JPWO2013035372A1 - 長主鎖構造を有するポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つポリヒドロキシアルカン酸合成活性を有するタンパク質
(4)前記ラクトンがω-ペンタデカラクトンである、(1)〜(3)のいずれか1記載の方法。
<細菌株及びプラスミド>
ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha又はR. eutropha)H16(ATCC 17699, 野生型)又はラルストニア・ユートロファPHB-4(DSM541)を、PHAの生産のために使用した。
先ず、ラルストニア・ユートロファH16又はPHAシンターゼ遺伝子を導入したラルストニア・ユートロファPHB-4を、肉エキス1.0g、ポリペプトン1.0g及び酵母エキス0.2gを含有する富栄養培地100mLを有する500mLフラスコで、30℃で14時間培養した。培養後、細胞を5000rpmで15分間遠心分離に供した。これらの培養条件下では、当該細胞中にポリマーの蓄積は観察されなかった。
上記のように、回収した細胞を凍結乾燥に供した後、スクリューキャップを有するガラスチューブにおいて60℃で2日間、クロロホルムを用いて、ポリマーを抽出した。抽出液を、濾紙を通過させることによって細胞破片を除去した。
上記で得られたコポリマーの組成及びシークエンス分布を、1H-NMRスペクトル及び13C-NMRスペクトル(Bruker-500 spectrometer)により決定した。400 MHz 1H-NMRスペクトルを、5msパルス幅、32000データポイント及び16集積でPHAのCDCl3溶液(10mg/mL)について27℃で記録した。また、100 MHz 13C-NMRスペクトルを、5msパルス幅(パルス角度45°)、0.7sパルス反復、23000Hzスペクトル幅、32000データポイント及び8000〜20000集積で、PHAのCDCl3溶液(20mg/mL)について27℃で記録した。テトラメチルシラン(Me4Si)を、内部化学シフト標準として使用した。
PHAフィルムの酵素分解を、0.1 Mリン酸バッファー(pH7.4)において37℃で行った。PHAフィルム(初期重量、約4mg;初期寸法、10×10mm;初期の厚さ、0.05mm)を、バッファー1.0mLを含有するスクリューキャップを備えた試験管に配置した。反応を、リパーゼ(500μg;ブタ膵臓由来;Wako Chemical Co製)の添加により開始した。反応液を、振盪フラスコにおいて37℃でインキュベートした。
ヒト間葉系幹細胞(hMSC)を、Lonza Walkersville Inc.(Walkerville, MD)から購入し、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び0.25μg/mLファンギゾンの存在下で10%ウシ胎児血清(FBS)、0.1 mM非必須アミノ酸及び1ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む増殖培地で、5%CO2インキュベーターにおいて37℃で培養した。
[細胞生存能%] = [PHAフィルム上でインキュベートした細胞培養物の490nmでの吸光度]/[96ウェル細胞培養プレート上でインキュベートした細胞培養物の490nmでの吸光度(陽性対照)]×100
により算出した。
<5HV単位を有するポリマーの微生物生産>
5HVモノマー(5HV-CoA)の前駆体であると期待される長鎖長の様々なα-ヒドロキシアルカン酸ナトリウム及びラクトンを、ポリマー生産のための培地中の唯一の炭素源として検討した(表1)。
図2Aは、CDCl3中でのポリマー(表3中のサンプル番号10)の典型的な1H-NMRスペクトルを示す。この結果から、当該ポリマーが3HB及び3HP単位の典型的なピークを有していることが明らかになった。他のピークは、P(3HB-co-3HV-co-5HV)コポリマーにおける5HV単位からのピークに割り当てられた(Doi, Y.; Tamaki, A.; Kunioka, M.; Soga, K., Makromol. Chem., Rapid Commun 1987, 8, 631-635.)。
生産されたP(3HB-co-3HP-co-5HV)の分子量を、上記表3に要約する。3HP及び5HV画分が多くなるほど、ポリマーの分子量は小さくなる傾向にあった(41000〜168000)。この結果は、ポリマー鎖への3HP及び5HV単位の取り込みにより分子量が低減することを示唆した。
各P(3HB-co-3HP-co-5HV)コポリマーについての機械的特性の試験結果を表4に示す。表4における各機械的特性データの値は、3回の測定値の平均値と標準偏差である。
図4は、ブタ膵臓由来のリパーゼを用いた、P(3HB)、P(3HP)、P(5HV)及びP(3HB-co-3HP-co-5HV)フィルムの重量損失プロフィールを示す。
PHAフィルム上でのhMSCの細胞生存能を、MTSアッセイを用いて評価した(図5)。細胞生存能100%を、陽性対照として細胞培養プレート上に播種した細胞培養物(48時間インキュベーション後)から算出した。hMSCの細胞生存能は、P(3HB)、P(3HP)、P(5HV)及びP(3HB-co-3HP-co-5HV)フィルムを用いた場合に、ほぼ同じであった(約110%)。P(3HB-co-5 mol% 3HP-co-1 mol% 5HV)フィルムを用いた場合には、他のフィルムと比較してhMSCの細胞生存能がわずかに増加した(127%)。これらの結果は、生産されたP(3HB-co-3HP-co-5HV)が、医学的用途に十分な高い生体適合性を示すP(3HB)と同じか又はより高いレベルの生体適合性を有することを示している。
ラルストニア・ユートロファ由来のPHAシンターゼ(PhaCRe)の突然変異体を有するラルストニア・ユートロファPHB-4によるω-PDLからのPHA生合成の結果を表5及び6に示す。表5及び6は、同様の実験を行った結果である。
M-22(V470M):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の470番目のアミノ酸においてバリンからメチオニンへの置換を有する突然変異体;
E-11/S12-1(F420S):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の420番目のアミノ酸においてフェニルアラニンからセリンへの置換を有する突然変異体;
2-12(L358P):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の358番目のアミノ酸においてロイシンからプロリンへの置換を有する突然変異体;
1-14(S174P):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の174番目のアミノ酸においてセリンからプロリンへの置換を有する突然変異体;
E-11/S12(S80P/F420S):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の80番目のアミノ酸においてセリンからプロリン及び420番目のアミノ酸においてフェニルアラニンからセリンへの置換を有する突然変異体;
B-1(N519S):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の519番目のアミノ酸においてアスパラギンからセリンへの置換を有する突然変異体;
E-11(S80P):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の80番目のアミノ酸においてセリンからプロリンへの置換を有する突然変異体;
B-7(S35P):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の35番目のアミノ酸においてセリンからプロリンへの置換を有する突然変異体;並びに、
1-11(N426S):野生型(アミノ酸配列:配列番号2)の426番目のアミノ酸においてアスパラギンからセリンへの置換を有する突然変異体。
本実施例は、野生型又は組換えラルストニア・ユートロファによる5HVNa又はω-PDLからの3HP及び5HV単位を含む新規のPHA型の生産に成功したことを示す。P(3HB-co-3HP-co-5HV)の組成は、培地中の炭素源濃度を調節することにより制御できた。
Claims (7)
- 少なくとも5-ヒドロキシバレレート単位を含むポリヒドロキシアルカン酸の製造方法であって、ラルストニア(Ralstonia)属に属する微生物を、炭素源として、環を構成する炭素数が12以上のラクトン及び/又はヒドロキシ酸若しくはヒドロキシ酸塩を含有する培地において培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ラルストニア属に属する微生物が、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子が導入されたラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)である、請求項1記載の方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子が、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項2記載の方法。
(a)配列番号2、4及び6のいずれか1つに示されるアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つポリヒドロキシアルカン酸合成活性を有するタンパク質 - 前記ラクトンがω-ペンタデカラクトンである、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- ヒドロキシ酸塩が5-ヒドロキシ吉草酸塩である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が3-ヒドロキシブチレート単位をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が10〜35 mol%の5-ヒドロキシバレレート単位を有するポリヒドロキシアルカン酸コポリマーである、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
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