JPWO2011049200A1 - 掻痒抑制剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、副作用が少なく、アトピー性皮膚炎等の強い掻痒を伴う皮膚疾患の治療に有効な速効性のある掻痒抑制剤として、下記の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端側から７個以上の部分アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチド等のコレシストキニン２受容体アゴニストを有効成分として含有することを特徴とする掻痒抑制剤を提供する。Val-Ser-Gln-Arg-Thr-Asp-Gly-Glu-Ser-Arg-Ala-His-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ala-Arg-Tyr-Ile-Gln-Gln-Ala-Arg-Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Val-Lys-Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2［配列番号１］

Description

本発明は、皮膚疾患に伴う掻痒を抑制する掻痒抑制剤に関するものである。
アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、じんましん、痒疹等の皮膚疾患は掻痒（かゆみ：皮膚を掻きたくなるような不快な皮膚の感覚）を伴うことが多い。掻痒は、それが誘発する掻破行動により病変の増悪および掻痒の増大という悪循環を引き起こすのみならず、日常生活や就業における作業効率を低下させ、また睡眠を阻害しＱＯＬの低下をもたらす。そのため、掻痒の抑制は、皮膚における炎症反応の抑制と共に皮膚疾患の治療において重要である。
皮膚疾患の治療には、各種合成ステロイドを含む薬剤が広く用いられており、著明な治療効果を挙げている。しかし、ステロイド外用薬は、掻痒に対する直接的な抑制効果は有しておらず、炎症反応を抑制することにより間接的に掻痒を抑制していると考えられる。
アトピー性皮膚炎等における掻痒は、Ｉ型アレルギー反応による肥満細胞（マスト細胞）由来のヒスタミンに起因する現象であると考えられていたことから、掻痒の抑制のために、抗ヒスタミン薬や抗アレルギー薬が内服薬または外用薬として投与されることも多い。
近年は、免疫抑制薬であるタクロリムスを含む外用薬も用いられるようになっている（例えば、非特許文献１参照）。タクロリムスも、ステロイド外用薬同様、炎症反応の抑制を主要な作用機序とするものであるが、皮膚疾患のアトピー性皮膚炎の病態モデルマウスを用いた実験より、タクロリムスによる掻破行動の抑制が観察されている（例えば、非特許文献２参照）。
また、従来の一般的治療によるコントロールがつかない重症アトピー性皮膚炎患者や、最近の風潮としてのステロイド外用薬を使用することの困難な患者に対する薬剤として、免疫抑制薬であるシクロスポリンの内服が検討されており（例えば、非特許文献３参照）、わが国においても、一定の条件下、重症アトピー性皮膚炎患者への使用が認可された。
別のアプローチとして、掻痒や皮膚の炎症反応を遺伝子レベルで調節する方法や薬剤が検討されている。例えば、特許文献１には、ニューロペプチドの一種であるコレシストキニン又はその類縁体を含有してなる、特定のタンパク質を含有する細胞の再生、増殖又は分化調節剤およびそれを投与することにより、肥満、糖尿病、免疫系疾患、肝臓疾患、消化器系疾患または美容整形時の組織の損傷等の細胞の再生、増殖または分化が関与する疾患を治療する方法が開示されており、その具体例として、アトピー性皮膚炎等の免疫系疾患の予防および／または治療剤としてのコレシストキニンの使用が開示されている。
また、特許文献２には、有効成分としての少なくとも１つの医薬剤と、少なくとも１つの医薬剤のインビボ取り込みを高めるために配合されたナノ構造と、液体とを含む医薬組成物に関する発明が開示されており、発明の実施の形態のひとつとして、ニューロペプチドを用いたかゆみ症の治療剤が開示されている。
国際公開第２００６/００６７２２号パンフレット（請求項２６、３４、再公表公報第２７ページ１８〜２５行目） 特表２００９-５２６７５４号公報（明細書段落００５２〜５３）
中川秀巳他著，「Tacrolimus ointment for atopic dermatitis（アトピー性皮膚炎用タクロリムス軟膏剤）」，Lancet，エルゼビア（Elsevier）社（英国），第３４４巻（１９９４年），ｐ．８８３ 稲垣直樹他著，「アトピー性皮膚炎治療薬の薬効評価」，日本薬理学雑誌，社団法人日本薬理学会，第１２７巻（２００６年），ｐ．１０９〜１１５ Camp, R. D.他著，「Cyclosporin A in severe, therapy-resistant atopic dermatitis（重症の難治性アトピー性皮膚炎に対するシクロスポリンＡ）」: report of an international workshop，April 1993，British Journal of Dermatology，英国皮膚科医会（British Association of Dermatologists），第１２９巻，第２号（１９９３年），ｐ．２１７〜２２０
しかしながら、ステロイド外用薬やタクロリムス外用薬には、重篤な副作用発現が懸念されるため、長期間の使用や、掻痒に伴う掻破行動が病態発現に大きく関与しているとされる小児への使用が制限されており、顕著な効果を有するにもかかわらず使用しにくい状況にある。
また、抗ヒスタミン薬には、眠気や口渇等の副作用があること、効用に個人差があること、アトピー性皮膚炎患者等の一部の掻痒が抗ヒスタミン薬に対する抵抗性を有すること等から、強い掻痒を伴うアトピー性皮膚炎等に対する有効性が疑問視されるようになっている。
更に、シクロスポリン内服薬についても、長期服用に伴う腎機能障害や高血圧等の副作用が懸念される。
特許文献１、２には、掻痒の抑制剤としての利用の可能性については記載されているものの、実験例、具体的や有効成分や有効量、および効果については何ら記載がない。
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、副作用が少なく、アトピー性皮膚炎等の強い掻痒を伴う皮膚疾患の治療に有効な速効性のある掻痒抑制剤を提供することを目的とする。
本発明者は、掻痒誘発ペプチドであるＰ物質（substance P）で刺激した正常ヒト表皮角質細胞（ＮＨＥＫ）においてコレシストキニン２受容体（ＣＣＫ２Ｒ）が高発現しているという新たな知見に基づき、ＣＣＫ２Ｒシグナリングを介した掻痒抑制作用について鋭意検討した結果、コレシストキニン２受容体アゴニストによる掻痒の抑制効果を見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、コレシストキニン２受容体（ＣＣＫ２Ｒ）アゴニストを有効成分として含有することを特徴とする掻痒抑制剤を提供する。
コレシストキニン（Cholecystokinin，ＣＣＫ）は、消化管ホルモンとして知られているのに加え、中枢神経において神経ペプチドとして作用している。神経ペプチドのうち、ＣＣＫは中枢神経系で最も豊富に存在し、不安、抑うつ、記憶、食行動等の様々な生理機能に関与していることが知られている。コレシストキニンは、同一の遺伝子産物（プリプロコレシストキニン）から誘導され、Ｃ末端側のアミノ酸配列が共通で種々のアミノ酸残基長を有するペプチドの総称であり、通常は、そのアミノ酸残基数により、ＣＣＫ５８、ＣＣＫ３９、ＣＣＫ３３、ＣＣＫ２２、ＣＣＫ８、ＣＣＫ７等と呼ばれている。
これまで、コレシストキニンおよびその受容体の皮膚における機能についてはほとんど知られていなかったが、Ｐ物質等の掻痒誘発物質の刺激により表皮細胞においてコレシストキニン２受容体（以下、「ＣＣＫ２Ｒ」と略称することがある。）が高発現すること、およびこのようにして発現したＣＣＫ２Ｒに対しアゴニスト（作動薬）を作用させることにより、動物実験において掻破行動が抑制されることが確認された。
本発明の掻痒抑制剤において、前記コレシストキニン２受容体アゴニストが、
（１）下記の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＣＣＫ５８）のＣ末端側から７個以上の部分アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチド、および
Val-Ser-Gln-Arg-Thr-Asp-Gly-Glu-Ser-Arg-Ala-His-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ala-Arg-Tyr-Ile-Gln-Gln-Ala-Arg-Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Val-Lys-Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号１］
（なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Tyr(SO3H)はＯ−硫酸化チロシンまたはその塩を表す。以下において同じ。）
（２）上記（１）のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＣＫ２Ｒアゴニスト活性を有するペプチドからなる群より選択される１または複数であることが好ましい。
上記のコレシストキニン２受容体アゴニストは、経皮投与された場合にも皮膚を通して体内に吸収され、掻痒抑制効果を発揮できると共に、ステロイド外用薬やタクロリムス外用薬に比べ、副作用のおそれを大幅に低減できる可能性がある。
この場合において、前記コレシストキニン２受容体アゴニストが、下記の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または下記の配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが特に好ましい。
Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号２］
Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号３］
本発明の掻痒抑制剤は、肥満細胞の脱顆粒を抑制するものであってもよい。このような作用により、肥満細胞による信号伝達に媒介される掻痒や炎症反応の発現を抑制できると考えられる。
本発明の掻痒抑制剤は、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤、スプレー剤、貼付剤およびゲル剤のいずれかであってもよい。
これらはいずれも局所への皮下および経皮投与に好適な剤型である。
本発明によれば、副作用が少なく、アトピー性皮膚炎等の強い掻痒を伴う皮膚疾患の治療に有効な速効性のある掻痒抑制剤が提供される。
ＩＳＣマウス由来表皮角質細胞（Keratinocyte）およびマウス胎児皮膚由来肥満細胞（ＦＳＭＣ）におけるＣＣＫ１Ｒ、ＣＣＫ２ＲおよびＮＫ１Ｒの発現レベル（β−アクチンの発現レベルにより規格化）を示すグラフである。 Ｐ物質（ＳＰ）（１０-6Ｍ）への暴露時間がＩＳＣマウス由来表皮角質細胞におけるＣＣＫ２ＲおよびＣＣＫ１Ｒの発現レベルに及ぼす影響を示すグラフである。 ＡはＳＰによる刺激で掻痒を誘導したＩＣＲマウスにおける、ＣＣＫ２Ｒアゴニストの経皮投与が掻破行動に及ぼす影響を示すグラフであり、ＢはＣＣＫ８Ｓの皮内投与の有無がＳＰによる刺激で掻痒を誘導したＩＣＲマウスの掻破行動に及ぼす影響を示すグラフである。 ヒト表皮角質細胞（ＮＨＥＫ）、ＦＳＭＣおよびラット褐色細胞腫由来細胞（ＰＣ１２）におけるＣＣＫ２ＲおよびＮＫ１Ｒの発現レベルを示すグラフである。 Ａは、ＣＣＫ８Ｓの投与濃度とＮＨＥＫにおけるＩＬ−８の産生量の減少率との関係を示すグラフであり、ＢはＣＣＫ８Ｓの投与濃度とＦＳＭＣの脱顆粒の減少率との関係を示すグラフであり、ＣはＣＨＳモデルマウスにおける惹起の有無およびＣＣＫ８Ｓの投与の有無と耳翼の厚さとの関係を示すグラフである。 ＦＳＭＣにおけるＣＣＫ８Ｓの投与後の細胞内Ｃａ濃度の変化を示すグラフである。
本発明の実施の形態に係る掻痒抑制剤は、コレシストキニン２受容体（ＣＣＫ２Ｒ）アゴニスト（作動薬）を有効成分として含有している。掻痒抑制剤の製造に使用できるＣＣＫ２Ｒアゴニストとしては、掻痒発現物質により選択的に発現が増大したＣＣＫ２Ｒに結合し、掻痒の低減に関連する生理機能を発現させる任意の物質を使用することができる。ＣＣＫ２Ｒアゴニストの一例としては、ＣＣＫファミリーに属するいずれかのペプチドおよびその類縁体が挙げられ、投与経路、治療対象となる皮膚疾患の種類等に応じて適当なものを適宜選択して使用することができるが、その一例として、（１）コレシストキニンのＣ末端を含む全長アミノ酸配列もしくは３以上のアミノ酸残基からなるその一部と相同なアミノ酸配列を含むペプチド、または（２）前記（１）のペプチドのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＣＫ２Ｒアゴニスト活性を有するペプチド（以下、総称して「コレシストキニンペプチド」ともいう。）が挙げられる。これらのペプチドのうち１種類のみを掻痒抑制剤の製造に使用してもよく、アミノ酸鎖長の異なる任意の２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
使用するコレシストキニンペプチドの分子量は、ＣＣＫ２Ｒに対するアゴニスト活性、投与経路等に応じて適宜選択される。一般に、皮膚から体内に吸収される物質の分子量の上限が３０００程度であるが、皮膚疾患の発症等により角層が障害されている場合には、それ以上の分子量の化合物も経皮吸収されうる。したがって、経皮投与用の掻痒抑制剤の製造に使用するコレシストキニンペプチドの分子量は必ずしも３０００以下である必要はない。そのため、掻痒抑制剤の製造に使用できる好ましいＣＣＫ２Ｒアゴニストとしては、
（１）下記の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（ＣＣＫ５８）のＣ末端側から７個以上の部分アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチド、および
Val-Ser-Gln-Arg-Thr-Asp-Gly-Glu-Ser-Arg-Ala-His-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ala-Arg-Tyr-Ile-Gln-Gln-Ala-Arg-Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Val-Lys-Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号１］
（２）上記（１）のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＣＫ２Ｒアゴニスト活性を有するペプチドからなる群より選択されるペプチドが挙げられる。
例えば、アミノ酸の置換の例としては、配列番号１のアミノ酸配列中、Ｃ末端側から７番目のＯ−硫酸化チロシンが通常のチロシンに置換されたもの、Ｃ末端のアミド化されたフェニルアラニンが通常の（アミド化されていない）フェニルアラニンに置換されたもの等が挙げられる。
これらのペプチドのうち１種類のみを掻痒抑制剤の製造に使用してもよく、任意の２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
より好ましいコレシストキニンペプチドの具体例としては、下記の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたは下記の配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるコレシストキニンペプチドが挙げられる。
Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号２］
Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号３］
これらのコレシストキニンペプチドのうち１種類のみを掻痒抑制剤の製造に使用してもよく、任意の２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
これらのコレシストキニンペプチドの起源について特に制限はなく、生体由来のもの、遺伝子組み換え法によりＥ．Ｃｏｌｉ等の微生物に産生させたもの、化学合成法により合成したもののいずれも使用できる。
掻痒抑制剤は、上記のコレシストキニンペプチド等のＣＣＫ２Ｒアゴニストを、医薬用途に許容される製剤添加物と所定の混合比で混合することにより製造される。掻痒抑制剤は、局所への皮下および経皮投与に好適な任意の剤型に製剤することができ、このような剤型の具体例としては、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、酒精剤、リニメント剤、ローション剤等の外用液剤、スプレー剤（外用エアゾール剤）、テープ剤、パップ剤等の貼付剤等が挙げられる。
なお、経皮投与の場合、ＣＣＫ２Ｒアゴニストの吸収率を向上させるために、テープストリッピング等により角質層の少なくとも一部を除去してもよい。
使用される製剤添加物の種類および量は、剤型や有効成分として添加されるＣＣＫ２Ｒアゴニストの種類（構造、分子量等）、添加量等に応じて適宜選択される。製剤添加物の具体例としては、下記のものが挙げられる。
（ａ）注射剤の場合：注射用水、生理的食塩水、リンゲル液等の水性溶液、植物油等の非水性溶媒、界面活性剤または乳化剤（懸濁性または乳濁性注射剤の場合）
（ｂ）軟膏剤の場合：ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、蜜ろう、動植物油等の疎水性基剤、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、マクロゴール剤等の親水性基剤
（ｃ）ローション剤の場合：エタノール、グリセリン等の溶剤、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース等の懸濁化剤、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルビン酸エステル等の乳化剤
（ｄ）外用エアゾール剤の場合：ＬＰＧ、ジメチルエーテル、フルオロカーボン類等の液化ガス、窒素、炭酸ガス等の圧縮ガス、各種溶剤、懸濁化剤および乳化剤（乳化型の場合）
その他、必要に応じて、安定剤、殺菌剤、保存料、香料等の成分を適宜添加してもよい。また、皮膚疾患の治療用の他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。
これらの製剤中に有効成分として添加されるＣＣＫ２Ｒアゴニストの量は、製剤の用法および用量等に応じて適宜決定され、例えば液剤の場合には、０．１〜０．５ｎｍｏｌ／１３μＬ（皮膚１ｃｍ2あたりに塗布するために必要な液剤の量）、好ましくは０．２〜０．３５ｎｍｏｌ／１３μＬのＣＣＫ２Ｒアゴニストを含むように調剤される。ＣＣＫ２Ｒアゴニストの投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等の要因に依存するため一義的に決定することは困難であるが、例えば、１回の塗布あたり０．１〜０．５ｎｍｏｌ／ｃｍ2、好ましくは０．２〜０．３５ｎｍｏｌ／ｃｍ2である。
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
［１］物質および実験動物
本実施例において使用したコレシストキニンペプチドは、下記の配列番号２〜６で表されるアミノ酸配列からなる５種類のペプチドである。
ＣＣＫ８Ｓ Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号２］
ＣＣＫ７Ｓ Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号３］
ＣＣＫ８ Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号４］
ＣＣＫ７ Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号５］
ＣＣＫ６ Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号６］
なお、本実施例において、「ＣＣＫｍ（ｍは７または８）Ｓ」は、Ｃ末端側から７番目のＴｙｒが硫酸化を受けた「天然型」のコレシストキニンを表し、「ＣＣＫｎ（ｎは６、７または８）」は、Ｃ末端側から７番目のＴｙｒが硫酸化を受けていないコレシストキニン類縁体を表す。
ＣＣＫ８Ｓ、ＣＣＫ８、ＣＣＫ７Ｓ、ＣＣＫ６は株式会社ペプチド研究所より、ＣＣＫ７はフナコシ株式会社より購入した。
Ｐ物質（ＳＰ）は株式会社ペプチド研究所より、肥満細胞を刺激して脱顆粒を起こさせる試験物質であるCompound 48/80は米国Sigma社より、ヒスタミンは和光純薬株式会社より、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ−２）アゴニストであるヘキサペプチドSer-Leu-Ile-Gly-Arg-Leu-NH2は米国Tocris社より、それぞれ購入した。
ＩＣＲ雌性マウスおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスは、株式会社ＫＢＴオリエンタルより購入した。これらのマウスは、産業医科大学動物研究センターにおいて特定病原微生物を持たない（ＳＰＦ）状態で飼育され、６〜８週齢に達したものを使用した。
動物実験は、産業医科大学動物管理使用規程に準拠して行った。
細胞および細胞培養
１）正常ヒト表皮角質細胞（ＮＨＥＫ）
正常ヒト表皮角質細胞（ＮＨＥＫ）の初代培養細胞は、Lonza社より購入した。ＮＨＥＫをKeratinocyte Growth Medium-2（KGM-2、Lonza社）で培養し、実験の際には、Keratinocyte Basal Medium-2（KBM-2、Lonza社）を用いた。培養および実験のいずれも、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ中で行った。
２）ＩＣＲマウス由来表皮角質細胞
ＩＣＲマウス新生仔の皮膚を生後２４時間以内に剥離し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気下、０．０５％コラゲナーゼ（clostridium histolyticum由来、タイプ２、Sigma社）中で２日間インキュベートした。表皮シートを回収し、培地中に懸濁した。細胞懸濁液を６ウェルプレート（Corning Glass Works社）上に播種し、ＣｎＴ−０７培地（フナコシ株式会社）中でサブコンフルエントで培養した。
３）マウス胎児皮膚由来肥満細胞（ＦＳＭＣ）
１４日齢マウス胎児の皮膚を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Gibco社）中３７℃で２０分間トリプシン消化した。RBC lysing buffer (Sigma社)を用いて赤血球を溶解させ、洗浄後、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、抗生／抗真菌剤、０．１％メルカプトエタノールを添加したcomplete RPMI培地（RPMI-1640：Gibco社）中に細胞を再懸濁させた。細胞懸濁液５０ｍＬを細胞培養フラスコに取り、組み換えマウスＩＬ−３（Invitrogen社、２０ｎｇ／ｍＬ）および組み替えマウス幹細胞因子（Biosource社、２０ｎｇ／ｍＬ）を加え、培地を交換せずに３７℃で培養した。非接着性細胞および軽く付着した細胞を回収した。細胞を遠心分離後、再度ＲＰＭＩ中に懸濁させ、４０％パーコール（GE Healthcare社）上に載せ、室温で遠心分離した。細胞ペレットをＦＳＭＣとして使用した。
４）ラット褐色細胞腫由来細胞（ＰＣ１２）
ＰＣ１２（ＪＣＲＢ０７３３）は、ＨＳ研究資源バンクより入手した。ＰＣ１２細胞を、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Sigma社）中で培養した。実験に用いる際には、フィブロネクチンでコーティングしたカバーガラス上にＰＣ１２細胞を播種し、組み換えラットβ−ＮＧＦで２４時間以上処理した後に使用した。
［２］分析法
統計解析
データの解析には、対応のないｔ検定（unpaired-Student's-t-test）を用いた。Ｐ＜０．０５である場合を有意とした。
マイクロアレイ
ＤＮＡマイクロアレイ分析のために、RNeasy Mini Kit（Qiagen社）を用いてＮＨＥＫから全ＲＮＡを抽出した。DNASIS Array（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて、プレートリーダより得られた画像データの解析を行った。
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen社)を用いて、細胞ペレットより全ＲＮＡを抽出した。Taqman逆転写試薬（Applied Biosystems社）を用いて全ＲＮＡサンプルよりｃＤＮＡを生成した。SYBR Green Dye (PE Biosystems社)およびABI PRISM 7000配列検出システム（Applied Biosystems社）を用いて、ｍＲＮＡ発現量の定量を行った。プライマーの設計には、ヒトおよびマウス用のものについてはPrimer Bank、ラット用のものについてはPrimer 3をそれぞれ用いた。プライマー配列（Invitrogen社）は下記のとおりである。
ヒトβ−アクチン：GGGAAATCGTGCGTGACATT および GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG、
ヒトＣＣＫ２Ｒ：GGGACACGAGAATTGGAGCTG および CGGTGCCAAAGATGAATGTGC、
ヒトＮＫ１Ｒ：CTCAGACCTCTCCCCAAACAT および CCACAATGACCGTGTAGGCAG、
マウスβ−アクチン：GGGAAATCGTGCGTGACATT および GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG、
マウスＣＣＫ２Ｒ：GATGGCTGCTACGTGCAACT および CGCACCACCCGCTTCTTAG、
マウスＣＣＫ１Ｒ：CACGCTGGTTATCACGGTG および GCCCATGAAGTAGGTGGTAGTC、
マウスＮＫ１Ｒ：CTCCACCAACACTTCTGAGTC および TCACCACTGTATTGAATGCAGC、
ラットβ−アクチン：AGCCATGTACGTAGCCATCC および CTCTCAGCTGTGGTTGGTGAA、
ラットＣＣＫ２Ｒ：TCTCCCGCGAACTCTACCTA および ACACAGCAGCCATCACTGTC、
ラットＮＫ１Ｒ：TGGGCAACGTAGTGGTGATA および CACGGCTGTCATGGAGTAGA。
リアルタイムＰＣＲの条件は以下のとおりである。
５０℃２分間、９５℃１０分間、次いで９５℃１５秒間および６０℃１分間の増幅サイクルを５０サイクル。
加熱および冷却工程における昇温および降温速度は、全て２０℃／分であった。相対発現量はΔＣｔ法を用いて計算した。
ウェスタンブロッティング
６ウェルプレート（Corning社）上に播種したＩＣＲマウス由来の表皮角質細胞を、ＳＰ（１０−８Ｍ）で０．５〜２４時間刺激し、ゴム製のポリスマンで回収後、RIPAバッファー（和光純薬株式会社、Tris-HCl [pH8.0]、150 mM塩化ナトリウム、0.5 w/v%デオキシコール酸ナトリウム、0.1 w/v%硫酸ドデシルナトリウム、および1.0 w/v% NP-40代替品）で抽出した。タンパク質サンプル２０μｇを８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて電気泳動（１８０ｍＡ、２時間）させ、ポリフッ化ビニリデンメンブレン上に転写した。スキムミルク溶液でブロッキング後、ウサギ由来抗マウスＣＣＫ１Ｒポリクローナル抗体（SC-33220；１：１０００、Santa Cruz社）またはウサギ由来抗マウスＣＣＫ２Ｒポリクローナル抗体（SC-33221；１：１０００，Santa Cruz社）とインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧ（１：３０００、Bio-Rad社）を用いて反応を検出した。ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare社)を用いて免疫ブロットを可視化した。CS Analyzer version 2.0（アトー株式会社）を用いて、吸光度分析法によりバンドを定量した。NIH/3T3全細胞溶解物（Santa Cruz社）を溶性対照として用いた。
サイトメトリックビーズアレイ
培地上清中のＩＬ−８濃度は、ベクトン・ディッキンソン社FACSCantoフローサイトメーターおよび同社のCytometric Bead Array (CBA） Flex Set Systemを用いて定量した。
フローサイトメトリー
フィコエリスリン（ＰＥ）と結合した抗マウスＦｃεＲＩ（eBionics社）およびAlexa Fluor 700と結合した抗マウスＣＤ１１７（c-kit）（eBionics社）を用い、氷浴上で２０分間細胞を染色し、２回洗浄後、ＦＡＣＳバッファー中に再度懸濁させた。ベクトン・ディッキンソン社FACSCantoフローサイトメーターおよびFlowJoソフトウェア（TreeStar社）を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。
（１）表皮角質細胞および肥満細胞におけるＣＣＫ２Ｒの発現
表皮角質細胞および肥満細胞は、共にＣＣＫによるＳＰに誘発される掻痒の抑制における標的である可能性を有している。表皮角質細胞が掻痒関連分子の受容体を発現していることが知られており、ＳＰ受容体はＮＫ１Ｒ、ヒスタミン受容体はＨ１受容体、トリプターゼ（合成アゴニスト、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2）受容体はプロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ−２）と表記される。肥満細胞がＮＫ１Ｒを有していることはよく知られている。
ＩＣＲマウス由来表皮角質細胞およびマウス胎児皮膚由来肥満細胞（ＦＳＭＣ）についてＣＣＫ受容体（ＣＣＫ１ＲおよびＣＣＫ２Ｒ）の発現を検討すると共に、後者についてはＮＫ１Ｒの発現も検討した。ＩＣＲマウス由来表皮角質細胞およびＦＭＳＣの初代培養物を回収し、リアルタイムＰＣＲ分析により、ＣＣＫ１Ｒ、ＣＣＫ２ＲおよびＮＫ１ＲをコードするｍＲＮＡの発現量を半定量的に決定した。
図１に示すように、両者の細胞においてＣＣＫ１ＲおよびＣＣＫ２Ｒの発現量は、ＮＫ１Ｒの発現量とほぼ同程度であった。β−アクチンの発現レベルを用いて発現レベルを規格化すると、ＦＳＭＣにおける３つの受容体の発現レベル（図１ｂ）は、表皮角質細胞（図１ａ、「Keratinocyte」）における発現レベルよりも高かった。
（２）正常ヒト表皮角質細胞（ＮＨＥＫ）におけるＳＰの刺激によるＣＣＫ２Ｒの発現
表皮角質細胞が、ＮＫ１受容体（ＳＰ）、Ｈ１受容体（ヒスタミン）、ＰＡＲ２受容体（トリプターゼ、合成アゴニストＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2（Ser-Leu-Ile-Gly-Arg-Leu-NH2））等の、掻痒に関連する分子の受容体を発現していることが知られている（カッコ内は、それぞれの受容体に対するアゴニストを示す。）。
ＤＮＡマイクロアレイ法を用いた正常ヒト表皮角質細胞（ＮＨＥＫ）の予備的分析において、高カルシウム濃度（０．６ｍＭ）下で、ＳＰ（１０-6Ｍ）、ヒスタミン（１０μｇ／ｍＬ）、またはＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2（１００ｎＭ）で刺激した場合における遺伝子発現レベルを検討した。
表１は、ＳＰ刺激時に発現が増強した上位２０の遺伝子について、その他ヒスタミン（histamine）、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2刺激時の値と合わせて示したものである。値は、Ｌｏｇ２（各刺激によるｍＲＮＡ発現量／コントロールの発現量）を示す。正常ヒト角化細胞をサブスタンスＰ（１０-6Ｍ）、ヒスタミン（１０μｇ／ｍＬ）、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2（１００ｎＭ）で培養し、刺激していない正常ヒト角化細胞と比較して各々のｍＲＮＡの発現比（２ｎ）を算出した。マイクロアレイを用いてｍＲＮＡの発現レベルを解析すると、ＳＰに刺激されたＮＨＥＫではＣＣＫ２Ｒが高発現し、その発現比は２8.67であった。しかし、ヒスタミンおよびＳＬＩＧＲＬで刺激したＮＨＥＫではＣＣＫ２Ｒの発現レベルに変化はなかった。これらの結果から、ＣＣＫ２ＲはＳＰで選択的に正に制御されることが示唆された。
Figure 2011049200
（３）ＩＣＲマウス由来表皮角質細胞におけるＳＰの刺激によるＣＣＫ２Ｒの発現
表皮角質細胞に対するＳＰの効果を決定するために、ＩＣＲマウス由来表皮角質細胞をＳＰの存在下で３０分間〜２４時間培養し、ウェスタンブロッティング法を用いてＣＣＫ２ＲおよびＣＣＫ１Ｒの発現レベルを分析した。ＣＣＫ２Ｒは、抗体によって７８ｋＤａのバンドとして検出され、ＳＰに５〜６時間暴露された表皮角質細胞において、その発現レベルが増大することが観測された（図２ａ参照）。一方、ＣＣＫ１Ｒ（抗体によって５０ｋＤａのバンドとして検出された。）の発現レベルはＳＰへの暴露によっては増大しないことが観測された（図２ｂ参照）。
（４）ＳＰに誘発される掻破行動に対するＣＣＫの効果
ＣＣＫ外用では表皮角質細胞に影響を与えると考えられることから、まず、掻痒関連掻破行動モデル（ＳＰ（100 nmol）を皮内投与したＩＣＲマウス）にＣＣＫ２Ｒアゴニストを経皮投与（アセトン：オリーブ油３：１溶剤を使用して調製した液剤を塗布）した。
実験の１日または２日前に、マウスの吻側背部を剃毛した。行動記録の前に、各マウス（１回の観察につき４頭）をアクリル製ケージ（１８×２３×１１ｃｍ）に入れ、１時間以上馴致させた。ＳＰ（１００ｎｍｏｌ生理食塩水溶液）を皮内投与すると、後肢による投与部位付近への掻破行動が誘導される。コレシストキニンペプチドの投与は、経皮投与および皮内注射の２通りの経路で行った。経皮投与を行うマウスについては、実験の前日に剃毛した背部の皮膚に対しテープストリッピング（６回）を行い、ＳＰの注射（１００ｎｍｏｌ）の３〜４分前に、アセトン／オリーブ油（３：１）に溶解したコレシストキニンペプチド（０．５ｎｍｏｌ）２０μＬを塗布した。皮内注射を行うマウスについては、コレシストキニンペプチド（０．０５ｎｍｏｌ、２０μＬ生理食塩水溶液）をＳＰと当時に投与した。処置直後に、マウスを元のケージに戻し、デジタルビデオカメラを用いて４０分間の行動を記録した。最初の２０分間について、投与部位への後肢による掻破行動の回数を計測した。
図３に示すように、ＣＣＫ８Ｓ、ＣＣＫ７Ｓを投与した場合には、掻破行動の有意な減少が観測された。一方、Ｃ末端側から７番目の硫酸化を受けたＴｙｒが存在しないＣＣＫ８、ＣＣＫ７、ＣＣＫ６を投与した場合には掻破行動の有意な減少は観測されなかった。
これらの結果から、掻破行動抑制効果を有するコレシストキニンには、Ｃ末端側から７番目の硫酸化を受けたアミノ酸（Ｔｙｒ）の存在が必須であることがわかる。
さらに、ＣＣＫ８Ｓを皮下投与した場合にも掻破行動が抑制されることを確認した。
この結果から、表皮角質細胞に加え、掻痒の発現に関与する肥満細胞等の真皮に存在する細胞がＣＣＫの標的になってことが示唆された。
（５）肥満細胞、神経細胞（培養細胞）におけるＣＣＫ２Ｒの発現
肥満細胞がＮＫ１受容体（ＮＫ１Ｒ）を発現しているという事実、およびＣＣＫ８Ｓの皮内投与によりＳＰに誘導されるＩＣＲマウスの掻破行動が抑制されるという上述の観察結果を踏まえ、表皮角質細胞に加え、肥満細胞、神経細胞におけるＣＣＫ２ＲおよびＮＫ１Ｒの発現の有無について検討した。
表皮角質細胞、肥満細胞および神経細胞の例として、それぞれ、ＮＨＥＫ、ＦＳＭＣ（マウス胎児皮膚由来肥満細胞）、およびＰＣ１２（ラット褐色細胞腫由来細胞）を選択し、これらの培養細胞より調製したサンプルにおける各受容体の発現量をリアルタイムＰＣＲで評価したところ、図４に示すように、いずれの細胞においてもＣＣＫ２ＲおよびＮＫ１Ｒの両者が発現しており、ＦＳＭＣおよびＰＣ１２において、ＮＨＥＫよりもＣＣＫ２Ｒの発現レベルが高いことが確認された。
（６）表皮角質細胞におけるＩＬ−８の産生および肥満細胞の脱顆粒にＣＣＫ２Ｒアゴニスト投与が及ぼす効果
上述の結果は、ＣＣＫ８Ｓは表皮角質細胞や肥満細胞の活性を抑制することにより掻痒を抑制していることを示唆している。掻痒抑制に関連するＣＣＫ８Ｓの標的細胞を明らかにするため、表皮角質細胞および肥満細胞におけるＣＣＫ８Ｓ投与の効果をin vitroで評価した。
ＮＨＥＫを種々の濃度のＣＣＫ８Ｓ（ＣＣＫ８Ｓ濃度１０-9、１０-8、１０-7Ｍ、Ｃａ濃度０．１５ｍＭあるいは０．６ｍＭ）で刺激した。その結果、いずれのＣａ濃度においても、上清中のＩＬ−８産生はＣＣＫ８Ｓの濃度に依存して減少した（図５Ａ参照）。
β−ヘキソアミニダーゼアッセイ
ＦＳＭＣをTyrode's buffer（Sigma社）で洗浄後、９６ウェルプレート中に、２×１０4個／ウェルずつ再懸濁させた。ＣＣＫ８Ｓの共存下または非共存下、３７℃で１５分間、ＦＳＭＣをcompound 48/80で刺激した。プレートを５分間遠心後、上清を他の９６ウェルプレートに移し、細胞ペレットを０．５％Triton X-100（Sigma社）を含むTyrode's buffer中に再懸濁させた。上清および細胞溶解物（５０μＬ）を４ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトキサミニド（１００μＬ）と共に、クエン酸バッファー（ｐＨ４．５）中３７℃で９０分間インキュベートした。０．４Ｍグリシン（ｐＨ１０．７、２００μＬ）を加えて反応を停止後、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad社）を用いて波長４０５ｎｍについて読み取りを行った（５９５ｎｍ参照フィルタを使用）。β−ヘキソアミニダーゼの放出活性は、上清および細胞溶解物における放出活性間の比率（百分率）として決定した。
ＦＳＭＣはcompound 48/80で脱顆粒する。これにＣＣＫ８Ｓ（１０-8、１０-7Ｍ）を加えると、ＦＳＭＣの脱顆粒の抑制が観測された（図５Ｂ参照）。この結果から、ＣＣＫ８Ｓが肥満細胞の機能を抑制することが示唆された。
（７）接触過敏マウスモデルにおけるＣＣＫ２Ｒアゴニスト投与の効果
またＤＮＦＢに対する接触過敏モデル（contact hypersensitivity，ＣＨＳ）マウスを用いて、ＣＣＫ８Ｓの投与効果を検討した。
ＣＨＳの感作および惹起ならびにコレシストキニンペプチドの投与
２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ、ナカライテスク）に対するＣＨＳの惹起のために、剃毛した腹部に０．５％ＤＮＦＢ（アセトン／オリーブ油３：１で希釈。２５μＬ）を塗布することにより、ＩＣＲマウスを２日間連続（第０日および第１日）で感作した。５日後、両耳の両則に、刺激をもたらさない濃度（０．２％）のＤＮＦＢを塗布した。チャレンジの前に、アセトン／オリーブ油（３：１）で希釈したＣＣＫ８Ｓ（各耳に対し０．５ｎｍｏｌずつ）またはアセトン／オリーブ油（３：１）を塗布した。チャレンジ前およびチャレンジから２４時間後に、厚さゲージを用いて耳翼の厚さを測定した。チャレンジ前後の耳翼の厚さの差より、耳翼の腫脹を求めた。
ＣＨＳモデルでは、ハプテンであるＤＮＦＢ（２，４−ジニトロフルオロベンゼン）で感作し、５日目にＤＮＦＢで接触過敏反応を惹起すると耳翼が腫脹する。この惹起直前にＣＣＫ８Ｓを外用すると、図５Ｃに示すように耳翼腫脹が抑制された。
ＣＨＳ惹起相には、皮膚を構成する細胞である表皮角質細胞、樹状細胞、肥満細胞等が関与しており、ＣＣＫ８Ｓがこれを抑制することを示唆された。これらの結果から、ＣＣＫ８Ｓは表皮角質細胞、肥満細胞に影響し、ＣＨＳを抑制すると予測される。ＣＣＫ８Ｓはかゆみ関連の反応を直接抑制するに加え、表皮角質細胞のサイトカイン・ケモカイン産生、免疫反応もＣＣＫ８Ｓに抑制されうると考えられた。
（８）ＣＣＫ８Ｓによる細胞内Ｃａの変化
ＣＣＫ８Ｓの経皮投与および皮内投与では、掻破行動の抑制について速効性が認められることから、ＣＣＫ８Ｓが表皮角質細胞や肥満細胞だけでなく、末梢神経に直接影響している可能性も考えられる。そこで、ＣＣＫ８Ｓが肥満細胞あるいは神経細胞に作用するかどうか知るため、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内Ｃａの変化を検討した。
共焦点イメージング
Zeiss LSM5 pascal（Carl Zeiss社）を用いて、蛍光染色した細胞の共焦点イメージングを行った。Fluo-4-AM(Invitrogen社)（１μＭ）を３７℃で２０分間染色し、２回洗浄後少なくとも４０分間静置した。肥満細胞は、Alexa Fluor 700と結合した抗マウスＣＤ１１７（c-kit）（eBionics社）を用いて染色した。LSM5高速共焦点レーザー顕微鏡を用い、細胞内Ｃａ濃度（励起波長４８８ｎｍ、発光波長＞５０５ｎｍ）およびＣＤ１１７の発現量（励起波長６３３ｎｍ、発光波長＞６５０ｎｍ）の同時測定を行った。共焦点イメージ（５１２×５１２ピクセル）の記録は室温で行った。ＳＰ、コレシストキニンペプチド等による刺激は、これらの物質を含む溶液（１０μＬ）を直接培養液中に滴下することにより行った。画像データの解析は、Zeiss LSM510解析ソフトウェア(LSM Image Examiner)を用いて行った。
図６に示すように、ＣＣＫ８ＳをＦＳＭＣに投与すると、投与１分以内に一過性の細胞内Ｃａの上昇がみられ、これは全体の４５％であった。一方で、ＰＣ１２細胞ではＣＣＫ８Ｓへの反応が観測されなかった。これらの結果より、ＣＣＫ８Ｓは肥満細胞のシグナリングに影響すると考えられる。
本発明は、アトピー性皮膚炎等の掻痒を伴う皮膚疾患の治療薬として利用できる。

Claims (5)

  1. コレシストキニン２受容体（ＣＣＫ２Ｒ）アゴニストを有効成分として含有することを特徴とする掻痒抑制剤。
  2. 前記コレシストキニン２受容体アゴニストが、
    （１）下記の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端側から７個以上の部分アミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチド、および
    Val-Ser-Gln-Arg-Thr-Asp-Gly-Glu-Ser-Arg-Ala-His-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Ala-Arg-Tyr-Ile-Gln-Gln-Ala-Arg-Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Val-Lys-Asn-Leu-Gln-Asn-Leu-Asp-Pro-Ser-His-Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号１］
    （なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Tyr(SO3H)はＯ−硫酸化チロシンまたはその塩を表す。）
    （２）上記（１）のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＣＫ２Ｒアゴニスト活性を有するペプチドからなる群より選択される１または複数であることを特徴とする請求項１記載の掻痒抑制剤。
  3. 前記コレシストキニン２受容体アゴニストが、下記の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または下記の配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項２記載の掻痒抑制剤。
    Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号２］
    Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ［配列番号３］
  4. 肥満細胞の脱顆粒を抑制することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の掻痒抑制剤。
  5. 注射剤、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤、スプレー剤、貼付剤およびゲル剤のいずれかである請求項１から４のいずれか１項記載の掻痒抑制剤。
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