a general translation and C-terminal labeled. また、X配列を変えたときの翻訳結果から、X配列がA配列と組み合わさって効果を現すには、最低4塩基からなることが必要であり、第一番目と第四番目の塩基はCかGであることが要求され、SNNS(SはCまたはG)の構成が必要であることが示された。 Moreover, the translation result when varying X sequence, the X array representing the effect in combination with the A sequence, it is necessary to made a minimum of 4 bases, FIRST and the fourth base is C or G is it is required, SNNS (S is C or G) was shown to be required configuration of.
さらに、mRNAテンプレートの3'側にPEGスペーサー分子(下記製造例1〜4参照)をライゲーションした翻訳テンプレートを作成した。 Furthermore, PEG spacer molecule (see below Preparation 1-4) to the 3 'side of mRNA template was created ligated translation template. ここでは、T4 RNAリガーゼ(宝酒造)をもちいて、PEGスペーサー部((dC) (T) ,PEG4000,PEG4000Puro−Boc)と、コード分子(Jun−X(CTCGAG)A8=Jun−XA(プライマー3'X(CTCGAG)A8=XAを用いて得られたもの))またはコード分子(Fos−D(−A)または3'baitFos−DA(+A)(プライマー3'baitFosDまたは3'baitFosDAを用いて得られたもの))とのライゲーション(15℃,20h)を行い、RNeasy Mini Kits(QIAGEN)で精製し、8M尿素4%PAGEで電気泳動し、エチレンブロマイド(EtBr)で染色し、バンドの蛍光(EtBrとフルオレセイン)をマルチ画像解析装置、Mole Here, T4 RNA ligase (Takara Shuzo) using a, PEG spacer portion ((dC) 2 (T) 2, PEG4000, PEG4000Puro-Boc) and, coding molecule (Jun-X (CTCGAG) A8 = Jun-XA ( primer 3'X (CTCGAG) A8 = those obtained using the XA)) or coding molecule (Fos-D (-A) or 3'baitFosDA (+ a) (using primers 3'baitFosD or 3'BaitFosDA the resulting ones)) and ligation (15 ° C., 20h) performed, and purified by RNeasy Mini Kits (QIAGEN), and electrophoresed 8M urea 4% PAGE, stained with ethylene bromide (EtBr), the band fluorescent (EtBr and fluorescein) multi-image analyzing apparatus, Mole ular Imager FX(Bio−Rad)で検出した。 It was detected in the ular Imager FX (Bio-Rad). ライゲーションした2pmolの翻訳テンプレートを用いて、Wheat Germ Extract(Promega)または、PROTEIOS(Toyobo)を用いて、10μlの系で翻訳(26℃;1,3,6,20hr)を行い、翻訳と同時に、修飾剤として240pmolのFluor−dCpPuroを用いて、蛋白質のラベル化(Miyamoto−Sato,E.,Nemoto,N.,Kobayashi,K.,and Yanagawa,H.(2000)Nucleic Acids Res.28:1176−1182;Nemoto,N.,Miyamoto−Sato,E.and Yanagawa,H.(1999)FEBS Lett.,462:43−46)を行い、15%SDS−PAGEで電気泳動し Using ligated 2pmol translation template, Wheat Germ Extract (Promega) or, using a PROTEIOS (Toyobo), translated in 10μl systems; performed (26 ℃ 1,3,6,20hr), translation and simultaneously, . using Fluor-dCpPuro of 240pmol as modifier, protein labeling (Miyamoto-Sato, E., Nemoto, N., Kobayashi, K., and Yanagawa, H (2000) Nucleic Acids Res.28: 1176- .. 1182; Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E.and Yanagawa, H (1999) FEBS Lett, 462: 43-46) performs, electrophoresed in 15% SDS-PAGE バンドの蛍光(Fluorescein)をマルチ画像解析装置、Molecular Imager FX(Bio−Rad)で測定した。 Multi image analyzer band fluorescence (Fluorescein), was measured with Molecular Imager FX (Bio-Rad). RNAの安定性実験は、PEGスペーサー部の蛍光を用いて、RNAの残量をマルチ画像解析装置、Molecular Imager FX(Bio−Rad)で測定した。 Stability experiments RNA, using the fluorescence of the PEG spacer portion, the multi-image analyzer the remaining amount of RNA, were measured by Molecular Imager FX (Bio-Rad). 対照としてライゲーションしていない翻訳テンプレートを用いて同様の手順を行った。 It was subjected to the same procedure using the translation template that is not ligated as a control. それらの結果をまとめたグラフを図7および図8に示す。 The graph summarizing the results shown in FIGS.
図7から、コード部の配列は基本的にはどのような配列でもPEGスペーサー部をライゲーションすることで翻訳量が増加することが示された(図7のA)。 From Figure 7, the sequence of the coding portion is the amount translated by ligating the PEG spacer portion any array basically has been shown to increase (A in Figure 7). また、XA配列を持つコード部をもつ翻訳テンプレート(XA)では、XA配列もPEGスペーサー部も持たないコード分子(None)に比べて、翻訳量が約3〜4倍増加していることが示された。 Further, in the translation template with code section with XA sequence (XA), it is compared to the coding molecule (None) not having even XA sequence also PEG spacer portion, the translation amount is increased by about 3 to 4 times shows It has been. また、XA配列を持つコード部では、PEG4000Puro−Bocの構成が最も翻訳量が増加することが示された(図7のB)。 Also, the code portion with XA sequence showed that structure of PEG4000Puro-Boc is most translation amount increases (B in Figure 7). よって、一般的な翻訳やC末端ラベル化にはPEGスペーサー部がライゲーションされたXA配列を持つ翻訳テンプレートを用いることが適しているといえる。 Therefore, it can be said that in general translation and C-terminal labeled is suitable to use a translation templates with XA sequence PEG spacer portion is ligated. 図8から、XA配列を持つコード分子(●;XA)、XA配列を持たないコード分子(□;None)は3時間で翻訳量は飽和に達したが、PEG4000Puro−Bocをもつ翻訳テンプレート(○;XA+PEG400Puro−Boc)は、6時間でも翻訳の増加が見られた(図8のA)。 8, the encoding molecules with XA sequence (●; XA), coding molecule without a XA sequence (□; None) is reached saturation translation level for 3 hours, the translation templates with PEG4000Puro-Boc (○ ; XA + PEG400Puro-Boc) was observed an increase in the translation even 6 hours (a in Figure 8). また、その翻訳量は、6時間で比較すると、PEG4000Puro−Bocをもつ翻訳テンプレート(○)は、XA配列を持つコード分子(●;XA)の約2倍、XA配列を持たないコード分子(□;None)の約4倍であった(図8のA)。 Moreover, the translation amount when compared with 6 hours, the translation templates with PEG4000Puro-Boc (○), the coding molecule with XA sequence; about 2-fold (● XA), coding molecule without a XA sequence (□ ; None) was about 4 times (a in Figure 8). コード分子と、PEGスペーサー部をもつ翻訳テンプレートとの安定性を比較すると、コード分子(●;XA)は、そのmRNAが1時間で50%減るのに対して、PEGスペーサー部をもつ翻訳テンプレート(○)は、13時間でようやく50%減ることから、PEGスペーサー部をもつコード分子(○)の安定性が非常によいことがわかる(図8のB)。 And coding molecule, when comparing the stability and translation templates with PEG spacer portion, the coding molecule (●; XA) is that the the mRNA is reduced 50% in 1 hour, the translation templates with PEG spacer portion ( ○), since the reduced finally 50% for 13 hours, the stability of the coding molecule with PEG spacer portion (○) are seen to be very good (Fig. 8 B). 以上から、翻訳テンプレート(○)の翻訳量が増加したのは、ライゲーションされたPEG4000Puro−Bocによる安定性向上が原因と考えられる。 From the above, the translation of the translation template (○) is increased, the stability improvement by the ligated PEG4000Puro-Boc is considered to be caused.
実施例2 翻訳テンプレートを用いた対応付けコード分子(mRNAテンプレート)にPEGスペーサー分子(下記製造例1〜4参照)をライゲーションしたものを翻訳テンプレートとして用いた。 It was used ligated correspondence coding molecule (mRNA templates) in PEG spacer molecule (see below Production Examples 1 to 4) with Example 2 Translation template as a translation template. ここでは、実施例1で得たコード分子のmRNAテンプレート(Jun−XA,Jun−A)とPEGスペーサー部(PEG2000Puro)を実施例1と同様の方法でライゲーションした。 Here and ligated in the same manner as mRNA template (Jun-XA, Jun-A) and the PEG spacer portion (PEG2000Puro) Example 1 of the encoding molecules obtained in Example 1. ライゲーションしたmRNAテンプレートを小麦胚芽の無細胞翻訳系としてWheat Germ Extract(Promega)をもちいて、実施例1と同様の方法で翻訳し、対応付け分子を8M尿素10%SDS−PAGEで電気泳動し、蛍光(フルオレセイン)によってマルチ画像解析装置、Molecular Imager FX(Bio−Rad)で検出した。 The ligated mRNA templates using a Wheat Germ Extract (Promega) as the wheat germ cell-free translation system, translates in the same manner as in Example 1, electrophoresed assigning molecule in 8M urea 10% SDS-PAGE, multi image analyzer by fluorescence (fluorescein), was detected with Molecular Imager FX (Bio-Rad). また、フリー蛋白質の量は、翻訳と同時に、修飾剤としてFluor−dCpPuroを用いて、蛋白質のラベル化(Miyamoto−Sato,E.,Nemoto,N.,Kobayashi,K.,and Yanagawa,H.(2000)Nucleic Acids Res.28:1176−1182;Nemoto,N.,Miyamoto−Sato,E.and Yanagawa,H.(1999)FEBS Lett.,462:43−46)を行い、8M尿素10%SDS−PAGEおよび15%SDS−PAGEで電気泳動し、バンドの蛍光(フルオレセイン)をマルチ画像解析装置、Molecular Imager FX(Bio−Rad)で測定し、あわせて、T7−tagによる抗体を用いたウエスタンプ The amount of free protein translation and simultaneous, using Fluor-dCpPuro as modifier, protein labeling (Miyamoto-Sato, E., Nemoto, N., Kobayashi, K., and Yanagawa, H. ( 2000) Nucleic Acids Res.28:.. 1176-1182; Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E.and Yanagawa, H (1999) FEBS Lett, 462: 43-46) performs, 8M urea 10% SDS- was electrophoresed on PAGE and 15% SDS-PAGE, the multi-image analyzer band fluorescence (fluorescein), measured by Molecular Imager FX (Bio-Rad), together, Western-flop with an antibody according to T7-tag ロットで総蛋白量を決定した。 To determine the total amount of protein in the lot. それらの結果をまとめたグラフを図9に示す。 The graph summarizing the results shown in FIG.
図9から、対応付け分子は、XA配列を持つコード部とA配列を持つコード部について比較すると、添加するRNA量を変化させたときの対応付け効率は両方とも70%でほとんど変わらないことが示された(図9のA)。 9, the assigning molecule is different about the code portion with the code portion and the A sequence with XA sequences that association efficiency hardly changes at both 70% when varying the amount of RNA added It indicated (a in Figure 9). しかしながら、添加したRNAテンプレートから合成された蛋白質総量(フリー蛋白質+対応付け分子=100%)に対する対応付け効率については、添加するRNA量を変化させたとき、A配列を持つコード部の場合は90%(フリー蛋白質10%)を超える高い効率を示すことが示された(図9のB)。 However, for assigning efficiency for the added synthesized protein amount from RNA template (free protein + assigning molecule = 100%), when varying the amount of RNA added, in the case of the code portion having the A array 90 % were shown to exhibit high efficiency of over (free protein 10%) (B in Figure 9). 一方、XA配列を持つコード部の場合は、フリー蛋白質の生成割合が高い(図9のB)。 On the other hand, in the case of the code portion with XA sequence, a high rate of production of free protein (B in Figure 9). よって、対応付け分子にはXA配列よりもA配列を持つコード部が適しているといえる。 Therefore, it can be said that the assigning molecule encoding unit having an A sequence than XA sequences is suitable.
製造例1 PEGスペーサー分子(11)の合成PEGスペーサー分子(11)は、図10に示す試薬を用い、図11に示す方法で合成した。 Synthesis PEG spacer molecule of Preparation 1 PEG spacer molecule (11) (11), using the reagents shown in FIG. 10, was synthesized by the method illustrated in FIG. 11. 図10中アミダイト試薬(1〜5)はグレンリサーチ社(アメリカ合衆国、バージニア州)より購入した。 Figure 10 in the amidite reagent (1-5) were purchased from Glen Research, Inc. (United States, Virginia). 平均分子量1000、2000、3000のPEGは日本油脂(東京都渋谷区)より購入した。 PEG of average molecular weight 1000, 2000, and 3000 was purchased from NOF (Shibuya-ku, Tokyo). 平均分子量4000のPEGはフルカ社(スイス)より購入した。 PEG having an average molecular weight of 4000 was purchased from Fluka (Switzerland). それらを原料にしてアミダイト試薬(6)を、Jaschkeらが報告した方法(Jaschke,A.et al.(1993)Tetrahedron Lett.34:301−304)を用い合成した。 The amidite reagent by them to the raw material (6), a method of Jaschke et al reported (Jaschke, A.et al (1993) Tetrahedron Lett.34:. 301-304) was synthesized using. 図11中10はIkedaらが報告した方法(Ikeda,S.et al.(1998)Tetrahedron Lett.39:5975−5978)で合成した。 11 10 how Ikeda et al reported (Ikeda, S.et al (1998) Tetrahedron Lett.39:. 5975-5978) were synthesized. なお、図10中DMTrは4,4'−ジメトキシトリチル基を、図11中Fmocは9−フルオレンメトキシカルボニル基を示す。 Incidentally, the DMTr in FIG. 10 is 4,4'-dimethoxytrityl group, in FIG. 11 Fmoc represents 9-fluorene methoxycarbonyl group.
10(400mg,ピューロマイシン10μmol含有)に対し、以下のA〜Dの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびPEGが導入されるまで繰り返し行なった。 To 10 (400 mg, puromycin 10μmol containing), in accordance with the process the predetermined sequence of A~D below, was repeated performed until a predetermined number of nucleotides and PEG are introduced.
A. A. 3%トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液を1mL加え室温で3分間放置後、塩化メチレン5mLで3回洗浄する。 3% trichloroacetic acid - After standing for 3 minutes methylene chloride solution 1mL was added at room temperature, washed 3 times with methylene chloride 5 mL. 再度同じ操作を繰り返した後、無水アセトニトリル5mLで5回洗浄する。 After repeating the same operation again, washed 5 times with anhydrous acetonitrile 5 mL.
B. B. ヌクレオチドアミダイト30μmol、0.457Mテトラゾール−無水アセトニトリル溶液100μL、および無水アセトニトリル1mLを加え、室温で15分間振盪する。 Nucleotide phosphoramidite 30 [mu] mol, 0.457 m tetrazole - anhydrous acetonitrile solution 100 [mu] L, and anhydrous acetonitrile 1mL was added, shaken for 15 minutes at room temperature. アセトニトリル5mLで5回洗浄する。 Wash 5 times with acetonitrile 5 mL.
C. C. 50mMヨウ素溶液(テトラヒドロフラン−ピリジン−水=75:20:5)1mLを加え室温で3分間放置後、ピリジン5mLで3回洗浄する。 50mM iodine solution (tetrahydrofuran - pyridine - water = 75: 20: 5) 1mL was added After standing at room temperature for 3 minutes, washed three times with pyridine 5 mL. 再度同じ操作を繰り返した後、無水ピリジン5mLで5回洗浄する。 After repeating the same operation again, washed 5 times with anhydrous pyridine 5 mL.
D. D. 10%無水酢酸−ピリジン溶液1mLおよび触媒量の4,4−ジメチルアミノピリジンを加え室温で20分間放置後、ピリジン5mLで5回、塩化メチレン5mLで5回洗浄する。 10% acetic anhydride - pyridine solution 1mL and a catalytic amount of 4,4-dimethylaminopyridine was added after standing at room temperature for 20 minutes, 5 times with pyridine 5 mL, washed 5 times with methylene chloride 5 mL.
上記の処理をし所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された10に濃アンモニア水1.5mLおよびエタノール0.5mLを加え、室温で14時間震盪した。 Of concentrated aqueous ammonia 1.5mL and ethanol 0.5mL was added to 10 of a predetermined sequence and a predetermined number of nucleotides were introduced by the above process was shaken at room temperature for 14 hours. ろ過により固相担体(CPG)を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。 Removing the solid support (CPG) by filtration, the filtrate was lyophilized. 残査をHPLC[カラム:YMC社(京都府)製YMC pack ODS−A SH−343−5,溶離液10−60%アセトニトリル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液(pH7.0)の30分間の直線濃度勾配、流速:10mL/分]で精製後、PEGスペーサー分子(11)を得た。 The residue HPLC [Column: straight YMC Inc. (Kyoto) manufactured by YMC pack ODS-A SH-343-5, eluent 10-60% acetonitrile-0.1 M 30 min aqueous triethylammonium acetate (pH 7.0) gradient, flow rate: after purification in 10 mL / min], to obtain a PEG spacer molecule (11). 得られたPEGスペーサー分子(11)の構造および収率を以下に示す。 The structure and yield of the resulting PEG spacer molecule (11) shown below.
製造例2 PEGスペーサー分子(14)の合成PEGスペーサー分子(14)は、図10に示す試薬を用い、図11および12に示す方法で合成した。 Synthesis PEG spacer molecule of Preparation 2 PEG spacer molecule (14) (14), using the reagents shown in FIG. 10, it was synthesized by the method illustrated in FIGS. 11 and 12. 図10中、ローダミングリーン(RhodG)活性エステル(7)はモレキュラプローブ社(アメリカ合衆国、オレゴン州)より、Cy5活性エステル(8)およびCy3活性エステル(9)はアマシャムファルマシアバイオテク社(イギリス、バッキンガムシャー)より、購入した。 In Figure 10, Rhodamine Green (RhodG) active ester (7) is Molecular Probes (USA, Oregon) than, Cy5 activated ester (8) and Cy3 active esters (9) is Amersham Pharmacia Biotech (UK, Buckinghamshire ) than were purchased. 図12中、12はIkedaらが報告した方法(Ikeda,S.et al.(1998)Tetrahedron Lett.39:5975−5978)を応用し合成した。 In Figure 12, 12 is a method of Ikeda et al. Reported (Ikeda, S.et al (1998) Tetrahedron Lett.39:. 5975-5978) was applied to the synthesis. なお、図10中、Bocはtert−ブトキシカルボニル基を示す。 In FIG. 10, Boc represents a tert- butoxycarbonyl group.
12(400mg,ピューロマイシン10μmol含有)に対し、PEGスペーサー分子(11)の合成の場合と同様のA〜Dの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびPEGが導入されるまで繰り返し行なった。 12 (400 mg, puromycin 10μmol containing) to, in accordance with a predetermined sequence processing similar A~D in the case of the synthesis of PEG spacer molecule (11) was repeated performed until a predetermined number of nucleotides and PEG are introduced .
上記の処理を行ない、所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された12に濃アンモニア水1.5mLおよびエタノール0.5mLを加え、室温で14時間震盪した。 Performs the above processing, the concentrated aqueous ammonia 1.5mL and ethanol 0.5mL was added to 12 of a predetermined sequence and a predetermined number of nucleotides were introduced, and shaken at room temperature for 14 hours. ろ過により固相担体(CPG)を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。 Removing the solid support (CPG) by filtration, the filtrate was lyophilized. 残査をHPLC[カラム:YMC社(京都府)製YMC pack ODS−A SH−343−5,溶離液:10−60%アセトニトリル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液(pH7.0)の30分間の直線濃度勾配、流速:10mL/分]で精製後、13を得た。 The residue HPLC [Column: 10-60% 30 min acetonitrile -0.1M aqueous triethylammonium acetate (pH 7.0): YMC Inc. (Kyoto) manufactured by YMC pack ODS-A SH-343-5, eluent linear gradient, flow rate: after purification in 10 mL / min] to obtain 13. 13を30%アセトニトリル−水0.1mLに溶かし、7,8または9を10μmol、および1M炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.3)を10μL加え室温で2時間放置した。 13 30% acetonitrile - dissolved in water 0.1 mL, and left for 2 hours 7, 8 or 9 10 .mu.mol, and 1M aqueous sodium bicarbonate (pH 8.3) 10 [mu] L was added at room temperature. 反応液を同上の条件のHPLCで精製後、産物を含む画分を濃縮した。 After purification of the reaction solution in HPLC conditions same as above, concentrating the fractions containing the product. 残査を60%トリフルオロ酢酸−水1mLにて室温で30分処理後、濃縮乾固した。 The residue of 60% trifluoroacetic acid - after 30 minutes at room temperature with water 1 mL, and concentrated to dryness. 残査を濃アンモニア水1mLにて室温で15分処理後、濃縮乾固した。 After 15 minutes at room temperature the residue with concentrated aqueous ammonia 1 mL, and concentrated to dryness. 残査を同上の条件のHPLCで精製後、産物を含む画分を濃縮し、PEGスペーサー分子(14)を得た。 After the residue was purified by HPLC conditions same as above, concentrating the fractions containing product to give a PEG spacer molecule (14). なお、図13中、RhodGは図10中7の、Cy5は図10中8の、Cy3は図10中9の、蛍光色素残基部をそれぞれ示す。 In FIG. 13, RhodG's 10 in 7, Cy5 is shown in FIG. 10 in 8, Cy3 indicates in FIG 9, the fluorescent dye residual base respectively. 得られたPEGスペーサー分子(14)の構造および収率を以下に示す。 The structure and yield of the resulting PEG spacer molecule (14) shown below.
製造例3 Boc保護PEGスペーサー分子(15)の合成図14に示したように、12(400mg,ピューロマイシン10μmol含有)より、PEGスペーサー部(11)と同じ方法を用いてBoc保護PEGスペーサー部(15)を合成した。 As shown in the synthesis diagram 14 Production Example 3 Boc protected PEG spacer molecule (15), 12 (400 mg, puromycin 10μmol containing) than, using the same method as PEG spacer portion (11) Boc protected PEG spacer portion ( 15) was synthesized. 得られたBoc保護PEGスペーサー分子(15)の構造と収率を以下に示す。 The structure and yield of the resulting Boc-protected PEG spacer molecule (15) shown below.
製造例4 ピューロマイシン非含有PEGスペーサー分子(16)の合成Jaschkeらが報告した方法(Jaschke,A.et al.(1993)Tetrahedron Lett.34:301−304)に従い合成した。 How synthesizing Jaschke et al reported the preparation 4 puromycin-free PEG spacer molecule (16) (Jaschke, A.et al (1993) Tetrahedron Lett.34:. 301-304) was synthesized according. 得られたピューロマイシン非含有PEGスペーサー分子(16)の構造と収率を以下に示す。 The structure and yield of the resulting puromycin-free PEG spacer molecule (16) shown below.
製造例5 修飾剤1〜7の合成修飾剤1〜7は、図15および図16に示した試薬を用い、図17および18にその概略を示す方法を用いて合成した。 Synthesis modifier 1-7 Production Example 5 modifier 1-7 using reagents shown in FIGS. 15 and 16 were synthesized using the method shown the schematic in Figure 17 and 18. 図15中、アミダイト試薬(15〜19)はグレンリサーチ社(アメリカ合衆国、バージニア州)より、スクシンイミド試薬(20〜22)はピアス社(アメリカ合衆国、イリノイ州)より購入した。 In FIG. 15, amidite reagent (15 to 19) is Glenn Research, Inc. (United States, Virginia) than, succinimide reagent (20-22) was purchased from Pierce (United States, Illinois).
10または12(400mg,ピューロマイシン10μmol含有)に対し、PEGスペーサー分子(11)の合成に関して示したA〜Dの処理を所定数のアミダイト試薬が導入されるまで繰り返し行なった。 10 or 12 (400 mg, puromycin 10μmol containing) against was repeated performed until amidite reagent handle the number of the predetermined A~D shown for the synthesis of PEG spacer molecule (11) is introduced. その後、50mM炭酸ナトリウム−水を2mLまたは濃アンモニア水1.5mLおよびエタノールを0.5mL加え、室温で14時間震盪した。 Thereafter, 50mM sodium carbonate - water and 2mL or concentrated aqueous ammonia 1.5mL and ethanol was added 0.5 mL, and shaken at room temperature for 14 hours. ろ過により固相担体(CPG)を取り除き、ろ液を減圧濃縮した。 Removing the solid support (CPG) by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. 残査をHPLC[カラム:YMC社(京都府)製YMC pack ODS−A SH−343−5,溶離液:10−60%アセトニトリル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液(pH7.0)の30分間の直線濃度勾配、流速:10mL/分]で精製後、凍結乾燥した。 The residue HPLC [Column: 10-60% 30 min acetonitrile -0.1M aqueous triethylammonium acetate (pH 7.0): YMC Inc. (Kyoto) manufactured by YMC pack ODS-A SH-343-5, eluent linear gradient, flow rate: after purification in 10 mL / min], and lyophilized. その後、修飾剤によっては、残査を30%アセトニトリル−水1mLに溶解させ、1M炭酸水素ナトリウム−水(pH8.3)を0.1mL、およびスクシンイミド試薬(7,8または20)0.1mmolをN,N'−ジメチルホルムアミド0.5mLに溶解させた液を加え、室温で2時間放置した。 Then, depending on the modifying agent, the residue of 30% acetonitrile - dissolved in water 1 mL, 1M sodium bicarbonate - water (pH 8.3) 0.1 mL, and the succinimide reagent (7,8 or 20) 0.1 mmol N, was dissolved in N'- dimethylformamide 0.5mL solution was added and left for 2 hours at room temperature. その後、減圧濃縮し、残査をHPLC[カラム:YMC社(京都府)製YMC pack ODS−ASH−343−5,溶離液:10−60%アセトニトリル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液(pH7.0)の30分間の直線濃度勾配、流速:10mL/分]で精製後、凍結乾燥した。 Thereafter, concentrated under reduced pressure, the residue was purified by HPLC [column: YMC Inc. (Kyoto) manufactured by YMC pack ODS-ASH-343-5, eluent: 10-60% acetonitrile -0.1M aqueous triethylammonium acetate (pH 7.0 linear gradient of 30 min), flow rate: after purification in 10 mL / min], and lyophilized. その後、修飾剤によっては、残査を80%酢酸−水2mLに溶解させ、室温で4時間放置後、減圧濃縮した。 Then, depending on the modifying agent, the residue of 80% acetic acid - is dissolved in water 2 mL, after standing at room temperature for 4 hours, and concentrated under reduced pressure. 残査を30%アセトニトリル−水1mLに溶解させ、1M炭酸水素ナトリウム−水(pH8.3)を0.1mL、およびスクシンイミド試薬(21または22)0.1mmolをN,N'−ジメチルホルムアミド0.5mLに溶解させた液を加え、室温で2時間放置した。 The residue was purified by 30% acetonitrile - dissolved in water 1 mL, 1M sodium bicarbonate - water (pH 8.3) 0.1 mL, and succinimide reagent (21 or 22) 0.1mmol N, N'- dimethylformamide 0. the liquid was dissolved in 5mL was added and left for 2 hours at room temperature. その後、Poly−PakII(グレンリサーチ社)で脱塩し減圧濃縮した。 Then desalted and concentrated under reduced pressure at Poly-PakII (Glen Research). その後、上記の残査に60%トリフルオロ酢酸−水2mLを加え、室温で30分間放置後、減圧濃縮した。 Thereafter, 60% trifluoroacetic acid in the above residue - water 2mL added and left for 30 minutes at room temperature, and concentrated under reduced pressure. 残査をHPLC[カラム:YMC社(京都府)製YMC pack ODS−A SH−343−5,溶離液:10−60%アセトニトリル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液(pH7.0)の30分間の直線濃度勾配、流速:10mL/分]で精製後、凍結乾燥した。 The residue HPLC [Column: 10-60% 30 min acetonitrile -0.1M aqueous triethylammonium acetate (pH 7.0): YMC Inc. (Kyoto) manufactured by YMC pack ODS-A SH-343-5, eluent linear gradient, flow rate: after purification in 10 mL / min], and lyophilized. 得られた修飾剤1〜7の物性データを以下に示す。 The physical property data of the resulting modifier 1-7 below.
産業上の利用の可能性本発明の一態様によれば、翻訳系における翻訳テンプレートの安定性が向上し、翻訳の絶対量が増加する。 According to an aspect of the possibility invention INDUSTRIAL APPLICABILITY improves the stability of the translation template in the translation system, the absolute amount of translation is increased.
また、本発明の別の態様によれば、翻訳系を用いる対応付け分子の製造において、翻訳により生じる総蛋白質に対する目的の対応付け分子の割合が向上し、効率的に対応付け分子を得ることができる。 According to another aspect of the present invention, in the manufacture of assigning molecule using translation systems, to improve the proportion of assigning molecules of interest with respect to total protein produced by translation, to be obtained efficiently assigning molecule it can.
【配列表】 [Sequence Listing]

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
図1は、本発明の翻訳テンプレート(A)ならびにその構成要素であるコード分子(B)およびスペーサー分子(C)の構成を示す。 Figure 1 shows the structure of a translation template (A) and coding molecule, which is a component of the present invention (B) and spacer molecule (C). 翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。 The translation template, consisting of portions of code from the code molecule and the spacer portion derived from the spacer molecule. F1およびF2は蛍光色素を す。 F1 and F2 to a fluorescent dye.
図2は、C末端修飾された蛋白質(C末端ラベル化蛋白質)(A)、本発明の翻訳テンプレート(B)、および、修飾剤(C)の構成を示す。 2, C-terminal, modified protein (C-terminal labeled protein) (A), the translation template of the present invention (B), and shows the configuration of a modifier (C).
図3は、C末端修飾された蛋白質(対応付け分子)(A)、本発明の翻訳テンプレート(B)、および、修飾剤(C)の構成を示す。 3, C-terminal, modified proteins (assigning molecule) (A), the translation template of the present invention (B), and shows the configuration of a modifier (C).
図4は、本発明の対応付け分子による物質や蛋白質の相互作用解析の一次スクリーニングの説明図を示す。 Figure 4 is an explanatory view of a primary screen analysis of interaction assigning molecule according to material and proteins of the present invention. 対応付け分子は、進化分子工学として、ランダムライブラリーなどから、漸進的に進化させ、所望の機能を獲得した物質を創製することに応用できる。 Assigning molecules, as directed evolution, etc. random library, progressively evolved, applicable to creating a substance acquired a desired function. また、ゲノム機能解析への応用として、cDNAライブラリーから所望の物質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析できる。 As an application to functional genomics, can comprehensively analyzed a group of gene sequences from a cDNA library with interaction with the desired material and proteins. ここでは、無細胞共翻訳スクリーニング法を利用することもできる。 Here, it is also possible to use cell-free cotranslation screening methods.
図5は、本発明の対応づけ分子やC末端ラベル化法による物質や蛋白質の相互作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの説明図を示す。 Figure 5 is an explanatory view of the primary screening and secondary screening of the interaction analysis of substances and proteins by associating molecules and C-terminal labeling method of the present invention. 本発明翻訳テンプレートから合成されたC末端修飾タンパク質(修飾剤でC末端修飾された蛋白質、翻訳テンプレートでC末端修飾された蛋白質(対応付け分子)、PEGによってC末端修飾された蛋白質を利用したタンパク質を、標的分子との間の相互作用の解析に利用可能である。図4のスクリーニングを一次スクリーニングとして物質や蛋白質と相互作用の詳細をFCCSやマイクロアレイなどによりさらに解析することが可能である。 C-terminal modified protein at the C-terminal modified protein (modifier synthesized from translation template of the present invention, C-terminal modified protein in translation template (assigning molecule), protein with the C-terminal modified protein by PEG and it is possible to analyze interactions are available. screening of Figure 4 as a primary screening agent or protein that interacts with the details further due FCCS and microarray analysis between the target molecule.
図6は、コード分子の3'末端配列の違いによる翻訳量の比較を示す。 Figure 6 shows a comparison of the translation amount due to the difference of 3 'terminal sequence of the coding molecules. c−junの遺伝子配列を有する、異なる12種類の3'末端配列を持つコード分子(A8=A配列)の翻訳量の比較。 Having the gene sequence of the c-jun, comparison of the translation level coding molecule with different 12 types of 3 'terminal sequence (A8 = A sequence). X配列のバリエーションと必要な条件を示した。 It showed the required conditions and variations of the X sequence. 詳細は、実施例1参照。 For details, see Example 1.
図7は、翻訳テンプレートがPEGスペーサー部を持たない場合および異なるPEGスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較を示す。 Figure 7 shows a comparison of the translation amount when the translation template has a case and different PEG spacer portion without a PEG spacer portion.
A:c−fosの遺伝子配列を有するA配列もX配列も持たないコード分子(None(mRNA))と,A配列を持つコード分子(A(mRNA))、およびdCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro−Bocをライゲーションした翻訳テンプレート(+PEG4000dCdCPuro−Boc,)の翻訳量の比較。 A: the c-fos coding molecule having no nor X sequence A sequence having the gene sequence of (None (mRNA)), coding molecule with A sequence (A (mRNA)), and dCdCT the (Flu) PEG4000dCdCPuro-Boc comparison of the ligated translation template (+ PEG4000dCdCPuro-Boc,) of the translation amount. 詳細は、実施例1参照。 For details, see Example 1.
B:c−junの遺伝子配列を有するA配列もX配列も持たないコード分子(None(mRNA)),XA配列を持つコード分子(XA(mRNA))、およびコード分子(XA(mRNA))に(dC) T(Flu)T(XA+(dC) ),dCdCT(Flu)TPEG4000(XA+PEG4000),dCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro−Boc(XA+PEG4000dCdCPuro−Boc)をライゲーションした翻訳テンプレートの翻訳量の比較(電気泳動の結果(写真)も示す)。 B: c-jun coding molecule having no nor X sequence A sequence having the gene sequence of (None (mRNA)), the code molecule with an XA sequence (XA (mRNA)), and the coding molecule (XA (mRNA)) (dC) 2 T (Flu) T (XA + (dC) 2 T 2), dCdCT (Flu) TPEG4000 (XA + PEG4000), comparison of dCdCT (Flu) PEG4000dCdCPuro-Boc ( XA + PEG4000dCdCPuro-Boc) translation amount of ligated translation template (electrophoresis results (photo) is also shown). 詳細は、実施例1参照。 For details, see Example 1.
図8は、翻訳テンプレートの翻訳量と安定性を示す。 Figure 8 shows the translation amount and stability of the translation template.
A:c−junの遺伝子配列を有するXA配列を持つコード分子(●;XA配列)、A配列もX配列も持たないコード分子(□;None配列)、およびコード分子(XA配列)とdCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro−Bocをライゲーションした翻訳テンプレート(○)の翻訳量のタイムコース。 A: coding molecule with XA sequence having the gene sequence of the c-jun (●; XA sequence), coding molecule having no nor X sequence A sequence (□; None sequences), and the coding molecule (XA sequence) and DCdCT ( Flu) translation amount of time course of PEG4000dCdCPuro-Boc the ligated translation template (○). 詳細は、実施例1参照。 For details, see Example 1.
B:c−junの遺伝子配列を有するコード分子(●;XA配列)と、およびコード分子(XA配列)とdCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro−Bocをライゲーションした翻訳テンプレート(○)の安定性のタイムコース。 B: coding molecule having the gene sequence of the c-jun; and (● XA sequences), and coding molecule stability time course of (XA sequence) and dCdCT (Flu) ligated PEG4000dCdCPuro-Boc translations template (○). 詳細は、実施例1参照。 For details, see Example 1.
図9は、本発明の翻訳テンプレートが異なるPEGスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較(電気泳動の結果(写真)も示す)を示す。 Figure 9 shows a comparison of the translation amount when having PEG spacer portion translation template is different of the present invention (electrophoretic results (photographs) are also shown).
A:c−junの遺伝子配列を有するコード分子(XA配列,A配列)とdCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro−Bocをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによる対応付け分子の形成効率。 A: coding molecule (XA sequence, A sequence) having the gene sequence of the c-jun formation efficiency of assigning molecules by the addition amount of difference in the translation template in the case of ligation with dCdCT (Flu) PEG4000dCdCPuro-Boc. IVV;対応付け分子、Ligated mRNA;コード部にPEGスペーサー部がライゲーションされた翻訳テンプレート。 IVV; assigning molecule, Ligated mRNA; translation template PEG spacer portion code portion is ligated. レーン1〜6;RNA添加量が10,25,50,100,200,400nM. Lanes 1-6; weight RNA added 10,25,50,100,200,400NM. 詳細は、実施例2参照。 For details, see Example 2.
B:c−junの遺伝子配列を有するコード分子(XA配列,A配列)とdCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro−Bocをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによるフリー蛋白質(Free protein)の合成率(対応付け分子の形成量+フリー蛋白質の合成量=100%)。 B: coding molecule (XA sequence, A sequence) having the gene sequence of the c-jun and dCdCT (Flu) free protein by the addition amount of the difference in the translation template in the case of ligated PEG4000dCdCPuro-Boc synthesis rate (the Free protein) ( synthesis amount = 100% correspondence formation amount + free protein molecules). レーン1〜6;RNA添加量が10,25,50,100,200,400nM. Lanes 1-6; weight RNA added 10,25,50,100,200,400NM. 詳細は、実施例2参照。 For details, see Example 2.
図10〜14は、本発明に使用されるPEGスペーサー分子とその合成スキームを示す。 Figure 10-14 shows PEG spacer molecule used in the present invention and its synthesis scheme.
図15〜18は、本発明に使用される修飾剤とその合成スキームを示す。 15-18 illustrate modifiers used in the present invention and its synthesis scheme.
図19は、対応付け分子、スペーサー分子およびコード分子の構造の概略を示す。 Figure 19 shows a schematic of a structure of an assigning molecule, spacer molecule and the coding molecule.
図20は、スペーサー分子の一例の詳細な構成を示す。 Figure 20 shows a detailed structure of an example of the spacer molecule. D:ドナー領域、X2およびX1:機能付与ユニット、PEG:PEG領域、A:ペプチドアクセプター領域。 D: donor region, X2 and X1: function-imparting unit, PEG: PEG region, A: peptide acceptor region. Bio:ビオチン、F1:蛍光色素。 Bio: biotin, F1: a fluorescent dye.
図21は、コード分子の一例の詳細な構成を示す。 Figure 21 shows a detailed structure of an example of a coding molecule.
図22は、C末端修飾蛋白質(A)、修飾剤(B)、および、翻訳テンプレート(C)の構成を示す図である。 22, C-terminal, modified protein (A), the modifier (B), and a diagram showing the configuration of a translation template (C).

Claims (7)

  1. 小麦胚芽無細胞翻訳系で翻訳することによりC末端修飾蛋白質を製造するためのコード分子であって、蛋白質に翻訳される情報を持つORF領域およびその3'末端領域を有し、3'末端領域は、ポリA配列からなるアクセプター領域と、アクセプター領域の5'上流の、CTCGAG、CTCGCC、CTCG、GTCC、CATG、CTCCおよびGTCGから選ばれる翻訳増強配列とからなることを特徴とするコード分子。 A coding molecule for the production of C-terminal modified protein by translating wheat germ cell-free translation system, 'I have terminal region, 3' ORF region and 3 with information for translation into a protein-terminal region is an acceptor region consisting of poly (a) sequence, the 5 'upstream of the acceptor region, CTCGAG, CTCGCC, CTCG, GTCC, CATG, code molecules characterized by comprising a translation enhancing sequences selected from CTCC and GTCG.
  2. アクセプター領域が、長さ2〜10塩基のポリA配列からなることを特徴とする請求項1記載のコード分子。 Acceptor region, coding molecule according to claim 1, characterized in that the length 2-10 bases of a poly A sequence.
  3. 翻訳増強配列がXhoI配列であることを特徴とする請求項1または2記載のコード分子。 Coding molecule of claim 1 or 2, wherein the translational enhancer sequence is a XhoI sequence.
  4. 請求項1〜3のいずれか1項に記載されたコード分子のライブラリー。 A library of coding molecule according to any one of claims 1 to 3.
  5. 小麦胚芽無細胞翻訳系で翻訳することによりC末端修飾蛋白質を製造するための翻訳テンプレートであって、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結するためのドナー領域を持つPEGスペーサー部を含み、コード部が請求項1〜3のいずれか1項に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。 A translation template for the production of C-terminal modified protein by translating wheat germ cell-free translation system, PEG having a donor area for connecting at least the code portion and the code portion having the information for translation into a protein includes a spacer portion, the code portion is from a code molecule according to any one of claims 1 to 3 translation template.
  6. 請求項に記載された翻訳テンプレートのライブラリー。 And libraries of translation template according to claim 5.
  7. 請求項1〜3のいずれか1項に記載されたコード分子もしくは請求項に記載された翻訳テンプレートまたはそのライブラリーを小麦胚芽無細胞翻訳系においてリボソーム上で翻訳することを含むC末端修飾蛋白質またはそのライブラリーの製造方法。 C-terminal modified protein comprising translated on the ribosome in translations template or wheat germ cell-free translation system The library according to the coding molecule or claim 5 according to any one of claims 1 to 3 or the method of manufacturing of the library.
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