JPWO2013171810A1 - 耐熱性抗体提示ファージを得る方法 - Google Patents

Abstract

バイオパニング法を用いて、耐熱性抗体提示ファージを得る。より具体的には、まず、複数種類の抗体提示ファージを含有する抗体提示ファージライブラリ水溶液を、ポリペプチドを表面に含む担体上に供給し、複数種類の抗体提示ファージをポリペプチドに特異的に結合させる。次に、担体を３７℃以上７０℃以下の温度に加熱し、一部の抗体提示ファージを担体から解離させ、かつ他の抗体提示ファージを担体に選択的に残す。最後に、前の工程において担体に選択的に残された他の抗体提示ファージを担体から回収し、耐熱性抗体提示ファージを得る。

Description

本発明は、耐熱性抗体提示ファージを得る方法に関する。

図１Ｂは、抗体提示ファージを示す。抗体提示ファージは、ファージの１種である。抗体提示ファージは、ファージミドベクターを内部に含有するタンパク質を含む。言い換えれば、このタンパク質は、ファージミドベクターを包囲する。抗体提示ファージは、外表面に抗体フラグメントを含む。２以上の抗体フラグメントが含まれ得る。ファージミドベクターは、この抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を有している。

図２は、複数の種類の抗体提示ファージを含有する抗体ファージライブラリを用いて、所定の性質を有する抗体提示ファージを選択する方法を示す。この方法は、「バイオパニング法」と言われる。（特許文献１の特に段落番号００４０、特許文献２の１５頁、特許文献３の特に第１６０頁第３３行目〜第１６２頁第３１行目、その中でも特に第１６２頁第８〜９行目を参照）

抗体ファージライブラリに含有される各抗体提示ファージは、異なる抗体フラグメントおよびその抗体をコードする異なる遺伝子配列を有している。

バイオパニング法が以下、簡単に説明される。

図２に示されるように、まず、抗体ファージライブラリを含有する水溶液が、所定の性質に対応する抗原を表面に有する担体に供給される。所定の性質を有する抗体提示ファージが、抗原に特異的に結合する。しかし、所定の性質を有しない抗体提示ファージは、洗浄により除去される。

担体に特異的に結合した抗体提示ファージが回収された後、回収された抗体提示ファージは増殖される。増殖の後、必要に応じて、再度、抗体提示ファージは、抗体を表面に具備する担体に供給される。

この手順が繰り返される。このようにして、所定の性質を有する抗体提示ファージが、抗体ファージライブラリから選択的に回収される。

特開２００９−２８０６１６号公報 国際公開第９６／０４０７４９号 国際公開第２００３／０９９９９９号

本発明の目的は、耐熱性抗体提示ファージを得る新規な方法を提供することである。

本発明は、耐熱性抗体提示ファージを得る方法であって、以下の工程：

（ａ）複数種類の抗体提示ファージを含有する抗体提示ファージライブラリ水溶液を、ポリペプチドを表面に具備する担体上に供給し、複数種類の抗体提示ファージをポリペプチドに特異的に結合させる工程であって、
各抗体提示ファージは、ファージミドベクターを内部に含有するタンパク質を含み、
各抗体提示ファージは、外表面に抗体フラグメントを含み、かつ
前記ファージミドベクターは、前記抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を有している工程；

（ｂ）担体を３７℃以上７０℃以下の温度に加熱し、一部の抗体提示ファージを担体から解離させ、かつ他の抗体提示ファージを担体に選択的に残す工程；および

（ｃ）工程（ｂ）において担体に選択的に残された他の抗体提示ファージを回収し、耐熱性抗体提示ファージを得る工程、

を含む、方法に関する。

一の実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号：０１により表されるアミノ酸配列からなる。

一の実施形態において、前記方法は、工程（ａ）および工程（ｂ）の間にさらに以下の工程：
工程（ａ）においてポリペプチドに特異的に結合しなかった抗体提示ファージを除去する工程、を含む。

一の実施形態において、前記方法は、工程（ｂ）および工程（ｃ）の間にさらに以下の工程：
前記担体を洗浄する工程、を含む。

一の実施形態において、前記方法は、工程（ｃ）の後にさらに以下の工程：
工程（ｃ）において回収された耐熱性抗体提示ファージを増幅させる工程、を含む。

本発明は、耐熱性抗体フラグメントを得る方法であって、以下の工程：

（ａ）複数種類の抗体提示ファージを含有する抗体提示ファージライブラリ水溶液を、ポリペプチドを表面に具備する担体上に供給し、複数種類の抗体提示ファージをポリペプチドに特異的に結合させる工程であって、
各抗体提示ファージは、ファージミドベクターを内部に含有するタンパク質を含み、
各抗体提示ファージは、外表面に抗体フラグメントを含み、かつ
前記ファージミドベクターは、前記抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を有している工程；

（ｂ）担体を３７℃以上７０℃以下の温度に加熱し、一部の抗体提示ファージを担体から解離させ、かつ他の抗体提示ファージを担体に選択的に残す工程；

（ｃ）工程（ｂ）において担体に選択的に残された他の抗体提示ファージを回収し、耐熱性抗体提示ファージを得る工程、

（ｄ）工程（ｃ）において回収された耐熱性抗体提示ファージに細胞を接触させ、感染細胞を生成する工程；および

（ｅ）工程（ｄ）において生成された感染細胞を培養して、耐熱性抗体フラグメントを得る工程、
を含む、方法に関する。

配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなる耐熱性ペプチドは、本発明の精神に含まれる。

一の実施形態において、前記ペプチドは、７０℃に加温されても安定である。

本発明は、耐熱性抗体提示ファージを得る新規な方法を提供する。

図１Ａは、抗体を示す。 図１Ｂは、抗体提示ファージを示す。 図２は、バイオパニング法を示す。 図３は、実施形態による耐熱性抗体提示ファージを選択的に得る方法を示す。 図４は、実施例によるファージミドベクターを得る方法を示す。 図５は、実施例２−２〜実施例２−３０による実験結果のグラフを示す。

本発明の実施形態が、以下、説明される。

（用語の説明）
まず、本明細書において用いられる用語が説明される。
図１Ａは、抗体を示す。広く知られているように、抗体１は「Ｙ」文字の形状を有する。抗体１は２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域からなる。抗体１は、２本の重鎖２および２本の軽鎖３からなる。各重鎖２は、重鎖定常領域１（参照符号：２２）、重鎖定常領域２（参照符号：２３）、重鎖定常領域３（参照符号：２４）、および重鎖可変領域２１からなる。各軽鎖３は、軽鎖可変領域３１および軽鎖定常領域３２からなる。

各Ｆａｂ領域は、１つの重鎖可変領域２１、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、１つの軽鎖可変領域３１、および１つの軽鎖定常領域３２からなる。軽鎖３はリンカー４を介して重鎖２に連結されている。重鎖２は先端に１つの重鎖可変領域２１を有している。軽鎖３は先端に１つの軽鎖可変領域３１を有している。抗体１には抗原が特異的に結合する。より詳細には、抗原は重鎖可変領域２１および軽鎖可変領域３１からなるＦｖ領域に特異的に結合する。

抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントである。

Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つのＦａｂ領域からなる。言い換えれば、Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つの軽鎖可変領域３１、１つの重鎖可変領域２１、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、およびリンカー４からなる。軽鎖定常領域３２は、リンカー４を介して重鎖定常領域１（参照番号：２２）に連結している。

Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、２つのＦａｂ領域からなる。上記の通り、各Ｆａｂ領域は、１つの軽鎖可変領域３１、１つの重鎖可変領域２１、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（参照符号：２２）、およびリンカー４からなる。これらの２つのＦａｂ領域は、他のリンカー（図示せず）を介して互いに連結されている。好ましくは、一方の重鎖定常領域１（参照番号：２２）が、他のリンカー（図示せず）を介して他方の重鎖定常領域１（参照番号：２２）に連結している。

ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、軽鎖可変領域３１、重鎖可変領域２１、およびリンカーからなる。軽鎖可変領域３１は、リンカー（図示せず）を介して重鎖可変領域２１に連結している。

リンカーの例は５〜２０のアミノ酸からなるペプチドである。より具体的には、リンカーの例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：５９）により表されるアミノ酸配列である。リンカーの他の例は、ジスルフィド結合（−硫黄原子（Ｓ）−硫黄原子（Ｓ）−）である。

（工程（ａ））
図３は、実施形態による耐熱性抗体提示ファージを選択的に得る方法を示す。

工程（ａ）では、まず、抗体提示ファージライブラリ水溶液が用意される。抗体提示ファージライブラリ水溶液は、複数種類の抗体提示ファージを含有する。

図１Ｂに示されるように、抗体提示ファージライブラリ水溶液に含まれる各抗体提示ファージは、抗体フラグメントをその表面に有している。各抗体提示ファージは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントをその表面に有することが望ましい。各ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、それぞれ複数の種類の重鎖可変領域２１および複数の種類の軽鎖可変領域３１の中からランダムに選択された１つの重鎖可変領域２１および１つの軽鎖可変領域３１からなる。

複数種類の抗体提示ファージは、互いに異なる抗体フラグメントを有している。

各抗体提示ファージは、ファージミドベクターを含有する。ファージミドベクターは、その表面に付加された抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を有する。望ましくは、ファージミドベクターは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントの１つの重鎖可変領域２１をコードするＶＨ遺伝子およびｓｃＦｖ抗体フラグメントの１つの軽鎖可変領域３１をコードするＶＬ遺伝子を有する。

非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５は、このような抗体提示ファージライブラリ水溶液を調製する方法を開示している。非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５を読んだ当業者は、抗体提示ファージライブラリ水溶液を容易に調製し得るであろう。

［非特許文献３］Ｇｒｅｇ Ｗｉｎｔｅｒ， Ａｎｄｒｅｗ Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ． Ｈａｗｋｉｎｓ， ａｎｄ Ｈｅｎｎｉｅ Ｒ． Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９４） Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １２，４３３−４５５
［非特許文献４］Ｔａｋａｙｕｋｉ Ｏｋａｍｏｔｏ， Ｙｏｈｅｉ Ｍｕｋａｉ， Ｙａｓｕｏ Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｈｉｒｏｋｏ Ｓｈｉｂａｔａ， Ｍａｋｉ Ｋａｗａｍｕｒａ， Ｙｏｋｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｓｈｉｎｓａｋｕ Ｎａｋａｇａｗａ， Ｈａｒｕｈｉｋｏ Ｋａｍａｄａ， Ｔａｋａｏ Ｈａｙａｋａｗａ， Ｔａｄａｎｏｒｉ Ｍａｙｕｍｉ， Ｙａｓｕｏ Ｔｓｕｔｓｕｍｉ （２００４） Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｅ ｓｃＦｖ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃＦｖｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ．３２３（２）， ５８３−９１
［非特許文献５］Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ （２００４／５／６）， ＩＳＢＮ ９７８−０１９９６３８７３４

図３に示されるように、抗体提示ファージライブラリ水溶液は、ポリペプチドを表面に具備する担体上に供給される。ポリペプチドは、抗原として機能する。抗体提示ファージの表面に付加された抗体フラグメントは、ポリペプチドに特異的に結合する。このようにして、複数種類の抗体提示ファージの少なくとも一部はポリペプチドに特異的に結合する。ポリペプチドに結合しなかった抗体提示ファージは、洗浄により除去されることが望ましい。洗浄のために、緩衝液が用いられることが望ましい。緩衝液の例は、０．１重量％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液である。

ポリペプチドは、担体に固定化されている。共有結合を介してポリペプチドは担体に固定化されていることが望ましい。例えば、ポリペプチドの末端にシステイン残基が導入される。一方、担体には、金膜が形成される。システイン残基に含まれる硫黄原子が金膜と反応して、ポリペプチドおよび金膜の間にスルフィド結合が形成される。このようにして、ポリペプチドは担体に固定化され得る。他の固定化方法も、用いられ得る。

担体の例は、基板、マイクロビーズ、および不織布である。基板の材料の例は、プラスチックである。ポリプロピレンが望ましい。より具体的には、担体の例は、ＥＬＩＳＡプレートである。

（工程（ｂ））
次に、担体が、３７℃以上７０℃以下の温度に加熱される。加熱温度が高い場合には、加熱時間が短い。一方、加熱温度が低い場合には、加熱時間は長い。より具体的には、担体は、６０℃でおよそ３０分間、加熱されることが望ましい。

本発明者らは、配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドが、耐熱性を有することを見出した。配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、７０℃に加熱されても、変性しない。後述される実施例２を参照せよ。

一部の抗体提示ファージが、加熱によって担体から解離される。担体から解離した抗体提示ファージは、耐熱性抗体提示ファージではない。緩衝液に担体が接触されながら、担体が加熱されることが望ましい。なぜなら、担体から解離した抗体提示ファージが、容易に緩衝液内に分散または溶解するからである。

一方、他の抗体提示ファージが、加熱によって担体から解離しない。言い換えれば、他の抗体提示ファージは、加熱されても担体に残される。担体に残された他の抗体提示ファージは、耐熱性抗体提示ファージである。このようにして、耐熱性抗体提示ファージが選択的に担体に残される。

工程（ｂ）の最後には、担体を洗浄することが望ましい。洗浄のために、緩衝液が用いられることが望ましい。緩衝液の例は、０．１重量％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液である。

（工程（ｃ））
最後に、担体に選択的に残された耐熱性抗体提示ファージが回収される。担体から耐熱性抗体提示ファージを回収するために、蛋白質を変性させる薬剤が用いられる。薬剤の例は、塩酸のような酸性水溶液または尿素水溶液である。薬剤の好ましい例は、０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ：２．２）である。

担体は、０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ：２．２）に１０分から３０分間、浸漬され、担体から耐熱性抗体提示ファージが解離する。このようにして、耐熱性抗体提示ファージを含有するグリシン塩酸緩衝液が得られる。

その後、グリシン塩酸緩衝液のｐＨは、アルカリ性水溶液を用いて調整される。このｐＨは、７に調整されることが望ましい。アルカリ性水溶液の例は、１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ：９．１）である。

図２に示されるように、回収された耐熱性抗体提示ファージは、増幅されることが望ましい。

最後に、回収された耐熱性抗体提示ファージを用いて、耐熱性抗体フラグメントが以下のように得られる。

まず、回収された耐熱性抗体提示ファージに細胞（望ましくは大腸菌ＴＧ−１）を接触させ、感染細胞を生成する。感染により、大腸菌ＴＧ−１は、抗生物質耐性を獲得する。

次に、この感染細胞が培養されて、耐熱性抗体フラグメントを得る。

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。

（実施例１）
表１、表２、表３、および表４は、実施例１において用いられたプライマーを示す。
表１は、軽鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマーＡ（プライマー１〜２１、配列番号：０２〜配列番号：２２）を示す。
表２は、重鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマーＢ（プライマー２２〜４４、配列番号：２３〜配列番号：４５）を示す。
表３は、軽鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマーＣ（プライマー４５〜４９、配列番号：４６〜配列番号：５０）を示す。
表４は、重鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマーＤ（プライマー５０〜５５、配列番号：５１〜配列番号：５６）を示す。

工程（ａ−１）ヒト心筋由来トロポニンＩを免疫したマウス脾臓からの全ＲＮＡの調製
ヒト心筋由来のトロポニンＩに含有されるポリペプチド（配列番号：０１、シグマアルドリッチジャパン株式会社から入手、ＣＡＰＡＰＩＲＲＲＳＳＮＹＲＡＹＡＴＥＰＨＡＫＫＫＳＫＩＳＡＳＲＫＬＱＬＫＴＬＬＬＱＩＡＫ）が、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣクロスリンカー（サーボフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）を用いて、ヒト血清アルブミン（シグマ・アルドリッチから購入）に連結された。

より具体的には、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣクロスリンカー（０．５ｍｇ）が、１００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第１水溶液を得た。この第１水溶液は、５０℃の温度下で１０分、放置された。

ヒト血清アルブミン（１０ｍｇ）が１ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第２水溶液を得た。

第１水溶液は第２水溶液と混合され、混合物を得た。混合物は、３０分間、静置された。このようにして、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣクロスリンカーがヒト血清アルブミンに結合された。

混合物は、カラム（ＧＥヘルスケアより商品名：ＰＤ１０として入手）に通され、未反応のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣクロスリンカーを除去した。

上記ポリペプチド（配列番号：０１、１．５ｍｇ）がジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという）により溶解され、ＤＭＳＯ溶液を得た。２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する混合物（１ｍＬ）にＤＭＳＯ溶液（１００マイクロリットル）が添加された。その後、一晩、混合物は放置され、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣクロスリンカーがアミノ酸（配列番号：０１）に結合された。

このようにして、トロポニンＩに含まれるポリペプチド（配列番号：０１）が修飾されたヒト血清アルブミンが得られた。以下、このヒト血清アルブミンは「トロポニン修飾ＨＳＡ」という。

完全フロイトアジュバント（和光純薬工業株式会社から購入）およびトロポニン修飾ＨＳＡが混合され、混合物を得た。この混合物がＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。ＢＡＬＢ／ｃマウスとは、アルビノマウスの一種である。

２週間後、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）およびトロポニン修飾ＨＳＡの混合物がＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。これをもう一度繰り返した。このようにして、１ヶ月かけて、ＢＡＬＢ／ｃマウスはトロポニン修飾ＨＳＡにより免疫された。言い換えれば、上記混合物をＢＡＬＢ／Ｃマウスに与えることによって、ＢＡＬＢ／ｃマウスの体内において、トロポニン修飾ＨＳＡに対する抗体が産生された。

免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓が摘出された。１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社より入手）が、脾臓に添加され、充分に攪拌された。

次に、０．２ｍＬの体積を有するクロロホルム液（純度：９９．９％）が脾臓を含む混合液に添加され、そして再度、充分に攪拌された

混合液は、１１７６００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、４℃の温度下、１５分間、遠心分離に供された。上清（５００マイクロリットル）が取得された。得られた上清にイソプロパノール（５００マイクロリットル）を添加し、室温下で１０分間、静置された。

上清は、再度、上記の条件と同一の条件を有する遠心分離に供され、沈殿物を得た。得られた沈殿物に７５％エタノール水溶液（１ｍＬ）を添加し、エタノール溶液を得た。

エタノール溶液は、７３５００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。沈殿物は、乾燥された。このようにして、全マウスＲＮＡが得られた。

工程（ａ−２）マウス脾臓由来全ＲＮＡからのｍＲＮＡの抽出
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ^ＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （タカラバイオ株式会社から購入）を用いて、工程（ａ−１）において得られた全マウスＲＮＡからｍＲＮＡが抽出された。

ＲＮａｓｅフリーの水（１００マイクロリットル）が１本のマイクロチューブに注入された。このマイクロチューブは、ブロックインキュベーター（アステック株式会社より入手）にセットされ、１時間、７０℃に加温された。

全マウスＲＮＡが、ＲＮａｓｅフリーの水（１００マイクロリットル）に溶解された。

キットに含まれている２×バインディング緩衝液（１００マイクロリットル）およびキットに含まれているオリゴテックス（１０マイクロリットル）がＲＮａｓｅフリーの水（１００マイクロリットル）に混合された。その後、混合物は７０℃の温度下で３分間、静置された。さらに室温で１０分間、混合物は静置された。

混合物は、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、５分間、遠心分離に供された。上清が除去され、キットに含まれている洗浄バッファー（３５０マイクロリットル）に沈殿物が懸濁された。懸濁液は、キットに含まれているカラムに供給された。カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。

カラムを洗浄するために、カラムに洗浄バッファー（３５０マイクロリットル）が供給された。再度、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３０秒間、遠心分離に供された。

カラムの底部にサンプル採取用のマイクロチューブが装着された。

カラムに含有されているｍＲＮＡを抽出するために、マイクロチューブに含有されているＲＮａｓｅフリーの水（２０マイクロリットル）がカラムに供給された。その後、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。再度、ＲＮａｓｅフリーの水（２０マイクロリットル）がカラムに供給され、カラムは、１４７０００ｍ／ｓ^２の重力加速度で、３分間、遠心分離に供された。

このようにして、ｍＲＮＡを含有する抽出液がマイクロチューブ内に得られた。

工程（ａ−３） ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写
得られた抽出液に含まれるｍＲＮＡが、逆転写酵素（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ、タカラバイオ株式会社から購入）を用いて逆転写され、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。

工程（ａ−４−１） ｃＤＮＡを用いた、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードミックスプライマーＡ（配列番号：０２〜２２）、およびリバースミックスプライマーＣ（配列番号：４６〜５０）を用いるＰＣＲ法により、軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片（以下、「ＶＬ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。

このＰＣＲ法のプロトコールは表５の通り。

サイクル回数：３５回。

最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＬ遺伝子断片を含有していた。

増幅されたＶＬ遺伝子断片の確認および精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。

工程（ａ−４−２） ｃＤＮＡを用いた、重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードミックスプライマーＢ（配列番号：２３〜４５）、およびリバースミックスプライマーＤ（配列番号：５１〜５６）を用いるＰＣＲ法により、重鎖可変領域をコードする遺伝子断片（以下、「ＶＨ遺伝子断片」という）が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。

このＰＣＲ法のプロトコールは、ＶＬ遺伝子断片のプロトコールと同一であった。

最後に溶液は６８℃で４分間放置された。このようにして、ＰＣＲ溶液が得られた。このＰＣＲ溶液は、増幅されたＶＨ遺伝子断片を含有していた。

ＶＨ遺伝子断片の生成の確認およびＶＨ遺伝子断片の精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。

工程（ａ−５） ＶＬ遺伝子断片およびＶＨ遺伝子断片の連結
精製されたＶＨ遺伝子断片は、精製されたＶＬ遺伝子断片にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片（以下、「ｓｃＦｖ遺伝子断片」という）を得た。得られた遺伝子断片の５末端および３末端は、それぞれ制限酵素サイトＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって修飾されていた。

工程（ａ−６） ｓｃＦｖ遺伝子のベクターへの導入
ｓｃＦｖ遺伝子断片は、アンピシリン耐性遺伝子を有するファージミドベクターにライゲーションされた。

具体的には、非特許文献６に開示されているファージミドベクターと同等のべクターが使用された。ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、ｇ３ｐファージコート蛋白質の融合蛋白質として発現された。
［非特許文献６］Ｈｕａｎ Ｑｉ， Ｈａｉｑｉｎ Ｌｕ， Ｈｕａ−Ｊｉ Ｑｉｕ， Ｖａｌｅｒｙ Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，Ａｉｈｕａ Ｌｉｕ （２０１２） Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｖｏｌ．４１７（３）， １２９-１４３

最初に、ｓｃＦｖ遺伝子断片は、制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ｓｃＦｖ遺伝子断片は、電気泳動法により精製され、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含有する水溶液を得た。

ファージミドベクターもまた、制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ファージミドベクターも、電気泳動により精製され、ファージミドベクターを含有する水溶液を得た。

これら２つの水溶液が混合され、混合液を得た。

混合液に、酵素（東洋紡株式会社より商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２として購入）が添加され、そして混合液は１６℃の温度下で２時間放置された。このようにして、ｓｃＦｖ遺伝子断片がファージミドベクターにライゲーションされた。

エレクトロポレーション法により、このライゲーション産物で、大腸菌ＴＧ−１が形質転換された。その後、大腸菌は２ＴＹＡＧプレート培地上で一晩培養された。

２ＴＹＡＧプレート培地は、表６に示される試薬を含有する寒天培地であった。

工程（ａ−７） 抗体提示ファージライブラリ水溶液の調製
２ＴＹＡＧプレート培地に形成された全てのコロニーが回収された。回収されたコロニーは、１５重量％の濃度でグリセロールを含有するＰＢＳ溶液に懸濁された。

回収された大腸菌溶液の一部が、３０ｍＬの容量を有する２ＴＹＡＧ液体培地に添加された。その後、大腸菌は、対数増殖期（ｌｏｇ−ｐｈａｓｅ）に到達するまで培養された。Ｍ１３Ｋ０７ ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手）が大腸菌溶液に添加され、感染多重度（ＭＯＩ）が１０とされた。大腸菌溶液は、３７℃で３０分間、静置された。さらに、大腸菌溶液は、３７℃で３０分振とう培養された。遠心分離により上清が除去された。その後、大腸菌を含有する沈殿物は、再度、２ＴＹＡＫ液体培地に懸濁された。大腸菌は３０℃の温度下で一晩、培養された。

２ＴＹＡＫ液体培地は、表７に示される試薬を含んでいた。

次に、培養液が遠心分離され、上清を回収した。２．５Ｍの濃度を有するＮａＣｌ水溶液および２０％（重量／体積）の濃度を有するポリエチレングリコール６０００の水溶液がこの上清に添加された。混合物がよく攪拌された後、混合物は４℃で６時間、静置された。

その後、混合物が遠心分離され、沈殿物を回収した。この沈殿物は、約１ｍＬの容積を有するＰＢＳ水溶液に溶解された。さらに、ＰＢＳ水溶液が遠心分離され、大腸菌の沈殿物を除去した。このようにして、上清が抗体提示ファージライブラリ水溶液として得られた。

工程（ａ−８） 担体への抗体提示ファージライブラリの結合
ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ、Ｔｅｒｍｏｓｃｏｅｎｍｔｉｆｉｃ社）を用いて、ポリペプチドが固定化された担体が以下のように用意された。

配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが、ＥＬＩＳＡプレートのプロトコールに従って、以下のように、ＥＬＩＳＡプレート上に固定された。

まず、ＥＬＩＳＡプレートは、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）およびＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：７．２）で３回洗浄された。

ポリペプチド（配列番号：０１、粉末、１ミリグラム）が、ＤＭＳＯ（１００マイクロリットル）に溶解され、ポリペプチド溶液を得た。

次に、以下の表８に示される試薬を含有するポリペプチド水溶液が調製された。

ポリペプチド水溶液は、ＥＬＩＳＡプレートに供給され、そして４℃の温度下で一晩、静置された。このようにして、ポリペプチド固定化担体が調製された。

ＥＬＩＳＡプレートは、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）およびＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：７．２）で３回洗浄された。

次に、以下の表９に示される試薬を含有するシステイン水溶液が調製された。

ＥＬＩＳＡプレートにシステイン水溶液が供給された。その後、システイン水溶液は室温下で１時間放置された。

ＥＬＩＳＡプレートは、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）およびＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：７．２）で３回洗浄された。

次に、５％（重量／容積）の濃度を有するウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という、１５マイクロリットル）および工程（ａ−７）において調製された抗体提示ファージライブラリ水溶液（７５マイクロリットル）が、ＰＢＳ水溶液に混合された。ＰＢＳ溶液中では、抗体提示ファージの個数は、１×１０＾１１ ＣＦＵであった。混合されたＰＢＳ水溶液（１５０マイクロリットル）が、ＥＬＩＳＡプレート上に添加された。

ＥＬＩＳＡプレートは室温で１時間、震とうされた。その後、ＥＬＩＳＡプレートは、０．１重量％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ水溶液（以下、「ＰＢＳＴ水溶液」という）で１０回、洗浄された。

洗浄後、ＥＬＩＳＡプレートにＰＢＳＴ水溶液（２００マイクロリットル）が添加された。その後、ＥＬＩＳＡプレートプレートは密閉された。

工程（ｂ）：加熱処理
工程（ａ−８）において得られたＥＬＩＳＡプレートが、６０℃の温度下で３０分間放置された。

工程（ｃ）：耐熱性抗体提示ファージの回収
工程（ｂ）の後、ＥＬＩＳＡプレートからＰＢＳＴ水溶液が除去された。ＥＬＩＳＡプレートは、６０℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液で５回、洗浄された。

次に、ＥＬＩＳＡプレートに０．１Ｍの濃度を有するグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ：２．２、２００マイクロリットル）が添加された。その後、ＥＬＩＳＡプレートは、室温で１０分間、放置された。これにより、耐熱性抗体提示ファージがＥＬＩＳＡプレートから解離した。グリシン塩酸緩衝液は、耐熱性抗体提示ファージを含有していた。

その後、グリシン塩酸緩衝液がＥＬＩＳＡプレートから回収され、すぐに１Ｍの濃度を有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：９．１）がグリシン塩酸緩衝液に添加され、グリシン塩酸緩衝液のｐＨをおよそ７．０に調整した。このようにして、耐熱性抗体提示ファージが得られた。

耐熱性抗体提示ファージを増殖させるために、得られた耐熱性抗体提示ファージは、大腸菌ＴＧ−１培養液（３０ｍＬ）によく混合された。この培養液中では、大腸菌ＴＧ−１は対数増殖期（ｌｏｇ−ｐｈａｓｅ）に到達するまで予め培養されていた。

混合後、この培養液は、３７℃の温度下で３０分静置された。その後、培養液は遠心分離され、上清を除去した。

大腸菌ＴＧ−１を含有する沈殿物は、２×ＴＹ液体培地（１ｍＬ）を用いて再度、懸濁された。このようにして、耐熱性抗体提示ファージによって感染された大腸菌ＴＧ−１が調製された。

この大腸菌ＴＧ−１は、２ＴＹＡＧプレート培地上で一晩、培養された。

次に、工程（ａ−７）が繰り返された。具体的には、まず、２ＴＹＡＧプレート培地上に形成された全てのコロニーが回収された。最後に、抗体提示ファージライブラリ水溶液が再度、得られた。

得られた抗体提示ファージライブラリ水溶液を用いて、バイオパニング法が実施された。具体的には、ヒト心筋由来のトロポニンＩ（フナコシより購入）の水溶液（１５０マイクロリットル）が用意された。この水溶液の濃度は、予め、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ：８．３）水溶液を用いて、６．７μｇ／ｍｌに調整されていた。

ヒト心筋由来のトロポニンＩの水溶液（１５０マイクロリットル）は、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒより購入）に添加された。その後、このＥＬＩＳＡプレートは、４℃の温度下で一晩放置された。

ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ水溶液で洗浄された後、０．５％（重量／容量）の濃度でＢＳＡを含有するＰＢＳ水溶液（４００マイクロリットル）がＥＬＩＳＡプレートに添加された。その後、ＥＬＩＳＡプレートは、室温で２時間放置された。このようにしてトロポニンＩが固定化されたＥＬＩＳＡプレートが調製された。

次に、５％（重量／容積）の濃度を有するＢＳＡ（３０マイクロリットル）が抗体提示ファージライブラリ水溶液（１２０マイクロリットル）に混合された。水溶液中では、抗体提示ファージの個数は、０．２×１０＾１０ ＣＦＵであった。混合後、水溶液（１５０マイクロリットル）が、ＥＬＩＳＡプレート上に添加された。

ＥＬＩＳＡプレートは室温で１時間、震とうされた後、ＥＬＩＳＡプレートは、０．１重量％の濃度を有するＰＢＳＴ水溶液で１０回、洗浄された。

その後、ＰＢＳＴ水溶液がＥＬＩＳＡプレートから回収され、すぐに１Ｍの濃度を有するトリス塩酸緩衝液（ｐＨ：９．１）がＰＢＳＴ水溶液に添加され、ＰＢＳＴ水溶液のｐＨをおよそ７．０に調整した。このようにして、耐熱性抗体提示ファージが得られた。

耐熱性抗体提示ファージを増殖させるために、得られた耐熱性抗体提示ファージは、大腸菌ＴＧ−１培養液（３０ｍＬ）に混合された。この培養液中では、大腸菌ＴＧ−１は対数増殖期（ｌｏｇ−ｐｈａｓｅ）に到達するまで予め培養されていた。

混合後、この培養液は、３７℃の温度下で３０分静置された。その後、培養液は遠心分離され、上清を除去した。

大腸菌ＴＧ−１を含有する沈殿物は、２×ＴＹ液体培地（１ｍＬ）を用いて再度、懸濁された。このようにして、耐熱性抗体提示ファージによって感染された大腸菌ＴＧ−１が調製された。

この大腸菌ＴＧ−１は、２ＴＹＡＧプレート培地上で一晩、培養された。このようにして、バイオパニング法が実施された。

２ＴＹＡＧプレート培地上に形成されたコロニーが回収された。大腸菌ＴＧ−１に含有される耐熱性抗体遺伝子の配列が解析された。その結果、回収された耐熱性抗体遺伝子の軽鎖可変領域塩基配列、リンカー塩基配列、および重鎖可変領域塩基配列は、それぞれ、配列番号：６０、配列番号：６１、および配列番号：６２と特定された。

軽鎖可変領域塩基配列（配列番号：６０）
GACGTGGTGATCACTCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAACGG

リンカー塩基配列（配列番号：６１）
GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCC

重鎖可変領域塩基配列（配列番号：６２）
GAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGGGCGGAGCTTGCGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGATGAGGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTGCATATGCCCCGAGGTTCCAGGTCAAGGCCACTATGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGAAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTAATGCTGATCTCCCTATGGACCAGTGGGGTCAAGGAACCACGGTCACCGTTTCCTCG

軽鎖可変領域塩基配列（配列番号：６０）、リンカー塩基配列（配列番号：６１）、および重鎖可変領域塩基配列（配列番号：６２）を用いて細胞が形質転換され、軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号：６３）、リンカーアミノ酸配列（配列番号：６４）、および重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号：６５）からなるｓｃＦｖ抗体フラグメントを得る。

（実施例２−１、加熱処理なし）
工程（ａ−８）に従って、ＥＬＩＳＡプレートが用意された。このＥＬＩＳＡプレートに、Ａ２抗体提示ファージを含有する水溶液が供給され、Ａ２抗体提示ファージがＥＬＩＳＡプレート上のポリペプチド（配列番号：０１）に固定された。Ａ２抗体提示ファージを含有する水溶液を調製する方法は、後述される。Ａ２抗体提示ファージは、図１Ｂに示されるように、Ａ２遺伝子配列を有するプラスミドベクターを含有する。Ａ２抗体提示ファージは、図１Ｂに示されるように、外周面にＡ２抗体フラグメントを具備する。

ＥＬＩＳＡプレートは室温で１時間、震とうされた。その後、ＥＬＩＳＡプレートは、０．１重量％の濃度を有するＰＢＳＴ水溶液で１０回、洗浄された。

５％（重量／容積）の濃度を有するＢＳＡ（５００マイクロリットル）およびＨＲＰ修飾抗Ｍ１３抗体（ＧＥヘルスケア社より入手、１マイクロリットル）が、ＰＢＳ水溶液に混合された。混合されたＰＢＳ水溶液の一部（１５０マイクロリットル）が、ＥＬＩＳＡプレート上に添加された。

ＥＬＩＳＡプレートは室温で１時間、震とうされた。その後、ＥＬＩＳＡプレートは、０．１重量％の濃度を有するＰＢＳＴで５回、洗浄された。

３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（以下、「ＴＭＢ」という、商品名：１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ − ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社より入手）がＥＬＩＳＡプレートに添加された。５分後、硫酸が添加された。４５０ナノメートルの波長でのＥＬＩＳＡプレートの吸光度が、マイクロプレートリーダー（装置名：インフィニットＭ２００ ＰＲＯ、入手先：テカンジャパン株式会社）を用いて、３回測定された。測定された吸光度は表１０に示される。より詳細には、１回目、２回目、および３回目の測定により得られた吸光度が、それぞれ、表１０のＮ＝１、Ｎ＝２、およびＮ＝３の欄に示される。

（実施例２−２、２５℃かつ５分）
工程（ａ−８）に従って、ＥＬＩＳＡプレートが用意された。このＥＬＩＳＡプレートに、Ａ２抗体提示ファージを含有する水溶液が供給され、Ａ２抗体提示ファージがＥＬＩＳＡプレート上のポリペプチド（配列番号：０１）に固定された。

ＥＬＩＳＡプレートは室温で１時間、震とうされた。その後、ＥＬＩＳＡプレートは、０．１重量％の濃度を有するＰＢＳＴ水溶液で１０回、洗浄された。

洗浄後、ＰＢＳＴ水溶液（２００マイクロリットル）がＥＬＩＳＡプレートに添加された。その後、ＥＬＩＳＡプレートプレートは密閉された。

その後、ＥＬＩＳＡプレートが、２５℃の温度下で５分間放置された。

ＥＬＩＳＡプレートからＰＢＳＴ水溶液が除去された。ＥＬＩＳＡプレートは、２５℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液で５回、洗浄された。

その後、ＥＬＩＳＡプレートに、５％（重量／容積）の濃度を有するＢＳＡ（５００マイクロリットル）およびＨＲＰ修飾抗Ｍ１３抗体（ＧＥヘルスケア社より入手、１マイクロリットル）が、ＰＢＳ水溶液に混合された。混合されたＰＢＳ水溶液の一部（１５０マイクロリットル）が、ＥＬＩＳＡプレート上に添加された。

ＥＬＩＳＡプレートは室温で４５分間、震とうされた。その後、ＥＬＩＳＡプレートは、０．１重量％の濃度を有するＰＢＳＴ水溶液で５回、洗浄された。

ＴＭＢがＥＬＩＳＡプレートに添加された。５分後に硫酸が添加された。最後に、実施例２−１と同様に、ＥＬＩＳＡプレートの吸光度が測定された。

（実施例２−３、２５℃・１０分）
ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが２５℃の温度下で１０分間放置されたこと以外は、実施例２−２と同様の実験が行われた。

（実施例２−４、２５℃・１５分）
ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが２５℃の温度下で１５分間放置されたこと以外は、実施例２−２と同様の実験が行われた。

（実施例２−５、２５℃・２０分）
ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが２５℃の温度下で２０分間放置されたこと以外は、実施例２−２と同様の実験が行われた。

（実施例２−６、２５℃・３０分）
ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが２５℃の温度下で３０分間放置されたこと以外は、実施例２−２と同様の実験が行われた。

（実施例２−７、２５℃・６０分）
ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが２５℃の温度下で６０分間放置されたこと以外は、実施例２−２と同様の実験が行われた。

（実施例２−８、３７℃・５分）
以下の（ａ）および（ｂ）を除き、実施例２−２と同様の実験が行われた。
（ａ） ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが３７℃の温度下で５分間放置されたこと、および
（ｂ） ２５℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したことに代えて、３７℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したこと。

（実施例２−９、３７℃・１０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを３７℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが３７℃の温度下で１０分間放置されたこと以外は、実施例２−８と同様の実験が行われた。

（実施例２−１０、３７℃・１５分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを３７℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが３７℃の温度下で１５分間放置されたこと以外は、実施例２−８と同様の実験が行われた。

（実施例２−１１、３７℃・２０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを３７℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが３７℃の温度下で２０分間放置されたこと以外は、実施例２−８と同様の実験が行われた。

（実施例２−１２、３７℃・３０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを３７℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが３７℃の温度下で３０分間放置されたこと以外は、実施例２−８と同様の実験が行われた。

（実施例２−１３、３７℃・６０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを３７℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが３７℃の温度下で６０分間放置されたこと以外は、実施例２−８と同様の実験が行われた。

（実施例２−１４、５０℃・５分）
以下の（ａ）および（ｂ）を除き、実施例２−２と同様の実験が行われた。
（ａ） ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが５０℃の温度下で５分間放置されたこと、および
（ｂ） ２５℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したことに代えて、５０℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したこと。

（実施例２−１５、５０℃・１０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを５０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが５０℃の温度下で１０分間放置されたこと以外は、実施例２−１４と同様の実験が行われた。

（実施例２−１６、５０℃・１５分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを５０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが５０℃の温度下で１５分間放置されたこと以外は、実施例２−１４と同様の実験が行われた。

（実施例２−１７、５０℃・２０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを５０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが５０℃の温度下で２０分間放置されたこと以外は、実施例２−１４と同様の実験が行われた。

（実施例２−１８、５０℃・３０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを５０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが５０℃の温度下で３０分間放置されたこと以外は、実施例２−１４と同様の実験が行われた。

（実施例２−１９、５０℃・６０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを５０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが５０℃の温度下で６０分間放置されたこと以外は、実施例２−１４と同様の実験が行われた。

（実施例２−２０、６０℃・５分）
以下の（ａ）および（ｂ）を除き、実施例２−２と同様の実験が行われた。
（ａ） ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが６０℃の温度下で５分間放置されたこと、および
（ｂ） ２５℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したことに代えて、６０℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したこと。

（実施例２−２１、６０℃・１０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを６０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが６０℃の温度下で１０分間放置されたこと以外は、実施例２−２０と同様の実験が行われた。

（実施例２−２２、６０℃・１５分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを６０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが６０℃の温度下で１５分間放置されたこと以外は、実施例２−２０と同様の実験が行われた。

（実施例２−２３、６０℃・２０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを６０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが６０℃の温度下で２０分間放置されたこと以外は、実施例２−２０と同様の実験が行われた。

（実施例２−２４、６０℃・３０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを６０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが６０℃の温度下で３０分間放置されたこと以外は、実施例２−２０と同様の実験が行われた。

（実施例２−２５、６０℃・６０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを６０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが６０℃の温度下で６０分間放置されたこと以外は、実施例２−２０と同様の実験が行われた。

（実施例２−２６、７０℃・５分）
以下の（ａ）および（ｂ）を除き、実施例２−２と同様の実験が行われた。
（ａ） ＥＬＩＳＡプレートを２５℃の温度下で５分間放置することに代えて、ＥＬＩＳＡプレートが７０℃の温度下で５分間放置されたこと、および
（ｂ） ２５℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したことに代えて、７０℃の温度を有するＰＢＳＴ水溶液を用いてＥＬＩＳＡプレートを洗浄したこと。

（実施例２−２７、７０℃・１０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを７０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが７０℃の温度下で１０分間放置されたこと以外は、実施例２−２６と同様の実験が行われた。

（実施例２−２８、７０℃・１５分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを７０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが７０℃の温度下で１５分間放置されたこと以外は、実施例２−２６と同様の実験が行われた。

（実施例２−２９、７０℃・２０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを７０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが７０℃の温度下で２０分間放置されたこと以外は、実施例２−２６と同様の実験が行われた。

（実施例２−３０、７０℃・３０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを７０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが７０℃の温度下で３０分間放置されたこと以外は、実施例２−２６と同様の実験が行われた。

（実施例２−３１、７０℃・６０分）
得られたＥＬＩＳＡプレートを７０℃の温度下で５分間放置することに代えて、得られたＥＬＩＳＡプレートが７０℃の温度下で６０分間放置されたこと以外は、実施例２−２６と同様の実験が行われた。

吸光度は、加熱した後における、配列番号：０１により示されるアミノ酸配列からなるペプチドを表面に有するＥＬＩＳＡプレート上に残存したＡ２抗体提示ファージの量に対応する。高い吸光度は、多くのＡ２抗体提示ファージが残存したことを意味する。逆に、低い吸光度は、少ないＡ２抗体提示ファージが残存したことを意味する。

以下の式（Ｉ）に基づいて表１０からファージ結合比が算出された。
ファージ結合比（％）＝各実施例の平均吸光度／実施例２−１による平均吸光度×１００ （Ｉ）

図５は、実施例２−２〜実施例２−３１において算出されたファージ結合比のグラフを示す。

図５から明らかなように、７０℃以下かつ５分以下、６０℃以下かつ１０分以下、５０℃以下かつ２０分以下、または３７℃以下かつ６０分以下の条件下で、４０％以上のファージ結合比が得られる。従って、配列番号：０１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、７０℃以下かつ５分以下の加熱条件、望ましくは６０℃以下かつ１０分以下の加熱条件、より望ましくは５０℃以下かつ２０分以下の加熱条件、最も望ましくは３７℃以下かつ６０分以下の加熱条件で実施されるバイオパニング法に好適に用いられ得る。加熱温度の下限は２５℃であることが望ましい。

（Ａ２抗体提示ファージを含有する水溶液の調製）
上述のように、Ａ２抗体提示ファージは、Ａ２遺伝子配列を有するプラスミドベクターを含有する。Ａ２抗体提示ファージは、その表面にＡ２抗体フラグメント（ｓｃＦｖ抗体フラグメントの１種）を具備する。

Ａ２遺伝子配列が以下に記述される。
GACGTGGTGCTCACTCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACAAAGTTGGAAATTAAACGGGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCCAGCTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTGCATATGCCCCGAGGTTCCAGGTCAAGGCCACTATGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTAATGCTGATCTCCCTATGGACCAGTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（配列番号：６６）

実施例１の工程（ａ−１）〜工程（ａ−４）に従って、精製されたＶＨ遺伝子断片および精製されたＶＬ遺伝子断片が得られた。

精製されたＶＨ遺伝子断片は、精製されたＶＬ遺伝子断片にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片（以下、「ｓｃＦｖ遺伝子断片」という）を得た。得られた遺伝子断片の５末端および３末端は、それぞれ制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによって修飾されていた。

ｓｃＦｖ遺伝子断片は、タンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＥＴ２２ｂ（＋）、タカラバイオ株式会社より購入）にライゲーションされた。ライゲーションの詳細は以下に記述される。

最初に、ｓｃＦｖ遺伝子断片は、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ｓｃＦｖ遺伝子断片は、電気泳動法により精製され、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含有する水溶液を得た。

タンパク質発現用ベクターもまた、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。タンパク質発現用ベクターも、電気泳動により精製され、タンパク質発現用ベクターを含有する水溶液を得た。

これら２つの水溶液が混合され、混合液を得た。

混合液に、酵素（東洋紡株式会社より商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２として購入）が添加され、そして混合液は１６℃の温度下で２時間放置された。このようにして、ｓｃＦｖ遺伝子断片がタンパク質発現用ベクターにライゲーションされた。

このようにしてｓｃＦｖ遺伝子断片がライゲーションされたタンパク質発現用ベクターを用いて、大腸菌（商品名：ＤＨ５αコンピテントセル、タカラバイオ株式会社より入手）が形質転換された。

その後、大腸菌は、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上で１６時間、インキュベートされた。インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（５ｍＬ）に供給され、そして１６時間インキュベートされた。

このＬＢ液体培地からタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が、キット（株式会社キアゲンより商品名：ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔとして入手）を用いて抽出された。

抽出されたタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に含有されるＡ２抗体遺伝子の軽鎖可変領域塩基配列、リンカー塩基配列、および重鎖可変領域塩基配列は、それぞれ、配列番号：６７、配列番号：６８、および配列番号：６９と特定された。

軽鎖可変領域塩基配列（配列番号：６７）
GACGTGGTGCTCACTCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACAAAGTTGGAAATTAAACGG

リンカー塩基配列（配列番号：６８）
GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCC

重鎖可変領域塩基配列（配列番号：６９）
CAGCTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTGCATATGCCCCGAGGTTCCAGGTCAAGGCCACTATGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTAATGCTGATCTCCCTATGGACCAGTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

次に、抽出されたタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）、フォワードプライマー５６（配列番号：５７）、およびリバースプライマー５７（配列番号：５８）を用いたＰＣＲ法により、ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片が増幅された。このＰＣＲ法において用いられるポリメラーゼは、商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎとしてタカラバイオ株式会社から購入された。

このＰＣＲ法のプロトコールは表１２に記述される。

サイクル回数：３０回。

このようにして、ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードする遺伝子断片を得た。以下、この遺伝子断片を「ｓｃＦｖ遺伝子断片」という。ｓｃｆｖ遺伝子断片の５’末端および３’末端は、それぞれ、制限酵素サイトＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって修飾されていた。

ｓｃＦｖ遺伝子断片は、アンピシリン耐性遺伝子を有するファージミドベクターにライゲーションされた。

具体的には、非特許文献６に開示されているファージミドベクターと同等のべクターが使用された。ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、ｇ３ｐファージコート蛋白質の融合蛋白質として発現された。

最初に、ｓｃＦｖ遺伝子断片は、制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ｓｃＦｖ遺伝子断片は、電気泳動法により精製され、ｓｃＦｖ遺伝子断片を含有する水溶液を得た。

ファージミドベクターもまた、制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔ（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって処理された。ファージミドベクターも、電気泳動により精製され、ファージミドベクターを含有する水溶液を得た。

これら２つの水溶液が混合され、混合液を得た。

混合液に、酵素（東洋紡株式会社より商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２として購入）が添加され、そして混合液は１６℃の温度下で２時間放置された。このようにして、ｓｃＦｖ遺伝子断片がファージミドベクターにライゲーションされた。

エレクトロポレーション法により、このライゲーション産物で大腸菌ＴＧ−１が形質転換された。その後、大腸菌は２ＴＹＡＧプレート培地（表６を参照せよ）上で一晩培養された。

２ＴＹＡＧプレート培地に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。

シングルコロニーは、３０ｍＬの容量を有する２ＴＹＡＫ液体培地（表７を参照せよ）に添加された。その後、大腸菌は、対数増殖期（ｌｏｇ−ｐｈａｓｅ）に到達するまで培養された。Ｍ１３Ｋ０７ ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手）が大腸菌溶液に添加され、感染多重度（ＭＯＩ）が１０とされた。大腸菌溶液は、３７℃で３０分間、静置された。さらに、大腸菌溶液は、３７℃で３０分振とう培養された。遠心分離により上清が除去された。その後、大腸菌を含有する沈殿物は、再度、２ＴＹＡＫ液体培地に懸濁された。大腸菌は３０℃の温度下で一晩、培養された。

次に、培養液が遠心分離され、上清を回収した。２．５Ｍの濃度を有するＮａＣｌ水溶液および２０％（重量／体積）の濃度を有するポリエチレングリコール６０００の水溶液がこの上清に添加された。混合物がよく攪拌された後、混合物は４℃で６時間、静置された。

その後、混合物が遠心分離され、沈殿物を回収した。この沈殿物は、約１ｍＬの容積を有するＰＢＳ水溶液に溶解された。さらに、ＰＢＳ水溶液が遠心分離され、大腸菌の沈殿物を除去した。このようにして、上清が得られた。この上清は、Ａ２遺伝子配列を含有する抗体提示ファージを含有する水溶液であった。

本発明の耐熱性抗体提示ファージを得る方法は、医薬分野及び臨床検査薬分野における抗体開発のために有用である。

Claims (8)

1. 耐熱性抗体提示ファージを得る方法であって、以下の工程：
   （ａ）複数種類の抗体提示ファージを含有する抗体提示ファージライブラリ水溶液を、ポリペプチドを表面に具備する担体上に供給し、複数種類の抗体提示ファージをポリペプチドに特異的に結合させる工程であって、
   各抗体提示ファージは、ファージミドベクターを内部に含有するタンパク質を含み、
   各抗体提示ファージは、外表面に抗体フラグメントを含み、かつ
   前記ファージミドベクターは、前記抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を有している工程、
   （ｂ）担体を３７℃以上７０℃以下の温度に加熱し、一部の抗体提示ファージを担体から解離させ、かつ他の抗体提示ファージを担体に選択的に残す工程、および
   （ｃ）工程（ｂ）において担体に選択的に残された他の抗体提示ファージを回収し、耐熱性抗体提示ファージを得る工程、
   を含む、方法。
2. 前記ポリペプチドが、配列番号：０１により表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）および工程（ｂ）の間にさらに以下の工程：
   工程（ａ）においてポリペプチドに特異的に結合しなかった抗体提示ファージを除去する工程、
   を含む、請求項１に記載の方法。
4. 工程（ｂ）および工程（ｃ）の間にさらに以下の工程：
   前記担体を洗浄する工程、
   を含む、請求項１に記載の方法。
5. 工程（ｃ）の後にさらに以下の工程：
   工程（ｃ）において回収された耐熱性抗体提示ファージを増幅させる工程、
   を含む、請求項１に記載の方法。
6. 耐熱性抗体フラグメントを得る方法であって、以下の工程：
   （ａ）複数種類の抗体提示ファージを含有する抗体提示ファージライブラリ水溶液を、ポリペプチドを表面に具備する担体上に供給し、複数種類の抗体提示ファージをポリペプチドに特異的に結合させる工程であって、
   各抗体提示ファージは、ファージミドベクターを内部に含有するタンパク質を含み、
   各抗体提示ファージは、外表面に抗体フラグメントを含み、かつ
   前記ファージミドベクターは、前記抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を有している工程、
   （ｂ）担体を３７℃以上７０℃以下の温度に加熱し、一部の抗体提示ファージを担体から解離させ、かつ他の抗体提示ファージを担体に選択的に残す工程、
   （ｃ）工程（ｂ）において担体に選択的に残された他の抗体提示ファージを回収し、耐熱性抗体提示ファージを得る工程、
   （ｄ）工程（ｃ）において回収された耐熱性抗体提示ファージに細胞を接触させ、感染細胞を生成する工程、および
   （ｅ）工程（ｄ）において生成された感染細胞を培養して、耐熱性抗体フラグメントを得る工程、
   を含む、方法。
7. 配列番号：０１によって表されるアミノ酸配列からなる耐熱性ペプチド。
8. ７０℃に加温されても安定である、請求項７に記載の耐熱性ペプチド。

Images