JPWO2011078213A1

JPWO2011078213A1 - プロピオン酸菌生菌含有組成物、及びその利用方法

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Publication number: JPWO2011078213A1
Application number: JP2011547588A
Authority: JP
Inventors: 健司世良; 勝紀木村; 道雄神辺; 毅典折橋; 愛美吉田; 嘉昭小原
Original assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Feed Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Feed Co Ltd
Priority date: 2009-12-25
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2013-05-09
Anticipated expiration: 2030-12-22
Also published as: NZ600700A; AU2010336620A1; EP2517715A1; US9095159B2; EP2517715B1; JP5847587B2; EP2517715A4; WO2011078213A1; CA2785268C; US20120276055A1; AU2010336620B2; CA2785268A1

Abstract

反芻動物ルーメン内のプロピオン酸菌の代謝機能を充分に発揮させるためにルーメン内のプロピオン酸菌増殖活性を亢進して、これにより反芻動物のルーメンアシドーシスを予防、治療する組成物、及びその利用方法を提供する。反芻動物にプロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を経口投与することで、反芻動物ルーメン内でのプロピオン酸菌増殖を劇的（急激）に促進し、ルーメン内の揮発性脂肪酸濃度が高まり、よって、反芻動物のルーメンアシドーシスを予防及び／又は治療できる。

Description

本発明は、反芻動物のルーメンアシドーシスを予防、治療する方法及び当該用途の組成物に関する。詳細には、反芻動物ルーメン内での乳酸の過剰な増加を抑制することによって、反芻動物のルーメンアシドーシスを予防、治療する方法及び当該用途の組成物に関する。

反芻動物（例えば、ウシなど）の体の維持エネルギーの７０％は、ルーメン（第一胃）内で産生される揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）による。ルーメン発酵により産生するＶＦＡは、主に酢酸、プロピオン酸、酪酸である。このうち、プロピオン酸が最もエネルギー効率が高い。例えば、ウシのルーメンでは、繊維、糖の一部、デンプンなどから、ルーメン発酵によりプロピオン酸が合成され、肝臓でグルコースとなり、エネルギー源や乳・肉の原料として利用される。

この反芻動物のルーメン環境は、給与飼料などの影響を強く受け、したがって、ルーメン発酵は給与飼料などによって著しく変動する。近年、家畜の生産性向上のため、穀物などの濃厚飼料の多給が行われ、粗繊維の不足、易発酵性の炭水化物の供給過剰となりがちである。それにより、ルーメンの恒常性が乱れ、様々な代謝障害（生産病と呼ばれる）をもたらす原因となっている。

例えば、濃厚飼料多給、粗繊維不足などの条件下で、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖｉｓなどの乳酸菌が増殖して乳酸が著しく増加すると、ルーメン内のｐＨが５以下に低下し（正常時はｐＨ６〜７）、急性のアシドーシス（この状態を、ルーメンアシドーシスという）を生ずる。ルーメンアシドーシスのウシの症状としては、採食量の急激な低下、乳脂肪率の低下、軟便と強い酸臭、跛行牛の増加などがあらわれ、乳などの生産効率が低下する。

また、生産現場では、顕著な臨床症状は見られないが、潜在性アシドーシスを起こしている反芻家畜が数多く見られると予想され、乳などの生産効率に大きく影響していることが危倶されている。そこで、ルーメン発酵を制御する技術の開発が重要な課題となっている。

このような背景の中、腸内環境改善のために、乳酸菌の働きを改善する目的でプロピオン酸菌を投与する方法が示されているが（特許文献１、２）、乳酸菌を活性化するのみでは逆にルーメン内の乳酸が増加してアシドーシスを促進してしまう恐れもある。また、ルーメン内のプロピオン酸菌を活性化するため、プロピオン酸菌生菌を反芻動物に直接投与する方法も試みられているが、プロピオン酸菌は非常に増殖しにくい菌であり、かつ、ルーメン内のプロピオン酸菌量は、給与する飼料などにより大きく変動し、不安定であるため、単にプロピオン酸菌をルーメン内に補充するだけでは、ルーメンの働きを充分に改善することは困難である。

特開２００６−２５４８４１号公報特開２０００−２５６２０１号公報

本発明は、上述のような背景の中、反芻動物ルーメン内のプロピオン酸菌の代謝機能を充分に発揮させるためにルーメン内のプロピオン酸菌増殖活性を亢進して、これにより反芻動物のルーメンアシドーシスを予防、治療する組成物、及びその利用方法の提供を目的としてなされたものである。さらに付随して、プロピオン酸菌の代謝機能によってルーメン内のプロピオン酸を代表とする揮発性脂肪酸濃度を高めることにより、反芻家畜の乳や肉の品質、生産性を向上することを二次的目的とする。

上記目的を達成するため、本発明者らは各方面から検討の結果、反芻動物にプロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を経口投与することで、反芻動物ルーメン内でのプロピオン酸菌増殖を劇的（急激）に促進し、プロピオン酸菌の急速な増加及びルーメン発酵の活性化が起こってルーメン内の揮発性脂肪酸濃度が高まり、よって、反芻動物のルーメンアシドーシスを予防及び／又は治療できることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を添加すること、を特徴とするプロピオン酸菌増殖促進方法。
（２）プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物（乳酸菌生菌及び／又は死菌を含む物も包含する。以下同様）を反芻動物に経口投与すること、を特徴とする反芻動物のルーメンアシドーシス予防及び／又は治療方法。
（３）プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を反芻動物に経口投与すること、を特徴とする反芻動物ルーメン内でのプロピオン酸菌（急速）増殖促進方法。
（４）プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を反芻動物に経口投与すること、を特徴とする反芻動物ルーメン内の揮発性脂肪酸濃度を高める方法。
（５）プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）であること、を特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）乳酸菌培養物が、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）培養物であること、を特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ‐３株（ＦＥＲＭＢＰ−８１１５）であり、乳酸菌培養物がラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）培養物であること、を特徴とする（５）又は（６）に記載の方法。
（８）反芻動物がウシであること、を特徴とする（２）〜（７）のいずれか１つに記載の方法。

（９）プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を有効成分とすること、を特徴とする反芻動物のルーメンアシドーシス予防及び／又は治療組成物（反芻動物医薬としてのルーメンアシドーシス予防及び／又は治療剤、又は、反芻動物用飼料）。
（１０）プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）であること、を特徴とする（９）に記載の組成物。
（１１）乳酸菌培養物が、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）培養物であること、を特徴とする（９）又は（１０）に記載の組成物。
（１２）プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ‐３株（ＦＥＲＭＢＰ−８１１５）であり、乳酸菌培養物がラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）培養物であること、を特徴とする（１０）又は（１１）に記載の組成物。
（１３）反芻動物がウシであること、を特徴とする（９）〜（１２）のいずれか１つに記載の組成物。
（１４）プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を有効成分とすること、を特徴とするプロピオン酸菌増殖促進剤（医薬用途、食品用途のいずれも含む）。

本発明によれば、反芻動物にプロピオン酸菌生菌と乳酸培養物の２つの有効成分を経口投与することで、投与したプロピオン酸菌だけでなくルーメンに内在するプロピオン酸菌の増殖活性も亢進し、ルーメン内でのプロピオン酸菌増殖が急速に進み、プロピオン酸菌による乳酸からプロピオン酸への転換等のルーメン発酵が非常に活性化（促進）され、これによって反芻動物のルーメン内乳酸過剰増加によるルーメンアシドーシス（潜在性アシドーシスを含む）を予防、治療することが可能となる。さらには、プロピオン酸等の揮発性脂肪酸の増加により、反芻家畜の乳や肉の品質、生産性が向上する。

プロピオン酸菌の増殖に及ぼすＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物添加の効果を示した。ここでは、ＧＡＭブイヨンのみ（黒三角）をコントロールとして、ＧＡＭブイヨンにホエイ培地を添加したもの（白丸）及びＧＡＭブイヨンにＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物を添加したもの（黒丸）を比較した結果を示し、ホエイ培地の濃度をグラフ上部に示したように２％、５％、１０％の３条件で実施した結果を示した。なお、グラフの縦軸は培地の濁度（ＯＤ_６００）、横軸は培養時間を示す。Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物添加の有無が人工ルーメンに及ぼす影響(ｉｎｖｉｔｒｏ試験）を示した。培養後６、１２、２４時間の人工ルーメン内の乳酸濃度（１）、総ＶＦＡ濃度（２）、酢酸濃度（３）、プロピオン酸濃度（４）、ｐＨの変化（５）を、コントロール（白丸）、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株の乳清発酵物（生菌含有）添加（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物添加あり、黒三角）、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株の乳清発酵物（生菌含有）添加（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物添加なし、白三角）の３区について示した。なお、グラフの縦軸は（１）〜（４）については人工ルーメン内の各成分の濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）、（５）についてはｐＨの値を、横軸は培養時間を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、反芻動物のアシドーシスを予防、治療するための、ルーメン内のプロピオン酸菌の増殖活性を亢進する組成物を提供するものであるが、反芻動物ルーメン内におけるプロピオン酸菌の主な働きとしては、次のものが例示される。
（１）乳酸をプロピオン酸に転換して、アシドーシスを抑制する。
（２）メタン細菌を抑制して、メタン発生量を低減する（環境への負荷軽減）。
（３）繊維分解菌の増殖を促進して、エネルギー代謝を改善する。
（４）上記結果として、乳の生産量と乳質を改善する。
しかし、反芻動物ルーメン内のプロピオン酸菌量は非常に不安定であり、給与している飼料によってはほとんど存在しない場合もある。このようなことから、本発明では、第一の有効成分としてプロピオン酸菌生菌を用いる。

本発明におけるプロピオン酸菌生菌としては、特に限定はされないが、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）に属する菌が好ましい。例えば、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ−３株、同ＡＴＣＣ６２０７株、同ＡＴＣＣ８２６２株、同ＩＦＯ１２４２４株、同ＩＦＯ１２４２６株、同ＩＦＯ１２３９１株などが例示される。

なお、上述のプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ−３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、２００２年（平成１４年）７月１１日付けで国際寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭＢＰ−８１１５である。

本発明においては、プロピオン酸菌を乳清（ホエイ及び／又はそのプロテアーゼ処理物）含有培地で培養し、得られた培養物、単離した菌体自体をプロピオン酸菌生菌として使用することもできる。
プロピオン酸菌の培養は、ホエイを含有する（５〜１５％）培地を使って、常法にしたがって好気的又は嫌気的（例えば、窒素ガス加圧下 (０．５ｋｇ／ｃｍ^２））培養によればよい。通常、２０〜４０℃、ｐＨ６〜８で、菌数が１０^９ｃｆｕ／ｍｌ以上になるまで培養する。このように調製したプロピオン酸菌による乳清発酵物は、そのまま、もしくは単離した菌体をプロピオン酸菌の生菌として利用するが、賦形剤として、脱脂粉乳、デンプン、トレハロース、穀類、糖類等を加えて凍結乾燥し、利用してもよい。

本発明は、第二の有効成分として乳酸菌培養物を用いる。上述の通り、プロピオン酸菌は特にルーメン内においては非常に増殖がしにくい（増殖に時間を要する）細菌である。したがって、単にプロピオン酸菌生菌を経口投与したのみでは、補充したプロピオン酸菌及びルーメンに内在するプロピオン酸菌の増殖が共に進まず、ルーメン環境を充分に改善することはできない。本発明においては、プロピオン酸菌増殖促進成分として乳酸菌培養物を併用することが特徴である。

本発明における乳酸菌培養物としては、特に限定はされないが、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）に属する乳酸菌（例えば、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株）を培養して得た乳酸菌培養物全体（生菌及び／又は死菌を含む）が好ましい。また、培養物から分離した菌体（生菌及び／又は死菌）、菌体破砕物（乳酸菌破砕物）、該培養物から菌体を含む固形物を除去した乳酸菌培養物残渣（培養液、培養液の混濁した部分ではなく澄んだ部分である培養上澄液を包含する）、それらの処理物の少なくともひとつなども例示される。なお、ここで処理物とは、濃縮物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物の少なくともひとつ）、液状物、希釈物、殺菌物から選ばれる少なくともひとつを示す。なお、上記成分に賦形剤（デンプン、デキストリン、乳成分、ケイ酸等）水、飼料成分、乳酸、乳酸塩等を添加したものを用いても良い。
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉは、耐酸性も強く、酸生成能力が高いだけでなく、ホエイなどの蛋白質分解酵素処理物含有培地での乳糖からの乳酸生成効率もＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓなどに比べて著しく高く、本発明には、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの使用が好適である。

なお、上述のラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、２０００年（平成１２年）１月１４日付けで国際寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭＢＰ−６９９９である。

乳酸菌の培養は、乳酸菌や細菌類の培養にしたがい常法によって行えばよく、培地としては、脱脂乳、脱脂粉乳、ホエイ、ホエイ粉などが利用できるが、ｐＨを一定範囲に保持して高濃度の菌数にすることができる中和培養の容易な合成培地や半合成培地を用いるのが好ましい。

合成培地、半合成培地には、脱脂乳、脱脂粉乳、ホエイ、ホエイ粉などの少なくともひとつあるいはそれらの蛋白質分解酵素処理物が使用できるが、ホエイ蛋白質濃縮物（ＷｈｅｙＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、ＷＰＣ）やホエイ蛋白質分離物（ＷｈｅｙＰｒｏｔｅｉｎＩｓｏｌａｔｅ、ＷＰＩ）、あるいはそれらの酵素処理物の使用も好適である。この場合、１〜１０％の乳糖を併用することが望ましい。中和培養は、培地に乳酸菌を接種し、３５〜４２℃で、生成する乳酸量に合わせて、アルカリ液を加え、培養液のｐＨを４．５〜７．０の範囲に維持して培養する。培養液中の菌数が１０^９〜１０^１１ｃｆｕ／ｍｌ、乳酸含量が２．５％以上になるように、２４〜４８時間培養する。この培養物を遠心分離して得た上澄液を利用することができる。

本発明においては、上述のプロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を、同時に、あるいは分けて反芻動物に経口投与する。例えば、牛に投与する場合、プロピオン酸菌の生菌素材（生菌数１０^１１ｃｆｕ／ｇ)を０．０１〜１０ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ（好ましくは０．１〜５ｇ／ｈｅａｄ／ｄａｙ）の投与量が好適であり、この際に（同時に又はその直前、直後に）培養終点酸度（乳酸含量）が０．５〜６％の乳酸菌培養物を、プロピオン酸菌生菌素材の１〜１５％投与する。尚、他の反芻動物の場合は、体重等に応じて投与量を増減させればよい。なお、本発明の組成物は、それ自体反芻動物に直接投与することができるだけでなく、飼料や飲料水、代用乳などに添加して投与することも可能である。

本発明に係る組成物は、プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を有効成分として、反芻動物医薬又は反芻動物飼料として使用することができるが、反芻動物医薬品タイプとして使用する場合の経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。飼料及び／又は飼料添加物（剤）として使用する場合には、例えば、賦形剤として、脱脂粉乳、デンプン、トレハロース、穀類、糖類等を加えて凍結乾燥して用いることができる。

本発明で対象となる反芻動物は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、水牛、ラクダ等が例示される。特に、畜産業としての乳や肉の食品としての利用を考慮すると、家畜として飼育されているウシ、ヤギ、ヒツジが好ましい。

上述のように、本発明に係る組成物を反芻動物に投与することで、反芻動物ルーメン内のプロピオン酸菌（及び投与したプロピオン酸菌生菌）の増殖が促進され、ルーメンアシドーシスを効果的に予防、治療することができる。
ルーメン液中の乳酸含量は、通常、３〜１３０ｍｇ／ｌ００ｍｌと大きく変動していて、プロピオン酸菌が有効に利用できる乳酸量が常に存在しているとはいえない。こういう状況下では、ルーメンに先住するプロピオン酸菌はもとより、補給したプロピオン酸菌もコンスタントに増殖して、能力を発揮することは難しい。したがって、乳酸・乳糖・窒素化合物などを含む乳酸菌培養物を併用することで、先住及び投与のプロピオン酸菌の何れにも増殖促進効果が発揮される。

なお、本発明に係るプロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を有効成分とする組成物は、反芻動物以外の動物に投与することもできる。例えば、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウマ等の家畜、家禽類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット等の齧歯類のほか、イヌ、ネコなどのペット用小動物及び動物園で飼育されている動物（いわゆる愛玩動物）及びヒト、その他哺乳動物にも適用可能である。これらの動物に対して本発明に係る組成物を投与することで、腸内環境を改善することができる。

以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株は、他のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｐｓｕｓ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓなどの菌株に比べて、低ｐＨ条件下での増殖能が著しく高いことが示されている。そこで、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの菌株による増殖能と乳酸の産生能を測定・比較する目的で、以下の試験を実施した。ＭＲＳＢｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ社製）で２回賦活培養（３７℃、１８時間）した９種類のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ（表１、表２に記載）をｐＨ４．０に調製したＭＲＳＢｒｏｔｈに１０μｌ接種し、好気的に３７℃で培養した。培養開始９時間後に培地の濁度（ＯＤ_６５０）と培地中の乳酸濃度（ｇ／ｌ）を測定した。

表１に、低ｐＨ条件下でのＬ．ｇａｓｓｅｒｉの増殖能を示した。菌株の中で、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株が０．２４８と最も高い濁度を示した。表２に、低ｐＨの条件下でのＬ．ｇａｓｓｅｒｉの乳酸の産生能を示した。９時間培養後の乳酸濃度は、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株が５．５７ｇ／ｌで最も高かった。

以上の結果から、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株が、特に低ｐＨ条件下での増殖性が優れていることが明らかになった。よって、本発明にはＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株の使用が最適と考えられた。

ＧＡＭブイヨン（日水製薬社製）でのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株の増殖に対するホエイ培地とＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物添加による促進効果について比較した。

Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株をＧＡＭブイヨンで３回継代培養し、ＧＡＭブイヨンのみ、ＧＡＭブイヨンにＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物を２％、５％、１０％添加したもの、ＧＡＭブイヨンにホエイ培地を２％、５％、１０％添加したものを調製し、各３ｍｌに対して５．０×１０^６ｃｆｕのＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株を植菌した。３７℃、嫌気性培養条件下での増殖活性（ＯＤ_６００における濁度）を培養後２４、４８、７２時間で測定した。

結果としては、培養後２４時間では、各試験区間で差は見られなかったが、培養後４８時間、７２時間で明らかにＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物及びホエイ培地添加区において増殖活性が亢進した（図１）。また、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物ではホエイ培地と比較して増殖活性が大きく、添加量が５、１０％と増加するにしたがって容量依存的に増殖活性が高まった（図１、おそらく乳酸発酵により生じている乳酸や窒素化合物等が複合して機能しているものと推察される）。このことから、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物は、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株の増殖促進効果があり、その増殖促進効果はＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物の添加量に依存して高まることが明らかになった。

Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物添加の有無がルーメンに及ぼす影響を人工ルーメン法で調べた。

人工ルーメン実験（バッチ法）において、プロピオン酸菌増殖に関連した発酵能に対するプロピオン酸菌及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物の添加効果について試験を行った。経口カテーテルにて採取したルーメン濾過液と人工唾液を１：２で混合したもの１５ｍｌ、乾草粉末１００ｍｇ、配合飼料粉末２００ｍｇを５０ｍｌバイエル瓶にとり、ＣＯ_２通気で嫌気性にしたバッチ法で、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株（１０^７ｃｆｕ）、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物（０．５ｍｌ）を添加して、ルーメンの発酵性を培養６、１２、２４時間で観察した。

結果を図２に示す。Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株の添加により培養後６、１２、２４時間で、総ＶＦＡ、酢酸、プロピオン酸産生量が増加した。また、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物の添加においては、培養後６、１２、２４時間で、総ＶＦＡ、酢酸、プロピオン酸産生量がさらに増加した。以上の結果から、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＥＴ‐３株及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉＯＬＬ２７１６株のホエイ培地培養物の添加によって、プロピオン酸菌によるルーメン発酵性が活性化されることが明らかになった。

なお、本発明を要約すれば次のとおりである。
すなわち、本発明は、反芻動物ルーメン内のプロピオン酸菌の代謝機能を充分に発揮させるためにルーメン内のプロピオン酸菌増殖活性を亢進して、これにより反芻動物のルーメンアシドーシスを予防、治療する組成物、及びその利用方法を提供することを課題とする。そして、反芻動物にプロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を経口投与することで、反芻動物ルーメン内でのプロピオン酸菌増殖を劇的（急激）に促進し、ルーメン内の揮発性脂肪酸濃度が高まり、よって、反芻動物のルーメンアシドーシスを予防及び／又は治療できる。

本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ‐３株（ＦＥＲＭＢＰ−８１１５）。
（２）ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）。

Claims

プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を添加すること、を特徴とするプロピオン酸菌増殖促進方法。
プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を反芻動物に経口投与すること、を特徴とする反芻動物のルーメンアシドーシス予防及び／又は治療方法。
プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を反芻動物に経口投与すること、を特徴とする反芻動物ルーメン内でのプロピオン酸菌増殖促進方法。
プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を反芻動物に経口投与すること、を特徴とする反芻動物ルーメン内の揮発性脂肪酸濃度を高める方法。
プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）であること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
乳酸菌培養物が、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）培養物であること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ‐３株（ＦＥＲＭＢＰ−８１１５）であり、乳酸菌培養物がラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）培養物であること、を特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
反芻動物がウシであること、を特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
プロピオン酸菌生菌及び乳酸菌培養物を有効成分とすること、を特徴とする反芻動物のルーメンアシドーシス予防及び／又は治療組成物。
プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）であること、を特徴とする請求項９に記載の組成物。
乳酸菌培養物が、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）培養物であること、を特徴とする請求項９又は１０に記載の組成物。
プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ‐３株（ＦＥＲＭＢＰ−８１１５）であり、乳酸菌培養物がラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）培養物であること、を特徴とする請求項１０又は１１に記載の組成物。
反芻動物がウシであること、を特徴とする請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物。