JPWO2012124798A1 - Reagent for measuring activity of total protein S in sample and method for measuring activity - Google Patents
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Abstract
試料中に存在する全てのプロテインＳの活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来る、試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法を提供する。本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法は、試料中の総プロテインＳの活性を測定する方法であって、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とするものである。Provided are a reagent and a method for measuring the activity of total protein S in a sample, which can measure the activity of all protein S present in a sample, that is, the activity of total protein S. The reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention includes activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin. It contains a substrate. The method for measuring the activity of total protein S in a sample according to the present invention is a method for measuring the activity of total protein S in a sample, wherein a surfactant is present during the measurement reaction of the total protein S activity. It is characterized by.
Description
本発明は、試料中の総プロテインＳの活性を測定することができる活性測定試薬及び活性測定方法に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。The present invention relates to an activity measuring reagent and activity measuring method capable of measuring the activity of total protein S in a sample.
The present invention is particularly useful in the field of life science such as clinical examination, molecular biology, and medicine.
プロテインＳは、生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。
このプロテインＳは、主に血液中に存在するものであって、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。
なお、活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子；ＦＶＩＩＩａ）を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。
プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質；Ｃ４ｂＢＰ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。
このプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。
通常、健常者の血液中（血漿中）のプロテインＳは、その約６０％が「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」（すなわち、結合型）であり、その約４０％は「遊離状態のプロテインＳ」（すなわち、遊離型）である。
なお、遊離のプロテインＳ（すなわち、遊離型）のみが、活性化プロテインＣに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができるのである。
なお、本明細書において、「プロテインＳ」又は「Ｃ４ｂ結合タンパク質」等の語は、特に複合体（若しくは結合型）又は遊離（若しくは遊離型）等の記載が無い場合は、それぞれこれらの物質の複合体（又は結合型）及び遊離状態（又は遊離型）のものの総称を意味するものとする。
下に、プロテインＣ及びプロテインＳによる血液凝固系の制御機構の模式図を示した。
活性化プロテインＣは、ヒトおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。
プロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、プロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性は上昇し、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分解反応は促進される。
血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインＳの活性の低下又は異常は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインＳの先天性異常症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ビタミンＫ欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインＳの活性の低下又は異常が認められる。
即ち、血漿等の試料中のプロテインＳの活性を測定することにより、プロテインＳの活性の低下又は異常を把握することができ、引いては血栓症等の疾患の発症の予測、早期発見及び治療効果の判定等に重要な役割を果たすものである。
試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を蛇毒からのプロテインＣ−活性化剤と共に、活性化プロテインＣの形成下にインキュベートし、血液凝固第ＸＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子又は血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）の活性化剤を添加し、かつ血液凝固因子及びその活性剤により媒介される、プロトロンビンからのトロンビンの形成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測光測定する方法が開示されている（特許文献１参照。）。
別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、血漿試料にプロテインＣを活性化するプロテインＣ活性化物質又は活性化プロテインＣを添加し、次に活性化血液凝固第ＩＸ因子を加えインキュベートし、生成するトロンビンの量を知られた方法で測定し、これをプロテインＳ活性が既知の標品を測定して得た値と比較して、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献２参照。）。
また、別の試料中のプロテインＳの活性を測定する方法として、試料を、活性化プロテインＣ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、リン脂質及びカルシウムイオンとインキュベートし、次にこの混合物を、活性化血液凝固第ＩＩ因子（トロンビン）、活性化血液凝固第ＩＸ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子とインキュベートし、次にこのインキュベーション混合物へ活性化血液凝固第Ｘ因子特異性基質を添加し、この基質の開裂によって生成したシグナルの量を測定することよりなる、試料中のプロテインＳの活性を測定する方法が開示されている（特許文献３参照。）。
これら従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その測定反応に使用する血液凝固反応の成分（因子）の少なくとも一つは、試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いているものであった。すなわち、試料に含まれている成分に依存しているものであった。
従って、このような試料に含まれている成分（因子）をそのまま用いる従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、その成分（因子）〔例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子〕がその試料提供者において欠損又は低下しているときには、前記測定反応の反応成分（因子）の少なくとも一つが十分量存在しない訳であるから、測定反応は十分に進行せず、得られるプロテインＳ活性値は、場合により本来の値よりかい離し、誤差を含むものになるという問題を有するものであった。
すなわち、測定値が、血液凝固反応に係わる成分（因子）の試料中の存在量（濃度）又はその変異により、影響を受けてしまうことが起こるという問題を有するものであった。
そこで、本発明者らは、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中のプロテインＳの活性測定試薬、並びに、試料に由来しない、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させ、次に、前記の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定し、次に、試料に含まれるプロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量を求めることにより、試料中に含まれていたプロテインＳの活性値を得る試料中のプロテインＳの活性測定方法を発明し、開示した（特許文献４及び非特許文献１参照。）。
しかしながら、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬は、いずれも遊離のプロテインＳ（遊離型）の活性を測定するものであった。
つまり、従来の試料中のプロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬はいずれも、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することは出来ないものであった。Protein S is a plasma protein that functions centrally in the control mechanism of the blood coagulation system in the living body.
This protein S is mainly present in blood and is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, which can increase the activity of activated protein C, and is activated in blood. It is indispensable for the function of protein C.
In addition, activated protein C decomposes activated blood coagulation factor V (factor Va; FVA) and activated blood coagulation factor VIII (factor VIIIa; FVIIIa) that promote blood coagulation in humans. It is a factor that plays a role in suppressing the blood coagulation reaction.
Protein S specifically binds one-to-one with a C4b binding protein (complement factor 4b binding protein; C4bBP) to form a complex. That is, the C4b binding protein is a protein S ligand.
This complex formation reaction between protein S and C4b binding protein is as shown below, but this reaction is a reversible reaction.
Usually, about 60% of protein S in the blood (plasma) of healthy individuals is “protein S-C4b binding protein complex” (ie, bound type), and about 40% of “protein S in free state”. S "(ie free).
Only free protein S (that is, free form) exhibits a coenzyme activity for activated protein C and can increase the activity of activated protein C.
In the present specification, the term “protein S” or “C4b binding protein” means that each of these substances, unless there is a description of complex (or binding type) or free (or free type). It shall mean the generic name of complex (or bound) and free (or free).
The schematic diagram of the control mechanism of the blood coagulation system by protein C and protein S is shown below.
Activated protein C is a serine protease that plays a role in suppressing blood coagulation by degrading activated blood coagulation factor V and activated blood coagulation factor VIII that promote blood coagulation in humans.
Protein S is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, and the presence of protein S increases the activity of activated protein C, and the activated blood coagulation factor V degradation reaction by activated protein C and The degradation reaction of activated blood coagulation factor VIII is promoted.
A decrease or abnormality in the activity of protein S, which has a function of suppressing the blood coagulation reaction, can cause thrombosis in vivo.
In fact, people with congenital anomalies of protein S frequently have arterial thrombosis such as deep vein thrombosis, venous thrombosis such as superficial phlebitis or pulmonary infarction, or coronary thrombosis causing heart failure. Will develop symptoms.
In addition, a decrease or abnormality in protein S activity is also observed in disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), vitamin K deficiency, or hepatic hypofunction.
That is, by measuring the activity of protein S in a sample such as plasma, it is possible to grasp the decrease or abnormality of protein S activity, thereby predicting the onset, early detection and treatment of diseases such as thrombosis. It plays an important role in determining effects.
As a method for measuring the activity of protein S in a sample, the sample is incubated with protein C-activator from snake venom under the formation of activated protein C, and blood coagulation factor XII, blood coagulation factor VII or blood A method of photometrically measuring the decrease in thrombin formation from prothrombin mediated by blood coagulation factor and its activator, using a chromogenic thrombin substrate, by adding an activator of coagulation factor II (prothrombin) Is disclosed (see Patent Document 1).
As a method for measuring the protein S activity in another sample, a protein C activator or protein C activating protein C is added to a plasma sample, and then activated blood coagulation factor IX is added and incubated. Then, the amount of thrombin produced is measured by a known method, and this is compared with the value obtained by measuring a sample with known protein S activity to measure the activity of protein S in the sample. It is disclosed (see Patent Document 2).
Alternatively, as a method of measuring the activity of protein S in another sample, the sample is incubated with activated protein C, blood coagulation factor VIII, phospholipids and calcium ions, and then this mixture is activated with blood coagulation. Incubate with factor II (thrombin), activated blood coagulation factor IX and activated blood coagulation factor X, then add activated blood coagulation factor X specific substrate to the incubation mixture and cleave this substrate Has disclosed a method for measuring the activity of protein S in a sample, which comprises measuring the amount of signal generated by (see Patent Document 3).
In these conventional methods for measuring protein S activity and reagents for measuring the activity of protein S, at least one of the components (factors) of the blood coagulation reaction used in the measurement reaction is a component (factor) contained in the sample. They were used as they were. That is, it depends on the components contained in the sample.
Therefore, in the conventional method for measuring the activity of protein S and the reagent for measuring the activity of protein S using the components (factors) contained in the sample as they are, the components (factors) [for example, activated blood coagulation X When the factor] is deficient or decreased in the sample provider, at least one of the reaction components (factors) of the measurement reaction is not present in a sufficient amount, so the measurement reaction does not proceed sufficiently and the protein obtained In some cases, the S activity value has a problem that it is far from the original value and includes an error.
That is, there is a problem that the measured value is influenced by the amount (concentration) in the sample of the component (factor) related to the blood coagulation reaction or its variation.
Therefore, the present inventors are in a sample containing activated protein C, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate that is not derived from the sample. A protein S activity measuring reagent, and activated protein C, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate not derived from the sample Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component described above is measured, and then the amount of signal whose generation is suppressed according to the activity of protein S contained in the sample is obtained. Invented and disclosed a method for measuring the activity of protein S in a sample to obtain the activity value of protein S contained in the sample ( Patent Document 4 and Non-Patent Document 1 see.).
However, the protein S activity measuring method and activity measuring reagent in the conventional samples all measure the activity of free protein S (free form).
In other words, both the conventional method for measuring the activity of protein S and the reagent for measuring the activity of protein S include all the proteins S present in the sample (complexes of protein S and C4b binding protein (binding type), and free protein). S (free form)], that is, the activity of total protein S could not be measured.
本発明の課題は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来る、試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法を提供することである。 The object of the present invention is to determine the activity of all protein S present in a sample [complex of protein S and C4b-binding protein (binding type) and free protein S (free type)], that is, total protein The present invention provides a reagent for measuring the activity of total protein S in a sample and a method for measuring the activity, which can measure the activity of S.
本発明者らは、試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬について検討を重ねたところ、総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１） 試料中の総プロテインＳの活性を測定する方法であって、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（２） プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させる、前記（１）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（３） 総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記（１）又は（２）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（４） プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（５） 試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法により行われるものである、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（ａ） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ） 次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（６） 試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法により行われるものである、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定方法。
（ａ） 試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ） 次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ） 次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ） 次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（７） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（８） 界面活性剤が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものである、前記（７）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（９） リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質である、前記（７）又は（８）記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（１０） ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものである、前記（７）〜（９）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（１１） 次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものである、前記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（ａ） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ） 次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（１２） 次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものである、前記（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬。
（ａ） 試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ） 次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ） 次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ） 次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。The inventors of the present invention have studied the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of total protein in a sample, and can solve the above-mentioned problems by making a surfactant present during the measurement reaction of the total protein S activity. As a result, the present invention has been completed.
That is, this invention consists of the following invention.
(1) A method for measuring the activity of total protein S in a sample, wherein a surfactant is present during the measurement reaction of the total protein S activity. Method.
(2) The surfactant according to the above (1), wherein a surfactant is present at the time of the activity increase reaction of the activated protein C by the protein S and at the time of the degradation reaction of the activated blood coagulation factor V by the activated protein C having the increased activity. A method for measuring the activity of total protein S in a sample.
(3) The method for measuring the activity of total protein S in the sample according to (1) or (2), wherein a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present during the measurement reaction of total protein S activity.
(4) Phospholipids comprising phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine at the time of increased activity of activated protein C by protein S and at the time of degradation of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity. The method for measuring the activity of total protein S in the sample according to any one of (1) to (3), which is present.
(5) The measurement of the total protein S activity in the sample is performed by a method including the following steps (a) to (c), according to any one of (1) to (4) above: For measuring the activity of total protein S in the samples.
(A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
(B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
(C) Next, the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
(6) The measurement of total protein S activity in a sample is performed by a method including the following steps (a) to (e), and any one of (1) to (5) above For measuring the activity of total protein S in the samples.
(A) By contacting the sample with at least activated protein C, surfactant, phospholipid, and calcium ions, the activity of activated protein C increases when protein S is contained in the sample.
(B) Next, the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V catalyzed by activated protein C in the presence of the component (a) and activated blood coagulation factor V is activated in the above (a). It is promoted by the increased activity of protein C.
(C) Next, the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ions, promoted by activated blood coagulation factor V, The production of thrombin is reduced by inhibiting the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V in the above.
(D) Next, the reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed by reducing the generation of thrombin in (c).
(E) Next, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained by measuring the amount of signal whose production was suppressed by the suppression of the reaction in (d).
(7) Activity of total protein S in a sample containing activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate Measuring reagent.
(8) The surfactant is present at the time of the activation increase reaction of activated protein C by protein S and at the time of the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having the increased activity (7) ) Reagent for measuring the activity of total protein S in the sample described above.
(9) The reagent for measuring the activity of total protein S in the sample according to (7) or (8) above, wherein the phospholipid is a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine.
(10) Phospholipids comprising phosphatidylcholine, phosphatidylserine, and phosphatidylethanolamine are activated during the activation reaction of activated protein C by protein S and during the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having the increased activity. The reagent for measuring the activity of total protein S in the sample according to any one of (7) to (9), which is present.
(11) In the sample according to any one of (7) to (10), which is for measurement of total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (c): Reagent for measuring the total protein S activity.
(A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
(B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
(C) Next, the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
(12) In the sample according to any one of (7) to (11), which is for measurement of total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (e): Reagent for measuring the total protein S activity.
(A) By contacting the sample with at least activated protein C, surfactant, phospholipid, and calcium ions, the activity of activated protein C increases when protein S is contained in the sample.
(B) Next, the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V catalyzed by activated protein C in the presence of the component (a) and activated blood coagulation factor V is activated in the above (a). It is promoted by the increased activity of protein C.
(C) Next, the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ions, promoted by activated blood coagulation factor V, The production of thrombin is reduced by inhibiting the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V in the above.
(D) Next, the reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed by reducing the generation of thrombin in (c).
(E) Next, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained by measuring the amount of signal whose production was suppressed by the suppression of the reaction in (d).
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来るものである。
つまり、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の活性に加えて、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」に含まれるプロテインＳが遊離のプロテインＳ（遊離型）となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものである。
これにより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインＳの活性値を得ることが出来る。The reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention include all protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type), free protein S ( The activity of free form)], that is, the activity of total protein S can be measured.
That is, the reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention include a complex of “protein S and C4b binding protein (binding) in addition to the activity of“ free protein S (free form) ”. The activity expressed when the protein S contained in the "type" becomes free protein S (free form) can also be measured.
As a result, the reagent for measuring the activity of total protein S and the method for measuring the activity of the total protein S in the sample of the present invention can be used for all protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type) and free For protein S (free form)], an activity value of protein S corresponding to the protein amount can be obtained.
１．総論
（１）試料中の総プロテインＳの活性測定方法
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法は、試料中の総プロテインＳの活性を測定する方法であって、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させることを特徴とする、試料中の総プロテインＳの活性測定方法である。
なお、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法は、試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
（ａ） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ） 次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料中の総プロテインＳ活性の測定が、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法により行われるものであることが好ましい。
（ａ） 試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性の上昇により、促進される。
（ｃ） 次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ） 次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ） 次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
（２）試料中の総プロテインＳの活性測定試薬
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有する試料中の総プロテインＳの活性測定試薬である。
なお、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、界面活性剤が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質であることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質が、プロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び当該活性上昇した活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるものであることが好ましい。
更に、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものであることが好ましい。
（ａ） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ） 次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬は、次の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む試料中の総プロテインＳ活性の測定のためのものであることが好ましい。
（ａ） 試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性の上昇により、促進される。
（ｃ） 次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ） 次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ） 次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
２．試料中の総プロテインＳの活性測定の方法
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法における測定の方法、及び本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬を用いる測定の方法として、次の（１）又は（２）に記載の方法等を挙げることができ、これらの方法等により行うことが好ましい。
（１）
（ａ） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
なお、これらの成分と試料との接触は、１回に全ての成分との接触を行わせて、下記の反応系の全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、前記成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより下記の反応系の反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
（ｂ） 前記（ａ）における接触により、前記の各成分による下記の反応が進行する。
そして、この一連の反応によりトロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
即ち、前記の一連の反応により、トロンビンの基質がトロンビンにより分解等の作用を受け、この結果生じるシグナルの量（例えば、吸光度等）を測定する。
（ｃ） 試料にプロテインＳが含まれている場合には、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解が促進されるので、その結果トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制されて、シグナルの生成が抑制される。
このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインＳの活性値に応じて大きくなる。
従って、前記（ｂ）においてシグナル量を測定することにより、生成が抑制されたシグナル量を測定することになり、これにより試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得ることができる。
活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）、プロトロンビン及びトロンビンの基質より構成される次の反応系を用いて試料中のプロテインＳの活性値を測定する方法であって、
（ａ） 試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
これにより、試料にプロテインＳが含まれる場合にはリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化プロテインＣの活性が上昇する。
（ｂ） 活性化プロテインＣの前記（ａ）における活性の上昇により、活性化プロテインＣがリン脂質及びカルシウムイオンの存在下に触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、界面活性剤の共存下で促進される。
（ｃ） 活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減する。
（ｄ） 前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
なお、このシグナル生成の抑制度は、試料に含まれていた総プロテインＳの活性に応じて大きくなる。
（ｅ） 前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定する。
以上の通り前記の反応により生成したシグナル量を測定し、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、試料とは、プロテインＳを含有する可能性がある物質である。
この試料として、例えば、生体試料（ヒト又は動物などに由来する試料）等を挙げることができる。
生体試料としては、例えば、血液、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液等を挙げることができる。
４．活性化プロテインＣ
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化プロテインＣは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬における測定反応中に、プロテインＣ活性化物質等によりプロテインＣより活性化プロテインＣを生成させて、これを本発明における活性化プロテインＣとして用いてもよい。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化プロテインＣは、試料と接触することにより、試料中にプロテインＳが含まれている場合には、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、この活性化プロテインＣの活性が上昇する。
そして、活性化プロテインＣは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応の触媒となる。
よって、プロテインＳが存在することにより、活性化プロテインＣが活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応は促進される。
前記の活性化プロテインＣ等と試料を接触させることと、活性化プロテインＣを活性化血液凝固第Ｖ因子等と接触させることは、同時に行ってもよい。
また、活性化プロテインＣをリン脂質とともに試料と接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｖ因子及びカルシウムイオンと接触させ、インキュベートして、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応を行わせてもよい。
この活性化プロテインＣを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子と接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解させる際には、通常、１ｐＭ〜１００ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、測定の感度を高く得るには、活性化プロテインＣ濃度が高い方が好ましいので、前記の活性化プロテインＣ濃度としては、１０ｐＭ〜１０ｎＭにあることがより好ましく、１００ｐＭ〜１ｎＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に活性化プロテインＣが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化プロテインＣを、１ｐＭ〜２００ｎＭ含有させることが好ましく、１０ｐＭ〜２０ｎＭ含有させることがより好ましく、１００ｐＭ〜２ｎＭ含有させることが特に好ましい。
５．界面活性剤
本発明の総プロテインＳの活性測定方法においては、当該総プロテインＳ活性の測定反応時に、界面活性剤を存在させる。
また、本発明の総プロテインＳの活性測定試薬においては、活性化プロテインＣ、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質とともに、界面活性剤を含有する。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜存在させればよい。
この界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
なお、この界面活性剤が非イオン性界面活性剤の場合、そのＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ）は、１０〜２０の範囲のものが好ましく、１２〜１８の範囲のものがより好ましく、１３〜１６の範囲のものが特に好ましい。
この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔ポリオキシエチレン（ｎ＝９，１０）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１３．５〕、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４〔ポリオキシエチレン（ｎ＝７，８）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１２．４〕、ＮＰ−１０〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１０）ノニルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１６．５〕、ＮＰ−１１〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１１）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ−１２〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１２）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ−１３〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１３）ノニルフェニルエーテル〕、ＮＰ−１５〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１５）ノニルフェニルエーテル、ＨＬＢ：１８．０〕、ＢＴ−９〔ポリオキシエチレン（ｎ＝９）２級アルキルエーテル、ＨＬＢ：１３．５〕、又はＢＴ−１２〔ポリオキシエチレン（ｎ＝１２）２級アルキルエーテル、ＨＬＢ：１４．５〕等が好ましい。
また、両イオン性界面活性剤としては、ＡＭ−３０１〔ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン水溶液〕等が好ましい。
そして、陰イオン性界面活性剤としては、サルコシネート ＬＮ〔ラウロイルサルコシンナトリウム〕等が好ましい。
更に、陽イオン性界面活性剤としては、ＣＡ−２３５０〔塩化セチルトリメチルアンモニウム〕等が好ましい。
なお、総プロテインＳ活性の測定反応時に界面活性剤を存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、０．００００１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、０．０００１〜１％（Ｗ／Ｖ）がより好ましく、０．００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）が更に好ましく、０．００５〜０．０５％（Ｗ／Ｖ）が特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、両イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、陰イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましく、陽イオン性界面活性剤においては０．００００１〜０．００１％（Ｗ／Ｖ）が非常に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に界面活性剤が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に界面活性剤を含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬に界面活性剤を０．００００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）含有させることが好ましく、０．０００１〜２％（Ｗ／Ｖ）含有させることがより好ましく、０．００１〜０．２％（Ｗ／Ｖ）含有させることが更に好ましく、０．００５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）含有させることが特に好ましい。
そして、非イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０２％（Ｗ／Ｖ）、両イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．０２％（Ｗ／Ｖ）、陰イオン性界面活性剤においては０．００１〜０．２％（Ｗ／Ｖ）、陽イオン性界面活性剤においては０．００００１〜０．００２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含有させることが非常に好ましい。
なお、本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
６．リン脂質
（１）総論
本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．０３μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．３μＭ〜５０μＭにあることがより好ましく、３μＭ〜３０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を０．０３μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．３μＭ〜１００μＭ含有させることがより好ましく、３μＭ〜６０μＭ含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、総プロテインＳ活性の測定反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
（２）活性化プロテインＣによる触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及びこの活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時には、その活性化プロテインＣの活性上昇反応及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、１μＭ〜５０μＭにあることがより好ましく、１０μＭ〜３０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、１μＭ〜１００μＭ含有させることがより好ましく、１０μＭ〜６０μＭ含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
また、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
（３）活性化血液凝固第Ｘ因子による触媒反応に用いるリン脂質
本発明の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、その反応に必要なリン脂質を存在させる。
このリン脂質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの、その他の動物由来のもの、植物由来のもの、微生物由来のもの又は人工的に合成したもの等を挙げることができる。
前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時にリン脂質を存在させる際の濃度は、通常、０．１μＭ〜１００μＭにあることが好ましく、０．５μＭ〜５０μＭにあることがより好ましく、１μＭ〜１０μＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、リン脂質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この活性測定試薬にリン脂質を０．１μＭ〜２００μＭ含有させることが好ましく、０．５μＭ〜１００μＭ含有させることがより好ましく、１μＭ〜２０μＭ含有させることが特に好ましい。
このリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール若しくはジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質や、又はスフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質等を挙げることができる。
なお、このリン脂質としては、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン、又はホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させることが、前記反応の促進の効果が高くなるため好ましい。
また、このホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質を存在させる場合、この２種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルコリンの組成比が８５％（Ｗ／Ｖ）〜５０％（Ｗ／Ｖ）であり、かつホスファチジルセリンの組成比が１５％（Ｗ／Ｖ）〜５０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
特に、ホスファチジルコリンの組成比が８０％（Ｗ／Ｖ）〜７０％（Ｗ／Ｖ）であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）〜３０％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
あるいは、このホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質を存在させる場合、この３種類のリン脂質の組成としては、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が１０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が２０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
特に、ホスファチジルエタノールアミンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であり、かつホスファチジルセリンの組成比が３０％（Ｗ／Ｖ）以上であることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際のリン脂質としては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に用いたリン脂質をそのまま用いることができる。
しかしながら、先に述べたとおり、適したリン脂質の組成がそれぞれの反応により異なるので、各々の反応に適した組成のリン脂質をその反応時に存在させて用いることが好ましい。
なお、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際に、先に加えた前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応及び活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応に適した組成のリン脂質が、このプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に適した組成のリン脂質と共存したとしても、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては全く支障はない。
７．カルシウムイオン
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時、及び活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応時には、カルシウムイオンを存在させる。
このカルシウムイオンとしては、カルシウムイオン自体はもちろんのこと、又はカルシウムの塩等のカルシウムイオンを含む化合物であれば、特に制限なく用いることができる。
このカルシウムイオンを含む化合物としては、例えば、フッ化カルシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウム又はシアン化カルシウム等を挙げることができる。
このカルシウムイオンを用いる際の濃度は、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応の際、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応の際、そして活性化血液凝固第Ｘ因子及び活性化血液凝固第Ｖ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応の際には、通常、０．１ｍＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性化プロテインＣの活性上昇反応時、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時及びトロンビン生成反応時にカルシウムイオンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、カルシウムイオン又はカルシウムイオンを含む化合物を、この活性測定試薬に０．１ｍＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
８．活性化血液凝固第Ｖ因子
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｖ因子は、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化プロテインＣにより分解される。
そして、試料中にプロテインＳが含まれている場合そのプロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性が上昇して、この分解反応は促進される。
また、活性化血液凝固第Ｖ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を促進するものである。
よって、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇して、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化プロテインＣ等とを接触させることと、活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等とを接触させることは、同時に行ってもよい。
しかしながら、活性化血液凝固第Ｖ因子を、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンとともに活性化プロテインＣと接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートした後に、活性化血液凝固第Ｘ因子及びプロトロンビン等と接触させ、インキュベートして、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を行わせることが好ましい。
この活性化血液凝固第Ｖ因子を用いる際の濃度は、活性化プロテインＣと接触させ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｖ因子を分解する反応を行わせる際には、通常、０．５ｐＭ〜５ｎＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｖ因子の濃度が高いと、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子濃度としては、５ｐＭ〜５００ｐＭにあることがより好ましく、２０ｐＭ〜２００ｐＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に活性化血液凝固第Ｖ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｖ因子を、０．５ｐＭ〜１０ｎＭ含有させることが好ましく、５ｐＭ〜２ｎＭ含有させることがより好ましく、２０ｐＭ〜１ｎＭ含有させることが特に好ましい。
９．活性化血液凝固第Ｘ因子
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いる活性化血液凝固第Ｘ因子（第Ｘａ因子；ＦＸａ）は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、活性化血液凝固第Ｘ因子は、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応を触媒する。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のトロンビンを生成させる反応は抑制される。
この活性化血液凝固第Ｘ因子を用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及びプロトロンビン等と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、０．１ｐＭ〜３００ｐＭにあることが好ましい。
しかしながら、この活性化血液凝固第Ｘ因子の濃度が高いと、先の活性化血液凝固第Ｖ因子の場合と同様、試料に由来する成分（因子）等による血液凝固反応が進行してしまい、フィブリンが析出したり又は多大な発色が生じて正確な測定が行えなくなるので、前記の活性化血液凝固第Ｘ因子濃度としては、１ｐＭ〜１００ｐＭにあることがより好ましく、１０ｐＭ〜５０ｐＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時に活性化血液凝固第Ｘ因子が前記の濃度となるように、活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、活性化血液凝固第Ｘ因子を、０．１ｐＭ〜６００ｐＭ含有させることが好ましく、１ｐＭ〜２００ｐＭ含有させることがより好ましく、１０ｐＭ〜１００ｐＭ含有させることが特に好ましい。
１０．プロトロンビン
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるプロトロンビンは、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。
また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において、プロトロンビンは、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒する反応の基質となり、トロンビンになる。
この活性化血液凝固第Ｘ因子によるプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在により促進される。
よって、先に述べたように、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇し、これにより活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進され、このため活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制され、生成されるトロンビンの量（濃度）は低減される。
このプロトロンビンを用いる際の濃度は、活性化血液凝固第Ｖ因子及び活性化血液凝固第Ｘ因子と接触させ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下、プロトロンビンよりトロンビンを生成させる際には、通常、１ｎＭ〜５０μＭにあることが好ましく、５０ｎＭ〜５μＭにあることがより好ましく、そして１００ｎＭ〜１μＭにあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記のトロンビン生成反応時にプロトロンビンが前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、プロトロンビンを、この活性測定試薬に１ｎＭ〜１００μＭ含有させることが好ましく、５０ｎＭ〜１０μＭ含有させることがより好ましく、１００ｎＭ〜２μＭ含有させることが特に好ましい。
１１．トロンビンの基質
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬において用いるトロンビンの基質は、トロンビンのプロテアーゼとしての触媒作用を（トロンビンの基質として）受けることにより何らかのシグナルを生じるもの、又はトロンビンによる触媒反応に加え更に他の反応を続けることにより何らかのシグナルが生じるものであれば、特に制限なく用いることができる。
この何らかのシグナルが生じるということであるが、これはトロンビンの触媒作用を受けることにより光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル（信号）の生成又は変化を検出することができるということを意味する。
例えば、トロンビンの触媒作用を受けることにより、吸光虔、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、光の吸収曲線が変化するもの、又は発光するもの等を挙げることができる。
この一例としては、遊離したときに吸光度、透過率若しくは蛍光強度、又は光の吸収曲線が変化するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質、或いは遊離したときに発光するような化合物を結合したペプチド又はタンパク質等であって、トロンビンの触媒作用により前記の化合物が前記のペプチド又はタンパク質より遊離するような物質等を挙げることができる。
このような物質においては、トロンビンの触媒作用を受け、前記化合物が遊離することにより、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等として検出できるので、トロンビンの触媒作用すなわちトロンビンの酵素活性を、生成したシグナル（吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等）の量を測定することにより求めることができる。
このような物質としては、例えば、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」〔テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８〕（製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕）、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」〔ＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ（登録商標）ＴＨ〕（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ社・コスモバイオ社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｉ，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」〔ＣＨＲＯＭＯＺＹＭＥ ＴＨ〕（ＰＥＮＴＡＰＨＡＲＭ社）、「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリン」（第一三共社）、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ＡＭＣ・塩酸塩」〔Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＩＩＩ，Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社・コスモバイオ社）、「ｔ−ブトキシカルボニル−アスパラギル（Ｏ−ベンジル）−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）、又は「ｔ−ブトキシカルボニル−バリニル−プロリル−アルギニル−ＭＣＡ」（ペプチド研究所）等を挙げることができる。なお、特に「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」が好ましい。
前記の活性化血液凝固第Ｖ因子と活性化血液凝固第Ｘ因子とプロトロンビン等とを接触させることと、生成したトロンビンとこのトロンビンの基質とを接触させることは、同時に行ってもよいし、別々の段階として分けて行ってもよい。
なお、いずれにしても、生成したトロンビンにトロンビンの基質を接触させ、少なくとも１分間以上、好ましくは５分間以上、室温又は３７℃等においてインキュベートして、トロンビンの基質からシグナルを生じさせる。
このトロンビンの基質を用いる際の濃度は、このトロンビンの基質がトロンビンの触媒作用を受ける際に、通常、５μＭ〜１００ｍＭにあることが好ましく、５０μＭ〜１０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬においては、トロンビンの触媒作用を受ける際にこのトロンビンの基質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このトロンビンの基質を、５μＭ〜２００ｍＭ含有させることが好ましく、５０μＭ〜２０ｍＭ含有させることが特に好ましい。
１２．シグナル量の測定
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬におけるトロンビンの基質は、プロトロンビンより生成したトロンビンの触媒作用を受けることによりシグナルを生じる。
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、このトロンビンの基質より生成したシグナルの量を測定する。
なお、試料中にプロテインＳが含まれている場合、このシグナルの量は、試料中の総プロテインＳの活性値に応じて生成が抑制されたシグナルの量である。
この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）の測定は、そのシグナルに応じて適宜行えばよい。
例えば、シグナルが、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化或いは発光等である場合には、吸光度、透過率、蛍光強度又は発光強度などを測定する等により行う。
より具体的には、トロンビンの基質が、前記の「Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩」、「Ｈ−Ｄ−ヘキサハイドロチロシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二酢酸塩」、「ベンゾイル−フェニルアラニル−バリニル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩」、又は「トシル−グリシル−プロリル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド」等の、ペプチドにｐ−ニトロアニリンを結合させた物質である場合には、トロンビンの触媒作用により遊離したｐ−ニトロアニリンが波長４０５ｎｍ近辺に有する光の吸収を、波長４０５ｎｍ又はその近辺の波長において吸光度を測定することにより行う。
この場合、吸光度の測定は、主波長のみの一波長測定でもよいし、又は主波長と副波長において測定する二波長測定でもよい。
そして、この吸光度の測定は、エンドポイント法でもよいし、又はレート法でもよい。
１３．試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料中にプロテインＳが含まれていると、活性化プロテインＣの活性が上昇して、活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されて、活性化血液凝固第Ｖ因子の存在量（濃度）は少なくなる。
そうすると、活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応に対する活性化血液凝固第Ｖ因子の促進効果が小さくなるので、前記のプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応は抑制される。
これにより、トロンビンの生成が低減するので、このトロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応も抑制されて、生成するシグナルの量は抑制される。
すなわち、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値に応じて、このシグナル生成の抑制度は大きくなる。
従って、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、試料と活性化プロテインＣ等とを接触させ前記の通りの反応を行わせることによって生成したシグナル量を測定して、すなわち生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。
この生成が抑制されたシグナル量を測定した後、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得ることは、適宜行えばよいが、例えば以下のようにして行うことができる。
総プロテインＳの活性値が分かっている試料の少なくとも一つと、総プロテインＳの活性値が「ゼロ」であることが分かっている試料（生理食塩水又は純水等）について、前記の通り測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
そして、この生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）と試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を、数式又はグラフ等に表して、検量線を作成する。
この検量線は、すなわち、シグナル生成の抑制度と試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものである。
次に、総プロテインＳの活性値が未知の試料について、前記の通り同様に測定操作を行い、生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）を求める。
このシグナル量を前記の検量線に当てはめ、相当する総プロテインＳの活性値を求める。
これにより、総プロテインＳの活性値が未知の試料における生成したシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）より、その試料の総プロテインＳの活性値を得ることができる。
なお、前記の検量線は、シグナル量（生成が抑制されたシグナル量）すなわちシグナル生成の抑制度と、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものであるが、この検量線におけるシグナル量（生成が抑制されたシグナル量）は、測定されたシグナル量そのものでもよいが、そのシグナル量の値を基に算出した数値であってもよい。
つまり、前記の検量線は、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値と、試料中に含まれる総プロテインＳの活性値との関係を表したものであってもよい。
なお、この場合であっても、測定されたシグナル量の値を基に算出した数値は、生成が抑制されたシグナル量に対応したものである。
この測定されたシグナル量の値を基に算出した数値としては、例えば、測定されたシグナル量の単位時間当たりの変化量の数値、又は測定されたシグナル量の値を時間に対して一次微分して算出した数値、若しくは二次微分して算出した数値等を挙げることができる。
例として、測定により得られた吸光度の１分間当たりの変化量、又は測定により得られた吸光度を時間に対して一次微分して得た吸光度変化の速度、若しくは測定により得られた吸光度を時間に対して二次微分して得た吸光度変化の加速度等を挙げることができる。
１４．タンパク質
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミンなどのアルブミン、カゼイン、又はゼラチン等のタンパク質を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
このタンパク質を存在させる濃度は、通常、０．１μＭ〜１ｍＭにあることが好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、このタンパク質が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、このタンパク質を、０．１μＭ〜２ｍＭ含有させることが好ましい。
１５．塩
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、ハロゲン元素とアルカリ金属の塩又はハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩等の塩を前記の活性測定反応時に存在させることが好ましく、又は前記の活性測定試薬に含有させることが好ましい。
ハロゲン元素とアルカリ金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、臭化ナトリウム又は臭化カリウム等を挙げることができる。
また、ハロゲン元素とアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化マグネシウム、フッ化マグネシウム又は臭化マグネシウム等を挙げることができる。
この塩を存在させる濃度は、通常、５ｍＭ〜１Ｍにあることが好ましく、５０ｍＭ〜２５０ｍＭにあることが特に好ましい。
そして、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、この塩が前記の濃度となるように、この活性測定試薬に含有させることが好ましい。
例えば、この塩を、５ｍＭ〜２Ｍ含有させることが好ましく、５０ｍＭ〜５００ｍＭ含有させることが特に好ましい。
１６．希釈液
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、試料を希釈液により希釈した後に、前記の活性測定反応を行わせることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、希釈液を前記の活性測定試薬に含有させることが、試料中の総プロテインＳの活性測定のために好ましい。
この希釈液のｐＨは、特に限定はないが、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）のｐＨ範囲のものであることが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）のｐＨ範囲のものであることがより好ましい。
なお、この希釈液には、ｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
また、この希釈液には、必要に応じて適宜、タンパク質、塩、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の成分を含有させることができる。
この希釈液としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は緩衝液等を挙げることができる。
この希釈液により試料を希釈する際の希釈倍率であるが、特に限定はないものの、試料中の総プロテインＳの活性測定のためには、２倍〜６０倍が好ましく、５倍〜４０倍がより好ましく、１０倍〜２０倍が特に好ましい。
１７．ｐＨ
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法においては、前記の活性測定反応を、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）の範囲で行うことが特に好ましい。
また、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬においては、前記の活性測定反応が、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０（２０℃）のｐＨ範囲で行われるようなｐＨであることが好ましく、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５（２０℃）のｐＨ範囲で行われるようなｐＨであることが特に好ましい。
なお、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、活性測定反応におけるｐＨ又は活性測定試薬のｐＨを前記のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を適宜存在させ又は含有させることが好ましい。
１８．他の成分
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬においては、必要に応じて適宜、防腐剤、安定化剤、活性化剤、又は糖類等の前記記載した成分以外の成分を前記の活性測定反応時に存在させ、又は前記の活性測定試薬に含有させることができる。
１９．測定手法
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬における、試料中の総プロテインＳの活性の測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
２０．測定段階
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応は、１回に全ての成分と試料との接触を行わせて、全ての反応を１段階に行ってもよく（１ステップ法）、また、成分を分け、接触を複数段階に分けて行うことにより活性測定反応を複数段階に分けて行ってもよい（多ステップ法）。
複数段階に分ける場合、特に制限はないが、例えば次のように行うことができる。
（１）２ステップ法−１
（ａ） 試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
（２）２ステップ法−２
（ａ） 試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質を接触させる。
（３）３ステップ法
（ａ） 試料、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）のものに、活性化血液凝固第Ｖ因子を接触させる。
（ｃ） 更に、前記（ｂ）のものに、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を接触させる。
２１．試料中の総プロテインＳの活性測定試薬
本発明の試料中のプロテインＳの活性測定試薬は、活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を含有するものである。
必要に応じて前記成分以外の成分を含んでいても構わない。
２２．試料中の総プロテインＳの活性測定試薬の構成
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬おいて、前記詳述した活性測定反応の各成分は、全て一つの試薬中に含有させてもよく（１試薬系）、また、各成分を２試薬又は３試薬等の複数の試薬に分けて含有させてもよい（複数試薬系）。
各成分を複数の試薬に分けて含有させる場合、特に制限はないが、例えば次のように含有させることができる。
（１）２試薬系−１
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン及び活性化血液凝固第Ｖ因子
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
（２）２試薬系−２
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質
（３）３試薬系
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｖ因子
（ｃ）第３試薬：活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン、トロンビンの基質及びリン脂質
（４）４試薬系
（ａ）第１試薬：活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオン
（ｂ）第２試薬：活性化血液凝固第Ｖ因子
（ｃ）第３試薬：活性化血液凝固第Ｘ因子
（ｄ）第４試薬：プロトロンビン及びトロンビンの基質1. General remarks
(1) Method for measuring the activity of total protein S in a sample
The method for measuring the activity of total protein S in a sample of the present invention is a method for measuring the activity of total protein S in a sample, wherein a surfactant is present during the measurement reaction of the total protein S activity. This is a method for measuring the activity of total protein S in a sample.
In the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the activation reaction of activated protein C by protein S and the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity are performed. Sometimes it is preferred to have a surfactant present.
In the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, it is preferable that a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present during the measurement reaction of the total protein S activity.
In the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the activation reaction of activated protein C by protein S and the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C having increased activity are performed. Sometimes it is preferred to have a phospholipid consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine.
Furthermore, in the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the measurement of the total protein S activity in the sample may be performed by a method comprising the following steps (a) to (c): preferable.
(A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
(B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
(C) Next, the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
Further, in the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the measurement of the total protein S activity in the sample is performed by a method including the following steps (a) to (e): Is preferred.
(A) When the sample is brought into contact with at least activated protein C, a surfactant, a phospholipid, and calcium ions, the activity of activated protein C increases when the sample contains protein S.
(B) Next, the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V catalyzed by activated protein C in the presence of the component (a) and activated blood coagulation factor V is activated in the above (a). It is promoted by an increase in the activity of protein C.
(C) Next, the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ions, promoted by activated blood coagulation factor V, The production of thrombin is reduced by inhibiting the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V in the above.
(D) Next, the reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed by reducing the generation of thrombin in (c).
(E) Next, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained by measuring the amount of signal whose production was suppressed by the suppression of the reaction in (d).
(2) Reagent for measuring the activity of total protein S in the sample
The reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention includes activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin. It is a reagent for measuring the activity of total protein S in a sample containing a substrate.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the surfactant is used for the activated blood coagulation activity by activated protein C during the activation reaction of activated protein C by protein S and by the activated protein C having increased activity. It is preferably present during the factor V decomposition reaction.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the phospholipid is preferably a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is activated during the activity-increasing reaction of activated protein C by protein S and the activity increased in the activity. Preferably, it is present during the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C.
Furthermore, the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably for measuring the total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (c).
(A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
(B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
(C) Next, the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
The reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably for measuring the total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (e).
(A) When the sample is brought into contact with at least activated protein C, a surfactant, a phospholipid, and calcium ions, the activity of activated protein C increases when the sample contains protein S.
(B) Next, the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V catalyzed by activated protein C in the presence of the component (a) and activated blood coagulation factor V is activated in the above (a). It is promoted by an increase in the activity of protein C.
(C) Next, the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ions, promoted by activated blood coagulation factor V, The production of thrombin is reduced by inhibiting the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V in the above.
(D) Next, the reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed by reducing the generation of thrombin in (c).
(E) Next, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained by measuring the amount of signal whose production was suppressed by the suppression of the reaction in (d).
2. Method for measuring the activity of total protein S in a sample
As a measuring method in the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and a measuring method using the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the following (1) or (2) is described. It is preferable to carry out by these methods.
(1)
(A) activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V (factor Va; FVa), activated blood coagulation factor X (factor Xa; FXa), prothrombin and Contact the substrate of thrombin with the sample.
The contact between these components and the sample may be performed with all the components at one time, and all the reactions in the following reaction system may be performed in one stage (one-step method). The reaction of the following reaction system may be performed in a plurality of stages by dividing the components and performing the contact in a plurality of stages (multi-step method).
(B) By the contact in the above (a), the following reaction by each of the above components proceeds.
The amount of signal generated from the thrombin substrate by this series of reactions is then measured.
That is, the thrombin substrate is subjected to an action such as degradation by thrombin by the series of reactions described above, and the amount of signal (for example, absorbance etc.) generated as a result is measured.
(C) When protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases in the presence of phospholipids and calcium ions, thereby promoting the degradation of activated blood coagulation factor V As a result, the reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed, and the generation of the signal is suppressed.
The degree of inhibition of this signal generation increases according to the activity value of total protein S contained in the sample.
Therefore, by measuring the amount of signal in (b) above, the amount of signal whose production is suppressed is measured, whereby the activity value of total protein S contained in the sample can be obtained.
Activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V (factor Va; FVa), activated blood coagulation factor X (factor Xa; FXa), prothrombin and thrombin substrate A method for measuring the activity value of protein S in a sample using the following reaction system comprising:
(A) A sample is brought into contact with at least activated protein C, a surfactant, a phospholipid, and calcium ions.
Thereby, when protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases in the presence of phospholipids and calcium ions.
(B) Due to the increase in the activity of activated protein C in (a) above, the degradation reaction of activated blood coagulation factor V that activated protein C catalyzes in the presence of phospholipids and calcium ions Promoted in coexistence.
(C) The reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ions, promoted by activated blood coagulation factor V, is activated in the above (b) Stimulation of blood coagulation factor V is promoted to suppress thrombin generation.
(D) The reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed by reducing the generation of thrombin in (c).
The degree of inhibition of this signal generation increases according to the activity of total protein S contained in the sample.
(E) The amount of signal whose production is suppressed by the suppression of the reaction in (d) is measured.
As described above, the amount of signal generated by the above reaction is measured, that is, the amount of signal whose generation is suppressed is measured, thereby obtaining the activity value of total protein S contained in the sample.
In the method and method for measuring the activity of total protein S in a sample of the present invention, the sample is a substance that may contain protein S.
Examples of this sample include biological samples (samples derived from humans or animals).
Examples of biological samples include blood, plasma, saliva, sweat, urine, tears, cerebrospinal fluid, ascites, amniotic fluid, and other biological fluids; liver, heart, brain, bone, hair, skin, nails, muscle, nerve tissue, etc. And extracts of organs, tissues, cells and the like.
4). Activated protein C
The activated protein C used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method.
For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned. Moreover, what was refine | purified and prepared from body fluids or organs, such as plasma, or what was prepared by genetic engineering operation, cell engineering operation, cell culture operation, etc. can be mentioned.
Further, during the measurement reaction in the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent, activated protein C is produced from protein C by a protein C activator or the like, and this is used as the activity in the present invention. It may be used as modified protein C.
In the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, activated protein C is brought into contact with the sample, so that when protein S is contained in the sample, phospholipid and calcium In the presence of ions, the activity of this activated protein C increases.
Activated protein C serves as a catalyst for a reaction that decomposes activated blood coagulation factor V in the presence of phospholipids and calcium ions.
Thus, the presence of protein S promotes the reaction of activated protein C degrading activated blood coagulation factor V.
Contacting the sample with activated protein C or the like and contacting activated protein C with activated blood coagulation factor V or the like may be performed simultaneously.
Further, activated protein C is brought into contact with the sample together with phospholipid, and after being incubated at room temperature or 37 ° C. for at least 1 minute or more, preferably 5 minutes or more, then contacted with activated blood coagulation factor V and calcium ions, Incubation may be followed by a degradation reaction of activated blood coagulation factor V.
When this activated protein C is used, the concentration of the activated protein C is contacted with the activated blood coagulation factor V, and when the activated blood coagulation factor V is decomposed in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ion, Usually, it is preferably 1 pM to 100 nM.
However, in order to obtain high measurement sensitivity, it is preferable that the activated protein C concentration is high. Therefore, the activated protein C concentration is more preferably 10 pM to 10 nM, and more preferably 100 pM to 1 nM. Particularly preferred.
In addition, the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention contains the activated protein C so that the concentration of the activated protein C becomes the above-mentioned concentration during the degradation reaction of the activated blood coagulation factor V. It is preferable to make it.
For example, the activated protein C is preferably contained in an amount of 1 pM to 200 nM, more preferably 10 pM to 20 nM, and particularly preferably 100 pM to 2 nM.
5. Surfactant
In the method for measuring the activity of total protein S of the present invention, a surfactant is present during the measurement reaction of the total protein S activity.
In the reagent for measuring the activity of total protein S of the present invention, the activated protein C, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate, Contains an active agent.
As the surfactant, one or more kinds of various surfactants such as a nonionic surfactant, an amphoteric surfactant, an anionic surfactant or a cationic surfactant are appropriately present. You can do it.
Examples of the surfactant include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene Nonionic surfactants such as phytosterol, phytostanol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin; amphoteric interfaces such as betaine acetate An activator; or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or polyoxyethylene alkyl ether acetate It may be mentioned an ionic surfactant or the like.
When this surfactant is a nonionic surfactant, its HLB (Hydrophile-Lipophile Balance) is preferably in the range of 10 to 20, more preferably in the range of 12 to 18, and 13 to 16 The thing of the range of is especially preferable.
As the nonionic surfactant, this surfactant is Triton X-100 [polyoxyethylene (n = 9,10) pt-octylphenyl ether, HLB: 13.5], Triton X-114 [ Polyoxyethylene (n = 7,8) pt-octylphenyl ether, HLB: 12.4], NP-10 [polyoxyethylene (n = 10) nonylphenyl ether, HLB: 16.5], NP- 11 [polyoxyethylene (n = 11) nonylphenyl ether], NP-12 [polyoxyethylene (n = 12) nonylphenyl ether], NP-13 [polyoxyethylene (n = 13) nonylphenyl ether], NP -15 [polyoxyethylene (n = 15) nonylphenyl ether, HLB: 18.0], BT-9 [polyoxy Ethylene (n = 9) 2 alkyl ether, HLB: 13.5], or BT-12 [polyoxyethylene (n = 12) 2 alkyl ether, HLB: 14.5] and the like are preferable.
Moreover, as an amphoteric surfactant, AM-301 [lauryl dimethylamino acetic acid betaine aqueous solution] etc. are preferable.
And as anionic surfactant, sarcosinate LN [lauroyl sarcosine sodium] etc. are preferable.
Furthermore, as the cationic surfactant, CA-2350 [cetyltrimethylammonium chloride] and the like are preferable.
The concentration of the surfactant in the measurement reaction of total protein S activity is not particularly limited, but is preferably 0.00001 to 5% (W / V), 0.0001 to 1% (W / V) is more preferable, 0.001 to 0.1% (W / V) is further preferable, and 0.005 to 0.05% (W / V) is particularly preferable.
And in nonionic surfactant, 0.001 to 0.01% (W / V) is very preferable, and in amphoteric surfactant, 0.001 to 0.01% (W / V) is used. Highly preferred, 0.001-0.1% (W / V) is highly preferred for anionic surfactants and 0.00001-0.001% (W / V) for cationic surfactants. Is highly preferred.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, this activity measuring reagent contains a surfactant so that the surfactant has the above-mentioned concentration during the measurement reaction of the total protein S activity. Is preferred.
For example, it is preferable to contain 0.00001 to 10% (W / V) of a surfactant in this activity measurement reagent, more preferably 0.0001 to 2% (W / V). It is more preferable to make it contain 0.2% (W / V), and it is especially preferable to make it contain 0.005-0.1% (W / V).
And in nonionic surfactant 0.001-0.02% (W / V), in amphoteric surfactant 0.001-0.02% (W / V), anionic interface It is very preferable that the active agent is contained at a concentration of 0.001 to 0.2% (W / V), and the cationic surfactant is contained at a concentration of 0.00001 to 0.002% (W / V).
In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the present invention, the activated blood by activated protein C at the time of the activity of activated protein C by the protein S contained in the sample and at the increased activity of the protein C. The presence of a surfactant during the degradation reaction of coagulation factor V is preferred for measuring the activity of total protein S in the sample.
6). Phospholipid
(1) General
In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity of the present invention, phospholipid is present during the measurement reaction of the total protein S activity.
This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method.
Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
In the measurement reaction of total protein S activity, the concentration at the time of the presence of phospholipid is usually preferably 0.03 μM to 100 μM, more preferably 0.3 μM to 50 μM, and 3 μM to 30 μM. Is particularly preferred.
Then, the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably contained in the reagent for measuring activity so that the phospholipid has the aforementioned concentration during the measurement reaction of the total protein S activity.
For example, the activity measurement reagent preferably contains 0.03 μM to 200 μM of phospholipid, more preferably 0.3 μM to 100 μM, and particularly preferably 3 μM to 60 μM.
Examples of the phospholipid include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
In addition, as this phospholipid, it is preferable for the activity measurement of the total protein S in a sample to make the phospholipid which consists of a phosphatidylcholine, a phosphatidylserine, and a phosphatidylethanolamine exist in the measurement reaction of total protein S activity.
Moreover, when the phospholipid consisting of this phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present, the composition of these three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
In particular, the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
(2) Phospholipid used for catalytic reaction with activated protein C
In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the present invention, the activated blood coagulation factor V at the time of the activity increase reaction of activated protein C by protein S contained in the sample and this activated protein C In the factor decomposition reaction, phospholipids necessary for the activation reaction of the activated protein C and the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V are present.
This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method.
Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
The concentration of phospholipid in the activated protein C activity increasing reaction and activated blood coagulation factor V decomposition reaction is preferably 0.1 μM to 100 μM, and preferably 1 μM to 50 μM. More preferably, it is more preferably 10 μM to 30 μM.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the concentration of phospholipid is adjusted to the above-mentioned concentration at the time of activated protein C activity increasing reaction and activated blood coagulation factor V decomposition reaction. It is preferable to be contained in this activity measurement reagent.
For example, the activity measurement reagent preferably contains 0.1 μM to 200 μM of phospholipid, more preferably 1 μM to 100 μM, and particularly preferably 10 μM to 60 μM.
Examples of the phospholipid include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
As this phospholipid, the presence of a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine at the time of the activated protein C activity increasing reaction and the activated blood coagulation factor V decomposition reaction, Preferred for measuring the activity of total protein S in a sample.
Moreover, when the phospholipid consisting of this phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present, the composition of these three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
In particular, the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
(3) Phospholipids used for catalytic reaction by activated blood coagulation factor X
In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the present invention, in the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of activated blood coagulation factor V, the reaction is performed. Make the necessary phospholipids present.
This phospholipid can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method.
Examples thereof include those derived from mammals such as humans, cows and pigs, those derived from other animals, those derived from plants, those derived from microorganisms, and those synthesized artificially.
The concentration of phospholipid in the reaction for generating thrombin from prothrombin is preferably 0.1 μM to 100 μM, more preferably 0.5 μM to 50 μM, and more preferably 1 μM to 10 μM. It is particularly preferred.
Then, the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably contained in this activity measuring reagent so that the phospholipid has the above-mentioned concentration during the reaction for generating thrombin from prothrombin.
For example, the activity measurement reagent preferably contains 0.1 μM to 200 μM of phospholipid, more preferably 0.5 μM to 100 μM, and particularly preferably 1 μM to 20 μM.
Examples of the phospholipid include glycerophospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as sphingomyelin.
In addition, as this phospholipid, the presence of a phospholipid composed of phosphatidylcholine and phosphatidylserine, or phosphatidylcholine, phosphatidylserine, and phosphatidylethanolamine during the reaction for generating thrombin from the prothrombin has the effect of promoting the reaction. Since it becomes high, it is preferable.
Moreover, when the phospholipid consisting of this phosphatidylcholine and phosphatidylserine is present, the composition ratio of these two types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylcholine of 85% (W / V) to 50% (W / V), The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 15% (W / V) to 50% (W / V).
In particular, the composition ratio of phosphatidylcholine is 80% (W / V) to 70% (W / V), and the composition ratio of phosphatidylserine is 20% (W / V) to 30% (W / V). Is preferred.
Alternatively, when a phospholipid composed of the phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine is present, the composition of the three types of phospholipids is a composition ratio of phosphatidylethanolamine of 10% (W / V) or more, and The composition ratio of phosphatidylserine is preferably 20% (W / V) or more.
In particular, the composition ratio of phosphatidylethanolamine is preferably 30% (W / V) or more, and the composition ratio of phosphatidylserine is preferably 30% (W / V) or more.
As the phospholipid in the reaction for generating thrombin from prothrombin, the phospholipid used in the above-mentioned activity-increasing reaction of activated protein C and the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V may be used as it is. it can.
However, as described above, the composition of a suitable phospholipid differs depending on each reaction, and therefore it is preferable to use a phospholipid having a composition suitable for each reaction in the presence of the reaction.
In the reaction for generating thrombin from this prothrombin, a phospholipid having a composition suitable for the activated protein C activity increase reaction and the activated blood coagulation factor V decomposition reaction previously added is the prothrombin. Even if it coexists with a phospholipid having a composition more suitable for the reaction for generating thrombin, there is no problem at all in the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention.
7). Calcium ion
In the method for measuring the activity of total protein S in the sample and the reagent for measuring the activity of the present invention, the activated blood coagulation process by activated protein C is performed during the reaction of increasing the activity of activated protein C by protein S contained in the sample. Calcium ions are present during the factor V degradation reaction and during the reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X and activated blood coagulation factor V.
As this calcium ion, not only calcium ion itself but also a compound containing calcium ion such as calcium salt can be used without particular limitation.
Examples of the compound containing calcium ions include calcium fluoride, calcium chloride, calcium bromide, calcium iodide, calcium sulfate, calcium nitrate, calcium acetate, calcium lactate, and calcium cyanide.
The concentration of this calcium ion is determined during the activation reaction of activated protein C by protein S contained in the sample, during the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by activated protein C, and In the reaction for producing thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X and activated blood coagulation factor V, it is usually preferably 0.1 mM to 100 mM, particularly preferably 1 mM to 10 mM. .
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, calcium ions are contained in the activated protein C activity increasing reaction, activated blood coagulation factor V decomposition reaction and thrombin generation reaction. It is preferable to make this activity measurement reagent contain so that it may become the density | concentration of.
For example, calcium ions or compounds containing calcium ions are preferably contained in the activity measurement reagent in an amount of 0.1 mM to 200 mM, and particularly preferably 1 mM to 20 mM.
8). Activated blood coagulation factor V
The activated blood coagulation factor V (factor Va; FVa) used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention is not particularly limited regardless of its origin (origin) and preparation method. Can be used.
For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
Moreover, what was refine | purified and prepared from body fluids or organs, such as plasma, or what was prepared by genetic engineering operation, cell engineering operation, cell culture operation, etc. can be mentioned.
In the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, activated blood coagulation factor V is degraded by activated protein C in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ion.
When protein S is contained in the sample, the presence of the protein S increases the activity of the activated protein C and promotes this decomposition reaction.
Activated blood coagulation factor V promotes the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipids and calcium ions.
Therefore, if protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C is increased, the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V is promoted, and the abundance of activated blood coagulation factor V is present. (Concentration) decreases.
Then, since the effect of activating blood coagulation factor V to the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X is reduced, the reaction of generating thrombin from prothrombin is suppressed.
Contacting the activated blood coagulation factor V with activated protein C and the like, and contacting the activated blood coagulation factor V with activated blood coagulation factor X and prothrombin, etc. are performed simultaneously. Also good.
However, after contacting activated blood coagulation factor V with activated protein C together with surfactant, phospholipid and calcium ions and incubating at room temperature or at 37 ° C. for at least 1 minute, preferably 5 minutes or more, It is preferable to perform a reaction in which thrombin is generated from prothrombin by in contact with activated blood coagulation factor X, prothrombin, and the like.
The concentration at which this activated blood coagulation factor V is used is brought into contact with activated protein C to cause a reaction to decompose the activated blood coagulation factor V in the presence of a surfactant, phospholipid and calcium ions. In particular, it is usually preferable to be in the range of 0.5 pM to 5 nM.
However, when the concentration of this activated blood coagulation factor V is high, blood coagulation reaction proceeds due to components (factors) derived from the sample, and fibrin is precipitated or a large amount of color develops, resulting in accurate measurement. Therefore, the activated blood coagulation factor V concentration is more preferably 5 pM to 500 pM, and particularly preferably 20 pM to 200 pM.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the activity measuring reagent is used so that the activated blood coagulation factor V becomes the above concentration during the degradation reaction of the activated blood coagulation factor V. It is preferable to make it contain.
For example, the activated blood coagulation factor V is preferably contained at 0.5 pM to 10 nM, more preferably 5 pM to 2 nM, and particularly preferably 20 pM to 1 nM.
9. Activated blood coagulation factor X
The activated blood coagulation factor X (factor Xa; FXa) used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention is not particularly limited, regardless of its origin (origin) or preparation method. Can be used.
For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
Moreover, what was refine | purified and prepared from body fluids or organs, such as plasma, or what was prepared by genetic engineering operation, cell engineering operation, cell culture operation, etc. can be mentioned.
In the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, activated blood coagulation factor X catalyzes a reaction for producing thrombin from prothrombin in the presence of phospholipid and calcium ion.
This reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X is promoted by the presence of activated blood coagulation factor V.
Therefore, as described above, when protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases, thereby promoting the degradation reaction of activated blood coagulation factor V, and thus the activity. Since the effect of activating blood coagulation factor V on the reaction that generates thrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X is reduced, the reaction that generates thrombin is suppressed.
When this activated blood coagulation factor X is used, the concentration is usually in contact with activated blood coagulation factor V, prothrombin, etc., and when thrombin is produced from prothrombin in the presence of phospholipid and calcium ion, It is preferable that it exists in 0.1 pM-300 pM.
However, if the concentration of this activated blood coagulation factor X is high, the blood coagulation reaction by the component (factor) derived from the sample proceeds as in the case of the above-mentioned activated blood coagulation factor V, and fibrin Or a large amount of color develops and accurate measurement cannot be performed. Therefore, the activated blood coagulation factor X concentration is more preferably 1 pM to 100 pM, and particularly preferably 10 pM to 50 pM. preferable.
In addition, the protein S activity measurement reagent in the sample of the present invention is preferably contained in the activity measurement reagent so that the activated blood coagulation factor X is at the above-mentioned concentration during the thrombin generation reaction.
For example, the activated blood coagulation factor X is preferably contained in an amount of 0.1 pM to 600 pM, more preferably 1 pM to 200 pM, and particularly preferably 10 pM to 100 pM.
10. Prothrombin
The prothrombin used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention can be used without particular limitation regardless of its origin (origin) and preparation method.
For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned.
Moreover, what was refine | purified and prepared from body fluids or organs, such as plasma, or what was prepared by genetic engineering operation, cell engineering operation, cell culture operation, etc. can be mentioned.
In the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, prothrombin becomes a substrate for the reaction catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ion, and becomes thrombin.
This reaction of generating thrombin from prothrombin by activated blood coagulation factor X is promoted by the presence of activated blood coagulation factor V.
Therefore, as described above, when protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases, thereby promoting the degradation reaction of activated blood coagulation factor V, and thus the activity. Since the promoting effect of activated blood coagulation factor V on the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X is reduced, the reaction of generating thrombin from prothrombin is suppressed, and the thrombin produced The amount (concentration) is reduced.
The concentration of prothrombin used is usually 1 nM when thrombin is produced from prothrombin in the presence of phospholipids and calcium ions in contact with activated blood coagulation factor V and activated blood coagulation factor X. It is preferably ˜50 μM, more preferably 50 nM to 5 μM, and particularly preferably 100 nM to 1 μM.
In addition, the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention is preferably contained in this activity measuring reagent so that prothrombin has the aforementioned concentration during the thrombin generation reaction.
For example, it is preferable to contain 1 nM to 100 μM of prothrombin, more preferably 50 nM to 10 μM, and particularly preferably 100 nM to 2 μM.
11. Thrombin substrate
The thrombin substrate used in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention is one that generates some signal by receiving a catalytic action (as a thrombin substrate) of thrombin as a protease, or by thrombin Any other signal can be used as long as it produces some signal by continuing other reactions in addition to the catalytic reaction.
This kind of signal is generated, but it is possible to detect the generation or change of a signal (signal) in optical, electrical, magnetic, or other energy by being catalyzed by thrombin. Means that.
For example, there may be mentioned those in which the absorbance, transmittance or fluorescence intensity changes due to the catalytic action of thrombin, in which the light absorption curve changes, or in which light is emitted.
Examples of this include peptides or proteins bound to compounds that change absorbance, transmittance or fluorescence intensity, or light absorption curves when released, or peptides bound to compounds that emit light when released or Examples thereof include proteins and the like, and substances that release the compound from the peptide or protein by the catalytic action of thrombin.
In such substances, thrombin is catalyzed, and when the compound is liberated, it can be detected as absorbance, transmittance or fluorescence intensity, light absorption curve change or light emission, etc. The enzyme activity can be determined by measuring the amount of the generated signal (absorbance, transmittance or fluorescence intensity, change in light absorption curve or light emission, etc.).
As such a substance, for example, “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride” [Test Team (registered trademark) chromogenic substrate S-2238] (manufacturer : Chromogenix-Instrumentation Laboratories [Italy], distributor: Sekisui Medical [Japan]], “HD-hexahydrotyrosyl-L-alanyl-L-arginyl-p-nitroanilide diacetate” [SPECTROZYME (registered trademark) TH] (AMERICAN DIAGNOSTICA, Cosmo Bio), “Benzoyl-phenylalanyl-valinyl-arginyl-p-nitroanilide hydrochloride” [Thrombin Substrate I, Colorimetric] (CAL BIOCHEM, Cosmo Bio), "Tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-nitroanilide" [CHROMOZYME TH] (PENTAPHARM), "HD-phenylalanyl-prolyl-arginyl-3-carboxy-4- “Hydroxy-aniline” (Daiichi Sankyo), “Benzoyl-phenylalanyl-valinyl-arginyl-AMC / hydrochloride” (Thrombin Substrate III, Fluorogenic) (CALBIOCHEM, Cosmo Bio), “t-butoxycarbonyl- Asparagyl (O-benzyl) -prolyl-arginyl-MCA "(Peptide Institute) or" t-butoxycarbonyl-valinyl-prolyl-arginyl-MCA "(Peptide Institute). In particular, “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride” is preferable.
Contacting the activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X and prothrombin, etc., and contacting the generated thrombin with the substrate of this thrombin may be performed simultaneously or separately. The steps may be performed separately.
In any case, the thrombin produced is brought into contact with a thrombin substrate and incubated at least at least 1 minute, preferably at least 5 minutes at room temperature or 37 ° C. to generate a signal from the thrombin substrate.
The concentration when this thrombin substrate is used is usually preferably 5 μM to 100 mM, particularly preferably 50 μM to 10 mM, when the thrombin substrate is catalyzed by thrombin.
The protein S activity measurement reagent in the sample of the present invention is preferably contained in the activity measurement reagent so that the thrombin substrate has the aforementioned concentration when it is catalyzed by thrombin.
For example, the thrombin substrate is preferably contained in an amount of 5 μM to 200 mM, particularly preferably 50 μM to 20 mM.
12 Measurement of signal level
The substrate for thrombin in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention generates a signal by being catalyzed by thrombin generated from prothrombin.
In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring activity in the sample of the present invention, the amount of signal generated from the thrombin substrate is measured.
In addition, when protein S is contained in the sample, the amount of this signal is the amount of the signal whose production is suppressed according to the activity value of total protein S in the sample.
Measurement of the generated signal amount (signal amount in which generation is suppressed) may be appropriately performed according to the signal.
For example, when the signal is a change in absorbance, transmittance, fluorescence intensity, light absorption curve or light emission, the absorbance, transmittance, fluorescence intensity, emission intensity, or the like is measured.
More specifically, the substrate of thrombin is the aforementioned “HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride”, “HD-hexahydrotyrosyl- “L-alanyl-L-arginyl-p-nitroanilide diacetate”, “benzoyl-phenylalanyl-valinyl-arginyl-p-nitroanilide hydrochloride” or “tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-” In the case of a substance in which p-nitroaniline is bound to a peptide such as “nitroanilide”, the absorption of light that p-nitroaniline liberated by the catalytic action of thrombin has in the vicinity of a wavelength of 405 nm has a wavelength of 405 nm or the vicinity thereof. By measuring absorbance at a wavelength of.
In this case, the absorbance measurement may be a single wavelength measurement of only the main wavelength, or a two-wavelength measurement measured at the main wavelength and the sub wavelength.
The absorbance measurement may be performed by the end point method or the rate method.
13. Activity value of total protein S contained in the sample
In the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, if protein S is contained in the sample, the activity of activated protein C increases, and activated blood coagulation factor V Is promoted, and the abundance (concentration) of activated blood coagulation factor V decreases.
Then, since the effect of activating blood coagulation factor V to the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X is reduced, the reaction of generating thrombin from prothrombin is suppressed.
Thereby, since the production | generation of thrombin reduces, the reaction which produces a signal from the substrate of thrombin which this thrombin catalyzes is also suppressed, and the quantity of the signal to generate | occur | produce is suppressed.
That is, the degree of inhibition of this signal generation increases according to the activity value of total protein S contained in the sample.
Therefore, in the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of total protein in the sample of the present invention, the amount of signal generated by contacting the sample with activated protein C or the like and carrying out the reaction as described above is measured. That is, by measuring the amount of signal whose production is suppressed, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained.
Obtaining the activity value of total protein S contained in the sample after measuring the amount of signal in which this generation is suppressed may be performed as appropriate. For example, it can be performed as follows.
As described above, measurement operation is performed on at least one sample whose activity value of total protein S is known and a sample whose physiological protein S activity value is known to be “zero” (such as physiological saline or pure water). To determine the amount of signal generated (the amount of signal with suppressed generation).
Then, a calibration curve is created by expressing the relationship between the generated signal amount (signal amount whose generation is suppressed) and the activity value of the total protein S contained in the sample in a mathematical expression or a graph.
This calibration curve represents the relationship between the degree of inhibition of signal generation and the activity value of total protein S contained in the sample.
Next, the measurement operation is performed in the same manner as described above for a sample whose activity value of total protein S is unknown, and the amount of signal generated (the amount of signal with suppressed generation) is obtained.
This signal amount is applied to the calibration curve, and the corresponding activity value of total protein S is determined.
Thereby, the activity value of the total protein S of the sample can be obtained from the amount of signal generated in the sample whose total protein S activity value is unknown (the amount of signal whose generation is suppressed).
The calibration curve represents the relationship between the amount of signal (the amount of signal with suppressed generation), that is, the degree of inhibition of signal generation, and the activity value of total protein S contained in the sample. The amount of signal in the calibration curve (the amount of signal whose generation is suppressed) may be the measured signal amount itself, or may be a numerical value calculated based on the value of the signal amount.
That is, the calibration curve may represent a relationship between a numerical value calculated based on the measured signal amount value and the activity value of total protein S contained in the sample.
Even in this case, the numerical value calculated based on the value of the measured signal amount corresponds to the signal amount whose generation is suppressed.
Examples of the numerical value calculated based on the measured signal amount value include, for example, a numerical value of a change amount of the measured signal amount per unit time, or a first derivative of the measured signal amount value with respect to time. Or a numerical value calculated by second-order differentiation.
For example, the amount of change per minute in the absorbance obtained by measurement, or the rate of change in absorbance obtained by first derivative of the absorbance obtained by measurement with respect to time, or the absorbance obtained by measurement in time On the other hand, the acceleration of the change in absorbance obtained by second-order differentiation can be exemplified.
14 protein
In the method and the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the protein such as albumin such as human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin, casein, or gelatin is used as described above. It is preferably present during the activity measurement reaction, or is preferably contained in the activity measurement reagent.
The concentration at which this protein is present is usually preferably 0.1 μM to 1 mM.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, it is preferable to contain the protein in the activity measuring reagent so that the protein has the aforementioned concentration.
For example, this protein is preferably contained at 0.1 μM to 2 mM.
15. salt
In the method and reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, a salt such as a halogen element and an alkali metal salt or a halogen element and an alkaline earth metal salt is present during the activity measurement reaction. Or is preferably contained in the activity measuring reagent.
Examples of the halogen element and alkali metal salt include sodium chloride, potassium chloride, sodium fluoride, potassium fluoride, sodium bromide, and potassium bromide.
In addition, examples of the salt of a halogen element and an alkaline earth metal include magnesium chloride, magnesium fluoride, and magnesium bromide.
The concentration at which this salt is present is usually preferably from 5 mM to 1 M, particularly preferably from 50 mM to 250 mM.
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, it is preferable to contain this salt in the activity measuring reagent so as to have the aforementioned concentration.
For example, this salt is preferably contained in an amount of 5 mM to 2 M, particularly preferably 50 mM to 500 mM.
16. Diluted solution
In the method for measuring the activity of total protein S in a sample of the present invention, it is preferable for the activity measurement of total protein S in the sample to be performed after the sample is diluted with a diluent.
Further, in the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, it is preferable for the activity measuring reagent to contain a diluent for measuring the activity of total protein S in the sample.
The pH of the diluted solution is not particularly limited, but is preferably in the pH range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.), and is in the pH range of pH 6.5 to pH 8.5 (20 ° C.). More preferably.
In addition, in order to maintain pH in the said pH range, it is preferable to make this dilution liquid contain or contain the buffer which has a buffer capacity in the said pH range suitably.
In addition, components such as proteins, salts, surfactants, preservatives, stabilizers, activators, or saccharides can be appropriately contained in the diluted solution as necessary.
Examples of the diluent include water, physiological saline, phosphate buffered saline, and buffer solution.
Although it is a dilution ratio at the time of diluting a sample with this diluent, it is preferably 2 to 60 times, preferably 5 to 40 times for measuring the activity of total protein S in the sample, although there is no particular limitation. More preferably, 10 times to 20 times is particularly preferable.
17. pH
In the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, the activity measurement reaction is preferably performed in the range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.), and pH 6.5 to pH 8.5 ( It is particularly preferable to carry out in the range of 20 ° C.
Further, in the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, it is preferable that the above-mentioned activity measurement reaction has a pH such that the reaction is performed in a pH range of pH 6.0 to pH 10.0 (20 ° C.). It is particularly preferable that the pH is such that it is carried out in the pH range of pH 6.5 to pH 8.5 (20 ° C.).
In the method for measuring the activity of total protein S and the activity measuring reagent in the sample of the present invention, in order to keep the pH in the activity measuring reaction or the pH of the activity measuring reagent in the above pH range, the buffering capacity is set in the above pH range. It is preferable that the buffering agent to be present or contained appropriately.
18. Other ingredients
In the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the total protein S in the sample of the present invention, components other than the above-described components such as preservatives, stabilizers, activators, or saccharides are appropriately added as necessary. It can be present during the activity measurement reaction, or can be contained in the activity measurement reagent.
19. Measurement method
In the method for measuring the activity of total protein S in the sample and the reagent for measuring the activity of the present invention, the activity of the total protein S in the sample may be measured by a method or using an apparatus such as an automatic analyzer. You may go.
20. Measurement stage
In the method for measuring the activity of total protein S in the sample and the reagent for measuring the activity of the present invention, the activity measurement reaction described in detail above is performed by bringing all components into contact with the sample at one time. The activity measurement reaction may be performed in multiple stages (multi-step method) by dividing the components and contacting in multiple stages.
When dividing into a plurality of stages, there is no particular limitation, but for example, it can be performed as follows.
(1) Two-step method-1
(A) A sample, activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion and activated blood coagulation factor V are contacted.
(B) Next, activated blood coagulation factor X, prothrombin and a substrate of thrombin are brought into contact with the above-mentioned (a).
(2) Two-step method-2
(A) A sample, activated protein C, surfactant, phospholipid, and calcium ion are contacted.
(B) Next, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin, thrombin substrate and phospholipid are brought into contact with those in (a).
(3) Three-step method
(A) A sample, activated protein C, surfactant, phospholipid, and calcium ion are contacted.
(B) Next, activated blood coagulation factor V is brought into contact with the above (a).
(C) Further, activated blood coagulation factor X, prothrombin and a substrate for thrombin are brought into contact with the above-mentioned (b).
21. Reagent for measuring the activity of total protein S in a sample
The reagent for measuring the activity of protein S in the sample of the present invention includes activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate. It contains.
You may contain components other than the said component as needed.
22. Composition of total protein S activity measurement reagent in sample
In the reagent for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, all the components of the activity measurement reaction described in detail above may be contained in one reagent (one reagent system). A plurality of reagents such as two or three reagents may be contained separately (multiple reagent system).
When each component is contained separately in a plurality of reagents, there is no particular limitation, but for example, it can be contained as follows.
(1) 2-reagent system-1
(A) First reagent: activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion and activated blood coagulation factor V
(B) Second reagent: activated blood coagulation factor X, prothrombin, thrombin substrate and phospholipid
(2) 2-reagent system-2
(A) First reagent: activated protein C, surfactant, phospholipid and calcium ion
(B) Second reagent: activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate
(3) Three reagent system
(A) First reagent: activated protein C, surfactant, phospholipid and calcium ion
(B) Second reagent: activated blood coagulation factor V
(C) Third reagent: activated blood coagulation factor X, prothrombin, thrombin substrate and phospholipid
(4) Four reagent system
(A) First reagent: activated protein C, surfactant, phospholipid and calcium ion
(B) Second reagent: activated blood coagulation factor V
(C) Third reagent: activated blood coagulation factor X
(D) Fourth reagent: prothrombin and thrombin substrate
以下、本発明を実施例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
〔実施例１〕（本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬−１）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｘ因子（精製ウシ活性化血液凝固第Ｘ因子；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ社、米国） １００ｐＭ
リン脂質
塩化カルシウム １０．０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．６ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）１．０ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５（すなわち、３０％（Ｗ／Ｖ）：２０％（Ｗ／Ｖ）：５０％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、１５μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝３：２：５）」ということがある。〕
（２）第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
プロトロンビン（精製ヒトプロトロンビン；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） １．５μＭ
テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８（トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕；製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕） １．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
（３）第３試薬−ａ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ａを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．５ｍｇ、及びホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．５ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が１：１（すなわち、５０％（Ｗ／Ｖ）：５０％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、２０μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの組成比が１：１のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ＝１：１）」ということがある。〕
（４）第３試薬−ｂ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ｂを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ＝１：１）を、２０μＭの濃度となるように含有させた。
（５）第３試薬−ｃ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ｃを調製した。
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１（すなわち、３３．３３％（Ｗ／Ｖ）：３３．３３％（Ｗ／Ｖ）：３３．３３％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、２４μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）」ということがある。〕
（６）第３試薬−ｄ
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−ｄを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（７）第４試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第４試薬を調製した。
活性化プロテインＣ（精製ヒト活性化プロテインＣ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） １６．５ｎＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
（８）第５試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第５試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｖ因子（精製ヒト活性化血液凝固第Ｖ因子；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）６．０ｎＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
２．試料
次の（１）及び（２）をそれぞれ試料として用いた。
（１） 精製された遊離のプロテインＳと精製された遊離のＣ４ｂ結合タンパク質とを１：１（モル比）で混合して調製した総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料
（２） 精製された遊離のプロテインＳと精製された遊離のＣ４ｂ結合タンパク質とを１：１（モル比）で混合して調製した総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定
各試料の総プロテインＳの活性値の測定を、次のようにして行った。
（１） 前記２の試料のそれぞれについて、その０．５μＬと前記１の（３）の第３試薬−ａの１９３．５μＬを混合した。
（２） 次に、これに前記１の（７）の第４試薬の４μＬを添加混合し、３７℃で５分間インキュベートした。
（３） 次に、これに前記１の（８）の第５試薬の２μＬを添加混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。
（４） 次に、この１８０μＬを分取し、前記１の（１）の第１試薬の１８０μＬ及び前記１の（２）の第２試薬の１８０μＬを入れて３７℃でインキュベートしておいたキュベットに添加混合して、３７℃でインキュベートした。
（５） 前記（４）における添加混合の後、波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（６） なお、前記（１）において、前記１の（３）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（４）の第３試薬−ｂを用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第３試薬−ｂを用いた場合の波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（７） また、前記（１）において、前記１の（３）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（５）の第３試薬−ｃを用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第３試薬−ｃを用いた場合の波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
（８） そして、前記（１）において、前記１の（３）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（６）の第３試薬−ｄを用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、第３試薬−ｄを用いた場合の波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。
４．試料中の総プロテインＳの活性値の算出
前記３において測定した波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化（反応のタイムコース）の値を微分して、試料中の総プロテインＳの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインＳ活性値が既知の試料について、前記３の通り測定を行い、測定した波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインＳ活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記２の試料を前記３の通り測定を行って得た、波長４０５ｎｍにおける吸光度の変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
なお、本特許出願の明細書及び図面においては、精製ヒトプロテインＳ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）の１μｇ／ｍＬが有する総プロテインＳ活性値を、総プロテインＳ活性値１μｇ／ｍＬ当量と定義した。
よって、本特許出願の明細書及び図面においては、総プロテインＳの活性は、「μｇ／ｍＬ当量」を用いて表している。
５．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を表１に示した。
なお、この表において、「比率（％）」として表した値は、試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率をパーセント表示で示したものである。
また、この表より、第３試薬−ｂを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン（１：１）よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６５．４％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６２．８％であることが分かる。
また、この表より、第３試薬−ｃを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させず、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン（１：１：１）よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては５０．４％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては５０．０％であることが分かる。
また、この表より、第３試薬−ｄを用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させ、かつホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミン（１：１：１）よりなるリン脂質を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては７８．７％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては８９．１％であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインＳ活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
また、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に存在させるリン脂質が、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンよりなるリン脂質よりも、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンよりなるリン脂質の方が、より正確に試料中の総プロテインＳ活性を測定することができることが確かめられた。
〔実施例２〕（本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬−２）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果を確認した。
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）第１試薬
第１試薬として、前記の実施例１の１の（１）の第１試薬を用いた。
（２）第２試薬
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。
（３）第３試薬−１
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−１を調製した。
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（４）第３試薬−２〜第３試薬−１９
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第３試薬−２から第３試薬−１９までを調製した。
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
また、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ−１０、ＮＰ−１１、ＮＰ−１２、ＮＰ−１３、ＢＴ−９及びＢＴ−１２、陰イオン性界面活性剤のサルコシネート ＬＮ、陽イオン性界面活性剤のＣＡ−２３５０、並びに両性界面活性剤のＡＭ−３０１のそれぞれを、次の通り記載の濃度となるように各々の試薬に含有させた。
第３試薬−２： Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国） ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−３： Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国） ０．００６０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−４： Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国） ０．００７０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−５： Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（和光純薬工業社、日本国） ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−６： ＮＰ−１０（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００２５％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−７： ＮＰ−１１（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００２５％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−８： ＮＰ−１１（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−９： ＮＰ−１２（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００２５％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１０： ＮＰ−１３（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００５０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１１： ＢＴ−９（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００３％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１２： ＢＴ−９（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１３： ＢＴ−１２（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１４： サルコシネート ＬＮ（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１５： サルコシネート ＬＮ（日光ケミカルズ社、日本国） ０．０１０％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１６： ＣＡ−２３５０（日光ケミカルズ社、日本国） ０．０００１％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１７： ＣＡ−２３５０（日光ケミカルズ社、日本国） ０．０００３％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１８： ＡＭ−３０１（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００３％（Ｗ／Ｖ）
第３試薬−１９： ＡＭ−３０１（日光ケミカルズ社、日本国） ０．００６％（Ｗ／Ｖ）
（５）第４試薬
第４試薬として、前記の実施例１の１の（７）の第４試薬を用いた。
（６）第５試薬
第５試薬として、前記の実施例１の１の（８）の第５試薬を用いた。
２．試料
前記の実施例１の２の（１）及び（２）の各試料を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３及び４の記載の通りに総プロテインＳの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインＳの活性値を得た。
なお、前記の実施例１の３の（１）の第３試薬−ａに替えて、前記１の（３）の第３試薬−１及び前記１の（４）の第３試薬−２から第３試薬−１９までを順々に用いた。
４．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を表２に示した。
なお、この表において、「比率（％）」として表した値は、試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率をパーセント表示で示したものである。
また、この表より、第３試薬−２から第３試薬−１９までをそれぞれ用いた場合には、すなわち、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させた場合には、前記の比率〔試料の総プロテインＳ活性値に対する、測定値（試料を測定して得た総プロテインＳ活性値）の比率〕が、総プロテインＳ活性値が１０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６２．０％〜８８．０％、そして総プロテインＳ活性値が２０μｇ／ｍＬ当量の試料においては６４．０％〜１０４．３％であることが分かる。
これらのことより、試料中に含まれていたプロテインＳによる活性化プロテインＣの活性上昇反応時、及び当該活性上昇したプロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応時に、界面活性剤を存在させることにより、試料中の総プロテインＳ活性を、より正確に測定することができることが確かめられた。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の効果が確かめられた。
そして、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤の全てのタイプの界面活性剤において、この本発明の効果を確かめることができた。
〔実施例３〕（本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬の再現性の検討）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬により試料中の総プロテインＳ活性値を測定する際の測定の再現性について検討した。
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、希釈液を調製した。
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国） ０．０６％（Ｗ／Ｖ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
クエン酸三ナトリウム １０．６ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
（２）第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。
活性化プロテインＣ（精製ヒト活性化プロテインＣ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ３９７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（３）第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｖ因子（精製ヒト活性化血液凝固第Ｖ因子；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）３５７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。
（４）第３試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第３試薬を調製した。
活性化血液凝固第Ｘ因子（精製ウシ活性化血液凝固第Ｘ因子；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ社、米国） ５０ｐＭ
プロトロンビン（精製ヒトプロトロンビン；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ７３８ｎＭ
テストチーム（登録商標）発色基質Ｓ−２２３８（トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕；製造元：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社〔イタリア国〕、販売元：積水メディカル社〔日本国〕） ７５０μＭ
リン脂質
塩化カルシウム ５．０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
なお、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝３：２：５）を、７．５μＭの濃度となるように含有させた。
２．試料
ヒトの血漿の４検体を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定
各試料の総プロテインＳの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１７０Ｓ形汎用自動分析装置を使用して行った。
（１） 前記２の試料それぞれについて、前記１の（１）の希釈液により希釈倍率１５倍で希釈を行った。
（２） 前記（１）で希釈した試料２．０μＬに、前記１の（２）の第１試薬の９８μＬを添加し、３７℃で１．４分間反応させた。
（３） 次に、前記１の（３）の第２試薬の２０μＬを添加し、３７℃で８．３分間反応させた。
（４） 次に、前記１の（４）の第３試薬の２３６μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（５） 前記（４）における第３試薬の添加の後、主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の変化を１２．３分間測定した。
（６） 前記（１）〜（５）の操作を繰り返して計５回行い、同時再現性の検討を行なった。
（７） また、前記（１）〜（５）の操作を連続する３日間のそれぞれの日に行い、日差再現性の検討を行なった。
４．試料中の総プロテインＳの活性値の算出
前記３の（５）において測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の値を微分して、試料中の総プロテインＳの活性値を求めた。
なお、予め、総プロテインＳ活性値が既知の試料について、前記３の通り測定を行い、測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインＳ活性値に対してプロットして検量線を作成した。
そして、前記２の試料を前記３の通り測定を行って得た、第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、検量線に当てはめてることにより、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
５．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を表３に示した。
この表において、同時再現性のデータ、及び日差再現性のデータとも、それぞれの試料毎に、「平均値±標準偏差（ＳＤ）」及び「変動係数（ＣＶ）」を示した。
また、日差再現性における変動係数（ＣＶ）は２．８％〜５．６％の範囲のものであり、例え測定を行う日が異なったとしてもその測定値のバラツキは小さく、精密に測定できることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬は測定の再現性がよく、精密に測定が行えるものであることが確かめられた。
〔実施例４〕（ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬と、ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬との相関を検討した。
Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
希釈液として、前記の実施例３の１の（１）の希釈液を用いた。
（２）第１試薬
第１試薬として、前記の実施例３の１の（２）の第１試薬を用いた。
（３）第２試薬
第２試薬として、前記の実施例３の１の（３）の第２試薬を用いた。
（４）第３試薬
第３試薬として、前記の実施例３の１の（４）の第３試薬を用いた。
２．試料
健常人５０名の血漿を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例３の３及び４の記載の通りに総プロテインＳの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインＳの活性値を得た。
この試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を図１に示した。
ＩＩ．ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳのタンパク質量の活性測定試薬
ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳのタンパク質量の活性測定試薬として、市販の「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」（製造者：ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ社、フランス国；製造販売者：ロシュ・ダイアグノスティックス社、日本国）を用いた。
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」は次のものより構成される。
（ａ） 抗体コーティングストリップ（抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｂ） 抗体コンジュゲート（ペルオキシダーゼ標識抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｃ）基質液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、及び３０％過酸化水素水）
（ｄ）希釈緩衝液
（ｅ）洗浄液
（ｆ）スタンダード（総プロテインＳ・キャリブレーター）
（ｇ）コントロール（総プロテインＳ・コントロール）
（ｈ）プレートフレーム
（ｉ）プレートカバー
２．試料
前記のＩの２における試料（健常人５０名の血漿）を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定及び算出
「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」の添付文書の記載に従い、試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定及び算出を行った。
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」における操作方法は次の通りである。
（ａ） 検体（クエン酸血漿）を希釈緩衝液で１０１倍に希釈し、試料とする。
（ｂ） 希釈緩衝液で１０１倍に希釈して調製したスタンダードを段階的に希釈し、希釈系列を作成する。
（ｃ） 抗体コーティングストリップの各ウェルに抗体コンジュゲートを５０μＬ分注する。
（ｄ） 試料又は希釈したスタンダード２００μＬをそれぞれ分注し、１８〜２５℃で１時間インキュベーションする。
（ｅ） 各ウェルの内容液を吸引除去し、洗浄液で５回洗浄する。
（ｆ） 洗浄液を吸引除去した後、各ウェルに基質液２００μＬを分注し、１８〜２５℃で５分間インキュベーションする。
（ｇ） １Ｍ硫酸５０μＬを分注し、プレートを穏やかに揺らして内容物を混和する。１５分間放置した後、１時間以内に波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
（ｈ） スタンダードの吸光度と試料の吸光度を比較し、試料中の総プロテインＳ濃度を求める。
このようにして、前記２の各試料の総プロテインＳのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図１に示した。
ＩＩＩ．測定結果
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図１に示した。
この図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ当量」である。
この相関の回帰式を求めた結果、回帰式はｙ＝０．９５９ｘ−０．８６０であり、相関係数はｒ＝０．９３であった。（ｘ：前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果、ｙ：前記Ｉの本発明による総プロテインＳの活性値の測定結果）
この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による活性値は、試料中の総プロテインＳのタンパク質量と良好な相関性を示すことが分かる。
このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬により得られる活性値が、正確なものであることが分かる。すなわち、試料中の総プロテインＳの活性を正確に測定出来ている。
そして、このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来るものであることが分かる。
つまり、このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の活性に加えて、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」に含まれるプロテインＳが遊離のプロテインＳ（遊離型）となった場合に発現する活性もあわせて測定することが出来るものであることが分かる。
すなわち、このように総プロテインＳのタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕について、そのタンパク質量に相応するプロテインＳの活性値を得ることが出来るものであることが分かる。
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法が、試料中の総プロテインＳの活性を正確に測定することが出来るものであることが確かめられた。
〔実施例５〕（総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量との比較）
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬により得た総プロテインＳの活性値と、ラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインＳのタンパク質量とを比較した。
Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による測定
１．総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
希釈液として、前記の実施例３の１の（１）の希釈液を用いた。
（２）第１試薬
第１試薬として、前記の実施例３の１の（２）の第１試薬を用いた。
（３）第２試薬
第２試薬として、前記の実施例３の１の（３）の第２試薬を用いた。
（４）第３試薬
第３試薬として、前記の実施例３の１の（４）の第３試薬を用いた。
２．試料
次の（１）〜（４）をそれぞれ試料として用いた。
（１） 健常人２１１名の血漿
（２） プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している７名の血漿
（３） プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している１名の血漿
（４） プロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例３の３及び４の記載の通りに総プロテインＳの活性値の測定及び算出を行い、各試料の総プロテインＳの活性値を得た。
この試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を図２に示した。
ＩＩ．ラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の活性測定試薬
（１）第１試薬
Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
次に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．２（２０℃）〕を調製した。
ここに、前記の通り調製したＣ４ｂ結合タンパク質を２５μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、第１試薬とした。
（２）第２試薬
（ａ）抗プロテインＳ抗体の調製
本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインＳ抗体の調製を行った。
プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。
このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
これに、０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
次に、これに、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
その後、これを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を得た。
（ｂ）抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液１．０ｍＬと５０ｍＭ ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕１．０ｍＬとを混和し、更に３２０ｍＭカルボジイミド（同仁化学研究所；製品番号：３４８−０３６３１）水溶液３２μＬを添加して混和し、氷上で１０分間放置した。
前記の氷上で１０分間放置したラテックス粒子懸濁液１．２ｍＬに、前記（ａ）で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を０．０８３ｇ／ｄＬの濃度で５０ｍＭ ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕に混和した液１．８ｍＬを加え、４℃で一晩攪拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を０．８％ＢＳＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕にて懸濁し、３７℃で３時間放置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長７００ｎｍにおける吸光度が１５．０ＯＤとなるように懸濁した。
これを抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
（ｃ）第２試薬の調製
前記（ｂ）で調製した抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で１０倍希釈し、０．１％の「抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第２試薬とした。
２．試料
前記のＩの２の（１）〜（４）の各試料を、試料として用いた。
３．試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定及び算出
（１）測定手順
（ａ）測定は、東芝−１２０ＦＲ自動分析装置（東芝メディカルシステムズ社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の試料の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。
これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインＳと、前記の第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となった。
（ｂ）前記の第１試薬の添加後４分４０秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬の１００μＬを添加し、混合した。
（ｃ）前記の第１試薬の添加後５分３５秒目（１９ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
（ｄ）前記の第１試薬の添加後９分４７秒目（３３ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。
（ｅ）前記（ｄ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ｃ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインＳタンパク質量（濃度）に比例したものである。
これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体（３．２％クエン酸血漿）を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳタンパク質濃度を求めた。
このようにして、前記２の各試料の総プロテインＳのタンパク質量を得た。
この試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図２に示した。
ＩＩＩ．測定結果
１．図の説明
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果とを比較する図を、図２として示した。
この図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのラテックス比濁法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ当量」である。
２．健常人の試料の比較
前記Ｉの本発明による総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩのラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を、次のようにして行った。
試料が健常人２１１名の血漿である場合について、前記Ｉの総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩの総プロテインＳのタンパク質量の測定結果より、プロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）を求めた。
この健常人２１１名の血漿試料のプロテインＳの比活性の平均値と標準偏差（以下、ＳＤということがある）を算出し、平均±２ＳＤ（０．９８±０．２６）の範囲を求めた。
この範囲を外れる試料が１０あったので、この１０の試料を除外した健常人２０１名の試料について、再度、総プロテインＳの活性値の測定結果と、総プロテインＳのタンパク質量の測定結果より求めたプロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）の平均値と標準偏差を算出し、平均±２ＳＤ（０．９９±０．２０）の範囲と平均±３ＳＤ（０．９９±０．３０）の範囲を求めた。
なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。
この図において、比活性の平均値であるｙ＝０．９９ｘの式の線を実線で表した。
また、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上及び下に、平均±２ＳＤを示す線（ｙ＝１．１９ｘ、及びｙ＝０．７９ｘ）を破線でこの図に表した。
そして、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上に平均＋３ＳＤを示す線（ｙ＝１．２９ｘ）を点線で、またこの式ｙ＝０．９９ｘの線の下に平均−３ＳＤを示す線（ｙ＝０．６９ｘ）を実線でこの図に表した。
健常人２１１名の血漿の試料の測定結果において、この図２で、前記のｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れるものが、７つ認められた。
すなわち、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下の試料が、７つ認められた。
これらの比活性が０．６９以下の７つの試料のうち、すなわち総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離している７つの試料のうち、同意が得られた３つの試料についてプロテインＳ遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの３つの試料のいずれもプロテインＳ遺伝子のＰＳ−Ｋ１５５Ｅ変異（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明した。〔図２において、これらの３つの試料に矢印（↓又は↑）を付した。〕
このことより、試料中の総プロテインＳの活性値及び試料中の総プロテインＳのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。
３．プロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料の比較
前記Ｉの２の（２）〜（４）のプロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料（計９名の試料）のそれぞれについて、前記Ｉの本発明による総プロテインＳの活性値の測定結果と、前記ＩＩのラテックス比濁法による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果との比較を行う。
図２において、前記Ｉの２の（２）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している７名の血漿の試料を「●」で示した。
また、前記Ｉの２の（３）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「◆」で示した。
そして、前記Ｉの２の（４）のプロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「□」で示した。
プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、前記の図２におけるｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れていることが分かる。
すなわち、プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下であることが分かる。
つまり、これらの９つの試料は、総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。
よって、試料中の総プロテインＳの活性値及び試料中の総プロテインＳのタンパク質量を測定し、この測定により得た総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインＳの遺伝子変異の９つの試料の比較結果からも確かめられた。The present invention will be further described below with reference to examples. In addition, this invention is not limited by these.
[Example 1] (Method for measuring activity of total protein S in the sample of the present invention and reagent 1 for measuring activity)
The effect of the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent was confirmed.
1. Total protein S activity measurement reagent
(1) First reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 7.5 (20 ° C.) to prepare the first reagent.
Activated blood coagulation factor X (purified bovine activated blood coagulation factor X; New England Biolabs, Inc, USA) 100 pM
Phospholipid
Calcium chloride 10.0 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.15M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
The phospholipids were phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.6 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Secondary Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, 1.0 mg of ethanolamine (porcine liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) was collected in a test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added for 1 minute. Phosphatidylserine prepared by vigorous stirring and sonication at 60 ° C. for 10 minutes Phospholipids having a composition ratio of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine of 3: 2: 5 (ie, 30% (W / V): 20% (W / V): 50% (W / V)) and a concentration of 15 μM It was made to contain. [The phospholipid having a composition ratio of phosphatidylserine, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine of 3: 2: 5 may be referred to as “phospholipid (PS: PC: PE = 3: 2: 5)” hereinafter. ]
(2) Second reagent
The following components were dissolved in pure water so that each concentration was as described, and the pH was adjusted to pH 7.5 (20 ° C.) to prepare a second reagent.
Prothrombin (purified human prothrombin; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) 1.5 μM
Test Team (registered trademark) Chromogenic Substrate S-2238 (Thrombin Substrate [Thrombin Chromogenic Substrate]; Manufacturer: Chromogenix-Instrumentation Laboratories [Italy], Distributor: Sekisui Medical [Japan]] 1.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.15M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
(3) Third reagent-a
The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-a.
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
Phospholipids include 0.5 mg of phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSSAN Serial Research Laboratories, Korea) and 0.5 mg of phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Secondary Research Laboratories, Korea). The composition of phosphatidylserine and phosphatidylcholine prepared by evaporating chloroform as a solvent with an evaporator, adding distilled water and stirring vigorously for 1 minute, and then sonicating at 60 ° C. for 10 minutes. Phospholipids with a ratio of 1: 1 (ie 50% (W / V): 50% (W / V)) were included to a concentration of 20 μM. [The phospholipid having a composition ratio of phosphatidylserine and phosphatidylcholine of 1: 1 may be hereinafter referred to as “phospholipid (PS: PC = 1: 1)”. ]
(4) Third reagent-b
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-b.
Surfactant
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
The surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) to a concentration of 0.006% (W / V).
The phospholipid contained the phospholipid (PS: PC = 1: 1) to a concentration of 20 μM.
(5) Third reagent-c
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-c.
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
Phospholipids include 0.4 mg of phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea), 0.4 mg of phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea), 0.4 mg of phosphatidylserine. 0.4 mg of ethanolamine (porcine liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) was collected in a test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added for 1 minute. Phosphatidylserine prepared by vigorous stirring and sonication at 60 ° C. for 10 minutes Phospholipids with a composition ratio of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine of 1: 1: 1 (ie, 33.33% (W / V): 33.33% (W / V): 33.33% (W / V))) In a concentration of 24 μM. [The phospholipid having a 1: 1: 1 composition ratio of phosphatidylserine, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine may be hereinafter referred to as “phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1)”. ]
(6) Third reagent-d
The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-d.
Surfactant
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
The surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) to a concentration of 0.006% (W / V).
Moreover, the phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1) was contained so that it might become a density | concentration of 24 micromol.
(7) Fourth reagent
The following components were dissolved in pure water so that each concentration was as described, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare a fourth reagent.
Activated protein C (purified human activated protein C; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) 16.5 nM
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
(8) Fifth reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare a fifth reagent.
Activated blood coagulation factor V (purified human activated blood coagulation factor V; Haematologic Technologies, Inc., USA) 6.0 nM
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
2. sample
The following (1) and (2) were used as samples.
(1) Sample having a total protein S activity value of 10 μg / mL equivalent prepared by mixing purified free protein S and purified free C4b-binding protein at a 1: 1 (molar ratio)
(2) Sample having a total protein S activity value of 20 μg / mL equivalent prepared by mixing purified free protein S and purified free C4b-binding protein at 1: 1 (molar ratio)
3. Measurement of total protein S activity in samples
The activity value of total protein S of each sample was measured as follows.
(1) About each of said 2 samples, 0.5 microliters and 193.5 microliters of said 3rd reagent-a of said (3) were mixed.
(2) Next, 4 μL of the fourth reagent (1) of (1) was added and mixed with this, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
(3) Next, 2 μL of the fifth reagent of (1) above was added and mixed therewith, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
(4) Next, 180 μL of this was collected, and 180 μL of the first reagent of (1) above and 180 μL of the second reagent of (1) (1) were placed and incubated at 37 ° C. And mixed at 37 ° C. and incubated.
(5) After the addition and mixing in (4), the change in absorbance at a wavelength of 405 nm was measured.
(6) It should be noted that in (1) above, (1) to (1) to (3) except that the third reagent-b of (1) (4) is used instead of the third reagent-a of (1) (3) The operation was performed as in (5), and the change in absorbance at a wavelength of 405 nm when the third reagent-b was used was measured.
(7) Further, in the above (1), except that the third reagent-c of (1) (5) is used instead of the third reagent-a of (1) of (1), The operation was performed as in (5), and the change in absorbance at a wavelength of 405 nm when the third reagent-c was used was measured.
(8) Then, in (1) above, except that the third reagent-d of (1) (6) is used instead of the third reagent-a of (1) above (3), The operation was performed as in (5), and the change in absorbance at a wavelength of 405 nm when the third reagent-d was used was measured.
4). Calculation of total protein S activity in the sample
The value of the change in absorbance (reaction time course) at a wavelength of 405 nm measured in 3 was differentiated to determine the activity value of total protein S in the sample.
In addition, a sample with a known total protein S activity value was measured in advance as described above, and the amount of change in absorbance per minute of the change in absorbance (reaction time course) at a wavelength of 405 nm was measured with respect to time. A linear equation (differential line) was obtained, and a calibration curve was prepared by plotting the slope of this line against this known total protein S activity value.
Then, the amount of change in absorbance per minute of the change in absorbance at the wavelength of 405 nm (reaction time course) obtained by measuring the above-mentioned 2 samples as described in 3 above is a linear expression (differential line) with respect to time. The slope of this straight line was applied to the calibration curve, and the activity value of total protein S in the sample was calculated.
That is, the acceleration of change in absorbance (second derivative of absorbance) was obtained from the absorbance obtained by measurement, and applied to a calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample.
In the specification and drawings of this patent application, the total protein S activity value of 1 μg / mL of purified human protein S (Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) is expressed as the total protein S activity value of 1 μg / mL equivalent. Defined.
Therefore, in the specification and drawings of this patent application, the activity of total protein S is expressed using “μg / mL equivalent”.
5. Measurement result
The results obtained by measuring the activity value of total protein S in the sample as described above are shown in Table 1.
In this table, the value expressed as “ratio (%)” indicates the ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value of the sample in percent. It is a thing.
Further, from this table, when the third reagent-b was used, that is, during the activity of the activated protein C by the protein S contained in the sample, and the activation by the protein C having the increased activity. When a surfactant is present and a phospholipid consisting of phosphatidylcholine and phosphatidylserine (1: 1) is present during the degradation reaction of blood coagulation factor V, the ratio [total protein S activity value of the sample] The ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to 65.4% in the sample having a total protein S activity value of 10 μg / mL equivalent, and the total protein S activity value of 20 μg It turns out that it is 62.8% in the sample of / mL equivalent.
Further, from this table, when the third reagent-c is used, that is, during the activity of the activated protein C by the protein S contained in the sample, and the activation by the protein C having the increased activity. In the degradation reaction of blood coagulation factor V, when a surfactant is not present and a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine (1: 1: 1) is present, the ratio [ The ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value of the sample is 50.4% in the sample having a total protein S activity value of 10 μg / mL equivalent, and It can be seen that the total protein S activity value is 50.0% in the sample equivalent to 20 μg / mL.
Further, from this table, when the third reagent-d was used, that is, during the activity of the activated protein C by the protein S contained in the sample, and the activation by the protein C having the increased activity. When a surfactant is present and a phospholipid composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine (1: 1: 1) is present during the degradation reaction of blood coagulation factor V, the above-mentioned ratio [sample The ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value is 78.7% in the sample having a total protein S activity value of 10 μg / mL equivalent, It can be seen that the protein S activity value is 89.1% in the sample of 20 μg / mL equivalent.
From these facts, there is a surfactant in the activation reaction of the activated protein C by the protein S contained in the sample and in the degradation reaction of the activated blood coagulation factor V by the protein C having the increased activity. As a result, it was confirmed that the total protein S activity in the sample can be measured more accurately.
That is, the effects of the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent were confirmed.
In addition, phospholipids present in the activation reaction of activated protein C by protein S contained in the sample and in the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by protein C having increased activity are phosphatidylcholine and phosphatidyl. It was confirmed that the phospholipid consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine can measure the total protein S activity in the sample more accurately than the phospholipid consisting of serine.
[Example 2] (Method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and reagent 2 for measuring activity)
The effect of the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent was confirmed.
1. Total protein S activity measurement reagent
(1) First reagent
As the first reagent, the first reagent (1) of Example 1 described above was used.
(2) Second reagent
As the second reagent, the second reagent (1) of Example 1 described above was used.
(3) Third reagent-1
The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-1.
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
In addition, the phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1) was contained so that it might become a density | concentration of 24 micromol.
(4) Third reagent-2 to third reagent-19
The following components were dissolved in pure water to the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to 8.0 (20 ° C.) to prepare the third reagent-2 to the third reagent-19.
Surfactant
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
In addition, the phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1) was contained so that it might become a density | concentration of 24 micromol.
Further, the surfactants are nonionic surfactants Triton X-100, Triton X-114, NP-10, NP-11, NP-12, NP-13, BT-9 and BT-12, anion Each of the surfactants sarcosinate LN, the cationic surfactant CA-2350, and the amphoteric surfactant AM-301 was contained in each reagent so as to have the concentrations described below.
Third reagent-2: Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0050% (W / V)
Third reagent-3: Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0060% (W / V)
Third Reagent-4: Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0070% (W / V)
Third Reagent-5: Triton X-114 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.0050% (W / V)
Third reagent-6: NP-10 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0025% (W / V)
Third Reagent-7: NP-11 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0025% (W / V)
Third Reagent-8: NP-11 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0050% (W / V)
Third Reagent-9: NP-12 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0025% (W / V)
Third Reagent-10: NP-13 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0050% (W / V)
Third Reagent-11: BT-9 (Nikko Chemicals, Japan) 0.003% (W / V)
Third reagent-12: BT-9 (Nikko Chemicals, Japan) 0.006% (W / V)
Third Reagent-13: BT-12 (Nikko Chemicals, Japan) 0.006% (W / V)
Third reagent-14: Sarcosinate LN (Nikko Chemicals, Japan) 0.006% (W / V)
Third Reagent-15: Sarcosinate LN (Nikko Chemicals, Japan) 0.010% (W / V)
Third Reagent-16: CA-2350 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0001% (W / V)
Third Reagent-17: CA-2350 (Nikko Chemicals, Japan) 0.0003% (W / V)
Third Reagent-18: AM-301 (Nikko Chemicals, Japan) 0.003% (W / V)
Third Reagent-19: AM-301 (Nikko Chemicals, Japan) 0.006% (W / V)
(5) Fourth reagent
As the fourth reagent, the fourth reagent of (7) of Example 1 described above was used.
(6) Fifth reagent
As the fifth reagent, the first reagent (8) of Example 1 was used.
2. sample
Each of the samples of (1) and (2) of Example 1 was used as a sample.
3. Measurement and calculation of the activity value of total protein S in the sample
For each of the two samples, the activity value of total protein S was measured and calculated as described in 3 and 4 of Example 1 to obtain the activity value of total protein S for each sample.
In addition, instead of the third reagent-a in 3 (1) of Example 1, the third reagent-1 in 1 (3) and the third reagent-2 in 1 (4) are used. Up to 3 reagents-19 were used in sequence.
4). Measurement result
The results obtained by measuring the activity value of total protein S in the sample as described above are shown in Table 2.
In this table, the value expressed as “ratio (%)” indicates the ratio of the measured value (total protein S activity value obtained by measuring the sample) to the total protein S activity value of the sample in percent. It is a thing.
Further, from this table, when each of the third reagent-2 to the third reagent-19 was used, that is, during the activity of the activated protein C by the protein S contained in the sample, When a surfactant is present during the degradation reaction of activated blood coagulation factor V by increased protein C, the ratio [measured value relative to the total protein S activity value of the sample (by measuring the sample The ratio of the total protein S activity value) is 62.0% to 88.0% in the sample having a total protein S activity value of 10 μg / mL equivalent, and the sample having a total protein S activity value of 20 μg / mL equivalent It turns out that it is 64.0%-104.3%.
From these facts, there is a surfactant in the activation reaction of the activated protein C by the protein S contained in the sample and in the degradation reaction of the activated blood coagulation factor V by the protein C having the increased activity. As a result, it was confirmed that the total protein S activity in the sample can be measured more accurately.
That is, the effects of the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent were confirmed.
And the effect of this invention was able to be confirmed in all types of surfactant of a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, and an amphoteric surfactant.
[Example 3] (Examination of reproducibility of activity measuring reagent and activity measuring method of total protein S in the sample of the present invention)
The method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the reproducibility of the measurement when measuring the total protein S activity value in the sample using the activity measuring reagent were examined.
1. Total protein S activity measurement reagent
(1) Diluent
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, and the pH was adjusted to 8.0 (20 ° C.) to prepare a diluted solution.
Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.06% (W / V)
Bovine serum albumin (BSA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Trisodium citrate 10.6 mM
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
(2) First reagent
The following components were dissolved in pure water so that each concentration was as described, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare the first reagent.
Activated protein C (purified human activated protein C; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) 397 pM
Surfactant
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
The surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) to a concentration of 0.006% (W / V).
Moreover, the phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1) was contained so that it might become a density | concentration of 24 micromol.
(3) Second reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, and the pH was adjusted to pH 8.0 (20 ° C.) to prepare a second reagent.
Activated blood coagulation factor V (purified human activated blood coagulation factor V; Haematologic Technologies, Inc., USA) 357 pM
Surfactant
Phospholipid
Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
The surfactant contained Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) to a concentration of 0.006% (W / V).
Moreover, the phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1) was contained so that it might become a density | concentration of 24 micromol.
(4) Third reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above, and the pH was adjusted to pH 7.5 (20 ° C.) to prepare a third reagent.
Activated blood coagulation factor X (purified bovine activated blood coagulation factor X; New England Biolabs, Inc, USA) 50 pM
Prothrombin (purified human prothrombin; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) 738 nM
Test Team (registered trademark) chromogenic substrate S-2238 (Thrombin substrate [Thrombin chromogenic substrate]; manufacturer: Chromogenix-Instrumentation Laboratories [Italy], distributor: Sekisui Medical [Japan]) 750 μM
Phospholipid
Calcium chloride 5.0 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.15M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
In addition, the phospholipid was made to contain said phospholipid (PS: PC: PE = 3: 2: 5) so that it might become a density | concentration of 7.5 micromol.
2. sample
Four samples of human plasma were used as samples.
3. Measurement of total protein S activity in samples
The total protein S activity value of each sample was measured using a 7170S type general-purpose automatic analyzer manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation (Japan).
(1) Each of the two samples was diluted with the dilution liquid of (1) in (1) at a dilution ratio of 15 times.
(2) To 2.0 μL of the sample diluted in (1), 98 μL of the first reagent of (1) in (1) above was added and reacted at 37 ° C. for 1.4 minutes.
(3) Next, 20 μL of the second reagent of (1) above was added and reacted at 37 ° C. for 8.3 minutes.
(4) Next, 236 μL of the third reagent of (1) above was added and reacted at 37 ° C.
(5) After the addition of the third reagent in (4), the change in absorbance at the main wavelength of 405 nm and the sub wavelength of 505 nm was measured for 12.3 minutes.
(6) The above operations (1) to (5) were repeated a total of 5 times to examine simultaneous reproducibility.
(7) In addition, the operations of (1) to (5) were performed on each of three consecutive days, and the daily difference reproducibility was examined.
4). Calculation of total protein S activity in the sample
The activity change value of total protein S in the sample was determined by differentiating the absorbance change (reaction time course) after addition of the third reagent measured in (3) above.
In addition, a sample with a known total protein S activity value is measured in advance as described above, and the amount of change in absorbance per minute of the change in absorbance (reaction time course) after addition of the measured third reagent is measured as time. On the other hand, a linear equation (differential line) was obtained, and a calibration curve was prepared by plotting the slope of this straight line against this known total protein S activity value.
Then, the absorbance change amount per minute of the absorbance change (reaction time course) after the addition of the third reagent, obtained by measuring the sample of 2 as described in 3 above, is expressed linearly (differentiated) with respect to time. A straight line) was obtained, and the slope of this straight line was applied to the calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample.
That is, the acceleration of the change in absorbance (second derivative of absorbance) was obtained from the absorbance obtained by measurement, and applied to a calibration curve, thereby calculating the activity value of total protein S in the sample.
5. Measurement result
The results obtained by measuring the activity value of total protein S in the sample as described above are shown in Table 3.
In this table, both of the data of simultaneous reproducibility and the data of daily reproducibility show “average ± standard deviation (SD)” and “coefficient of variation (CV)” for each sample.
In addition, the coefficient of variation (CV) in the daily difference reproducibility is in the range of 2.8% to 5.6%, and even if the measurement day is different, the variation in the measured value is small and the measurement is accurate. I understand that I can do it.
From these facts, it was confirmed that the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity of the total protein S in the sample of the present invention have good reproducibility of measurement and can be measured accurately.
[Example 4] (Method for measuring the amount of protein of total protein S in a sample by ELISA method and correlation with measurement reagent)
The correlation between the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the total protein S in the sample of the present invention and the method for measuring the amount of protein of the total protein S in the sample by the ELISA method and the measuring reagent were examined.
I. Method for measuring activity of total protein S in a sample of the present invention and measurement using an activity measuring reagent
1. Total protein S activity measurement reagent
(1) Diluent
As the diluting solution, the diluting solution of (1) in Example 3 was used.
(2) First reagent
As the first reagent, the first reagent of (2) of Example 3 was used.
(3) Second reagent
As the second reagent, the second reagent of (3) of Example 3 described above was used.
(4) Third reagent
As the third reagent, the third reagent (1) (4) of Example 3 was used.
2. sample
Plasma of 50 healthy people was used as a sample.
3. Measurement and calculation of the activity value of total protein S in the sample
For each of the two samples, the activity value of total protein S was measured and calculated as described in 3 and 4 of Example 3 above, and the activity value of total protein S of each sample was obtained.
The results obtained by measuring the activity value of total protein S in this sample are shown in FIG.
II. Method for measuring the amount of total protein S in a sample by ELISA and measurement with a measuring reagent
1. Reagent for measuring protein amount of total protein S by ELISA
As a reagent for measuring the amount of protein of total protein S by ELISA, commercially available “Acerachrome Total Protein S TMB” (manufacturer: DIAGNOSTICA STAGO, France; manufacturer / distributor: Roche Diagnostics, Japan) ) Was used.
This “Acerachrome Total Protein S TMB” is composed of the following:
(A) Antibody-coated strip (anti-total protein S mouse monoclonal antibody)
(B) Antibody conjugate (peroxidase-labeled anti-total protein S mouse monoclonal antibody)
(C) Substrate solution (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine and 30% aqueous hydrogen peroxide)
(D) Dilution buffer
(E) Cleaning liquid
(F) Standard (Total Protein S / Calibrator)
(G) Control (Total Protein S / Control)
(H) Plate frame
(I) Plate cover
2. sample
The sample in I-2 above (plasma of 50 healthy people) was used as a sample.
3. Measurement and calculation of total protein S in the sample
In accordance with the description in the package insert of “Acerachrome Total Protein S TMB”, the amount of protein of total protein S in the sample was measured and calculated.
The operation method in “Acerachrome Total Protein S TMB” is as follows.
(A) A sample (citrate plasma) is diluted 101 times with a dilution buffer to prepare a sample.
(B) A standard prepared by diluting 101 times with a dilution buffer is diluted stepwise to prepare a dilution series.
(C) Dispense 50 μL of antibody conjugate into each well of the antibody-coated strip.
(D) Each sample or 200 μL of diluted standard is dispensed and incubated at 18-25 ° C. for 1 hour.
(E) Aspirate the contents of each well and wash 5 times with the washing solution.
(F) After removing the washing solution by suction, 200 μL of the substrate solution is dispensed into each well and incubated at 18 to 25 ° C. for 5 minutes.
(G) Dispense 50 μL of 1M sulfuric acid and gently shake the plate to mix the contents. After standing for 15 minutes, the absorbance at a wavelength of 450 nm is measured within 1 hour.
(H) Compare the absorbance of the standard with the absorbance of the sample to determine the total protein S concentration in the sample.
Thus, the protein amount of the total protein S of each sample of 2 was obtained.
The results obtained by measuring the amount of total protein S in this sample are shown in FIG.
III. Measurement result
The measurement result of the activity value of the total protein S in the sample in the above I and the measurement result of the protein amount of the total protein S in the sample in the above II are shown in FIG.
In this figure, the horizontal axis (x) represents the measurement result of the amount of total protein S in the sample by the ELISA method of II. The unit of this measured value is “μg / mL”.
In this figure, the vertical axis (y) represents the measurement result of the activity value of total protein S in the sample by the activity measurement method and activity measurement reagent of the present invention in I above. The unit of this measured value is “μg / mL equivalent”.
As a result of obtaining the regression equation of this correlation, the regression equation was y = 0.959x−0.860, and the correlation coefficient was r = 0.93. (X: measurement result of protein amount of total protein S by ELISA method of II, y: measurement result of activity value of total protein S according to the present invention of I)
From this figure and the regression equation of correlation, the activity value of the total protein S activity measurement method and the activity measurement reagent in the sample of the present invention show a good correlation with the protein amount of total protein S in the sample. I understand.
Thus, by showing a good correlation with the measurement value of the protein amount of total protein S, the activity value obtained by the method for measuring the activity of total protein S and the reagent for measuring the activity in the sample of the present invention is accurate. I understand that there is. That is, the activity of total protein S in the sample can be accurately measured.
And since it shows a good correlation with the measured value of the protein amount of total protein S in this way, the activity measuring reagent and activity measuring method for total protein S in the sample of the present invention are all present in the sample. The activity of protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type)], ie, the activity of total protein S can be measured. I understand.
That is, by showing a good correlation with the measurement value of the protein amount of total protein S in this way, the reagent and method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention are “free protein S (free protein S In addition to the activity of “type”, the activity expressed when protein S contained in “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)” becomes free protein S (free type) is also combined It can be seen that it can be measured.
That is, by showing a good correlation with the measurement value of the protein amount of total protein S in this way, the reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention can be applied to all the samples present in the sample. For protein S [complex of protein S and C4b binding protein (binding type) and free protein S (free type)], an activity value of protein S corresponding to the protein amount can be obtained. I understand.
From these facts, it was confirmed that the reagent and method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention can accurately measure the activity of total protein S in the sample.
[Example 5] (Comparison of activity value of total protein S and protein amount of total protein S)
The activity value of total protein S obtained by the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention and the activity measuring reagent, and the method for measuring the amount of protein of the total protein S in the sample by latex nephelometry and the measuring reagent The total protein S was compared with the amount of protein.
I. Method for measuring activity of total protein S in a sample of the present invention and measurement using an activity measuring reagent
1. Total protein S activity measurement reagent
(1) Diluent
As the diluting solution, the diluting solution of (1) in Example 3 was used.
(2) First reagent
As the first reagent, the first reagent of (2) of Example 3 was used.
(3) Second reagent
As the second reagent, the second reagent of (3) of Example 3 described above was used.
(4) Third reagent
As the third reagent, the third reagent (1) (4) of Example 3 was used.
2. sample
The following (1) to (4) were used as samples, respectively.
(1) Plasma of 211 healthy people
(2) Plasma of 7 patients who have been found to be PS-K155E heterozygote (protein S Tokushima, which is one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S
(3) One plasma known to be PS-K155E homozygote (protein S Tokushima, which is one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S
(4) One plasma known to be a C206F heterozygote (a protein S abnormality) that is a protein S gene mutation
3. Measurement and calculation of the activity value of total protein S in the sample
For each of the two samples, the activity value of total protein S was measured and calculated as described in 3 and 4 of Example 3 above, and the activity value of total protein S of each sample was obtained.
The results obtained by measuring the activity value of total protein S in this sample are shown in FIG.
II. Method for measuring the amount of total protein S in a sample by latex turbidimetry and measurement with a measuring reagent
1. Reagent for measuring activity of total protein S by latex nephelometry
(1) First reagent
C4b binding protein was obtained from B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 847-856, 1983].
Next, a 50 mM MES-hydrochloric acid buffer solution (pH 6.2 (20 ° C.)) containing 0.1% (W / V) BSA, 0.3 mol / L sodium chloride and 0.05% sodium azide was prepared. .
Here, the C4b binding protein prepared as described above was added to a concentration of 25 μg / mL, and used as the first reagent.
(2) Second reagent
(A) Preparation of anti-protein S antibody
The present inventors prepared anti-protein S antibody according to a conventional method using purified free protein S as an immunizing antigen.
A hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to a site other than the binding site of protein S to the C4b binding protein was screened to obtain a mouse / mouse hybridoma (strain 9H6).
5 mg of mouse anti-protein S monoclonal antibody produced from this hybridoma (9H6 strain) was dissolved in 0.5 mL of sodium phosphate buffer (pH 7.5).
To this, 0.01 mL of N, N-dimethylformamide in which 0.6 mg of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was dissolved was added and incubated at room temperature for 30 minutes.
Next, 0.02 mL of 0.1 M EDTA aqueous solution, 0.1 mL of 1 M tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.0), and 0 of 1 M hydroxylamine hydrochloride buffer (pH 7.0) were added thereto. Each 1 mL was added and incubated at 30 ° C. for 30 minutes.
Thereafter, this was subjected to gel filtration with a Sephadex G-25 column, which had been equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA, and mercapto-succinylated mouse anti-protein S. A monoclonal antibody was obtained.
(B) Preparation of anti-protein S antibody-immobilized latex particle suspension
1.0 mL of a 10% suspension of latex particles having an average particle size of 0.192 μm and 1.0 mL of 50 mM MES-hydrochloric acid buffer (pH 6.0 (20 ° C.)) are mixed, and further 320 mM carbodiimide (Dojindo Laboratories) Product number: 348-03631) 32 μL of an aqueous solution was added and mixed, and allowed to stand on ice for 10 minutes.
To 1.2 mL of the latex particle suspension that was allowed to stand on ice for 10 minutes, the mercapto-succinylated mouse anti-protein S monoclonal antibody prepared in (a) above was added at a concentration of 0.083 g / dL in 50 mM MES-HCl buffer. The liquid [pH 6.0 (20 degreeC)] 1.8mL mixed liquid was added, and it stirred at 4 degreeC overnight.
Next, after removing the supernatant by centrifugation, the precipitate was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0 (20 ° C.)) containing 0.8% BSA and left at 37 ° C. for 3 hours. The blocking process was performed.
Next, after collecting the precipitate by centrifugation, it was redispersed with a 0.05% sodium azide aqueous solution containing 0.1% BSA and suspended so that the absorbance at a wavelength of 700 nm was 15.0 OD. .
This was designated as an anti-protein S antibody-immobilized latex particle suspension.
(C) Preparation of second reagent
The anti-protein S antibody-immobilized latex particle suspension prepared in (b) above was diluted 10-fold with a 0.05% aqueous sodium azide solution containing 0.1% BSA to obtain 0.1% “anti-protein S”. A suspension containing “antibody-immobilized latex particles” was prepared.
This was used as the second reagent.
2. sample
Each of the samples I (2) (1) to (4) was used as a sample.
3. Measurement and calculation of total protein S in the sample
(1) Measurement procedure
(A) Measurement was performed using a Toshiba-120FR automatic analyzer (manufactured by Toshiba Medical Systems).
First, 3 μL of the sample 2 was added to a measurement cell (cuvette).
Next, 100 μL of the first reagent (1) was added to these measurement cells (cuvettes) and mixed.
These measurement cells (cuvettes) were allowed to stand at 37 ° C.
Thereby, the complex of the free protein S contained in the sample and the C4b binding protein in the first reagent was formed. That is, all the protein S contained in the sample became a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)”.
(B) At 4 minutes and 40 seconds (16th point) after the addition of the first reagent, the liquid mixture in these measurement cells (cuvette) is further added to the above (1) (2) (c). 100 μL of the second reagent was added and mixed.
(C) At 5 minutes and 35 seconds (19th point) after the addition of the first reagent, the absorbance (wavelength 700 nm) of the mixed solution in these measurement cells (cuvettes) was measured as a sample blind test.
These measurement cells (cuvettes) were allowed to stand at 37 ° C. for reaction.
As a result, an antigen-antibody reaction between the anti-protein S antibody immobilized on the latex particles and the protein S contained in the sample was performed to generate latex particle aggregates.
(D) At 9 minutes and 47 seconds (33 points) after the addition of the first reagent, the absorbance (wavelength 700 nm) of the reaction mixture in the measurement cell (cuvette) is measured as the measurement value of the sample. did.
(E) The absorbance (sample blind) measured in (c) was subtracted from the absorbance (measured value) measured in (d) to obtain an absorbance difference.
This difference in absorbance is proportional to the total protein S protein amount (concentration) contained in the sample.
A calibration curve was created from the absorbance difference of these samples, and the absorbance difference when the actual sample (3.2% citrate plasma) was measured by the same method was applied to the calibration curve to obtain the total protein S protein concentration in the sample. Asked.
Thus, the protein amount of the total protein S of each sample of 2 was obtained.
The results obtained by measuring the amount of total protein S in this sample are shown in FIG.
III. Measurement result
1. Description of figure
FIG. 2 is a diagram comparing the measurement result of the activity value of total protein S in the sample in I with the measurement result of the protein amount of total protein S in the sample in II.
In this figure, the horizontal axis (x) represents the measurement result of the protein amount of total protein S in the sample by the latex turbidimetric method of II. The unit of this measured value is “μg / mL”.
In this figure, the vertical axis (y) represents the measurement result of the activity value of total protein S in the sample by the activity measurement method and activity measurement reagent of the present invention in I above. The unit of this measured value is “μg / mL equivalent”.
2. Comparison of healthy subjects
The measurement result of the activity value of the total protein S according to the present invention of I and the measurement result of the protein amount of the total protein S by the latex turbidimetry method of II were compared as follows.
When the sample is the plasma of 211 healthy individuals, the specific activity of protein S (total protein S) was determined from the measurement result of the activity value of total protein S of I and the measurement result of the amount of protein of total protein S of II. Activity value / total protein S protein amount) was determined.
The average value and standard deviation (hereinafter sometimes referred to as SD) of the protein S specific activity of the plasma samples of 211 healthy individuals were calculated, and the average ± 2SD (0.98 ± 0.26) range was determined. .
Since there were 10 samples out of this range, 201 samples of healthy persons excluding these 10 samples were obtained again from the measurement result of the activity value of total protein S and the measurement result of the protein amount of total protein S. The average value and standard deviation of the specific activity of protein S (total protein S activity value / total protein S protein amount) were calculated, and the range of mean ± 2SD (0.99 ± 0.20) and mean ± 3SD (0. 99 ± 0.30).
In addition, this figure also represents the specific activity which divided | segmented the activity value of the total protein S in a sample by the protein amount of the total protein S about each sample.
In this figure, the line of the equation y = 0.99x, which is the average value of specific activity, is represented by a solid line.
In addition, above and below the line of the equation y = 0.99x, lines (y = 1.19x and y = 0.79x) indicating the mean ± 2SD are represented by broken lines in this figure.
A line indicating the average + 3SD (y = 1.29x) is a dotted line on the line of the equation y = 0.99x, and a line indicating the average −3SD is below the line of the equation y = 0.99x ( y = 0.69x) is represented in this figure by a solid line.
In the measurement results of the plasma samples of 211 healthy people, seven cases were found in this FIG. 2 that fall below the y = 0.69x (average-3SD) line.
That is, seven samples having a specific activity of 0.69 or less obtained by dividing the activity value of total protein S by the protein amount of total protein S were observed.
Of these seven samples with a specific activity of 0.69 or less, that is, among the seven samples in which the activity value of total protein S and the protein amount of total protein S are significantly different, three samples for which consent was obtained When the nucleotide sequence of the protein S gene was examined, it was found that all of these three samples were PS-K155E mutations (one of protein S abnormalities) of the protein S gene. [In FIG. 2, arrows (↓ or ↑) are attached to these three samples. ]
Based on this, the activity value of total protein S in the sample and the protein amount of total protein S in the sample were measured, and the activity value of total protein S and the protein amount of total protein S obtained by this measurement were determined as specific activity. It was confirmed that abnormalities of protein S such as mutations in the protein S gene can be detected by comparing the values obtained by, for example.
3. Comparison of samples that have been found to be protein S gene mutations (protein S abnormalities)
For each of the samples (total of 9 samples) that have been found to be genetic mutations (protein S abnormalities) of protein S of (2) to (4) of I above, the present invention of I above The measurement result of the activity value of total protein S according to II is compared with the measurement result of the protein amount of total protein S by the latex turbidimetric method of II.
In FIG. 2, seven plasma samples that have been found to be PS-K155E heterozygotes (one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S in 2 (2) of I above Is indicated by “●”.
In addition, a plasma sample of one person who has been found to be a PS-K155E homozygote (one of protein S abnormalities), which is a protein S gene mutation of 2 (3) of I above, is referred to as “ ◆ ".
Then, one of the plasma samples known to be a C206F heterozygote (one of protein S abnormalities), which is a protein S gene mutation of I-2 (4) above, is indicated by “□”. It showed in.
All of these nine samples (●, ◆, and □) that have been found to be protein S gene mutations are below the line of y = 0.69x (average −3 SD) in FIG. You can see that it is off.
That is, all of these nine samples (●, ◆, and □) that have been found to be protein S gene mutations have specific activities obtained by dividing the activity value of total protein S by the amount of protein of total protein S. It turns out that it is 0.69 or less.
That is, it can be seen that these nine samples have a large difference between the activity value of total protein S and the protein amount of total protein S.
Therefore, the activity value of total protein S in the sample and the protein amount of total protein S in the sample are measured, and the specific activity is obtained from the activity value of total protein S and the protein amount of total protein S obtained by this measurement. It was also confirmed from the comparison results of nine samples of these protein S gene mutations that protein S abnormalities such as protein S gene mutations can be detected by comparing the above.
本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔Ｃ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてその活性を、すなわち、総プロテインＳの活性を測定することが出来るものである。
よって、本発明により総プロテインＳ活性値を求めた試料について、別途総プロテインＳのタンパク質量を求め、その試料におけるプロテインＳの比活性（活性値／タンパク質量）を算出することにより、プロテインＳの異常症を検出することができる。
すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳの活性測定試薬及び活性測定方法を用いることにより、プロテインＳの異常症を検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。The reagent for measuring the activity and the method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention include all protein S [complex with C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type) present in the sample. ], That is, the activity of total protein S can be measured.
Therefore, for the sample for which the total protein S activity value was obtained according to the present invention, the protein amount of the total protein S was separately obtained, and the specific activity of protein S (activity value / protein amount) in the sample was calculated. Abnormalities can be detected.
That is, by using the reagent and method for measuring the activity of total protein S in the sample of the present invention, protein S abnormality can be detected and used for the prevention, diagnosis and treatment of diseases such as thrombosis. .
Claims (12)
（ａ） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ） 次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。The measurement of the total protein S activity in a sample is performed by the method of including the process of following (a)-(c), The sample in any one of Claims 1-4 Method for measuring the activity of total protein S.
(A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
(B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
(C) Next, the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
（ａ） 試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ） 次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ） 次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ） 次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。The measurement of the total protein S activity in a sample is performed by the method including the process of following (a)-(e), The sample in any one of Claims 1-5 Method for measuring the activity of total protein S.
(A) By contacting the sample with at least activated protein C, surfactant, phospholipid, and calcium ions, the activity of activated protein C increases when protein S is contained in the sample.
(B) Next, the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V catalyzed by activated protein C in the presence of the component (a) and activated blood coagulation factor V is activated in the above (a). It is promoted by the increased activity of protein C.
(C) Next, the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ions, promoted by activated blood coagulation factor V, The production of thrombin is reduced by inhibiting the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V in the above.
(D) Next, the reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed by reducing the generation of thrombin in (c).
(E) Next, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained by measuring the amount of signal whose production was suppressed by the suppression of the reaction in (d).
（ａ） 活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質、カルシウムイオン、活性化血液凝固第Ｖ因子、活性化血液凝固第Ｘ因子、プロトロンビン及びトロンビンの基質を試料と接触させる。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の各成分による反応の結果トロンビンの基質から生成されるシグナル量を測定する。
（ｃ） 次に、この試料に含まれる総プロテインＳの活性に応じて生成が抑制されたシグナル量より、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。The total protein S in the sample according to any one of claims 7 to 10, which is for measurement of total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (c): Activity measuring reagent.
(A) Contact activated protein C, surfactant, phospholipid, calcium ion, activated blood coagulation factor V, activated blood coagulation factor X, prothrombin and thrombin substrate with the sample.
(B) Next, the amount of signal generated from the substrate of thrombin as a result of the reaction by each component of (a) is measured.
(C) Next, the activity value of the total protein S contained in the sample is obtained from the signal amount whose production is suppressed according to the activity of the total protein S contained in the sample.
（ａ） 試料と、少なくとも活性化プロテインＣ、界面活性剤、リン脂質及びカルシウムイオンを接触させることにより、試料にプロテインＳが含まれる場合には活性化プロテインＣが活性上昇する。
（ｂ） 次に、前記（ａ）の成分及び活性化血液凝固第Ｖ因子の存在下、活性化プロテインＣが触媒する活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が、前記（ａ）における活性化プロテインＣの活性上昇により、促進される。
（ｃ） 次に、活性化血液凝固第Ｖ因子により促進される、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下に活性化血液凝固第Ｘ因子が触媒するプロトロンビンよりトロンビンを生成させる反応が、前記（ｂ）における活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応が促進されることにより抑制されて、トロンビンの生成が低減される。
（ｄ） 次に、前記（ｃ）におけるトロンビンの生成の低減により、トロンビンが触媒するトロンビンの基質からシグナルを生じさせる反応が抑制される。
（ｅ） 次に、前記（ｄ）における反応の抑制により生成が抑制されたシグナル量を測定することにより、試料中に含まれていた総プロテインＳの活性値を得る。The total protein S in the sample according to any one of claims 7 to 11, which is for measurement of total protein S activity in the sample including the following steps (a) to (e): Activity measuring reagent.
(A) By contacting the sample with at least activated protein C, surfactant, phospholipid, and calcium ions, the activity of activated protein C increases when protein S is contained in the sample.
(B) Next, the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V catalyzed by activated protein C in the presence of the component (a) and activated blood coagulation factor V is activated in the above (a). It is promoted by the increased activity of protein C.
(C) Next, the reaction of generating thrombin from prothrombin catalyzed by activated blood coagulation factor X in the presence of phospholipid and calcium ions, promoted by activated blood coagulation factor V, The production of thrombin is reduced by inhibiting the decomposition reaction of activated blood coagulation factor V in the above.
(D) Next, the reaction that generates a signal from the substrate of thrombin catalyzed by thrombin is suppressed by reducing the generation of thrombin in (c).
(E) Next, the activity value of total protein S contained in the sample is obtained by measuring the amount of signal whose production was suppressed by the suppression of the reaction in (d).
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