JPWO2012090909A1 - 脂溶性の測定方法 - Google Patents

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Abstract

本発明の課題は、幅広い物質の脂溶性を迅速かつ正確に測定する方法を提供することである。疎水性溶媒と親水性溶媒の比を変えた複数の溶媒を用いて脂溶性を測定することにより、幅広い範囲の物質の脂溶性を正確かつ迅速に測定できる。

Description

本発明は、薬物の脂溶性を測定する技術に関する。特に本発明は、ハイスループットな薬物の脂溶性の測定技術に関する。
近年、コンビナトリアルケミストリーや誘導体合成の効率化によって膨大な数の化合物を短時間で合成することが可能になっている。それにつれて、探索段階における膨大な数の試験化合物についてその物性を迅速かつ正確に評価し、薬剤候補化合物を戦略的に選定することが、迅速かつ効率的な新薬開発を実現する上で極めて重要になっている。薬理活性の増大のみに着目して化合物を探索すると化合物の溶解度が低くなることがあるが、医薬品として実際に機能するためにはある程度の経口吸収性が必要であり、脂溶性を始めとする薬として具備すべき特性（druglikeness）を開発の早い段階から正確に把握し、戦略的に創薬を進めることが重要である。
化合物の物性の中でも脂溶性は、経口吸収性、膜透過性、溶解度、分布容積、代謝安定性などに影響する重要な分子特性である。脂溶性を示すパラメータとしては、ｌｏｇＰ（partition coefficient）やｌｏｇＤ（distribution coefficient）などの分配係数が広く用いられており、その実測法としてはフラスコ振盪法が一般的である。フラスコ振盪法は、被験物質と２種類の溶媒をフラスコに入れて振盪してから、有機相と水相に含まれる被験物質の量を定量して分配係数を求める方法であり、オクタノール／水の分配係数の測定法はＪＩＳ規格などにも定められている（JIS Z7260-107、OECD Test Guideline 107）。一方、より簡便な系として，ＨＰＬＣ法が存在する。ＨＰＬＣ法は、逆相クロマトグラフィーの保持時間と分配係数との間に相関があることを利用して被験物質の分配係数を間接的に測定する方法であり、分配係数が既知の物質で保持時間と分配係数の相関関係をあらかじめ調べておき、その相関関係を利用して被験物質の分配係数を決定する。
しかし、フラスコ振盪法は、脂溶性を正確に評価できるものの、操作が煩雑であり、多検体処理には適さない。また、ＨＰＬＣ法は、フラスコ振盪法に比べて多検体処理が可能であるが、水への溶解度が低い化合物やカラム担体と反応してしまう化合物には適用できず、また、分配係数が既知の物質と被験物質の化学構造が大きく異なる場合には分配係数を正確に測定することができない。
そこで、脂溶性を実際に測定せずに、計算により算出する技術が開発されている。計算によって求められた分配係数はＣｌｏｇＰなどと表記され、近年、その精度が向上しつつあるが、フラスコ振盪法で実測した分配係数と乖離することも多く、計算により脂溶性を推定する技術の精度は十分とはいえない。
被験物質の脂溶性を迅速かつ大量に実測する方法として、特許文献１、非特許文献１、２などには、マルチウェルプレートを用いて脂溶性を測定する方法が提案されている。また、非特許文献３には、有機相に含まれる被験物質と水相に含まれる被験物質について、有機相のみ、水相のみ、両相ともの３種を定量することによって脂溶性を測定し、いずれかの値を採用する方法が記載されている。
特開２００６−２６７１０５号公報
Yun W. Alelyunas et al., Journal of Chromatography A, 1217 (2010), 1950-1955 Y. Dohta et al., Analytical Chemistry, vol. 79, no. 21, 8312-8315, 2007 溝口亮他「23-P8 High Throughput LogD 測定システムの構築」（日本薬剤学会第２４年会ポスターセッション資料、２００９年５月２３日）
上述したように、フラスコ振盪法は、脂溶性を比較的正確に評価できるものの、操作が煩雑で、サンプルを分配させた後、層分離操作により２相を別々に取り出してＨＰＬＣなどで定量するといった多段階のマニュアル操作が必要となるため、測定に時間がかかり、多検体同時処理には適さない。
このような状況の中、上記文献に記載されているように、溶媒の量を少なくし、９６ウェルなどのマルチウェルプレートを利用して工程を自動化することによって、フラスコ振盪法による脂溶性の測定をハイスループットで行うことが提案されている。しかしながら、溶媒の量を少なくすると脂溶性の測定精度が低下しやすく、ｌｏｇＤが１未満の低脂溶性物質やｌｏｇＤが３を超えるような高脂溶性物質についてはハイスループットな脂溶性測定が困難であった。
このような状況に鑑み、本発明は、幅広い物質の脂溶性を迅速かつ正確に測定する方法を提供することを課題とする。
本発明の発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、疎水性溶媒と親水性溶媒の比を変えた２種類以上の溶媒系を用いて脂溶性を測定することにより、被験物質の脂溶性を正確かつ迅速に測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、以下に限定されるものではないが、本発明は以下の発明を包含する。
１． 被験物質の脂溶性を測定する方法であって、（１）疎水性溶媒と親水性溶媒を第１の比率で含んでなる第１の溶媒系に所定量の被験物質を混合する工程と、（２）第１の溶媒系と同じ疎水性溶媒と親水性溶媒を第２の比率で含んでなる第２の溶媒系に所定量の被験物質を混合する工程と、（３）第１の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系の疎水相または親水相に含まれる被験物質を測定する工程と、（４）第２の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系について測定した相とは別の相に含まれる被験物質を測定する工程と、（５）第３および第４の工程で得られた二つの値に基づいて被験物質の脂溶性を算出する工程と、を含む上記方法。
２． 疎水性溶媒と親水性溶媒との第１の比率が５０：５０〜１：９９（容積比）である、上記１に記載の方法。
３． 疎水性溶媒と親水性溶媒との第２の比率が８０：２０〜２０：８０（容積比）である、上記１または２に記載の方法。
４． 疎水性溶媒が１−オクタノールであり、親水性溶媒が緩衝液である、上記１〜３のいずれかに記載の方法。
５． 第１から第５の工程を自動で行う、上記１〜４のいずれかに記載の方法。
６． ｌｏｇＤ測定値が−２〜６の被験物質に用いるための、上記１〜５のいずれかに記載の方法。
７． 以下の式：
（ａ×Ｃ１×Ｄ＋ｂ×Ｃ１）／Ｘ＝（ｃ×Ｃ２＋ｄ×Ｃ２／Ｄ）／Ｙ （式Ｉ）
式中、Ｄ＝分配比、
Ｘ＝第１の溶媒系に添加した被験物質の量
Ｙ＝第２の溶媒系に添加した被験物質の量
Ｃ１＝第１の溶媒系における親水相中の被験物質の濃度
Ｃ２＝第２の溶媒系における疎水相中の被験物質の濃度
ａ＝第１の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
ｂ＝第１の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
ｃ＝第２の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
ｄ＝第２の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
に基づいて被験物質の脂溶性を算出する、上記１〜６のいずれかに記載の方法。
８． 被験物質の脂溶性を測定するための装置であって、疎水性溶媒と親水性溶媒とを第１の比率および第２の比率で容器に分注するための分注機と、被験物質を分注するための分注機と、疎水性溶媒と親水性溶媒とを第１の比率で含む第１の溶媒系から疎水相または親水相をサンプリングし、疎水性溶媒と親水性溶媒とを第２の比率で含む第２の溶媒系から第１の溶媒系でサンプリングした相とは別の相をサンプリングするための分注機と、被験物質を測定するための分析機と、疎水性溶媒と親水性溶媒の比率および被験物質の測定結果から被験物質の脂溶性を算出するため計算機とを含む、上記装置。
９． 以下の式：
（ａ×Ｃ１×Ｄ＋ｂ×Ｃ１）／Ｘ＝（ｃ×Ｃ２＋ｄ×Ｃ２／Ｄ）／Ｙ （式Ｉ）
式中、Ｄ＝分配比、
Ｘ＝第１の溶媒系に添加した被験物質の量
Ｙ＝第２の溶媒系に添加した被験物質の量
Ｃ１＝第１の溶媒系における親水相中の被験物質の濃度
Ｃ２＝第２の溶媒系における疎水相中の被験物質の濃度
ａ＝第１の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
ｂ＝第１の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
ｃ＝第２の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
ｄ＝第２の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
に基づいて被験物質の脂溶性を算出する、上記８に記載の装置。
本発明によれば、物質の脂溶性を迅速かつ正確に測定することができる。
図１は、本発明によって測定したｌｏｇＤ（実施例）と、フラスコ振盪法によって測定したｌｏｇＤ（比較例）とを比較したグラフである。 図２は、市販の１４化合物について、本発明によって測定したｌｏｇＤ（実施例）と、フラスコ振盪法によって測定したｌｏｇＤ（比較例）とを比較したグラフである。
本発明は、被験物質の脂溶性を測定する方法であって、（１）疎水性溶媒と親水性溶媒を第１の比率で含んでなる第１の溶媒系に所定量の被験物質を混合する第１の工程と、（２）疎水性溶媒と親水性溶媒を第２の比率で含んでなる第２の溶媒系に所定量の被験物質を混合する工程と、（３）第１の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系の疎水相または親水相に含まれる被験物質を測定する工程と、（４）第２の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系について測定した相とは別の相に含まれる被験物質を測定する工程と、（５）第３および第４の工程で得られた結果に基づいて被験物質の脂溶性を算出する工程と、を含む。
本発明において、脂溶性を測定する物質は、任意の化学的または生物学的物質であり、例えば、有機化合物、タンパク質、ペプチドまたは核酸であってもよい。本発明によって脂溶性を測定する物質としては、例えば、多環式芳香族または脂肪族炭化水素、ハロゲン含有芳香族または脂肪族炭化水素、窒素および酸素含有芳香族または脂肪族炭化水素、及び脂溶性ビタミンなどが挙げられ、それらの中でも、医薬品の有効成分として許容されうる化合物、特には、低分子化合物が好ましく、分子量が１０００以下の化合物がより好ましく、窒素および酸素含有芳香族または脂肪族炭化水素であって分子量が１０００以下の化合物がさらに好ましい。
脂溶性を測定する物質は、固体または液体であってよく、例えば、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの適当な溶媒に溶解してもよい。本発明によって測定する物質の脂溶性は特に制限されず、本発明によれば、ｌｏｇＤが−１以下のような低脂溶性物質から、ｌｏｇＤが５以上の高脂溶性物質まで測定することができる。特に本発明によれば、ｌｏｇＤが３を超えるような脂溶性の高い物質やｌｏｇＤが１未満の脂溶性の低い物質であっても、正確に脂溶性を測定することができる。本発明方法を使用する場合の被験物質の態様としてはｌｏｇＤが−２〜６の化合物であり、別の態様としては−２〜５の化合物であり、さらに別の態様としては−１〜５の化合物である。
本発明において脂溶性とは物質の疎水性を示すパラメータであり、具体的には、ｌｏｇＤやｌｏｇＰなどの分配係数が挙げられる。一般に、互いに溶解しない親水性溶媒と疎水性溶媒を同じ容器に入れ、それに被験物質を加えると、親水相と疎水相に分配される物質の濃度比は被験物質の量にかかわらず一定となる。すなわち、親水相中の被験物質の濃度をＣｗ、疎水相中の被験物質の濃度をＣｏとすると、両者の比（Ｃｏ／Ｃｗ）は一定となり、その常用対数を分配係数という。ここで、ｌｏｇＰ（partition coefficient）は被験物質の電離を考慮しない分配係数であり、電気的に中性の物質の脂溶性の評価に用いられることが多い。その一方、ｌｏｇＤ（distribution coefficient）は、異なったｐＨ環境における分子の解離による脂溶性の変化を考慮に入れたパラメータであり、特に解離性官能基を有する物質の場合、ｌｏｇＤにより脂溶性を評価することが一般的である。中でもｐＨ７．４に調整された緩衝液を用いて測定したｌｏｇＤはｌｏｇＤ７．４と呼ばれ、物質の脂溶性評価に広く用いられている。
本発明においては、疎水性溶媒と親水性溶媒を使用して物質の脂溶性を測定する。ここで、疎水性溶媒と親水性溶媒は互いに混和しないか、ほとんど混和しない。本発明における疎水性溶媒は、いわゆる非極性溶媒であり、水などの極性溶媒と混和しないか、ほとんど混和しない。一般に、疎水性溶媒の誘電率は、水などの親水性溶媒の誘電率より低い。疎水性溶媒の例として、１−オクタノール（オクタン−１−オール）や脂肪族炭化水素（シクロヘキサン、ドデカン、ヘキサデカンまたはハロゲン化炭化水素）などの有機溶媒を挙げることができ、特に１−オクタノールを疎水性溶媒として用いることが好ましい。
一方、本発明における親水性溶媒は、いわゆる極性溶媒であり、電子的に荷電している分子を有する溶媒をいい、疎水性溶媒と混和しないか、ほとんど混和しない。親水性溶媒は、例えば、一定のｐＨ範囲内で高い緩衝能力を有する緩衝塩の水溶液（すなわち、緩衝液であり、具体的には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液や、３−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸緩衝液等が挙げられる）であってもよい。上記ｐＨ範囲としては０〜１４の範囲であってよく、ｐＨが約７．４であるように調整された緩衝液、特にはｐＨ７．４で緩衝化したリン酸緩衝液を親水性溶媒として用いることが好ましい。また、緩衝液の濃度は、緩衝能や、疎水性溶媒との混合による塩の析出等の面で測定に影響のない範囲で適宜選択できるが、例えば、ｐＨ７．４で緩衝化したリン酸緩衝液の濃度（リン酸換算）は、０．５〜２０ｍＭが好ましく、１〜１０ｍＭがより好ましく、５〜１０ｍＭがさらに好ましい。
なお、本明細書中の「疎水性溶媒と親水性溶媒の比率」とは、「疎水性溶媒と親水性溶媒を混合により形成される疎水相と親水相の容積比」を意味し、例えば、「疎水性溶媒と親水性溶媒を第１の比率で含んでなる第１の溶媒系」とは、「疎水性溶媒と親水性溶媒を混合により形成される疎水相と親水相の容積比が第１の比率である第１の溶媒系」であることを意味する。従って、疎水性溶媒と親水性溶媒の混合による全容積の変化や、分配平衡に達するまでに必要な時間を考慮すると、疎水性溶媒と親水性溶媒は、予め十分に混合して、互いに飽和させた混合液を調製し、その疎水相を疎水性溶媒として、その親水相を親水性溶媒として使用するのが好ましい。
本発明においては、疎水性溶媒と親水性溶媒を第１の比率で含んでなる第１の溶媒系に所定量の物質を混合し、さらに、第１の溶媒系と同じ疎水性溶媒と親水性溶媒を第２の比率で含んでなる第２の溶媒系に所定量の物質を混合する。このように疎水性溶媒と親水性溶媒の相比を変えた複数の系において被験物質を分配させることにより、脂溶性の高い物質から低い物質まで幅広い範囲の物質の脂溶性を正確に測定することができ、また、後述するように疎水性溶媒と親水性溶媒の相比を適宜選択することで、疎水相を分離除去せずに親水相をサンプリングして、脂溶性が測定できるため、煩雑な層分離操作を回避することができる。本発明において、第１の溶媒系に混合する被験物質の量と第２の溶媒系に混合する被験物質の量は、既知であればよく、両者が同じでも異なっていてもよい。
本発明において、疎水性溶媒と親水性溶媒の第１の比率と第２の比率は、両者が異なっていれば特に制限されない。本発明のある態様においては、例えば、疎水性溶媒と親水性溶媒の第１の比率（容積比）を５０：５０〜１：９９とすることができ、２０：８０〜１：９９とすることが好ましく、１０：９０〜１：９９とすることがより好ましく、１：１４〜１：４９とすることがさらに好ましい。親水性溶媒の比率を高くすることによって、比較的脂溶性の高い物質を測定する場合に親水相に含まれる被験物質の濃度を向上させて測定精度を高めることができるとともに、疎水相である上層が薄くなるため分注機などで上層の疎水相を分離除去せずに下層の親水相をサンプリングする際の上層の疎水相のコンタミネーションを抑制することができ、好適である。また、疎水性溶媒の量が少ない溶媒系を用いる場合、親水相をサンプリングすることが好適である。
一方、第２の溶媒系においては、第１の溶媒系よりも疎水性溶媒の比率を高くすることができる。好ましい態様において、疎水性溶媒と親水性溶媒の第２の比率（容積比）は９０：１０〜１：９９、より好ましくは８０：２０〜２０：８０である。また、極めて脂溶性の低い物質を測定する場合などは、疎水性溶媒と親水性溶媒の第２の比率（容積比）を９９：１〜５０：５０として、疎水性溶媒を多くしてもよい。また、第２の比率（容積比）を８０：２０〜２０：８０、特に５５：４５〜４５：５５にするとｌｏｇＤ＝０付近の測定精度が向上するため好ましい。
本発明において疎水性溶媒と親水性溶媒の合計量は特に制限されないが、ハイスループットな分析を行う観点から、５０μＬ〜１０ｍＬが好ましく、１００μＬ〜５ｍＬがより好ましく、５００μＬ〜２ｍＬがさらに好ましく、５００μＬ〜１．５ｍＬがより一層好ましく、８００μＬ〜１．２ｍＬが最も好ましい。また、各相のサンプルを質量分析機（MS）などで測定する観点からは、被験物質のｌｏｇＤが−２〜５程度の場合、第１の比率を１０：９０〜１：９９（より好ましくは１：１４〜１：４９）、第２の比率を８０：２０〜２０：８０（より好ましくは５５：４５〜４５：５５）として、第１の溶媒系および第２の溶媒系での振盪時の被験物質の濃度を２．５〜２０μＭとするのが好適である。
本発明においては、第１の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系の疎水相または親水相に含まれる被験物質を測定し、さらに、第２の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系について測定した相とは別の相に含まれる被験物質を測定する。第１の溶媒系と第２の溶媒系とで、被験物質を測定する相を異ならせることにより、測定精度を向上させることができる。好ましい態様において、第１の溶媒系については親水相中の被験物質を測定し、第２の溶媒系については疎水相中の被験物質を測定する。
本発明の好ましい態様において、ＬｏｇＤが−２〜５程度の化合物を被験物質とする場合、第１の比率を１０：９０〜１：９９（より好ましくは１：１４〜１：４９）、第２の比率を８０：２０〜２０：８０（より好ましくは５５：４５〜４５：５５）として、親水性溶媒と疎水性溶媒の合計量は５００μＬ〜２ｍＬとすると、ハイスループットかつ高精度な分析を行う上で好適である。
本発明では分配平衡に達してから、疎水相及び／又は親水相の被験物質を測定する。一般に、被験物質を添加してから一定時間経過後に分配平衡に達するが、撹拌・振盪させることにより分配平衡に達する時間を短縮させてもよい。分配平衡に達する時間は溶媒の量などにも依存するが、例えば、１分間〜２４時間であり、好ましくは１０分間〜１２時間、より好ましくは３０分間〜３時間である。
本発明においては、溶媒や被験物質を公知の方法によって容器に入れ、容器から取り出することができる。すなわち、公知の分注機（ディスペンサー）や試料採取機（サンプラー）などを使用することができ、これらの作業を自動化することも可能である。また、マルチウェルプレートなどを用いて本発明を複数の被験物質に対して行うことにより、ハイスループットな分析を少ない量のサンプルで行うことができるため、好ましい。本発明の方法は、標準的な装置を用いて容易に自動化することができるため、ハイスループット分析に特に適している。
本発明において被験物質の測定方法は特に制限されず、公知の方法を利用することができる。具体的には、ＵＶ等の吸光度検出器による測定や、液体クロマトグラフィー（LC）、ガスクロマトグラフィー（GC）又はキャピラリー電気泳動（CE）等と、これらに好ましい検出器を組み合わせた機器による測定が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。液体クロマトグラフィー（LC）の検出器としては、ＵＶ等の吸光度検出器、質量分析機（MS）及び／又は導電率検出器等が挙げられる。ハイスループットかつ高精度な分析を行う上で、LC/MSでの測定が好ましい場合がある。
本発明においては、相比の異なる複数の溶媒系における親水相の被験物質と疎水相の被験物質を測定し、その結果に基づいて被験物質の脂溶性を以下の式Ｉを用いて算出する。
（ａ×Ｃ１×Ｄ＋ｂ×Ｃ１）／Ｘ＝（ｃ×Ｃ２＋ｄ×Ｃ２／Ｄ）／Ｙ （式Ｉ）
式中、Ｄ＝分配比、
Ｘ＝第１の溶媒系に添加した被験物質の量
Ｙ＝第２の溶媒系に添加した被験物質の量
Ｃ１＝第１の溶媒系における親水相中の被験物質の濃度
Ｃ２＝第２の溶媒系における疎水相中の被験物質の濃度
ａ＝第１の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
ｂ＝第１の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
ｃ＝第２の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
ｄ＝第２の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
上記式中の濃度Ｃ１及びＣ２として、濃度と相関する値を代わりに用いてもよい。具体的には液体クロマトグラフィーやＬＣ／ＭＳのピーク面積値などである。
本発明においては、上記等式を利用して分配比Ｄを計算し、必要に応じて常用対数を算出してｌｏｇＤやｌｏｇＰを得る。
また別の態様において、本発明は被験物質の脂溶性を測定するための装置に関する。すなわち、本発明は、被験物質の脂溶性を測定するための装置であって、疎水性溶媒と親水性溶媒とを第１の比率および第２の比率で容器に分注するための分注機と、被験物質を分注するための分注機と、容器中の疎水性溶媒と親水性溶媒とを第１の比率で含む第１の溶媒系から疎水相または親水相をサンプリングし、適当な溶媒で希釈するための分注機と、疎水性溶媒と親水性溶媒とを第２の比率で含む第２の溶媒系から第１の溶媒系でサンプリングした相とは別の相をサンプリングし、適当な溶媒で希釈するための分注機と、容器中の疎水性溶媒と親水性溶媒とを第１の比率で含む第１の溶媒系から疎水相または親水相を適当な溶媒で希釈した試料と、疎水性溶媒と親水性溶媒とを第２の比率で含む第２の溶媒系から第１の溶媒系でサンプリングした相とは別の相を適当な溶媒で希釈した試料をサンプリングするための分注機と、被験物質を測定するための分析機と、疎水性溶媒と親水性溶媒の比率および被験物質の測定結果から被験物質の脂溶性を算出するため計算機とを備える。本発明の装置は、容器を一定温度に保持するための恒温槽をさらに備えていてもよく、被験物質が分配平衡に達することを促進するため、容器を振盪するための振盪機や、容器中で疎水相と親水相とを層分離させるための遠心分離機をさらに備えていることが好ましい。本発明の装置を構成する各部分は、一連の分析を自動で行うように自動化することが好ましい。
ハイスループット分析を行うため容器としてマルチウェルプレートなどのウェルプレートを用いることが好ましい。上述したように上層である有機相が薄いと、下層の親水相のサンプリングの際に上層である有機相のコンタミネーションが生じにくく望ましいため、溶媒系の比率と容器容量（面積）を選択して、ウェル中での液面の面積１ｍｍ２当たりの有機相量を０．５〜２μＬとするのが好ましく、１μＬとするのがより好ましい。また、ハイスループット分析や被験物質の使用量などの観点から、ウェルの容積は、５０μＬ〜１０ｍＬが好ましく、１００μＬ〜５ｍＬがより好ましく、液面におけるウェルの断面積は、１０ｍｍ２〜５００ｍｍ２が好ましく、２０ｍｍ２〜１００ｍｍ２がより好ましい。プレートなどの容器の材質としては、ポリプロピレンやガラスが好適である。
以下、実施例を挙げて本発明の内容をより詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に記載がない場合、本明細書において、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。
（実施例）
Ａ．本発明による脂溶性の測定
試験対象の３８化合物について本発明によりｌｏｇＤ７．４を測定した。１ウェルあたりの溶液量を１ｍＬとし、疎水性溶媒として１−オクタノール、親水性溶媒としてｐＨ７．４で緩衝化したリン酸緩衝液を用いた。また、第１の溶媒系および第２の溶媒系に添加する被験物質の量は同じとした（式ＩのＸ＝Ｙ）。第１の溶媒系は、１−オクタノール：リン酸緩衝液＝５：９５（容積比）とし、リン酸緩衝液相（以下、水相）に分配された被験物質を液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって測定した。第２の溶媒系は、１−オクタノール：リン酸緩衝液＝５０：５０（容積比）とし、１−オクタノール相（疎水相）に分配された被験物質を同様に測定した。
上記条件に従って、Ｘ＝Ｙ、ａ＝５、ｂ＝９５、ｃ＝ｄ＝５０を式（Ｉ）に代入することにより以下の二次方程式（式ＩＩ）が得られる。後述するように被験物質を測定すると、そのピーク面積値と希釈率からＣ２／Ｃ１が得られるため、その値を式（ＩＩ）に代入することにより分配比Ｄを求め、その常用対数をとってｌｏｇＤ７．４を算出した。
５×Ｃ１×Ｄ＋９５×Ｃ１＝５０×Ｃ２＋５０×Ｃ２／Ｄ
Ｄ２＋（１９−１０Ｃ２／Ｃ１）Ｄ−１０Ｃ２／Ｃ１＝０ （式ＩＩ）
測定は、９６ディープウェルプレート（グライナー社、型番780270：ウェル上部の内寸は、縦８．２ｍｍ、横８．２ｍｍ、ウェル下部の内寸は縦・横ともに７．３７ｍｍ、ウェル深さは４１ｍｍ、容量２ｍＬ、ポリプロピレン製）を用いて行った。分注、振盪、希釈などの操作は分注ロボット（Hamilton社製、MicroLabSTARlet）により自動化し、装置から装置へのプレートの移動などは手動にて行った。具体的な実験手順は以下のとおりである。
１．溶液の調製
（１） リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の調製
ダルベッコ試薬（ＳＩＧＭＡ製ＰＢＳ溶液１Ｌ用：塩化ナトリウム８ｇ、無水リン酸一水素ナトリウム１．１５ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、無水リン酸二水素カリウム０．２ｇを含む）を１Ｌにメスアップし、その後、撹拌し、不要物をろ別した。溶液のｐＨを測定し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。
（２） 飽和１−オクタノールと飽和リン酸緩衝液の調製
１−オクタノール（関東化学：分配係数測定用）と（１）で調製したリン酸緩衝液とをそれぞれ十分な量ずつ分液漏斗に加え、十分に混合した後、室温で一晩静置した。上層と下層を取り分けて、リン酸緩衝液飽和１−オクタノール（以下、飽和１−オクタノール）と１−オクタノール飽和リン酸緩衝液（以下、飽和リン酸緩衝液）を得た。それぞれの溶液は室温で保存した。
（３） 測定化合物のＤＭＳＯ溶液
測定化合物をＤＭＳＯに添加し、１０ｍＭの溶液を調製した。
２．測定化合物の分配
（１） 測定化合物の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を９６ディープウェルプレートに１０μＬ分注し、飽和１−オクタノール４９０μＬをさらに分注した。吸引吐出による撹拌を１０回行い、測定化合物のオクタノール標準液を調製した。
（２） オクタノール標準液５０μＬを２つのウェルに分注し、１つ目のウェルには、飽和リン酸緩衝液９５０μＬを分注し（疎水性溶媒：親水性溶媒＝５：９５）、２つ目のウェルには、飽和リン酸緩衝液５００μＬと飽和１−オクタノール４５０μＬを分注した（疎水性溶媒：親水性溶媒＝５０：５０）。
（３） マルチウェルプレートに圧力硬化シールを接着後、振盪器にて２５℃で３時間振盪した。振盪後、３０００ｒｐｍで５分間遠心処理した。
（４） １つ目のウェルから下相（水相）を抜き取り、メタノールで１０倍希釈したサンプルを調製した。２つ目のウェルから上相（１−オクタノール相）を抜き取り、メタノールで１０倍希釈したサンプルと、５０倍希釈したサンプルを調製した。１つ目のウェルの下相（希釈なし）と下相の１０倍希釈サンプル、２つ目のウェルの上相の１０倍希釈サンプルと５０倍希釈サンプルの計４サンプルについて、ＬＣ／ＭＳにより測定化合物を測定した。
３．測定化合物の測定
上記４サンプルをＬＣ／ＭＳのオートサンプラーにセットし、自動的に測定した。
（１） ２Ｌのメスフラスコに適当量の超純水（ミリポア社の超純水製造装置により調製）を加えた後、ホールピペットを用いてギ酸（関東化学）２ｍＬを滴下した。その後、超純水でメスアップし、転倒混和を行った。移動相用の瓶に移し、超音波処理を１０分間行い脱気して、０．１％ギ酸水溶液を調製した。
（２） １Ｌのメスフラスコに適当量のアセトニトリル（和光純薬製）を加えた後、ホールピペットを用いてギ酸（関東化学）１ｍＬを滴下した。その後、アセトニトリルでメスアップし、転倒混和を行った。移動相用の瓶に移し、超音波処理を１０分間行い脱気して、０．１％ギ酸アセトニトリル溶液を調製した。
（３） ＨＰＬＣの移動相として、０．１％ギ酸水溶液（Ａ液）および０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（Ｂ液）を用いた。グラジエント条件は、０〜０．３分：Ｂ液１０％、０．３〜１．５分：Ｂ液１０〜９５％、１．５〜２．２５分：Ｂ液９５％、２．２５〜３．０分：Ｂ液１０％とした。流速は０．６ｍＬ／分とした。
（４） ＨＰＬＣは、バイナリーポンプを有するＷａｔｅｒｓ社製Ａｃｑｕｉｔｙを使用した。カラム固定相として、オクタデシル基を有する逆相カラム（Acquity BEH C18、１．７μｍ、２．０×３０ｍｍ）を用いた。カラム温度は５０℃で実施した。
（５） ＭＳはＷａｔｅｒｓ社製ＺＱ又はＳＱＤを使用した。検出モードはＥＳＩ＋で，検出イオンは［Ｍ＋Ｈ］＋でデータを取得した。コーン電圧は２５Ｖで測定した。コーンガスとして窒素ガスを用い，流量は５０Ｌ／ｈで測定し，脱溶媒ガスの流量は７５０Ｌ／ｈで測定した。またソース温度は１３０℃に，脱溶媒温度は３５０℃に設定した。キャピラリー電圧は３．５ｋＶに設定した。
（６） ＬｏｇＤの計算では、１つ目のウェルの下相（希釈なし）サンプルと１つ目のウェルの下相をメタノールで１０倍希釈したサンプル、２つ目のウェルの上相をメタノールで１０倍希釈したサンプルと５０倍希釈したサンプルについて、ＬＣ／ＭＳ測定で得られた各サンプルのピーク面積が大きいサンプル（希釈率の低いサンプル）を、上相と下相でそれぞれ選択し、そのピーク面積値と希釈率からＣ２／Ｃ１を算出し、それを式（ＩＩ）に代入にしてｌｏｇＤを自動算出した。ただし、希釈率の低いサンプルでのピーク面積が著しく大きく、ＬＣ／ＭＳの定量性が低い範囲にあると考えられる場合（本試験条件においては、ピーク面積値が750000以上の場合）は、希釈率の大きいサンプルを選択して、そのピーク面積をＬｏｇＤ算出に用いた。
（比較例）
Ｂ．フラスコ振盪法による脂溶性の測定
以下の手順によりフラスコ振盪法により脂溶性を測定した。
１．溶液の調製
Ａと同様にして、溶液を調製した。
２．測定化合物の分配
試料を適量（ミクロスパーテルに半分くらい）とり、１０ｍＬのネジ口遠沈管に入れ、ＡＣＤ／Ｌａｂｓ（富士通）に代表される物性値予測ソフトにより、ＬｏｇＤ＜０の場合は飽和リン酸緩衝液を約６ｍＬ加え、ＬｏｇＤ≧０の場合は飽和１−オクタノールを約６ｍＬ加えた。超音波照射を数１０秒実施し、試料を分散させ、混合液とした。
この混合液をAnotop社製シリンジフィルタでろ過したのち、約５ｍＬを新しい１０ｍＬのネジ口遠沈管に投入し、２〜３回、転倒攪拌した。
ネジ口遠沈管に、物性予測ソフトでの値がＬｏｇＤ≧０の場合は飽和リン酸緩衝液、ＬｏｇＤ＜０の場合は飽和１−オクタノールを加え、遠沈管の目盛りで１０ｍＬとした。
ネジ口遠沈管を１０分間激しく振とうした後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。
上相（１−オクタノール相）１ｍＬを取り、メタノールで１０ｍＬに希釈した。さらに以下メタノールで希釈し、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈の４サンプルを調製した。
次に上相を完全に取り除いた後、下相（水相）１ｍＬと取り、メタノールで希釈し、１倍（希釈なし）、１０倍、１００倍、１０００倍希釈の４サンプルを調製した。
３．各相サンプル測定
上記８サンプルをＬＣ／ＭＳのオートサンプラーにセットし、自動的に測定した。
（１） ２Ｌのメスフラスコに１０ｍＭとなるように酢酸アンモニウム（和光純薬製）約１．５ｇを秤量し、超純水（ミリポア社の超純水製造装置により調製）でメスアップし、転倒混和を行った。移動相用の瓶に移し、超音波処理を１０分間行い脱気して、１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液を調製した。
（２） ２Ｌのメスフラスコに１０ｍＭとなるように酢酸アンモニウム（和光純薬製）約１．５ｇを秤量し、メタノール（和光純薬製）でメスアップし、転倒混和を行った。移動相用の瓶に移し、超音波処理を１０分間行い脱気して、１０ｍＭ酢酸アンモニウムアセトニトリル溶液を調製した。
（３） ＨＰＬＣの移動相として、１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（Ａ液）および１０ｍＭ酢酸アンモニウムメタノール溶液（Ｂ液）を用いた。グラジエント条件は、０―０．５分：Ｂ液１０〜５０％、０．５―５分：５０〜１００％、５―７分：１００％とした。流速は０．３ｍＬ／分とした。
（４） ＨＰＬＣは、バイナリーポンプを有するＡｇｉｌｅｎｔ社製ＬＣ１１００を使用した。カラム固定相として、オクタデシル基を有する逆相カラム（Ｉｍｔａｋｔ Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ―Ｃ１８ ２．０ＩＤ×５０ｍｍ）を用いた。カラム温度は４０℃で実施した。
（５） ＭＳはＡｇｉｌｅｎｔ社製１９４６Ｄを使用した。Ｄｒｙｉｎｇ Ｇａｓ Ｆｌｏｗは１２．０Ｌ／分、Ｄｒｙｉｎｇ Ｇａｓ Ｔｅｍｐを３５０℃、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｖｏｌｔａｇｅを３０００Ｖに設定した。検出モードはＥＳＩ+で、検出イオンはサンプルにより最適化を行いデータを取得した。代表的なイオンは[Ｍ＋Ｈ]＋や[Ｍ−Ｈ]＋であった。フラグメンター電圧はサンプルにより最適化を行い測定した。４０〜２００Ｖの範囲で最適化を行い代表的には８０Ｖや１００Ｖで測定した。
（６） ＬｏｇＤの計算では、ＬＣ／ＭＳ測定で得られた各サンプルのピーク面積が大きいサンプル（希釈率の低いサンプル）を、上相と下相でそれぞれ選択し、そのピーク面積をＬｏｇＤ算出に用いた（１−オクタノール相の面積×希釈倍率／水相の面積値×希釈倍率＝分配比、この分配比の常用対数をとることでＬｏｇＤを算出）。ただし、希釈率の低いサンプルでのピーク面積が著しく大きく、ＬＣ／ＭＳの定量性が低い範囲にあると考えられる場合は、希釈率の大きいサンプルを選択して、そのピーク面積をＬｏｇＤ算出に用いた。
Ｃ．測定結果
市販の１４化合物の他、表１に化合物１〜２４として示した２４化合物についても測定を行った。表１に測定したｌｏｇＤの値を示す。９６ウェルのマルチウェルプレートを用いて上記測定を行うことにより、３８化合物のｌｏｇＤ７．４を約１３時間で測定することができ、本発明によって極めてハイスループットな分析が可能になった。
また、図１に、本発明によって測定したｌｏｇＤ（実施例）を従来のフラスコ振盪法により測定したｌｏｇＤ（比較例）と比較したグラフを示す。図１によれば、ｌｏｇＤが−２〜５の範囲において、本発明により測定したｌｏｇＤはフラスコ振盪法により測定したｌｏｇＤとほぼ同等の値となっており（Ｒ２＝０．９９０６）、本発明によれば正確に脂溶性を測定できることが示された。疎水性溶媒と親水性溶媒の比率が異なる２つの溶媒を用いて、一方の下層、他方の上層に含まれる被験物質を測定することによって、サンプリングの際の疎水相のコンタミネーションを抑制すると同時に、親水相に含まれる被験物質の濃度を向上させることができ、その結果、脂溶性を高精度で測定することができた。
Figure 2012090909
本発明によれば、物質の脂溶性を迅速かつ正確に測定することができる。

Claims (9)

  1. （１） 疎水性溶媒と親水性溶媒を第１の比率で含んでなる第１の溶媒系に所定量の被験物質を混合する工程と、
    （２） 第１の溶媒系と同じ疎水性溶媒と親水性溶媒を第２の比率で含んでなる第２の溶媒系に所定量の被験物質を混合する工程と、
    （３） 第１の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系の疎水相または親水相に含まれる被験物質を測定する工程と、
    （４） 第２の溶媒系が分配平衡に達した後、第１の溶媒系について測定した相とは別の相に含まれる被験物質を測定する工程と、
    （５） 第３および第４の工程で得られた二つの値に基づいて被験物質の脂溶性を算出する工程と、
    を含む、被験物質の脂溶性を測定する方法。
  2. 疎水性溶媒と親水性溶媒との第１の比率が５０：５０〜１：９９（容積比）である、請求項１に記載の方法。
  3. 疎水性溶媒と親水性溶媒との第２の比率が８０：２０〜２０：８０（容積比）である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 疎水性溶媒が１−オクタノールであり、親水性溶媒が緩衝液である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 第１から第５の工程を自動で行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. ｌｏｇＤ測定値が−２〜６の被験物質に用いるための、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 以下の式：
    （ａ×Ｃ１×Ｄ＋ｂ×Ｃ１）／Ｘ＝（ｃ×Ｃ２＋ｄ×Ｃ２／Ｄ）／Ｙ （式Ｉ）
    式中、Ｄ＝分配比、
    Ｘ＝第１の溶媒系に添加した被験物質の量
    Ｙ＝第２の溶媒系に添加した被験物質の量
    Ｃ１＝第１の溶媒系における親水相中の被験物質の濃度
    Ｃ２＝第２の溶媒系における疎水相中の被験物質の濃度
    ａ＝第１の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
    ｂ＝第１の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
    ｃ＝第２の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
    ｄ＝第２の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
    に基づいて被験物質の脂溶性を算出する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 疎水性溶媒と親水性溶媒とを第１の比率および第２の比率で容器に分注するための分注機と、
    被験物質を分注するための分注機と、
    疎水性溶媒と親水性溶媒とを第１の比率で含む第１の溶媒系から疎水性溶媒相または親水性溶媒相をサンプリングし、疎水性溶媒と親水性溶媒とを第２の比率で含む第２の溶媒系から第１の溶媒系でサンプリングした相とは別の相をサンプリングするための分注機と、
    被験物質を測定するための分析機と、
    疎水性溶媒と親水性溶媒の比率および被験物質の測定結果から被験物質の脂溶性を算出するため計算機と、
    を含む、被験物質の脂溶性を測定するための装置。
  9. 以下の式：
    （ａ×Ｃ１×Ｄ＋ｂ×Ｃ１）／Ｘ＝（ｃ×Ｃ２＋ｄ×Ｃ２／Ｄ）／Ｙ （式Ｉ）
    式中、Ｄ＝分配比、
    Ｘ＝第１の溶媒系に添加した被験物質の量
    Ｙ＝第２の溶媒系に添加した被験物質の量
    Ｃ１＝第１の溶媒系における親水相中の被験物質の濃度
    Ｃ２＝第２の溶媒系における疎水相中の被験物質の濃度
    ａ＝第１の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
    ｂ＝第１の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
    ｃ＝第２の溶媒系における疎水性溶媒の量（疎水相の容積）
    ｄ＝第２の溶媒系における親水性溶媒の量（親水相の容積）
    に基づいて被験物質の脂溶性を算出する、請求項８に記載の装置。
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