JPWO2010044468A1 - インフルエンザウイルス由来のrnaポリメラーゼpb1−pb2タンパク質の発現系構築と結晶化 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)下記の(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドと、下記の(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドとを含む複合体。
(a1)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b1)配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b2)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b3)配列番号3のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(2)下記の(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドと、下記の(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドとを含む複合体。
(a1)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b4)配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b5)配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b6)配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(3) (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを含有する組換えベクター。
(4) (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを含有する組換えベクター。
(5) (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞。
(6) (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞。
(7)(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から(1)記載の複合体を採取することを含む、(1)記載の複合体の製造方法。
(8)(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から(2)の複合体を採取することを含む、(2)記載の複合体の製造方法。
(9)(1)記載の複合体の結晶。
(10)(2)記載の複合体の結晶。
(11)空間群がP21である(9)記載の結晶。
(12)単位格子が、a=41.12±50Å、b=61.37±50Å、c=45.36±50Åの大きさとβ=103.5±30°の角度を持つ(11)記載の結晶。
(13)(1)又は(2)記載の複合体を沈殿剤の存在下に結晶化させることを含む、(1)又は(2)記載の複合体の結晶の製造方法。
(14)沈殿剤がリン酸カリウム及びPEG 4000である(13)記載の方法。
(15)下記の(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチド。
(a1)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(16)(15)記載のポリペプチドをコードするDNA。
(17)(16)記載のDNAを含有する組換えベクター。
(18)(15)記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞。
(19)(15)記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から(15)記載のポリペプチドを採取することを含む、(15)記載のポリペプチドの製造方法。
(20)下記の(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチド。
(b1)配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b2)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b3)配列番号3のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(21)下記の(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチド。
(b4)配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b5)配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b6)配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(22)(20)又は(21)記載のポリペプチドをコードするDNA。
(23)(22)記載のDNAを含有する組換えベクター。
(24)(20)又は(21)記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞。
(25)(20)又は(21)記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から(20)又は(21)記載のポリペプチドを採取することを含む、(20)又は(21)記載のポリペプチドの製造方法。
(26)候補物質の存在下で、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼを構成するPB1サブユニット又はその部分断片とPB2サブユニット又はその部分断片とを接触させ、前記PB1サブユニット又はその部分断片と前記PB2サブユニット又はその部分断片との相互作用を阻害する物質を選択する工程を含む、抗インフルエンザ薬の有効成分となり得る物質のスクリーニング方法。
(27)PB1サブユニットが以下の(a4)又は(a5)のポリペプチドからなるものである(26)に記載の方法。
(a4) 配列番号16のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a5) 配列番号16のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのPB1サブユニット活性を有するポリペプチド
(28)PB1サブユニットの部分断片が(15)に記載のポリペプチドからなるものである(26)に記載の方法。
(29)PB2サブユニットが以下の(b7)又は(b8)のポリペプチドからなるものである(26)に記載の方法。
(b7) 配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b8) 配列番号18のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのPB2サブユニット活性を有するポリペプチド
(30)PB2サブユニットの部分断片が(20)又は(21)に記載のポリペプチドからなるものである(26)に記載の方法。
(31)PB1サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号16のアミノ酸配列におけるLeu 695、Lys 698、Phe 699、Val 715、Asp 725、Ile746及びIle 750のアミノ酸残基並びに配列番号2のアミノ酸配列における前記アミノ酸残基に対応する残基からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である(26)〜(30)のいずれかに記載の方法。
(32)PB2サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号4、18又は20のアミノ酸配列におけるGlu 2、Arg 3、Ile 4、Lys 5、Glu 6、Leu 7、Arg 8、Asn 9及びLeu 10からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である、(26)〜(30)のいずれかに記載の方法。
(33)PB1サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号16のアミノ酸配列におけるLeu 695、Phe 699、Val 715、Ile746及びIle 750のアミノ酸残基並びに配列番号2のアミノ酸配列における前記アミノ酸残基に対応する残基からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である(26)〜(30)のいずれかに記載の方法。
(34)PB2サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号4、18又は20のアミノ酸配列におけるGlu 2、Ile 4、Leu 7及びLeu 10からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である、(26)〜(30)のいずれかに記載の方法。
(35.)候補物質が、化合物及びその塩、ペプチド、抗体並びに核酸からなる群から選択される少なくとも一種である、(26)〜(34)のいずれかに記載の方法。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2008年10月17日に出願された日本国特許出願(特願2008-268052号)及び2009年5月19日に出願された日本国特許出願(特願2009-121376号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、下記の(a1)、(a2)又は(a3)のポリペプチドと、下記の(b1)、(b2)又は(b3)のポリペプチドとを含む複合体を提供する。
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b1)配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b2)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b3)配列番号3のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b4)配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b5)配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b6)配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
これらの条件において、温度を下げる程に高い相同性を有するDNAのみならず、低い相同性しか有していないDNAまでも包括的に得ることができる。逆に、温度を上げる程、高い相同性を有するDNAのみを得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度以外にも塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAと少なくとも86%以上、好ましくは88%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するDNAが挙げられる。
複合体が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地から複合体を分離し、精製すればよい。複合体が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物から複合体を分離し、精製すればよい。
1.概要
本発明は、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼを構成するPB1サブユニットとPB2サブユニットとの相互作用を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。本発明は、そのような物質を抗インフルエンザ薬の有効成分になり得るものとして選択することを特徴とするものである。
インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのサブユニットは、PAサブユニット、PB1サブユニット及びPB2サブユニットの3つのサブユニットから構成され、PAにPB1が、そしてPB1にPB2が結合することにより三者複合体を形成し、RNAポリメラーゼの活性を有する活性体となる。
(1)RNA依存性RNAポリメラーゼ複合体
インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ複合体は、インフルエンザウイルスゲノムにおける8つのセグメントのそれぞれに結合するタンパク質複合体であり、ウイルスの転写及び複製に必須の複合体である。
RNAポリメラーゼ複合体は、ウイルスの転写、複製、病原性において必須の役割を果たすことから、そのアミノ酸配列はウイルス種間を超えて高度に保存されている。一方、ヒトタンパク質との相同性はないことから、この複合体を標的とする薬剤は副作用を低減できる点で有用である。
これらサブユニットの構造については、いくつか報告があるものの、ごく限られている(Area, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 308-313 (2004); Torreira, E. et al. Nucleic Acids Res. 35, 3774-3783 (2007);Tarendeau, F. et al. Nature Struct. Mol. Biol. 14, 229-233 (2007); Guilligay, D. et al. Nature Struct. Mol. Biol. 15, 500-506 (2008))。このことは、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼ複合体のX線結晶構造を解析すること自体が、当業者にとって非常に困難であったことを示す。
本発明におけるPB1サブユニット(「PB1」ともいう)としては、配列番号16のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
また、配列番号16のアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、当該ポリペプチドの変異体にも、PB2との相互作用を有するポリペプチドが存在し得る。したがって、配列番号16のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのPB1サブユニット活性を有するポリペプチドも、本発明の方法に使用することが可能である。
本発明におけるPB1サブユニットの部分断片としては、下記の(a1)、(a2)又は(a3)のポリペプチドが挙げられる。
(a1)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(i) 配列番号16のアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号16のアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号16のアミノ酸配列に1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
但し、配列番号2又は配列番号16のアミノ酸配列におけるLeu 695、Lys 698、Phe 699、Val 715、Asp 725、Ile746及びIle 750、好ましくはLeu 695、Phe 699、Val 715、Ile746及びIle 750は、PB2と相互作用し、PB2との結合を維持するために必要なアミノ酸である。したがって、上記アミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも1個のアミノ酸残基は、上記変異が生じていないことが好ましい。
また、配列番号2のアミノ酸配列は、配列番号16のアミノ酸配列におけるN末端から数えて678番目から757番目のアミノ酸残基と同一である。従って、配列番号2のアミノ酸配列には、配列番号16のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基に対応する残基が存在する。そこで、配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の表記については、配列番号16のアミノ酸配列のN末端から数えた番号を適用する。この番号で表記するアミノ酸配列を「対応する残基」という。例えば、配列番号2のアミノ酸配列のN末端から数えて38番目のバリン残基は、配列番号16のアミノ酸配列におけるVal 715に対応するので、前記38番目のバリン残基を「Val 715に対応する残基」という(配列番号2のアミノ酸配列における他のアミノ酸残基についても同様)。
本発明においては、上記PB1をコードするポリヌクレオチドは、PB1又はこれらの変異体を作製する際に使用される。
(i) 配列番号15のヌクレオチド配列又はその部分配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)の核酸が欠失したヌクレオチド配列、
(ii) 配列番号15のヌクレオチド配列又はその部分配列中の1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)の核酸が他の核酸で置換されたヌクレオチド配列、
(iii) 配列番号15のヌクレオチド配列又はその部分配列に1〜10個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)の核酸が付加したヌクレオチド配列、
(iv)上記(i)〜(iii)の組合せにより変異されたヌクレオチド配列などが挙げられる。
本発明において、ヌクレオチド配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
本発明におけるPB2サブユニット(「PB2」ともいう)としては、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
また、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、当該ポリペプチドの変異体であっても、PB1との相互作用を有するポリペプチドが存在し得る。したがって、配列番号18のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのPB2サブユニット活性を有するポリペプチドも、本発明の方法に使用することが可能である。
本発明におけるPB2サブユニットの部分断片としては、下記の(b1)、(b2)又は(b3)のポリペプチドが挙げられる。
(b1)配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b2)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b3)配列番号3のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b4)配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b5)配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b6)配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
PB2サブユニットのPB1サブユニットとの結合活性の有無については、前記と同様の公知の方法を用いることにより、判断することができる。
(i) 配列番号18のアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号18のアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号18のアミノ酸配列に1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
(i) 配列番号4又は20のアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号4又は20のアミノ酸配列中の1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号4又は20のアミノ酸配列に1〜9個(例えば、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
PB2についての部位特異的変異誘発法、PB2へのタグ配列の付加、ストリンジェントな条件の定義、ハイブリダイゼーションの方法、変異の態様、PCR法などは、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号17、配列番号18である点を除き、前記と同様である。
本発明において、「相互作用」とは、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼにおいて複合体を形成する構成因子PB1とPB2とが会合して結合することを意味する。相互作用の種類として、例えば、水素結合、疎水的会合、疎水結合などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
また、「相互作用」には、PB1-PB2間のシグナル伝達も含まれる。PB1-PB2間のシグナル伝達は、例えば、PB1サブユニット及びPB2サブユニットの相互作用部位における少なくとも一つのアミノ酸残基を介して行われる。
また、本発明において、「相互作用部位」とは、PB1とPB2との接触面(接触界面)に現れるアミノ酸残基のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列をいう。
よりさらに好ましくは、Val 715である。
本明細書において「候補物質」とは、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼ活性を変化させることのできる任意の分子である。例えば、天然又は合成の低分子化合物ライブラリー由来の化合物、遺伝子ライブラリーの発現産物(ペプチド、タンパク質等)、天然又は合成のオリゴ核酸、天然又は合成のペプチドライブラリー由来のペプチド、抗体、細菌由来の物質(細菌から代謝により放出される物質等)、微生物、植物細胞抽出液、動物細胞抽出液、培養液(微生物、植物細胞、動物細胞等の培養物)由来の化合物、土壌中の化合物、ファージディスプレイライブラリー等に含まれる化合物などが挙げられる。化合物は、従来の化学的手段、物理的手段及び/又は生化学的手段により改変したものであってもよく、たとえばアルキル化、エステル化、アミド化などの直接的化学修飾又はランダムな化学修飾に付して構造的類似体に改変させることができる。
本発明のスクリーニング方法は、PB1若しくはPB2を産生する細胞、又はこれらの細胞の細胞調製物を用いて、例えば生化学的手法により行うことができ、また、PB1及びPB2のうち少なくとも一つは精製された形態のものを使用することも可能である。「細胞調製物」としては、細胞の培養物、培養細胞の破砕物、培養細胞から分画された細胞質、核などのオルガネラなどが挙げられる。また、PB1又はPB2を産生する細胞としては、一般の遺伝子工学的手法で使用される細胞が挙げられる。これらの細胞は、PB1遺伝子及びPB2遺伝子のうち少なくとも一つが導入されて発現しているものを使用することができる。遺伝子の導入法は当分野で周知であり、容易に実施することができる(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照)。
また、PB1又はPB2を調製するその他の方法として、PB1又はPB2がアフィニティータグを融合した形になるように形質転換体又は無細胞系タンパク質合成で産生させ、PB1及びPB2を分離、精製する方法を例示することができる。
(i)候補化合物の存在下及び非存在下で、PB1とPB2とを接触させ、
(ii)候補化合物の存在下及び非存在下におけるPB1とPB2との相互作用をそれぞれ測定し、
(iii)前記(ii)で測定された測定結果に基づき、PB1とPB2との相互作用に影響を与える候補化合物を選択する。
前記(iii)で選択された候補化合物を、PB1とPB2との相互作用に影響を与える物質、あるいは抗インフルエンザ薬の有効成分であると同定する。
PB1とPB2との間の結合を速度論的に解析する系としては、例えば表面プラズモン共鳴法などを使う方法も挙げられる。この方法では、例えばBIACORE(登録商標)タンパク質相互作用解析システムなどが使用される。
PB1とPB2との相互作用を量的に解析する系においては、PB1及びPB2の全てを産生する細胞又は当該細胞の細胞調製物を用いて行なうことが可能である。
本発明のPB1及びPB2は、これらの相互作用を阻害する物質、又は抗インフルエンザ薬の有効成分となり得る物質のスクリーニング用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは上記PB1及びPB2を含むが、その他に、遺伝子発現に必要なベクター、プライマー、制限酵素、標識物質、検出用試薬などを含めることができる。標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等を意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の方法を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質(発色性基質等)、酵素基質溶解液、酵素反応停止液などを含めることができる。さらに、本発明のキットには、候補化合物用希釈液、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器(エッペンドルフチューブ等)、洗浄剤、実験操作マニュアル(説明書)等を含めることもできる。
インフルエンザウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼは多機能性ヘテロ三量体であり、”cap-snatching”機構を用いてウイルスmRNAを生産する。宿主細胞mRNAが切断されて、cap-bearingオリゴヌクレオチドが生産される。このオリゴヌクレオチドはウイルスゲノムRNAを鋳型として用いて伸長することができる。ウイルスゲノムRNAが結合すると、cap結合性及びエンドヌクレアーゼ活性が活性化する。それには、RNA結合性PB1サブユニットからcap結合性PB2サブユニットへのシグナル伝達と、ポリメラーゼ活性に必須のこれら2つのサブユニット間の界面が必要である。本発明者らは、タンパク質結晶学により相互作用表面を規定し、接触残基の突然変異がホロ酵素の機能に及ぼす効果を試験した。この新規な界面は、250 kDaポリメラーゼを制御するのに重大な役割を果たすが、驚くほど小さく、トリとヒトインフルエンザの間で完全に保存されている。
PB1とPB2との相互作用をより詳細にキャラクタライズするために、本発明者らは、共沈アッセイを用いて、PB1のC末端断片とPB2のN末端断片との結合を観察した。PB1の短い領域、残基678-757だけが緊密な結合に必要であることがわかっていた(21)。この断片(PB1-Cと呼ぶ)をPB2の残基1-37、1-86、37-174、252-490及び530-759とともに試験したところ、PB2の1-37と1-86断片のみが結合を示した(図1D)。PB2の残基37-177はPB1のC末端と結合せず、これは、PB2のN末端の27アミノ酸の欠失によりウイルスRNAポリメラーゼ活性が劇的に消失したことを示したPeralesらと一致する(25)。さらに、彼らは、PB2のN末端124残基がウイルス転写のドミナントネガティブインヒビターのような挙動をすることを示した。さらに、このタンパク質のN末端に対するPB2特異的モノクローナル抗体は、おそらく、PB1への結合を妨害することにより、in vitroで転写開始工程を抑制できる(26, 27)。
本発明者らの実験によれば、提案されている第二のPB1結合部位を含むPB2残基530-759は、PB1のC末端と相互作用することが見出されなかった。これらの結果は、明らかに、PB1のC末端とPB2のN末端が緊密で必須のサブユニット界面を形成することを示している。相互作用する断片は、PB1の80残基とPB2の37残基という、各サブユニットからのとりわけ短い配列である。これらの断片は、サブユニット間における重要な伝達に関与するが、これらの断片の分子量は、合わせても複合体の全分子量のわずか6%程度を含むに過ぎない。
このモデルの機能について試験するために、種々のPB2変異体を作製し、これら変異体のウイルスRNA合成レベルとin vitroでの複合体の安定性に対する効果を調べた(図6B-D)。機能アッセイにおいて、PB2の非存在下ではRNA産物が検出できなかった。また、PB2のヘリックス1を欠失させると、RNAポリメラーゼ活性は消失した。
また、Ile 4及びLeu 7をセリン残基に置換したPB2-N変異体(「I4S/L7S」)を用いて実験を行ったところ、そのRNA産物の産生量は大きく減少することが示された(図6B-D)。また、Leu 7及びLeu 10を同時にセリンに置換した変異体(「L7S/L10S」)もI4S/L7S変異体と同様に、RNA産物の産生量は大きく減少した(図6B-D)。
さらに、2種類の二重変異体(PB1のVal 715及びIle 750をセリンに置換した変異体(「V715S/I750S」)並びにPB1のIle 746及びIle 750をセリンに置換した変異体(「I746S/I750S」))を調製した。これらPB1変異体の双方において、vRNAの産生量は顕著に減少することが示された(図6B)。これらの変異体においては、cRNA及びmRNAの産生量も有意に減少したが、その減少の程度はvRNAに比較すると低いことが示された(図6C及びD)。これらの結果は、Leu 7が疎水性コアに埋もれている構造モデルからも理解できる。
非極性残基であるVal 715の側鎖は、極性残基であるLeu 7の側鎖の近くに埋もれている。しかしながら、Val 715の側鎖は、タンパク質表面の極性残基(Ser 713及びArg 754などを含む)の近くに存在するので、セリン側鎖に置換しても大きな影響を与えることがないと考えられる。また、Ile 750は、この構造モデルのタンパク質表面近くに位置することから、極性残基であるセリン残基に置換しても、PB1-PB2結合を阻害することなく、この位置に存在することができると考えられる。
一つの残基を置換した変異体PB2-Nを用いてさらに実験を行った。ウイルスmRNA産生量はHeLa細胞において評価した。RNA合成活性は、I4D変異体(4番目のアミノ酸残基をイソロイシンからアスパラギン酸に置換した変異体。以下同様)において有意に低下した。しかしながら、mRNA産生量は、Leu 7をアスパラギン酸に置換した変異体(L7D)においてさらに顕著に減少した(図7A)。同様の実験は、PB1のLeu 695をアスパラギン酸に置換した変異体(L695D)、Ile 750をアスパラギン酸に置換した変異体(I750D)、Phe 699をアラニンに置換した変異体(F699A)、及びVal715をセリンに置換した変異体(V715S)に対しても行った。これらの変異体は、80%の減少を示したV715Sを除き、いずれの変異体もmRNAの産生量の有意な減少を示さなかった(図7A)。
Leu 695及びIle 750はどちらも溶媒である水に近接する位置にある。おそらく、この水は、PB1-PB2結合を妨害することなく、アスパラギン酸残基がLeu 695又はIle 750のいずれかと置き換わることを許容するのであろう。PB2上の近隣のArg 8は、変異体においてAsp 750のカルボキシレート基との新規な相互作用を形成するのかもしれない。Val 715及びPhe 699の両方の側鎖はLeu 7の側鎖に近接して埋もれている。PB2のPhe 699をアラニンに置換すると(「F699A」)、界面内に実質的な空洞が導入されることが予想される。機能アッセイにおいてF699A変異体のmRNA産生量が有意に増加したのは、この空洞により生じた余分なフレキシビリティが原因かもしれない。上述の通り、V715S変異体の酵素活性が非常に強く低下したことは構造モデルからは予想できず、このことは、Ser 713及びArg 754を含むタンパク質表面での近くの極性残基がセリン側鎖を収容できるのであろうことを示唆している。バリンからセリンへの変異によりPB1-PB2相互作用が阻害又は大きく減少する理由は、構造モデルからは説明することができない。そこで、本発明者らは、V715S変異についてさらに実験を行うこととした。
逆遺伝学(reverse genetics)に基づく手法により、PB1ゲノムセグメントにV715S変異を有する組換えウイルス(「V715Sウイルス」という)を作製した。V715Sウイルスは、V715S変異を有するセグメント以外の7つのセグメントは全て野生型である。V715Sウイルスを実験に用いることにより、感染したvRNPからの一次転写レベルに対する単一部位突然変異(single-site mutation)の効果を分析することが可能となった。
野生型ウイルス又はPB1-V715SウイルスをそれぞれMOI=1でMDCK細胞に感染させた。感染から24時間後、細胞上清を採取し、MDCK細胞を用いてプラーク力価を決定した。
本発明者らは、V715Sウイルスを回収することに成功した(その力価は、野生型の力価よりわずかに低かった)(図7B)。RNAポリメラーゼはvRNP構造の一部である。従って、V715Sウイルスを単離することができたという結果は、Val715変異によりPB1-PB2相互作用が阻害されていないことを示す。
CHXを用いる前記試験方法により、本発明者らは、ウイルスゲノムの複製や三量体ポリメラーゼ複合体形成の効率とは独立して、ウイルスの転写活性を評価することができた。
次に、NP mRNAに特異的なプライマーセットを用いてリアルタイム定量PCRアッセイを実施した。
その結果、感染したV715S vRNPからの一次転写レベルは、野生型からの一次転写レベルと比較して顕著に減少することが示された(図7C)。
また、シクロヘキシミド非存在下における野生型ウイルス又はPB1-V715SウイルスのRNA合成活性を測定した。測定に際し、mRNAの産生量、cRNAの産生量、セグメント5 vRNAの産生量をそれぞれ別々に評価した。PB1-V715Sウイルスにおいて、各RNAの産生量は有意に減少した。βアクチンmRNAは、全ての操作において内部コントロールとして用いた。
一次転写レベルが低いことから予測できるとおり、V715Sウイルス感染細胞におけるvRNA、cRNA及びウイルスmRNAの合成は、CHXの非存在下でも減少した(図7D)。
in vitro及びin vivo機能アッセイの結果により、PB1のVal 715残基がRNA合成反応における二以上のステップに関与していることが強く示された。V715S変異が単にPB1-PB2結合をブロックしているにすぎないという可能性を排除するため、プルダウンアッセイを行った。プルダウンアッセイは、ヒスチジンタグが融合したPB2-NとPB1との複合体を共発現させ、この複合体をNi-NTAカラムに結合させることにより行った。
このプルダウンアッセイの結果は、上述した機能アッセイの結果とは対照的なものであった。本実施例では、イミダゾールで溶出する前に複合体を洗浄し、PB1の損失又は保持をゲル電気泳動で測定した。フリーのPB2-Nは不安定で、このアッセイでは検出されなかった。L695D、F699A及びI750D変異体は全てPB2-Nへの結合を示さなかったが、V715S変異体はPB2-Nへの結合を示した。これは、構造モデルから予想された通りである(図5C)。ポリメラーゼアッセイの結果とプルダウンアッセイの結果との間に相関がないのは、おそらく一部には、後者が平衡結合の試験ではなく、パートナータンパク質の解離速度に依存するという事実によるのであろう。プルダウンアッセイの結果は、V715S変異がPB1-PB2結合をブロックしないことを明確に示す。PB1とPB2との弱められた相互作用は、用いたアッセイ条件下では、酵素活性と矛盾しないように見える。ポリメラーゼ活性アッセイでは全長PB1とPB2を用いた。V715S変異体は、かなりのPB2結合と非常に減少した酵素活性の両方を示すが、このことは、わずかに変化した相互作用様式がポリメラーゼの効率に効果を及ぼすかもしれないことを示唆している。この場合、PB1とPB2が互いに結合していないために、酵素活性は喪失していない。F699A及びI750Dの変異体は弱いPB2結合を示すが、酵素活性は増強している。これらの対照をなす結果は、PB1-PB2界面が、パートナータンパク質が一体となる受動的な結合表面であるばかりでなく、それが酵素活性全体を制御する重要な役割を果たすことを示している。
一つのポリメラーゼサブユニットにおける変異が他のサブユニットの機能に影響すること、及び当該変異が別のサブユニットにおける補償変異(compensating mutation)により抑制されることは、既に報告されている(S11、S12)。
これらの報告は、RNAポリメラーゼには、サブユニット間の情報伝達を通して様々なポリメラーゼ機能を調節する機構が存在することを示唆している。また、上記報告を考慮すると、PB1のVal 715は、PB1とPB2との間のシグナル伝達によりウイルス遺伝子の転写に寄与していると考えられる。この考えによれば、V715S変異により、PB1とPB2とは結合することはできるが、両者の間の適切な情報伝達は阻害されることが理解できる。
また、本発明者らは、PB2変異体を用いて追加の実験を実施した。その結果、種々の界面変異体は、mRNAの顕著な減少を示した。この結果は、上述したPB1-PB2複合体及びNi-NTAを用いたプルダウンアッセイの結果と一致する。
この結果は、相互作用の態様がわずかに変化しただけでポリメラーゼの効率において顕著な効果が現れることを示す。
1.PB1-PB2複合体のクローニング、発現及び精製
PA-PB1複合体について以前に報告したように(S1)、クローニングと精製を行った。インフルエンザA/Puerto Rico/8/34由来の配列を用いた(S2)。ヘキサヒスチジンタグ及びN末端のTEV切断部位とともに、残基1-37、1-86、37-174、252-490及び530-759をコードするPB2遺伝子の断片をpET28bにクローニングした。シャイン・ダルガノ配列を持つPB2遺伝子の下流にPB1-Cコーディング領域をクローニングした。得られた共発現プラスミドを大腸菌BL21(DE3)RILP codon-plus株にトランスフォームし、細胞を0.5 mM IPTGで誘導した後15℃で一晩培養した。Ni-NTAアガロース(Qiagen)を用いるクロマトグラフィー、次いでSP and Q(GE Healthcare)セファロースでPB1-PB2複合体を精製した。Ni-NTAクロマトグラフィー後ヒスチジンタグをTEVプロテアーゼ消化で除去し、その後精製複合体を結晶化のためにcentricon YM-3(Millipore)で5 mg/mlまで濃縮した。
以前に報告したのと同じ方法で(S1)、プルダウンアッセイを行った。複合体をnickel affinityカラムに結合させた後、複合体を500 mMイミダゾールで溶出した。溶出したタンパク質をSDS-acrylamideゲル電気泳動(15%)及びクーマシーブルー染色で分析した。
以前に報告したように、モデルウイルスRNPアッセイを準備した(S1、S14)。PA、PB1(野生型又は変異体のいずれか)、PB2(野生型又は変異体のいずれか)、NP、及びpHH21-vNS-Lucリポータープラスミドをコードするウイルスタンパク質発現プラスミドでHeLa細胞をトランスフェクトした。このリポータープラスミドは、インフルエンザウイルスセグメント8の23ヌクレオチド長の5’末端プロモーター配列と26ヌクレオチド長の3’末端プロモーター配列に挟まれた逆配向のルシフェラーゼ遺伝子を有している。ルシフェラーゼ遺伝子はヒトPol Iプロモーターの制御下に置かれている。16時間インキュベーションした後、ルシフェラーゼアッセイ(Promega)及びリアルタイムRT-PCRを行った。細胞から精製したRNAをオリゴ(dT)20で逆転写させ、ウイルスmRNAのレベルを測定した。ヌクレオチド配列351-380位のルシフェラーゼコード領域に相当する5’-TATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTT-3’(配列番号13)とヌクレオチド配列681-700位のルシフェラーゼコード領域に相補的な5’-CCGGAATGATTTGATTGCCA-3’ (配列番号14)という2つの特異的プライマーを用いたリアルタイム定量PCRに合成一本鎖cDNAをかけた。発現プラスミドから転写されたNP mRNAは、内部コントロールとして使用した。
PB1-V715Sに関するセグメントをコードするウイルスゲノムを含む組換えウイルスを、Neumann et al.(S15)により報告されたプラスミドを用いた形質導入法(plasmid-based transfection method)により作製した。PB1-V715Sゲノムセグメント及び他の7つの野生型のゲノムセグメントは、細胞性RNAポリメラーゼIにより生成した。野生型PB1、PB2、PA、及びNPは、細胞性RNAポリメラーゼIIによりこれらのタンパク質をコードするプラスミドから生成した。細胞を形質導入から48時間インキュベートした後、細胞培養上清のアリコートをMDCK細胞におけるウイルス増幅に使用した。形質導入から48時間の時点で、培養液を回収し、使用するまで−80℃で保存した。
20℃の0.1 Mリン酸カリウム(pH 5.8)及び15% PEG 4,000を含有する結晶化バッファーに対するハンギングドロップ蒸気拡散法により、PB1-PB2複合体の結晶を成長させた。-180℃まで冷却した結晶から回折データを収集した。25%グリセロールを含有する結晶化バッファーを用いて、氷結を防いだ。日本のPhoton Factoryのビームライン17AでX線回折データを収集した。Selenomethionyl置換結晶を用いて、Se-K吸収端付近の3つの異なるX線エネルギーでデータセットを収集した。ADSC Quantum 270 CCD検出器を用いてデータを測定した。結晶は空間群P21に形成され、a = 44.27 Å、b = 61.48 Å、c = 45.47 Å、β = 103.4°であり、非対称ユニット中に2コピーの複合体が含まれていた。HKL2000及びSCALEPACK(S3)を用いて、回折データ積分、スケーリング及びマージングを行った。
SHELXC及びSHELXD(S4、S16)を用いて、14の可能なSe-Met部位のうち12のセレンの位置を見つけた。SOLVE(S5)を用いて、phase determinationを行った。溶媒をフラット化した後、RESOLVE(S6)を用いて、解像度2.1オングストロームの高品質電子密度マップを得た。電子密度を解析し、COOT(S7)を用いてトレースし、REFMAC(S8)でモデルを精密化した。球状の電子密度ピークが|2Fo-Fc|マップの1.3σより上及び|Fo-Fc|マップの3.0σより上に見つかり、かつ立体化学的に合理的な水素結合が許される位置に溶媒分子を置いた。PROCHECK(S9)を用いてPB1-PB2複合体の最終モデルの構造評価を行ったところ、残基の94%がラマチャンドランプロットの最も好ましい領域に存在し、”許されない”領域に存在する残基はなかった。最終モデルは配列中の117残基のうち109残基を含んでおり、PB1の残基678-684及びPB2の残基36-37は観察されなかった。データ収集及び精密化統計のまとめを表1に示す。複合体の原子配位及び構造因子はタンパク質データバンク(Protein Data Bank)にアクセッションコード2ZTTで登録されている。
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配列番号1は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの678-757をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの678-757のアミノ酸配列を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-37をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-37のアミノ酸配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、インフルエンザAウイルス(A/Duck/Hong Kong/2986.1/2000(H5N1))のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの678-751をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、インフルエンザAウイルス(A/Duck/Hong Kong/2986.1/2000(H5N1))のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの678-751のアミノ酸配列を示す。
<配列番号7>
配列番号7は、インフルエンザAウイルス(A/Duck/Hong Kong/2986.1/2000(H5N1))のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-37をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号8>
配列番号8は、インフルエンザAウイルス(A/Duck/Hong Kong/2986.1/2000(H5N1))のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-37のアミノ酸配列を示す。
<配列番号9>
配列番号9は、インフルエンザAウイルス(A/Equine/London/1416/1973(H7N7))のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの678-757をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号10>
配列番号10は、インフルエンザAウイルス(A/Equine/London/1416/1973(H7N7))のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの 678-757のアミノ酸配列を示す。
<配列番号11>
配列番号11は、インフルエンザAウイルス(A/Equine/London/1416/1973(H7N7))のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-37をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号12>
配列番号12は、インフルエンザAウイルス(A/Equine/London/1416/1973(H7N7))のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-37のアミノ酸配列を示す。
<配列番号13>
配列番号13は、ヌクレオチド配列351-380位のルシフェラーゼコード領域に相当する特異的プライマーのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号14>
配列番号14は、ヌクレオチド配列681-700位のルシフェラーゼコード領域に相補的な特異的プライマーのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号15>
配列番号15は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの全長をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号16>
配列番号16は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB1サブユニットの全長アミノ酸配列を示す。
<配列番号17>
配列番号17は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの全長をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号18>
配列番号18は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの全長アミノ酸配列を示す。
<配列番号19>
配列番号19は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-86をコードするDNAのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号20>
配列番号20は、インフルエンザA/Puerto Rico/8/34 H1N1型のRNAポリメラーゼPB2サブユニットの1-86のアミノ酸配列を示す。
Claims (35)
- 下記の(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドと、下記の(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドとを含む複合体。
(a1)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b1)配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b2)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b3)配列番号3のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド - 下記の(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドと、下記の(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドとを含む複合体。
(a1)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b4)配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b5)配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b6)配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド - (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを含有する組換えベクター。
- (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを含有する組換えベクター。
- (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞。
- (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞。
- (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から請求項1記載の複合体を採取することを含む、請求項1記載の複合体の製造方法。
- (a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAと、(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から請求項2記載の複合体を採取することを含む、請求項2記載の複合体の製造方法。
- 請求項1記載の複合体の結晶。
- 請求項2記載の複合体の結晶。
- 空間群がP21である請求項9記載の結晶。
- 単位格子が、a=41.12±50Å、b=61.37±50Å、c=45.36±50Åの大きさとβ=103.5±30°の角度を持つ請求項11記載の結晶。
- 請求項1又は2記載の複合体を沈殿剤の存在下に結晶化させることを含む、請求項1又は2記載の複合体の結晶の製造方法。
- 沈殿剤がリン酸カリウム及びPEG 4000である請求項13記載の方法。
- 下記の(a1)、(a2)又は(a3)のいずれかのポリペプチド。
(a1)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a2)配列番号2のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(a3)配列番号1のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド - 請求項15記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 請求項16記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項15記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞。
- 請求項15記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から請求項15記載のポリペプチドを採取することを含む、請求項15記載のポリペプチドの製造方法。
- 下記の(b1)、(b2)又は(b3)のいずれかのポリペプチド。
(b1)配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b2)配列番号4のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b3)配列番号3のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド - 下記の(b4)、(b5)又は(b6)のいずれかのポリペプチド。
(b4)配列番号20のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b5)配列番号20のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド
(b6)配列番号19のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b4)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド - 請求項20又は21記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 請求項22記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項20又は21記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞。
- 請求項20又は21記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から請求項20又は21記載のポリペプチドを採取することを含む、請求項20又は21記載のポリペプチドの製造方法。
- 候補物質の存在下で、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼを構成するPB1サブユニット又はその部分断片とPB2サブユニット又はその部分断片とを接触させ、前記PB1サブユニット又はその部分断片と前記PB2サブユニット又はその部分断片との相互作用を阻害する物質を選択する工程を含む、抗インフルエンザ薬の有効成分となり得る物質のスクリーニング方法。
- PB1サブユニットが以下の(a4)又は(a5)のポリペプチドからなるものである請求項26に記載の方法。
(a4) 配列番号16のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(a5) 配列番号16のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのPB1サブユニット活性を有するポリペプチド - PB1サブユニットの部分断片が請求項15に記載のポリペプチドからなるものである請求項26に記載の方法。
- PB2サブユニットが以下の(b7)又は(b8)のポリペプチドからなるものである請求項26に記載の方法。
(b7) 配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b8) 配列番号18のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのPB2サブユニット活性を有するポリペプチド - PB2サブユニットの部分断片が請求項20又は21に記載のポリペプチドからなるものである請求項26に記載の方法。
- PB1サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号16のアミノ酸配列におけるLeu 695、Lys 698、Phe 699、Val 715、Asp 725、Ile746及びIle 750のアミノ酸残基並びに配列番号2のアミノ酸配列における前記アミノ酸残基に対応する残基からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- PB2サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号4、18又は20のアミノ酸配列におけるGlu 2、Arg 3、Ile 4、Lys 5、Glu 6、Leu 7、Arg 8、Asn 9及びLeu 10のアミノ酸残基ならびにからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- PB1サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号16のアミノ酸配列におけるLeu 695、Phe 699、Val 715、Ile746及びIle 750のアミノ酸残基並びに配列番号2のアミノ酸配列における前記アミノ酸残基に対応する残基からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である請求項26〜30に記載の方法。
- PB2サブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号4、18又は20のアミノ酸配列におけるGlu 2、Ile 4、Leu 7及びLeu 10からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である、請求項26〜30に記載の方法。
- 候補物質が、化合物及びその塩、ペプチド、抗体並びに核酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項26〜34のいずれか1項に記載の方法。
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