JPWO2013073085A1 - Apoptosis inducer - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、ヒト肺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞に対してアポトーシスを誘導する効果がある物質およびその製造方法を提供することにある。本発明のエルゴステロール誘導体は、ヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞に対してアポトーシスを誘導することができる。さらに本発明のエルゴステロール誘導体は、天然素材であるヒメマツタケの脂溶性抽出物から見いだすことができ、食経験もあり安全性が高く、抗がん剤や健康食品として利用することができる。An object of the present invention is to provide a substance having an effect of inducing apoptosis of human lung cancer cells, human cervical cancer cells and human tongue cancer cells, and a method for producing the same. The ergosterol derivative of the present invention can induce apoptosis in human lung adenocarcinoma cells, human cervical cancer cells and human tongue cancer cells. Furthermore, the ergosterol derivative of the present invention can be found from a fat-soluble extract of Himematsutake, which is a natural material, has high food safety, and can be used as an anticancer agent or health food.
Description
本発明は、エルゴステロール誘導体を有効成分とするアポトーシス誘導剤に関するものである。 The present invention relates to an apoptosis inducer containing an ergosterol derivative as an active ingredient.
エルゴステロールとはビタミンDの前駆物質でステロールの一種であり、キノコなどの菌類において生合成されることが知られている。エルゴステロールの抗がん作用についての研究として、がん細胞に対する血管新生阻害作用の報告がされている(非特許文献1)。しかし、エルゴステロールはがん細胞に対してアポトーシスを誘導することは無い(非特許文献2)。 Ergosterol is a precursor of vitamin D and is a kind of sterol, and is known to be biosynthesized in fungi such as mushrooms. As a study on the anticancer effect of ergosterol, an angiogenesis inhibitory effect on cancer cells has been reported (Non-patent Document 1). However, ergosterol does not induce apoptosis on cancer cells (Non-patent Document 2).
また、エルゴステロール誘導体とは、エルゴステロールを母体とし、化学修飾された化合物をいう。エルゴステロール誘導体についても、抗がん作用に関するいくつかの研究があり、エルゴステロール誘導体のアポトーシス誘導作用の報告がされている(非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5、非特許文献6)。他にもエルゴステロール誘導体にはメラニン生成抑制の報告もある(特許文献1 2003−267873)。
An ergosterol derivative refers to a compound that is chemically modified with ergosterol as a base. As for ergosterol derivatives, there are some studies on anticancer effects, and the apoptosis-inducing action of ergosterol derivatives has been reported (Non-patent
しかしながら、上記の文献からも明白なところ、エルゴステロール誘導体は官能基の導入,酸化あるいは還元などによる化学構造の違いにより、抗がん効果が異なり、特にヒト肺腺がん細胞にアポトーシスの効果をもたらすものは未だに発明されていない。 However, as is apparent from the above literature, ergosterol derivatives have different anticancer effects due to differences in chemical structure due to the introduction, oxidation, or reduction of functional groups, and in particular have an apoptotic effect on human lung adenocarcinoma cells. What brings is not yet invented.
一方、ヒメマツタケとは、ハラタケ科ハラタケ属の担子菌であって学名Agaricus blazei Murrill のことをいう。ヒメマツタケの俗称としてアガリクスまたはアガリクス茸などの名前で呼ばれることも多く、一般的にはアガリクスの名称のほうが著名である。しかしながらアガリクスとは、ハラタケ属の学名Agaricusを日本語読みしたものであり、いわゆるマッシュルーム(Agaricus bisporus (J.Lange) Imbach var.albidus (J.Lange) Sing.)なども含まれてしまうため、本願では、種を特定するためヒメマツタケの名称を使用する。 On the other hand, Himematsutake is a basidiomycete belonging to the genus Agaricaceae and has the scientific name Agaricus blazei Murrill. The common name of Himematsutake is often referred to as Agaricus or Agaricus mausoleum. In general, the Agaricus name is more prominent. However, agaricus is a Japanese reading of the agaric genus Agaricus, which includes so-called mushrooms (Agaricus bisporus (J. Lange) Imbach var. Albidus (J. Lange) Sing.). Then, the name of Himematsutake is used to identify the species.
ヒメマツタケは、βグルカンを含有することで、免疫増強作用などが知られていた (非特許文献7)。免疫増強作用による抗がん治療法は、薬剤を投与すること無く、体内に存在する免疫細胞を活性化することでがん細胞を消滅させる治療法なので、正常細胞への傷害性が無いこと、また天然物由来の成分を使用するため副作用もほとんど無い点で優れている。しかしながら、その効果については個人差も大きく、さらに進行がんにいたっては切除が必要であり、免疫療法だけでの全快は困難であった。 Himematsutake has been known to have an immunopotentiating action by containing β-glucan (Non-patent Document 7). Anti-cancer treatment with immune enhancement is a treatment that eliminates cancer cells by activating immune cells present in the body without administering drugs, so there is no damage to normal cells, In addition, the use of ingredients derived from natural products is excellent in that there are almost no side effects. However, the effects vary widely among individuals, and further resection is necessary for advanced cancer, and it was difficult to achieve complete relief with immunotherapy alone.
ところが、最近はヒメマツタケにも特定のがん細胞に対してアポトーシスを誘導することがわかってきた(特許文献2 2008−115158)。特許文献2にはヒメマツタケ子実体またはその破砕物から得ることができるステロイド誘導体にヒト肺大細胞癌細胞およびヒト胃癌細胞に対するアポトーシス誘導作用が記載されており、ヒメマツタケ由来ステロイド誘導体によるアポトーシス誘導作用が明らかにされている。さらにこのステロイド誘導体はヒト大腸癌細胞並びにヒト肝癌細胞に対してもアポトーシス誘導作用を有することが明らかとされた(特許文献3 2010−229077)。
Recently, however, it has been found that Japanese red pine mushrooms also induce apoptosis of specific cancer cells (
しかしながら、死亡率の高い肺腺がんの細胞に対してヒメマツタケがアポトーシスを誘導するということは全く知られていない。さらに、他にもヒト子宮頸がん細胞やヒト舌がん細胞に対してもヒメマツタケがアポトーシス誘導を示すことは全く知られていない。抗がん剤は、がんの種類によって特異的な場合が多く、各種がん細胞ごとにアポトーシス効果を見出さなければならないという問題があった。 However, it is not known at all that Himematsutake induces apoptosis in lung adenocarcinoma cells with high mortality. Furthermore, it is not known at all that Himematsutake also induces apoptosis in human cervical cancer cells and human tongue cancer cells. Anticancer agents are often specific depending on the type of cancer, and there is a problem that an apoptotic effect must be found for each type of cancer cell.
本発明が解決しようとする課題は、エルゴステロール誘導体を有効成分とするアポトーシス誘導剤であって、特にヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞に対するアポトーシス誘導剤を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is an apoptosis inducer comprising an ergosterol derivative as an active ingredient, and particularly an apoptosis inducer for human lung adenocarcinoma cells, human cervical cancer cells and human tongue cancer cells. Is to provide.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねたところ、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体をヒメマツタケの脂溶性抽出物から見いだし、さらにヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞に対してアポトーシスを誘導させることを見いだして発明を完成させた。 The present inventor has conducted extensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the ergosterol derivative represented by the formula (1) has been found from a fat-soluble extract of Japanese apricot, and human lung adenocarcinoma cells, human cervix The present invention has been completed by finding that apoptosis is induced in cancer cells and human tongue cancer cells.
すなわち、請求項1にかかる発明は、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる1種又は2種以上の細胞に対するアポトーシス誘導剤である。
請求項2にかかる発明は、ヒメマツタケから得ることができる脂溶性抽出物であって、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分として含有することを特徴とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる1種又は2種以上の細胞に対するアポトーシス誘導剤である。
The invention according to
請求項3にかかる発明は、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から1種又は2種以上の細胞に対するアポトーシス誘導剤が、第一次抽出として、ヒメマツタケの乾燥粉末をプロトン性極性の有機溶媒から選ばれる1または2以上の有機溶媒で抽出物を得て、第二次抽出として、当該第一次抽出で得られた抽出物に蒸留水と低極性の有機溶媒から選ばれる1または2以上の有機溶媒とを加えて撹拌した後に分離して得られる有機溶媒層の濃縮物を得て、さらに、第二次抽出物の分画として、当該濃縮物をシリカゲルカラムに吸着させた後に、プロトン性極性の有機溶媒から選択される1ないし2以上の有機溶媒と低極性の有機溶媒から選択される1ないし2以上の有機溶媒を混合してなる有機溶媒混合液で溶出して複数の分画を得て、当該分画からヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる1種又は2種以上の細胞にアポトーシスを起こさせる分画を選択して製造されることを特徴とするアポトーシス誘導剤の製造方法である。
The invention according to
請求項1にかかる発明の効果は、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体によりヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞に対してアポトーシスを誘導し当該がん細胞を死滅させることができる。
The effect of the invention according to
請求項2にかかる発明は、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体が含有されているヒメマツタケの脂溶性抽出物により、ヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞に対してアポトーシスを誘導し当該がん細胞を死滅させることができる。さらに天然物由来のため副作用の無い抗がん作用をもつ物質を提供することができる。 According to a second aspect of the present invention, a human lung adenocarcinoma cell, a human tongue cancer cell or a human cervical cancer is obtained by using a fat-soluble extract of Himematsutake containing an ergosterol derivative represented by the formula (1). It can induce apoptosis of cells and kill the cancer cells. Furthermore, since it is derived from a natural product, it can provide a substance having an anticancer effect without side effects.
請求項3にかかる発明は、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から1種又は2種以上の細胞に対するアポトーシス誘導剤をヒメマツタケから製造する方法を提供することができる。
The invention according to
本発明にかかるヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞に対してアポトーシスを誘導する物質は、式(1)で表されるエルゴステロール誘導体である。
従って、構造が明確なため、当該エルゴステロール誘導体を合成することができれば、合成物を使用することができる。The substance that induces apoptosis of human lung adenocarcinoma cells, human tongue cancer cells or human cervical cancer cells according to the present invention is an ergosterol derivative represented by the formula (1).
Therefore, since the structure is clear, a synthesized product can be used if the ergosterol derivative can be synthesized.
また、本発明にかかるエルゴステロール誘導体はヒメマツタケの菌糸体又は子実体に含有されるため、ヒメマツタケの菌糸体又は子実体から抽出することもできる。 Moreover, since the ergosterol derivative according to the present invention is contained in the mycelium or fruit body of Himematsutake, it can also be extracted from the mycelium or fruit body of Himematsutake.
本発明にかかるエルゴステロール誘導体は脂溶性であるのはその構造上明確である。 It is clear from the structure that the ergosterol derivative according to the present invention is fat-soluble.
ヒメマツタケから脂溶性抽出物を得るためには、ヒメマツタケの菌糸体、子実体または菌糸体と子実体との混合物を用いることができるが、好ましくは子実体をさらにより好ましくは子実体の乾燥粉末を使用する。 In order to obtain a fat-soluble extract from Himematsutake, a mycelium, fruit body or a mixture of mycelium and fruit body of Himematsutake can be used. Preferably, the fruit body is further more preferably a dry powder of the fruit body. use.
ヒメマツタケの乾燥子実体は、天日干し、温風乾燥、熱風乾燥または凍結乾燥などで乾燥することができる。 The dried fruit body of Himematsutake can be dried by sun-drying, hot-air drying, hot-air drying or freeze-drying.
次に第一次抽出について説明する。 Next, the primary extraction will be described.
ヒメマツタケの乾燥子実体あるいはその粉末にプロトン性極性の有機溶媒から選択される1または2以上の有機溶媒を加えて混合液とし、一定時間静置しまたは撹拌してその後、混合液を吸引濾過し、抽出液を回収する。このときの残渣については、さらに上記有機溶媒を添加して一定時間の静置および吸引濾過を繰り返すことにより、抽出物をより多く回収することができる。回収した抽出液を減圧濃縮して有機溶媒を蒸発させ第一次抽出物を得ることができる。 One or two or more organic solvents selected from protic polar organic solvents are added to the dried fruit bodies of Japanese apricot peas to obtain a mixed solution, which is allowed to stand for a certain period of time or stirred, and then the mixed solution is suction filtered. Collect the extract. About the residue at this time, the above-mentioned organic solvent is further added, and the extract can be recovered more by repeating the standing and suction filtration for a fixed time. The recovered extract can be concentrated under reduced pressure to evaporate the organic solvent to obtain a primary extract.
ここで、プロトン性極性の有機溶媒としては、1−ブタノール、2−プロパノール、1−プロパノール、エタノール又はメタノール等があり、好ましくはエタノール、メタノール又は1−プロパノールの何れかを単独または2以上の混合溶媒として用いる。 Here, examples of the organic solvent having a protic polarity include 1-butanol, 2-propanol, 1-propanol, ethanol or methanol, and preferably ethanol, methanol, or 1-propanol alone or a mixture of two or more. Used as a solvent.
また、静置又は撹拌時間は24時間以上が好ましく、より好ましくは48時間静置である。 The standing or stirring time is preferably 24 hours or longer, more preferably 48 hours.
次に第二次抽出について説明する。 Next, secondary extraction will be described.
第一次抽出で得られた抽出物に蒸留水と低極性の有機溶媒から選択される1または2以上の有機溶媒とを添加して混合し、静置した後混合液が分離したら、蒸留水層を除いて有機溶媒層のみを残す。次に当該有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮して第二次抽出物を得ることができる。 If the extract obtained in the first extraction is added with distilled water and one or more organic solvents selected from low-polarity organic solvents, mixed and allowed to stand, then the mixture is separated, then distilled water Leave only the organic solvent layer except the layer. Next, the organic solvent layer can be dehydrated with anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure to obtain a secondary extract.
ここで、上記低極性の有機溶媒には、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等があり、好ましくは酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサンの何れかを単独または2以上の混合溶媒として用いる。 Here, the low-polar organic solvent includes methylene chloride, ethyl acetate, chloroform, diethyl ether, toluene, benzene, hexane, etc., and preferably any one of ethyl acetate, chloroform, hexane, or a mixture of two or more. Used as a solvent.
第二次抽出物は、さらに純度を上げるために分画することができる。すなわち、第二次抽出物をシリカゲルに吸着させ、その後当該シリカゲル吸着物を有機溶媒で溶出させて、1乃至10の画分に適宜に分画することで分画物を得ることができる。 The secondary extract can be fractionated to further increase the purity. That is, a secondary extract can be adsorbed on silica gel, and then the silica gel adsorbate is eluted with an organic solvent, and fractionated into 1 to 10 fractions as appropriate, whereby a fraction can be obtained.
ここで、上記シリカゲル吸着物を溶出させる有機溶媒は、低極性の有機溶媒から選択される1または2以上の有機溶媒とプロトン性極性の有機溶媒から選択される1または2以上の有機溶媒とを混合して得られる有機溶媒が好ましく、より好ましくはヘキサンと酢酸エチルとメタノールとを適宜に混合して得られる有機溶媒である。 Here, the organic solvent for eluting the silica gel adsorbent is one or more organic solvents selected from low polar organic solvents and one or two or more organic solvents selected from protic polar organic solvents. An organic solvent obtained by mixing is preferable, and an organic solvent obtained by appropriately mixing hexane, ethyl acetate, and methanol is more preferable.
次に第二次抽出物の分画物についてさらに純度を高めて単離する方法について説明する。 Next, a method for isolating the fraction of the secondary extract with higher purity will be described.
第二次抽出物の分画物を珪藻土に吸着させたのち、オクタデシルシリル化シリカゲル(ODS)を充填したオープンカラムを使用して、蒸留水と非プロトン性極性の有機溶媒と低極性の有機溶媒とを混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の有機溶媒を用いて、第二次抽出物の分画物を溶出させる。溶出させた液は、任意の溶出量ごとに分取して、任意の分画を集めて減圧濃縮し、第二次分画物を得る。 After adsorbing the fraction of the secondary extract onto diatomaceous earth, using an open column filled with octadecylsilylated silica gel (ODS), distilled water, aprotic polar organic solvent and low polar organic solvent The fraction of the secondary extract is eluted using a solvent mixed with or a single organic solvent. The eluted liquid is fractionated for each arbitrary elution amount, and arbitrary fractions are collected and concentrated under reduced pressure to obtain a secondary fraction.
上記第二次分画物を得る場合の非プロトン性極性の有機溶媒には、アセトニトリルやアセトンなどを使用することができるが、好ましくはアセトニトリルを用いる。また、低極性の有機溶媒については、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等があり、好ましくは酢酸エチルを用いる。 As the aprotic polar organic solvent for obtaining the second fraction, acetonitrile, acetone or the like can be used, but acetonitrile is preferably used. Examples of the low polarity organic solvent include methylene chloride, ethyl acetate, chloroform, diethyl ether, toluene, benzene, hexane and the like, and preferably ethyl acetate is used.
第二次分画物について、薄層クロマトグラフィ―法により抽出成分が単離されているか否かを確認し、抽出成分が単離されていない場合には、さらに分画を行う。 For the second fraction, it is confirmed whether or not the extracted component is isolated by thin layer chromatography. If the extracted component is not isolated, further fractionation is performed.
第二次分画物を珪藻土に吸着させたのち、シリカゲルを充填したオープンカラムを使用して、低極性の有機溶媒とプロトン性極性の有機溶媒とを混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の有機溶媒を用いて、第二次分画物を溶出させる。溶出させた液は、任意の溶出量ごとに分取して、任意の分画を集めて減圧濃縮し、第三次分画物を得る。 After adsorbing the secondary fraction on diatomaceous earth, using an open column packed with silica gel, a solvent that is a mixture of a low-polar organic solvent and a protic-polar organic solvent, or a single organic solvent for each. To elute the secondary fraction. The eluted liquid is collected for each arbitrary elution amount, and arbitrary fractions are collected and concentrated under reduced pressure to obtain a third fraction.
ここで、上記第三次分画物を得る場合に分取する溶出量は5ml以下が好ましくより好ましくは1mlである。また、低極性の有機溶媒としては、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等を用いることができるがより好ましくはクロロホルムを用いる。さらに、プロトン性極性の有機溶媒としては、1−ブタノール、2−プロパノール、1−プロパノール、エタノール、メタノール等を用いることができるが、より好ましくは、メタノールを用いる。 Here, the amount of elution collected when obtaining the third fraction is preferably 5 ml or less, more preferably 1 ml. Moreover, as a low polarity organic solvent, methylene chloride, ethyl acetate, chloroform, diethyl ether, toluene, benzene, hexane, etc. can be used, but chloroform is more preferably used. Furthermore, as a protic polar organic solvent, 1-butanol, 2-propanol, 1-propanol, ethanol, methanol and the like can be used, and methanol is more preferably used.
第三次分画物についても、薄層クロマトグラフィ―法により抽出成分が単離されているか否かを確認する。 薄層クロマトグラフィー法での抽出成分の単離の確認は次の方法ですることができる。 Also for the third fraction, it is confirmed whether or not the extracted component is isolated by thin layer chromatography. Confirmation of isolation of the extracted component by thin layer chromatography can be performed by the following method.
抽出成分を有機溶媒で溶解し、その溶液を毛細管を用いて薄層クロマトグラフィープレートの下端から7mmの高さに点で塗布する。当該抽出成分の塗布された薄層クロマトグラフィープレートを低極性の有機溶媒とプロトン性極性の有機溶媒とを混合した溶媒の入った密閉容器内に立てかけ、有機溶媒をプレート全体に展開させる。展開後は有機溶媒を十分に乾燥させた後、アニスアルデヒド発色試薬で成分を発色させ、成分の単離を確認する。 The extracted components are dissolved in an organic solvent, and the solution is applied with a point at a height of 7 mm from the lower end of the thin layer chromatography plate using a capillary tube. The thin layer chromatography plate coated with the extraction component is stood in a sealed container containing a mixed solvent of a low polarity organic solvent and a protic polarity organic solvent, and the organic solvent is spread over the entire plate. After the development, the organic solvent is sufficiently dried, and then the component is developed with an anisaldehyde coloring reagent to confirm the isolation of the component.
抽出成分の単離を確認したのち、赤外吸収スペクトル、1HNMRスペクトル、13CNMRスペクトルを解析することで、式(1)で表される化学構造を確認することができる。After confirming the isolation of the extracted component, the chemical structure represented by the formula (1) can be confirmed by analyzing the infrared absorption spectrum, 1 HNMR spectrum, and 13 CNMR spectrum.
次にがん細胞に対するアポトーシス誘導について説明する。 Next, apoptosis induction for cancer cells will be described.
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞(A549細胞、東北大学加齢医学研究所、TKG 0184)、ヒト子宮頸がん細胞(HeLa細胞、東北大学加齢医学研究所、TKG 0331)およびヒト舌がん細胞(HSC−3細胞、東北大学加齢医学研究所、TKG 0484)に、上記アガリクス抽出物すなわち第三次分画物をジメチルスルホキシドに溶解させてから添加する。24時間経過後、それぞれに細胞増殖測定試薬を添加して、1時間経過後、吸光度を測定することで細胞生存率を算出する。細胞生存率の算出方法は未処理群の吸光度の値を細胞生存率100%として、処理群の吸光度の値と比較して細胞生存率を求める。 Pre-cultured human lung adenocarcinoma cells (A549 cells, Tohoku University Institute of Aging Medicine, TKG 0184), human cervical cancer cells (HeLa cells, Tohoku University Institute of Aging Medicine, TKG 0331) and humans To the tongue cancer cells (HSC-3 cells, Tohoku University Institute of Aging Medicine, TKG 0484), the agaricus extract, that is, the third fraction, is dissolved in dimethyl sulfoxide and then added. After 24 hours, a cell proliferation measurement reagent is added to each, and after 1 hour, the absorbance is measured to calculate the cell viability. The cell survival rate is calculated by setting the absorbance value of the untreated group to 100% and comparing the absorbance value of the treated group with the absorbance value of the treated group.
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞に第三次分画物を添加する。24時間経過後、TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)法に従い、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出する。TUNEL法とはアポトーシスによってDNAが断片化した細胞を特異的に染色し検出する方法をいう。すなわち、TUNEL法で細胞が検出されればアポトーシスを起こしていることが明白となる。 The third fraction is added to human lung adenocarcinoma cells that have been subcultured in advance. After 24 hours, apoptotic cells are detected by flow cytometry according to the TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling) method. The TUNEL method is a method for specifically staining and detecting cells fragmented with DNA by apoptosis. That is, if cells are detected by the TUNEL method, it becomes clear that apoptosis has occurred.
また、上記第三次分画物は、ヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞のアポトーシスを起こすことが確認されることで、抗がん作用が期待できる。そして、上記第三次分画物は、ヒメマツタケから抽出された脂溶性抽出物であり、ヒメマツタケの食経験からすれば安全性も確保される。 In addition, the above-mentioned third fraction can be expected to have an anti-cancer effect by confirming apoptosis of human lung adenocarcinoma cells, human cervical cancer cells and human tongue cancer cells. And the said 3rd fraction is a fat-soluble extract extracted from Himematsutake, and safety is ensured from the eating experience of Himematsutake.
以上に説明した抽出方法で抽出されたヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケから得ることができる脂溶性抽出物に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、乳化剤、安定化剤、着色剤、香料などを1または複数加えて、通常の方法で食品に配合し、錠剤に打錠し、顆粒化しまたはカプセルに内包した状態にして健康食品または抗がん剤とすることができる。 The fat-soluble extract obtained from Himematsutake, which induces apoptosis of human lung adenocarcinoma cells extracted by the extraction method described above, is mixed with excipients, binders, disintegrants, lubricants, emulsifiers, and stabilization. Add one or more agents, coloring agents, fragrances, etc., mix into foods in the usual way, compress into tablets, granulate or encapsulate into health foods or anticancer agents it can.
また、上記ヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケからの脂溶性抽出物は、そのままあるいは乾燥して粉末化しただけの抗がん剤であっても良く、例えば、家庭で炊飯やお茶に簡単に加えられるように、ヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケからの脂溶性抽出物またはその乾燥粉末化した抗がん剤を小パックに詰めておいても良い。 Further, the fat-soluble extract from Himematsutake that induces apoptosis of human lung adenocarcinoma cells may be an anti-cancer agent as it is or just powdered by drying, such as cooking rice or tea at home. In order to be easily added, a small-pack may be packed with a fat-soluble extract from Himematsutake, which induces apoptosis of human lung adenocarcinoma cells, or a dry powdered anticancer agent thereof.
さらに、ヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケからの脂溶性抽出物は、そのままあるいは乾燥して粉末化したものを様々な加工食品に添加することで、抗がん作用のある健康食品とすることができる。 Furthermore, the fat-soluble extract from Himematsutake, which induces apoptosis of human lung adenocarcinoma cells, is added to various processed foods as it is or dried and powdered. It can be.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明の構成は、下記実施例に記載された内容に限られるものではなく、また、実施例の記述については、特許請求の範囲を限定し、あるいは特許請求の範囲を減縮するように解すべきものでもない。そして、本発明の構成は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において種々の変形が可能である。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the configuration of the present invention is not limited to the contents described in the following embodiments, and the description of the embodiments limits the scope of claims or reduces the scope of claims. It is not something to be understood. The configuration of the present invention can be variously modified within the technical scope described in the claims.
式(1)で表されるエルゴステロール誘導体のヒメマツタケからの製造工程について図1に示すとともに、以下に本発明にかかるエルゴステロール誘導体のヒメマツタケからの抽出例を詳説する。 FIG. 1 shows a process for producing the ergosterol derivative represented by the formula (1) from Himematsutake, and an example of extraction of the ergosterol derivative according to the present invention from Himematsutake is described in detail below.
(第一次抽出)
アガリクスの子実体、9711.57gをエタノール20lに浸漬し、室温で24時間静置した。その後、混合液を吸引濾過し、エタノールと残渣を分離して回収した。次に当該残渣を、再度エタノール20lに浸漬し、室温で48時間静置した後、混合液を吸引濾過し、エタノールと残渣を分離して回収した。更に当該残渣をエタノール20lに浸漬し、室温で24時間静置した後、混合液を吸引濾過して、エタノールを回収した。回収されたエタノール全てを一つにまとめて抽出液とした。抽出液を減圧濃縮し、そこへ、任意の量の蒸留水と任意の量の酢酸エチルを加え、分液ロート内で混合して攪拌した。蒸留水層を除いて、酢酸エチル層のみに対して無水硫酸ナトリウムを加え脱水処理した後、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶画分20.73gを得た。(Primary extraction)
Agaricus fruit bodies, 9711.57 g, were immersed in 20 l of ethanol and allowed to stand at room temperature for 24 hours. Thereafter, the mixed solution was subjected to suction filtration, and ethanol and the residue were separated and recovered. Next, the residue was again immersed in 20 l of ethanol and allowed to stand at room temperature for 48 hours, and then the mixed solution was suction filtered to separate and recover the ethanol and the residue. Further, the residue was immersed in 20 l of ethanol and allowed to stand at room temperature for 24 hours, and then the mixed solution was subjected to suction filtration to recover ethanol. All of the collected ethanol was combined into one extract. The extract was concentrated under reduced pressure, an arbitrary amount of distilled water and an arbitrary amount of ethyl acetate were added thereto, and the mixture was mixed and stirred in a separatory funnel. After removing the distilled water layer and adding only anhydrous ethyl sulfate to the ethyl acetate layer for dehydration treatment, the solution was concentrated under reduced pressure to obtain 20.73 g of an ethyl acetate soluble fraction.
(第二次抽出およびその分画)
酢酸エチル可溶画分のうち20.28gを珪藻土に吸着させ、シリカゲルを充填したオープンカラムにアプライし、ヘキサンと酢酸エチルとメタノールを任意の混合割合で混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の溶媒を用いて、抽出物を溶出させた。溶出した液は200mlずつ分取し、ヘキサン:酢酸エチル=1:1乃至1:3の混合比率で溶出された分画をまとめ、減圧濃縮して、分画物F−5(250mg)を得た。(Secondary extraction and its fractionation)
Of the ethyl acetate-soluble fraction, 20.28 g was adsorbed on diatomaceous earth, applied to an open column packed with silica gel, and a solvent in which hexane, ethyl acetate, and methanol were mixed at an arbitrary mixing ratio, or a single solvent was used. The extract was eluted. The eluted solution was collected in 200 ml aliquots, and the fractions eluted at a mixing ratio of hexane: ethyl acetate = 1: 1 to 1: 3 were combined and concentrated under reduced pressure to obtain Fraction F-5 (250 mg). It was.
(第二次分画)
抽出物F−5(250mg)を珪藻土に吸着させ、ODSを充填したオープンカラムにアプライし、蒸留水とアセトニトリルと酢酸エチルを任意の混合割合で混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の溶媒を用いて、抽出物を溶出させた。溶出した液は8mlずつ分取し、アセトニトリル:酢酸エチル=7:3乃至酢酸エチルで溶出された分画をまとめ、減圧濃縮して、分画物G−10(24.4mg)を得た。(Secondary fractionation)
Extract F-5 (250 mg) was adsorbed on diatomaceous earth, applied to an open column filled with ODS, and a solvent prepared by mixing distilled water, acetonitrile, and ethyl acetate at an arbitrary mixing ratio, or each using a single solvent, The extract was eluted. The eluted solution was collected in an amount of 8 ml, and fractions eluted with acetonitrile: ethyl acetate = 7: 3 to ethyl acetate were combined and concentrated under reduced pressure to obtain a fraction G-10 (24.4 mg).
(第三次分画)
分画物G−10(24.4mg)を珪藻土に吸着させ、シリカゲルを充填したオープンカラムにアプライし,クロロホルムとメタノールを任意の混合割合で混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の溶媒を用いて、抽出物を溶出させた。溶出した液は1mlずつ分取し、クロロホルム:メタノール=49:1で溶出された分画をまとめ、減圧濃縮して、単離成分2.6mgを得た。(Third fractionation)
Fraction G-10 (24.4 mg) was adsorbed on diatomaceous earth, applied to an open column packed with silica gel, and extracted using a solvent in which chloroform and methanol were mixed in any mixing ratio, or each with a single solvent. The product was eluted. The eluted solution was collected in 1 ml portions, and the fractions eluted with chloroform: methanol = 49: 1 were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 2.6 mg of an isolated component.
(構造解析)
単離した成分は、赤外吸収スペクトル、1HNMRスペクトル、13CNMRスペクトルを解析した結果、5α,9α-epidioxy-(22E)-ergosta-7,22-diene-3β,6β-diolであることが分かった。(Structural analysis)
As a result of analyzing the infrared absorption spectrum, 1 HNMR spectrum and 13 CNMR spectrum, the isolated component is 5α, 9α-epidioxy- (22E) -ergosta-7,22-diene-3β, 6β-diol. I understood.
(1)ヒト肺腺がん細胞の細胞死誘導試験 (1) Cell death induction test of human lung adenocarcinoma cells
ヒト肺腺がん細胞はA549細胞を使用した。 A549 cells were used as human lung adenocarcinoma cells.
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞を初回濃度1×104個/100μlの濃度に調整して平底プレート内で培養した。第三次分画で得られたエルゴステロール誘導体をそれぞれジメチルスルホキシドに溶解させ、濃度が0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mlになるようにそれぞれ培地で希釈し、培養した細胞に添加した。このときのジメチルスルホキシドの濃度は培地に対して1%だった。当該添加後24時間経過後、それぞれに細胞増殖測定試薬を添加し、さらに2時間経過後、それぞれの吸光度を測定し、その測定値から細胞生存率を算出した。なお、培地としては10%牛胎児血清、1%ストレプトマイシン・ペニシリンを含むRPMI1640を使用した。細胞生存率の算出方法はコントロール(1% ジメチルスルホキシドを含む細胞培地で培養した細胞群)の吸光度を生存率100%とし、エルゴステロール誘導体添加群の吸光度の値とコントロールの吸光度の値を比較して算出した。上記細胞生存率を図2に示した。本発明にかかるエルゴステロール誘導体は顕著にヒト肺腺がん細胞に対して細胞死を引き起こした。Human lung adenocarcinoma cells subcultured in advance were adjusted to an initial concentration of 1 × 10 4 cells / 100 μl and cultured in a flat bottom plate. The ergosterol derivatives obtained in the third fractionation are dissolved in dimethyl sulfoxide, respectively, and diluted with medium to give concentrations of 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 μg / ml. And added to the cultured cells. The concentration of dimethyl sulfoxide at this time was 1% with respect to the medium. After 24 hours from the addition, a cell proliferation measurement reagent was added to each, and after another 2 hours, the absorbance was measured, and the cell viability was calculated from the measured values. As the medium, RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum and 1% streptomycin penicillin was used. The calculation method for cell viability is that the absorbance of the control (cell group cultured in a cell culture medium containing 1% dimethyl sulfoxide) is 100%, and the absorbance value of the ergosterol derivative added group is compared with the absorbance value of the control. Calculated. The cell viability is shown in FIG. The ergosterol derivative according to the present invention markedly caused cell death in human lung adenocarcinoma cells.
(2)アポトーシス誘導作用の検証 (2) Verification of apoptosis-inducing action
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞を初回濃度2×105個/2mlで平底プレートに培養し、本発明にかかるエルゴステロール誘導体の濃度が0、1.0、4.0 μg/mlなるようにそれぞれ培地で希釈し、その培養したヒト肺腺がん細胞に添加した。24時間経過後に、TUNEL法に従い、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出した。Human lung adenocarcinoma cells previously subcultured are cultured on a flat bottom plate at an initial concentration of 2 × 10 5 cells / 2 ml, and the concentration of the ergosterol derivative according to the present invention is 0, 1.0, 4.0 μg / ml. Each was diluted with a medium and added to the cultured human lung adenocarcinoma cells. After 24 hours, apoptotic cells were detected using flow cytometry according to the TUNEL method.
TUNEL法によるアポトーシス誘導作用の検証の結果は、図3に示したとおりで、アポトーシスが誘導された細胞を顕著に検出した。このことにより、本発明にかかるエルゴステロール誘導体が引き起こしたヒト肺腺がん細胞の細胞死は、アポトーシスであることが明確となった。 The result of the verification of the apoptosis-inducing action by the TUNEL method is as shown in FIG. 3, and the cells in which apoptosis was induced were remarkably detected. This revealed that the cell death of human lung adenocarcinoma cells caused by the ergosterol derivative according to the present invention is apoptosis.
(3)他のがん細胞へのアポトーシス誘導作用 (3) Induction of apoptosis in other cancer cells
ヒト肺腺がん細胞以外の細胞として、ヒト子宮頸がん細胞(HeLa細胞)、ヒト舌がん細胞(HSC−3細胞)を使用した。 Human cervical cancer cells (HeLa cells) and human tongue cancer cells (HSC-3 cells) were used as cells other than human lung adenocarcinoma cells.
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞、ヒト舌がん細胞を初回濃度2×105個/2mlで平底プレート内でそれぞれ培養した。エルゴステロール誘導体が5.0 μg/mlになるように培地で希釈した後、平板プレート内で培養したそれぞれの細胞に添加した。24時間経過後に、TUNEL法に従い、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出した。Human lung adenocarcinoma cells, human cervical cancer cells and human tongue cancer cells subcultured in advance were each cultured in a flat bottom plate at an initial concentration of 2 × 10 5 cells / 2 ml. The ergosterol derivative was diluted with a medium so as to be 5.0 μg / ml, and then added to each cell cultured in a flat plate. After 24 hours, apoptotic cells were detected using flow cytometry according to the TUNEL method.
本発明にかかるエルゴステロール誘導体は、ヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞にアポトーシス誘導効果を発揮することが明白となった。 It became clear that the ergosterol derivative according to the present invention exerts an apoptosis-inducing effect on human lung adenocarcinoma cells, human cervical cancer cells and human tongue cancer cells.
本発明にかかるエルゴステロール誘導体は、肺腺がん、子宮頸がんおよび舌がんに対してアポトーシス誘導を起こさせる効果が期待でき、さらに食用のヒメマツタケから抽出ができるから食経験もあり、また天然素材のため安全性も期待でき、医薬品や健康食品の産業分野で利用することが可能である。 The ergosterol derivative according to the present invention can be expected to induce apoptosis in lung adenocarcinoma, cervical cancer, and tongue cancer, and can be extracted from edible matsutake mushrooms. Because it is a natural material, it can be expected to be safe and can be used in the pharmaceutical and health food industries.
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