JPWO2014046199A1 - 脳腫瘍に関する情報の取得方法、ならびに脳腫瘍に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット - Google Patents
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Abstract
Description
被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
調製工程で得られたDNA試料に含まれるCREM(cAMP responsive element modulator)、VRK2(Vaccinia related kinase 2)およびMYL12A(Myosin, light chain 12A, regulatory, non-sarcomeric)から選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、上記の被験者の脳腫瘍に関する情報を取得する工程と
を含む、脳腫瘍に関する情報の取得方法が提供される。
さらに、本発明によれば、CREM、VRK2およびMYL12Aの各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも1つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む、脳腫瘍に関する情報を取得するためのキットが提供される。
DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、アルカリ処理によりDNAの断片化を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Nとなるよう添加し、10〜40℃で5〜15分間インキュベーションすることによりDNAが断片化される。また、制限酵素処理によりDNAの断片化を行なう場合、用いる制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択され、例えばMseIやBamHIなどが用いられる。
なお、本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン(C)とグアニン(G)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
また、本明細書において、「メチル化の状態を解析する」とは、CREM、VRK2およびMYL12Aから選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無解析すること、または該プロモータ領域のメチル化の頻度を解析することを意味する。
なお、CREM、VRK2およびMYL12Aの各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、本発明の実施形態においては、該プロモータ領域におけるメチル化されたCpG部位の数自体をメチル化の頻度として利用できる。
DNAを増幅する工程としては、PCR法、定量的PCR法、IVT(in vitro transcription)増幅法、SPIA(商標)増幅法などを行う工程が挙げられる。
メチル化DNAおよび/または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
バイサルファイトを用いる処理では、DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。
したがって、DNA中のCpG部位のメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い(CおよびU)に変換される。なお、バイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
MSP法では、解析対象のCpG部位がメチル化されている(すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない)塩基配列は増幅できるが、CpG部位がメチル化されていない(すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている)塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が存在する場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
また、MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセットを用いて行なうこともできる。この場合、PCR産物が存在しない場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
また、本発明の別の実施形態では、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高いか、または閾値と同じという結果が得られた場合、そのような情報を取得することができる。
より具体的には、生体試料中に脳腫瘍由来の腫瘍細胞が存在するという情報を取得することができる。あるいは、被験者が脳腫瘍になる危険性が高いという情報、または脳腫瘍がすでに発生しているという情報を取得することができる。また、被験者に脳腫瘍が発生しているならば、被験者の予後が不良である(もしくは、悪い)という情報、または腫瘍の状態がより進行したステージであるという情報を取得することができる。
本発明の実施形態では、被験者から採取した生体試料から調製したDNA試料におけるマーカーのメチル化状態を解析し、得られた解析結果に基づいて該被験者の脳腫瘍に関する情報を取得することができる。なお、メチル化状態の解析および脳腫瘍の情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
該メモリには、下記のステップ:
被験者由来のDNA試料に含まれるCREM、VRK2およびMYL12Aから選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップと、
得られた解析結果に基づいて、上記の被験者の脳腫瘍に関する情報を提供するステップと
を該コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
被験者における脳腫瘍に関する情報の提供に適するシステム。
該媒体には、下記のステップ:
被験者由来のDNA試料に含まれるCREM、VRK2およびMYL12Aから選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップと、
得られた解析結果に基づいて、上記の被験者の脳腫瘍に関する情報を提供するステップと
を該コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
被験者における脳腫瘍に関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品。
(1)メチル化データの取得
本参考例では、脳腫瘍の癌部組織(283検体)および正常脳組織(2検体)について、TCGA(The Cancer Genome Atlas:http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)において公開されているInfinium HumanMethylation27 BeadChip(Illumina社)のメチル化データを取得した。
Infinium HumanMethylation27 BeadChipには、ヒトのゲノム上にあるCpG部位のうち、27,578ヶ所のCpG部位ごとにメチル化用プローブと非メチル化用プローブを設けている。本参考例では、CpG部位のメチル化用プローブのシグナル強度(シグナルM)と非メチル化用プローブのシグナル強度(シグナルU)とをBeadArray Readerで検出し、以下の計算式により各遺伝子のCpG領域のメチル化率(mCpG)を算出した。
(mCpG)=(シグナルM)/(シグナルM)+(シグナルU)
メチル化陽性率(%)=(メチル化陽性検体数/総検体数)×100
Infinium HumanMethylation27 BeadChip(Illumina社)を用いたデータマイニングの結果、CREM、VRK2およびMYL12Aの各遺伝子のプロモータ領域が、脳腫瘍の癌部組織に高度にメチル化が認められるマーカーとして同定された(図1A〜C参照)。以降、これらのマーカーを本発明のマーカーとも呼ぶ。
(1)メチル化データの取得
本参考例では、参考例1で示される脳腫瘍の癌部組織(283検体)および正常脳組織(2検体)に加えて、9種類の癌/腫瘍組織検体、7種類の非癌部組織検体および12種類の正常組織検体のメチル化データを比較した。なお、各組織の検体数を以下の表に示す。
・肺癌:Selamat SAら、Genome-scale analysis of DNA methylation in lung adenocarcinoma and integration with mRNA expression. Genome Res. Jul;22(7):1197-211(2012).
・前立腺癌:Kobayashi Yら、 DNA methylation profiling reveals novel biomarkers and important roles for DNA methyltransferases in prostate cancer. Genome Res. Jul 21(7):1017-27(2011)
・健常人末梢血93献体のデータ:Salhia Bら、DNA methylation analysis determines the high frequency of genic hypomethylation and low frequency of hypermethylation events in plasma cell tumors. Cancer Res. Sep 1;70(17):6934-44(2010).
各遺伝子のメチル化率(mCpG)の値について、閾値を「0.4」に設定し、メチル化率の値がこの閾値と同じか、またはこの閾値よりも高い検体を「メチル化陽性検体」とした。メチル化陽性検体の数に基づいて、各種の組織における本発明のマーカーのメチル化陽性率(%)を上記の式により算出した。結果を図2A〜Cに示す。なお、図2において、「正常組織」とは、表4に示される組織のうち、健常人末梢血93検体(Salhia Bら)を除いた正常組織を表し、「正常血液」とは健常人末梢血93検体(Salhia Bら)を表す。
脳腫瘍由来の腫瘍細胞においてメチル化されていることが既に知られているMGMTおよびCDKN2Aの各遺伝子(以下、「既知マーカー」という)について、参考例2と同様にして各組織におけるメチル化陽性率を算出した。結果を図3AおよびBに示す。
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、正常脳組織(1検体)および脳腫瘍の癌部組織(8検体)を用いた。
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。得られたDNA溶液に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor(COSMO BIO社製)によって断片化した。また、質量分析法における検量線を作成するため、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット(GEヘルスケアライフサイエンス社)を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor(COSMO BIO社製)により断片化して、非メチル化DNA断片(0%メチル化DNA)の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ(New England Biolab社)を反応させることによりCG配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片(100%メチル化DNA)の溶液を得た。そして、0%メチル化DNAの溶液と100%メチル化DNAの溶液とを所定の割合で混合して、25%、50%および75%メチル化DNAの溶液を得た。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
(iii)PCRおよびIVTによる増幅
バイサルファイト処理した各DNA断片に含まれるメチル化シトシンおよびウラシルを、PCR法およびIVT増幅法により、それぞれグアニンおよびアデニンに変換した。
なお、PCR法に用いたプライマーセットがメチル化DNAおよび非メチル化DNAのいずれも偏りなく増幅できることは、後述する対照試料を用いたMassARRAY(登録商標)解析によって確認されている。本発明のマーカーに対するプライマーセットの配列を、表5に示した。また、CREM、VRK2およびMYL12A遺伝子のプロモータ領域について、表5に示されるプライマーセットで解析される領域の塩基配列を、それぞれ配列番号18〜20で示した(配列番号18の塩基配列はマイナス鎖の配列であり、配列番号19および20の塩基配列はプラス鎖の配列である)。
・タグ配列:AGGAAGAGAG (配列番号10)
・T7プロモータ配列:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCT (配列番号11)
10x Hot Starバッファー(QIAGEN社) 0.5μL
25 mM dNTPミックス 0.04μL
Hot Star Taq(5U/μl)(QIAGEN社) 0.04μL
プライマーミックス 2.0μL
DNA溶液 1.0μL
水 1.42μL
トータル 5μL
94℃で15分を1サイクル、
94℃で20秒、52℃で30秒および72℃で1分を45サイクル、
72℃で3分。
5x T7 R&DNAポリメラーゼバッファー 0.89μL
T Cleavageミックス 0.24μL
100 mM DTT 0.22μL
T7 R&DNAポリメラーゼ 0.44μL
RNase A 0.06μL
RNaseフリーの水 3.15μL
トータル 5μL
(i)検量線の作成
上記で得られた対照試料を2回ずつ独立に質量分析を行った。得られた解析結果より、各プライマーセットについての検量線を作成し、相関係数を算出した。これにより、用いたプライマーセットは、メチル化DNAおよび非メチル化DNAのいずれにも偏りなく増幅できることが確認された。
(ii)測定用試料の解析
上記で得られた測定用試料の質量分析を行い、測定用試料に含まれるDNA断片のピークを得た。次いで、得られた各ピークが、CREM、VRK2およびMYL12Aの塩基配列のどの部分に由来するかを同定した。そして、同一の塩基配列に由来する断片について、メチル化CpG部位を含む断片のピークとメチル化CpG部位を含まない断片のピークとの面積比から、メチル化スコアを算出した。結果を図4A〜Cに示す。
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、上記の実施例1と同じ、正常脳組織(1検体)および脳腫瘍の癌部組織(8検体)を用いた。
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。得られたDNA溶液に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor(COSMO BIO社製)によって断片化した。
また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット(GEヘルスケアライフサイエンス社)を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor(COSMO BIO社製)により断片化して、非メチル化DNA断片(0%メチル化DNA)の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ(New England Biolab社)を反応させることによりCG配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片(100%メチル化DNA)の溶液を得た。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
上記(2)で得られた測定用試料および対照試料(バイサルファイト処理後のDNA)を用いて、MSPを行った。MSPで用いたPCR試薬の組成、プライマーセットおよびPCRの反応条件を以下に示す。
<PCR試薬>
DDW(滅菌水) 16.8μL
10×PCR buffer with MgCl2(Roche社) 2.5μL
2mM dNTP mix 2.5μL
10μMセンスプライマー 1.0μL
10μMアンチセンスプライマー 1.0μL
Faststart Taq polymerase(Roche社) 0.2μL
測定用試料または対照試料 1.0μL
トータル 25μL
上記のMSPで用いたプライマーセットを表6に示す。これらは、増幅される領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセットである。また、精度管理用プライマーセットとして、バイサルファイト処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのプライマーセットも用いた(表7参照)。なお、CREM、VRK2およびMYL12A遺伝子のプロモータ領域について、表6に示されるプライマーセットで解析される領域の塩基配列を、それぞれ配列番号23〜25で示した(配列番号23の塩基配列はマイナス鎖の配列であり、配列番号24および25の塩基配列はプラス鎖の配列である)。
95℃で6分、
95℃で30秒、X℃で30秒、72℃で30秒をYサイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「X」および「Y」はそれぞれ、表6および7に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。
上述のMSPで得られた増幅産物を2%アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図5に示す。なお、図中で「control」として示されている「0」および「100」はそれぞれ0%メチル化対照試料および100%メチル化対照試料を表す。
本実施例では、生体試料として末梢血を用いて、MSPにより、CREMおよびVRK2のプロモータ領域中のCpG部位についてメチル化解析を行った。
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、脳腫瘍患者から採取した末梢血(8検体)を用いた。また、対照試料として、健常人末梢血(3検体)を用いた。
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各末梢血(2ml)から常法により血漿を得た。得られた各血漿からゲノムDNAを、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
上記(2)で得られた測定用試料を用いて、定性MSPを行った。用いたPCR試薬の組成およびPCR条件を以下に示す。なお、本実施例に用いたプライマーセット(CREM、VRK2および精度管理)の塩基配列は、表6および表7に示されている。
<PCR試薬>
DW(滅菌水) 10.88μL
10×PCR buffer with MgCl2(Roche社) 1.5μL
10mM dNTP mix 0.3μL
10μMセンスプライマー 0.6μL
10μMアンチセンスプライマー 0.6μL
Faststart Taq polymerase(Roche社) 0.12μL
測定用試料 1.0μL
トータル 15μL
95℃で6分、
95℃で30秒、X℃で30秒、72℃で30秒をYサイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「X」および「Y」はそれぞれ、表8に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。
上述のMSPで得られた増幅産物を2%アガロースゲル電気泳動で確認した。各増幅産物のバンド強度をグラフで表した(図6A〜C参照)。図6AおよびBにおいて、健常人の末梢血として表示されている棒グラフはバックグラウンドに相当し、バンドを検出していないことを示す。図6AおよびBより、CREMおよびVRK2についてのPCRの結果、健常人の末梢血ではバンドを検出せず、脳腫瘍患者の末梢血では8症例中7症例でバンドを検出することができたことがわかる。また、CREMおよびVRK2を組み合わせることで、8症例の全てにおいてバンドを検出することができ、本発明のマーカーの高い性能を示された。なお、図6Cより、精度管理用プライマーセットを用いたPCRにより、全てのサンプルにおいてバンドが検出されたことがわかる。これは、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことを示している。このように、本発明のマーカーは、生体試料として末梢血を用いた場合でも、脳腫瘍患者において高率にメチル化傾向を示し、健常人ではメチル化が検出されないことがわかった。したがって、本発明のマーカーは、脳腫瘍に特異性の高いマーカーであり、血液試料中で脳腫瘍に由来する癌細胞の存否を判定するのに有用であることが示唆された。
2 測定装置
3 コンピュータシステム
3a コンピュータ本体
3b 入力デバイス
3c 表示部
Claims (10)
- 被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
調製工程で得られたDNA試料に含まれるCREM、VRK2およびMYL12Aから選択される少なくとも1つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、前記被験者の脳腫瘍に関する情報を取得する工程と
を含む、脳腫瘍に関する情報の取得方法。 - 脳腫瘍がグリオーマである請求項1に記載の方法。
- 解析工程が、少なくとも1つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程である請求項1または2に記載の方法。
- 被験者の脳腫瘍に関する情報が、被験者から採取した生体試料における脳腫瘍に由来する腫瘍細胞の存否であり、
情報取得工程が、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合に、生体試料中に脳腫瘍由来の腫瘍細胞が存在するという情報を取得する工程である請求項3に記載の方法。 - 解析工程が、メチル化の頻度を解析する工程である請求項1または2に記載の方法。
- 被験者の脳腫瘍に関する情報が、被験者から採取した生体試料における脳腫瘍に由来する腫瘍細胞の存否であり、
情報取得工程が、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高い場合に、生体試料中に脳腫瘍由来の腫瘍細胞が存在するという情報を取得する工程である、
請求項5に記載の方法。 - CREM、VRK2およびMYL12Aの各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも1つである、メチル化解析により脳腫瘍に関する情報を取得するためのマーカー。
- CREM、VRK2およびMYL12Aの各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも1つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む、脳腫瘍に関する情報を取得するためのキット。
- プライマーセットが、質量分析法およびメチル化特異的PCR法から選択される少なくとも1つの方法によりCpG部位のメチル化の状態を解析するためのプライマーセットである請求項8に記載のキット。
- プライマーセットが、
配列番号4および配列番号5の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号6および配列番号7の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号8および配列番号9の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号12および配列番号13の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号14および配列番号15の塩基配列であるプライマーセット、ならびに
配列番号16および配列番号17の塩基配列であるプライマーセット
から選択される少なくとも1つである請求項9に記載のキット。
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