JPWO2010041727A1 - リポソーム製造装置 - Google Patents

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Abstract

【課題】 モータを用いた比較的小型な多目的リポソーム製造装置であって、各種のリポソームを安定に製造できるもの、及び再構成リポソームを製造可能な再構成リポソーム製造装置を提供すること。【解決手段】 反応空間２Ａにおいて、内部に貯留された溶液に渦流を発生させる偏心モータ３と、ヒータ１５と、反応空間に水溶液を導入可能な水溶液ライン６Ａと、水溶液を貯留しておく第１ボトル９と、水溶液を移動させる第１ポンプ１４Ａと、反応空間内に窒素ガスを導入可能な不活性ガスライン７Ｂと、反応空間内を減圧する減圧ライン７Ｂと、減圧ラインを減圧する真空ポンプ２１と、反応空間に脂質を溶解させた有機溶媒を導入可能な脂質ライン６Ｂと、有機溶媒を貯留しておく第２ボトル１０と、この有機溶媒を脂質ライン６Ｂを経由して反応空間に移動させる第２ポンプ１４Ｂとを備えたものであって、不活性ガスを反応容器２に導入し、モータ３を駆動させて反応空間２Ａにおいて反応空間２Ａ内に貯留された脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させた状態において、真空ポンプ２１を駆動させ、反応空間２Ａを減圧させて有機溶媒を反応空間２Ａから気化させて反応容器２の内壁に脂質の薄膜を調製させた後、反応空間２Ａに不活性ガスを導入し、水溶液を脂質薄膜に加えてモータ３を駆動することで水溶液に渦流を発生させてリポソームを作製する多目的リポソーム製造装置によって達成される。【選択図】 図１

Description

本発明は、偏心モータを用いたリポソーム製造装置に関する。
リポソームは、脂質によって形成される二分子膜の閉鎖小胞である。リポソームは生体膜と類似の構造を有するため、従来から様々な研究材料として用いられてきている。リポソーム内部の水相には、水溶性の薬効成分・抗体・酵素・遺伝子などを封じ込めることができる。リポソームの二分子膜内には、油溶性のタンパク質・薬効成分などを保持できる。また、リポソームの二分子膜表面には、DNA・RNAなどを結合させることができる。このため、リポソームは、医療・化粧品・食品などの分野で用いられてきている。
近年には、薬物送達システム（DDS）に利用するリポソーム製剤が盛んに研究されている。リポソームの脂質二分子膜にタンパク質・ペプチドを組み込んで、それらのタンパク質等の作用を評価する研究なども行われている。
リポソームの製造方法としては、例えばボルテックス処理法、超音波法、逆相蒸発法、エタノール注入法、押し出し法、界面活性剤法、静置水和法等が知られている（非特許文献１、２）。各製造方法は、リポソームの構造に応じて適宜に選択される。これらの製造方法のうち超音波法は、リポソームに関する研究の創成期から現在まで使用されている効果的なリポソーム製造方法であるので、この方法を用いたリポソーム製造装置が開発されている（特許文献１）。また、超臨界流体を用いたリポソーム製造装置も開発されている（特許文献２）。
特開平４−２９３５３７号公報 特開２００５−１６２７０２号公報
寺田 弘、吉村 哲郎、「ライフサイエンスにおけるリポソーム 実験マニュアル」、シュプリンガー・フェアラーク東京(1992) V. P. Torchilin, V. Weissig 編, "Liposemes", Oxford University Press (2003)
特許文献１に開示された超音波法を用いたリポソーム製造装置は、超音波処理できる溶液量がごく少量に限られること、及び超音波処理により溶液温度が上昇することにより原料の分解や変性が見られるという欠点があった。特許文献２に開示された超臨界流体法を用いたリポソーム製造装置は、高圧に耐える容器などが必要であり、装置が大掛かりとなるという欠点があった。
上記事情のため、リポソームを調製する場合には、現在でもほとんどは手作業によらなければならない。手作業でリポソームを調製するときには、先ずリポソームを構成する脂質を有機溶媒に溶解させ、この脂質-有機溶媒溶液をフラスコに入れる。次に、このフラスコを回転させながら、フラスコ内を減圧して有機溶媒を徐々に気化させて飛ばすことにより、フラスコ内壁に脂質からなる薄膜を調製する。この製造方法は、良好なリポソームを製造するには、薄く均一な脂質薄膜を調製することが重要であるという理由に依るものである。このためフラスコとして、なるべく大きな底面積を備えた丸底フラスコが利用される。更に、上記方法では、脂質薄膜を広く張る目的で、多量の有機溶媒が使われており、環境にも好ましくない。
上記方法で脂質薄膜を製造するのには、手間と時間とを要するため、多種類のリポソームを製造するのは大変な労力が必要であった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、少量の有機溶媒を用いて迅速かつ効率的に多種のリポソームを調製する装置を開発すること、更には、調製したリポソーム膜へ種々の蛍光分子・ペプチド・膜タンパク質等を作用させたリポソーム、即ち再構成リポソームを調製する装置を開発することである。本発明者は、本体に保持された円筒型の反応容器と偏心モータを備えた比較的小型の機械装置部分を設計・作製した。この装置部分を基礎として、各種のリポソームを安定に製造できる多目的リポソーム製造装置、及び再構成リポソームを製造可能な再構成リポソーム製造装置を発明した。
本発明者らは、上記事情に鑑みて、鋭意検討を行った結果、本体に保持された円筒型の反応容器と偏心モータを用いた比較的簡易な構成により、MLV（multilamellar vesicles：多重層リポソーム）、LUV（large unilamellar vesicles：大きな単層リポソーム）、SUV（small unilamellar vesicles：小さな単層リポソーム）、GUV（giant unilamellar vesicles：巨大な単層リポソーム）などの各種リポソームの製造を可能とする装置を完成させた。
こうして、第１の発明に係る多目的リポソーム製造装置は、本体に保持された円筒状の反応容器と、前記反応容器内部において反応空間に貯留された溶液に渦流を発生させる偏心モータと、前記反応容器を所定の温度とするヒータと、前記反応容器に設けられ前記反応空間に水溶液を導入可能な水溶液ラインと、前記水溶液ラインの他端に設けられて前記水溶液を貯留しておく第１ボトルと、前記第１ボトル内の水溶液を前記水溶液ラインを経由して前記反応空間に移動させる第１ポンプと、前記反応容器に設けられ前記反応空間内に不活性ガスを導入可能な不活性ガスラインと、前記反応空間内を減圧する減圧ラインと、この減圧ラインを通じて減圧する真空ポンプと、前記反応容器に設けられ前記反応空間に脂質を溶解させた有機溶媒を導入可能な脂質ラインと、前記脂質ラインの他端に設けられて前記有機溶媒を貯留しておく第２ボトルと、前記第２ボトル内の有機溶媒を前記脂質ラインを経由して前記反応空間に移動させる第２ポンプと、前記有機溶媒を回収する有機溶媒回収装置とを備えたものであって、前記不活性ガスを前記反応容器内に導入し、前記偏心モータを駆動させて前記反応空間内において反応空間に貯留された脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させた状態において、前記真空ポンプを駆動させ、前記反応空間を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記有機溶媒回収装置によって回収しつつ、前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を形成させた後、前記反応空間に不活性ガスを導入し、前記水溶液を前記脂質薄膜の形成した前記反応空間内へ移動させ前記偏心モータを駆動することで水溶液に渦流を発生させてリポソームを作製することを特徴とする。
本発明においては、前記水溶液ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、水を主成分とする溶媒を貯留可能な水系ボトルと、この水系ボトル内の溶媒を前記水溶液ラインを通して前記反応空間内に移動させる水系ポンプとが設けられており、前記脂質ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、有機溶媒を主成分とする溶媒を貯留可能な有機系ボトルと、この有機系ボトル内の溶媒を前記脂質ラインを通して前記反応空間内に移動させる有機系ポンプとが設けられていることが好ましい。
第２の発明に係る多目的リポソーム製造方法は、下記工程、すなわち（１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、（２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水溶液を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水溶液に渦流を発生させて、多目的リポソームを調製することを特徴とする。
本発明においては、不活性ガスラインと減圧ラインとは、三方以上のコックを用いることにより、同じラインとできる。
本発明によれば、反応空間内に脂質を溶解させた有機溶媒（脂質-有機溶媒溶液）を貯留しておき、偏心モータを駆動させて、この脂質-有機溶媒溶液に渦流を発生させた状態で有機溶媒を気化させることにより、反応容器の内壁に脂質の薄膜が調製される。従来の方法では、脂質を溶解させた有機溶媒を丸底フラスコに入れ、窒素気流下または減圧下で有機溶媒を徐々に除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくっていたことから、手間の掛かるものであった。本発明者らは、嵩高い丸底フラスコを用いる代わりに円筒型容器を用い、この円筒型容器の底面に宛がった偏心モータを用いて円筒型容器に偏心回転運動を与えることによって容器内部の脂質-有機溶媒溶液に渦流を発生させる。この状態で、真空ポンプを用いて容器および系内を減圧することで有機溶媒を気化・除去し、脂質の薄膜を調製することに成功した。偏心モータを駆動させて、円筒型容器内の反応空間の溶液に渦流を発生させると、溶液は容器内壁に沿って上方へ展開される。この状態で反応空間を減圧させると、有機溶媒を急速に除去でき、かつ円筒型容器内壁に薄く広く広がった脂質薄膜を調製できる。
さらに、内壁に脂質薄膜を形成させた前記容器内に緩衝液などの水溶液を入れ、偏心モータを駆動させて、反応空間の水溶液に渦流を発生させることにより、脂質薄膜が水和・剥離してリポソームを製造できる。脂質組成、溶媒組成、水溶液組成、及び円筒型容器容量・温度・偏心モータ駆動条件（即ち渦流特性）等の装置の操作条件を調節することによって、各種リポソームを調製できる。従来は、前後（又は左右）方向に反応容器を振とうさせつつ反応空間を低圧として、有機溶媒を除去するシステムが知られていた。本発明では、偏心モータを用いることにより、溶液を広く容器内壁に沿って展開しながら有機溶媒を除去できる。このため、内部空間の有機溶媒の突沸を防ぐことができ、かつ急速に除去できるので好適な方法となる。偏心モータは、有機溶媒の除去とリポソーム製造とに併用できるので、製造装置の構造を簡易化できる。
更に、リポソームの製造中に反応容器を着脱する必要がないので、製造装置を完全自動化できる。加えて、連続運転を行うことにより、リポソームを大量生産できる。また、渦流を発生させながら脂質薄膜を調製するので、容器内壁に沿って広く溶媒が展開することから少量の有機溶媒を用いれば済み、環境にも必要以上の負荷をかけない。
リポソームを製造するほとんど全ての工程を閉鎖系とできるので、反応空間を減圧、脱酸素、窒素置換、及び滅菌でき、微生物などが混入するおそれ（コンタミネーション）も小さくなるので医薬品などの製造にも応用できる。
上記構成によれば、脂質ラインと、水溶液ラインとが分岐されているので、それぞれのラインを洗浄するときに便利である。
多目的リポソームとは、前述の各種リポソームであって、(i)脂質二分子膜で囲まれた水相に水溶性薬物・抗原・抗体・酵素・遺伝子などを封入したリポソーム、(ii)脂質二分子膜内に油溶性薬物を取り込んだリポソーム、(iii)膜に機能性タンパク質・ペプチド・生体高分子等を結合・表在・または貫通した状態として有するリポソーム、(iv)膜表面をPEG・糖鎖等で修飾したリポソーム、或いは(v)何も封入物を有さない未封入リポソームとして利用することを見込んで調製される多目的用途を持つリポソーム全般を意味する。多目的リポソームには、再構成リポソームの前駆リポソームとなるものも含まれる。このようなリポソームは、医学、薬学、生物学などの種々の研究などに利用できる。本発明は、多目的リポソームを製造できる装置に関する。
本発明においては、前記水溶液ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、水を主成分とする溶媒を貯留可能な水系ボトルと、この水系ボトル内の溶媒を前記水溶液ラインを通して前記反応空間内に移動させる水系ポンプとが設けられており、前記脂質ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、有機溶媒を主成分とする溶媒を貯留可能な有機系ボトルと、この有機系ボトル内の溶媒を前記脂質ラインを通して前記反応空間内に移動させる有機系ポンプとが設けられている。
このようにすれば、複数の水系溶媒及び有機溶媒を用意できるので、リポソームを製造する際のオプションが豊富となり、種々のリポソームを製造できる。また、水系溶媒と有機溶媒とのラインが分かれているので、それぞれのラインの洗浄が容易となる。
第３の発明に係る再構成リポソーム製造装置は、本体に保持された円筒状の反応容器と、前記反応容器内部の反応空間において反応空間に貯留された溶液に渦流を発生させる偏心モータと、前記反応容器を所定の温度とするヒータと、前記反応空間に設けられ前記反応空間にリポソーム溶液を導入可能なリポソーム溶液ラインと、前記リポソーム溶液ラインの他端に設けられて前記リポソーム溶液を貯留しておくリポソーム溶液ボトルと、前記リポソーム溶液ボトル内のリポソーム溶液を前記リポソーム溶液ラインを経由して前記反応空間に移動させるリポソーム用ポンプと、前記反応容器に設けられ前記反応空間に前記リポソームとの反応を行う反応液を導入可能な反応液ラインと、前記反応液ラインの他端に設けられて前記反応液を貯留しておく反応液ボトルと、前記反応液ボトル内の反応液を前記反応液ラインを経由して前記反応空間に移動させる反応液ポンプと、前記反応容器に設けられ前記反応空間内に不活性ガスを導入可能な不活性ガスラインとを備えたものであって、前記反応空間内に不活性ガスを導入した状態で、前記リポソーム溶液と前記反応液とを前記反応空間に移動させ、前記偏心モータを駆動させて前記反応空間内に貯留されたリポソーム溶液と反応液とを反応させて、再構成リポソームを調製することを特徴とする。
第４の発明に係る再構成リポソーム製造方法は、下記工程、すなわち（１）反応空間内に不活性ガスを満たした状態で、予め調製しておいたリポソーム溶液と所定の物質を含む反応溶液とを前記反応空間内に導入する工程、（２）前記反応空間内の溶液に渦流を発生させることで、リポソームと前記物質とを反応させて再構成リポソームを調製することを特徴とする。
再構成リポソームとは、(i)予め製造されたリポソームの膜表面にペプチド・タンパク質（抗原）・核酸などを結合させたリポソーム、或いは(ii)予め製造されたリポソームとウイルスあるいは細菌とを融合させたリポソームなどを意味する。再構成リポソームの例としては、組換え膜タンパク質搭載出芽ウイルスとリポソームとの融合、特定の標的部位（例えば、脳など）にトラップされるペプチドをリポソーム膜表面に結合させたものなどが例示される。本発明は、これらの例によって限定されない。
本発明においては、両リポソーム製造装置の構成は重なるところが多いので、多目的リポソーム製造装置が再構成リポソーム製造装置を兼用できる。そのような構成とすれば、両者のリポソーム製造装置の機能を一つの装置で行えるので非常に便利となる。
本発明に係るリポソーム製造装置は、第１の発明に記載の多目的リポソーム製造装置と、第３の発明に記載の再構成リポソーム製造装置とが兼用されていることを特徴とする。
本発明者らの検討によれば、反応空間内において脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、有機溶媒を蒸発させることで脂質の薄膜を形成させること、及びここに緩衝液などの水溶液を導入して、渦流を発生させることでリポソームを調製することに成功した。この方法を用いることにより、自動化させたリポソーム製造装置を提供できる。
本発明によれば、MLV、LUV、SUV、GUVなどの各種リポソームを製造する多目的リポソーム製造装置を提供できる。本発明は、超音波を用いず、温度コントロールも容易なので、タンパク質などの変性を防ぎ、安定なリポソームを提供できる。偏心モータにより有機溶媒に渦流を発生させながら脂質薄膜を調製するので、従来の方法に比べると、有機溶媒の使用量を激減でき、薄膜およびリポソーム調製時間も短縮できる。
連続運転によりリポソームを大量生産できる。更に、脂質二分子膜にタンパク質・ペプチドなどを結合させた再構成リポソームを製造可能な装置を提供できる。
本発明のリポソーム製造装置を用いることにより、(i)水溶性及び油溶性薬物・抗体・酵素・遺伝子などを封入した多目的リポソーム、(ii)タンパク質・ペプチド・DNA・RNAなどを脂質二分子膜に結合させた再構成リポソーム、及び(iii)組換え膜タンパク質などを脂質二分子膜に組み込んだ再構成リポソームを容易に提供できる。
多目的リポソーム製造装置の概要図である。 水系ラインの端末を複数に分岐させた構造を示す図である。 有機溶媒系ラインの端末を複数に分岐させた構造を示す図である。 水系ライン及び有機溶媒系ラインの各端末を複数に分枝させた多目的リポソーム製造装置の概要図である。この多目的リポソーム製造装置は、再構成リポソーム製造装置を兼用できる。 再構成リポソーム製造装置の概要図である。 水系ライン及び有機溶媒系ラインの各末端を複数に分枝させた再構成リポソーム製造装置の概略図である。
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施できる。本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
＜多目的リポソーム製造装置＞
１．多目的リポソーム製造装置の構成
図１には、多目的リポソーム製造装置１の概要を示した。以下、単に「製造装置１」という。製造装置１は、クロロホルムに溶解させた脂質を薄膜化させた後、所定の水溶液（例えば、適当な緩衝液など）中で脂質薄膜からリポソームを製造し、このリポソーム溶液を回収するという操作を行える。
製造装置１には、反応空間２Ａを備えた円筒型反応容器２と、この反応空間２Ａ内において反応空間２Ａに貯留された溶液に渦流を発生させる偏心軸を備えた偏心モータ３と、反応容器２を所定の温度とするヒータ１５と、反応容器２の温度を測定する温度センサ１６が設けられている。以下では、偏心モータ３は、単に「モータ３」という。偏心モータとしては、例えばボルテックスミキサー（登録商標）が用いられる。上記機構は、箱体８の内部に収容されている。図１中の矢印Ｔは、モータ３の駆動によって、反応容器２内の液体に渦流を発生させる方向を示している。
製造装置１では、モータ３を駆動させて、反応空間２Ａの溶液に渦流を発生させることにより、各種のリポソームを製造できる。つまり、製造装置１は従来のボルテックス処理法を応用したものである。
後述のように、モータ３を駆動させて、反応空間２Ａの溶液に渦流を発生させた状態で、反応空間２Ａを低圧としつつ、有機溶媒を除去して脂質薄膜を調製できる。従来には、前後（又は左右）方向に丸底フラスコを振とう、または回転させつつ反応空間を低圧として、有機溶媒を除去するシステムが知られていた。本実施形態では、モータ３を用いることにより、有機溶媒に渦流を発生させながら、有機溶媒を除去することで、均一かつ薄い脂質薄膜を短時間で製造することに成功した。この方法では、内部空間の有機溶媒が、内部空間内壁に沿って上方に広く展開しながら、かつ必要以上に反応容器２の上方にまで飛び散ることを防ぐことができるので、好適な方法となる。従来の方法に比べると、極めて少量の有機溶媒を用いれば済む。更に、モータ３が、リポソーム製造と有機溶媒の除去とに併用できるので、製造装置１の構造を簡易化できた。
反応容器２の中央やや上方位置には、保持器４が設けられている。保持器４は、モータ３の駆動によって、反応容器２内の溶液に渦流を発生させられる。保持器４としては、通常のクランプを用いることができる。反応容器２の上部開口には、蓋体５が固定されている。蓋体５と反応容器２とを固定するための治具を用いることができる。
蓋体５には、上下方向に貫通するライン６Ａ，６Ｂ，７Ａ，７Ｂが設けられている。ライン６Ａ，６Ｂ，７Ａ，７Ｂは、耐有機溶媒性及び耐圧性を備えたチューブから形成されている。これらのラインのうち、ライン６Ａは、反応容器２に水溶液１１を導入可能な水溶液ラインである。水溶液としては、適当な緩衝液、カルセイン溶液などが用いられる。水溶液は、矢印Ｙ方向に移動する。ライン６Ａは、反応空間２Ａ内の液体を回収できる。液体の回収時には、液体は矢印Ｘ方向に移動する。ライン６Ａの一端は、反応空間２Ａの下端付近に設けられており、他端には、水溶液１１を貯留しておくボトル９（第１ボトル）が設けられている。ライン６Ａの途中には、ボトル９内の水溶液１１を反応空間２Ａに移動させるポンプ１４Ａ（第１ポンプ）が設けられている。
ライン６Ｂは、脂質ラインである。ライン６Ｂは、反応空間２Ａに、主として有機系溶媒を供給できる。溶媒の供給時には、溶媒は矢印Ｚ方向に移動する。ライン６Ｂの一端は、反応空間２Ａの下端付近に設けられており、他端には、クロロホルム１２を貯留しておくボトル１０（第２ボトル）が設けられている。ライン６Ｂの途中には、ボトル１０内のクロロホルム１２を反応空間２Ａに移動させるポンプ１４Ｂ（第２ポンプ）が設けられている。クロロホルム１２には、リポソームの脂質膜を構成する脂質が溶解されている。
ライン７Ａは、反応空間２Ａを外気と連絡するための通気用のものである。ライン７Ａの他端部は、箱体８の外方に延設されており、そこにはバルブ１７が設けられている。
ライン７Ｂは、反応空間２Ａに不活性ガスを供給する不活性ガスラインである。不活性ガスとしては、窒素ガス・アルゴンガスなどが用いられる。ライン７Ｂは、真空ポンプ２１の駆動によって、反応空間２Ａ内部を減圧する減圧ラインを兼用している。両ライン７Ａ，７Ｂの下端位置は、反応容器２の上端位置において、内部の液体に接触しないようになっている。
ライン７Ｂの途中には、三方バルブ１８が設けられている。三方バルブ１８から経路が二つに分かれており、その一方側の先端には窒素ボンベ１９が接続されている。窒素ガスは、矢印Ｖ方向に供給される。三方バルブ１８の他方側には、有機溶媒回収装置２０と真空ポンプ２１が設けられている。減圧時のガスは、矢印Ｗ方向に移動する。ライン７Ｂにおいて、三方バルブ１８と反応容器２との間には、減圧計２２が設けられている。
本実施形態では、リポソームの製造中に反応容器２を着脱する必要がなく、リポソームを製造する工程において、反応空間２Ａを減圧、脱酸素、窒素置換、及び滅菌できる。このため、微生物などが混入してコンタミネーションを起こす可能性を小さくでき、医薬品などの製造にも応用できる。
２．製造装置を用いた多目的リポソームの製造
次に、製造装置を用いてMLVを製造する方法について説明する。
ここで使用する製造装置は、図１に示す上記製造装置１の構成の一部を変更している。具体的には、図２及び図３に示すように、二本のライン６Ａ，６Ｂのそれぞれにおいて、反応容器２に設置された端部とは、逆側の端部では、複数の水系のライン６Ａ１，６Ａ２，６Ａ３と、有機溶媒系のライン６Ｂ１，６Ｂ２，６Ｂ３とを設けている。これらの構成を備えたものを図４に示した。
ライン６Ａ，６Ｂには、ラインを三本に分岐させる前の位置に、バルブ１３Ａ，１３Ｂが設けられている。水系の各ライン６Ａ１，６Ａ２，６Ａ３の途中には、バルブ１３Ａ１，１３Ａ２，１３Ａ３とポンプ１４Ａ１，１４Ａ２，１４Ａ３（水系ポンプ）とが設けられている。ライン６Ａ１，６Ａ２，６Ａ３の端部には、それぞれボトル９Ａ，９Ｂ，９Ｃ（水系ボトル）が設けられている。ボトル９Ａ，９Ｂ，９Ｃ内の溶液は、ポンプ１４Ａ１，１４Ａ２，１４Ａ３の駆動によって、反応容器２に導入できる。逆方向の駆動を行えば、ポンプ１４Ａ１，１４Ａ２，１４Ａ３によって、反応容器２内の液体をボトル９Ａ，９Ｂ，９Ｃに回収できる。
有機溶媒系のライン６Ｂ１，６Ｂ２，６Ｂ３のそれぞれにも、バルブ１３Ｂ１，１３Ｂ２，１３Ｂ３と、ポンプ１４Ｂ１，１４Ｂ２，１４Ｂ３（有機系ポンプ）とが設けられている。各ライン６Ｂ１，６Ｂ２，６Ｂ３の端部には、ボトル１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ（有機系ボトル）が設けられている。ボトル１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ内の溶液は、ポンプ１４Ｂ１，１４Ｂ２，１４Ｂ３の駆動によって、反応容器２に導入できる。
MLVを製造するときには、水系のボトル９Ａ，９Ｂ，９Ｃには、それぞれ回収されるリポソーム、水溶液（緩衝液などを含む）、洗浄水が貯留される。有機溶媒系のボトル１０Ａ，１０Ｂには、それぞれ脂質を溶解させたクロロホルム、アルコールが貯留される。MLVの製造時には、ボトル１０Ｃは使用する必要がない。
２−１．水溶性物質（低分子）封入リポソームの製造
（i）MLVの製造
クロロホルムに溶解したリン脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン 25μmol、及びジオレオイルホスファチジルセリン 25μmol）2.5mlをボトル１０Ｂにセットした。10mM HEPES NaOH / 175mM NaCl（pH7.5）、100mM Calcein（カルセイン）5mlをボトル９Ｃにセットした。カルセインは、MLV中に取り込まれたか否かをゲルろ過で確認するためのマーカとして用いた。ボトルをセット後、MLVを製造した。製造後のMLV溶液をボトル９Ｂに回収した。このとき使用した製造ステップ（Step：共通、０〜２５）を下表１に示した。表１には、ボトル９Ａ，９Ｂ，９Ｃ，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃを順に、ボトル１〜６と記載した。
Figure 2010041727
各ステップの内容は次の通りである。各ステップにおける詳細なコック、ポンプなどの駆動・停止の動作については省略するが、当業者であれば表１の内容に基づき容易に理解できる。
ステップ共通は、各種リポソームを製造するための共通ステップである。このステップでは、初期設定を行う。
ステップ０では、装置が駆動するまでの時間（10秒）を設定する。ステップ２及び４では、三方コック１８を窒素ボンベ１９と反応容器２とを接続した状態で、窒素ガスを10秒間送る。このときコック１７は開放されているので、余分な窒素ガスは大気に開放され、反応容器２内が高圧とはならない。ステップ５では、ボトル１０Ｂ（５）からクロロホルムに溶解した脂質2.5mLを反応容器２に送液する。ステップ９では、窒素ガスの流入を停止し、10秒間待機する。
ステップ１０及び１１では、クロロホルムを蒸発させつつ、反応容器２の内壁に脂質の薄膜を形成させる。これらのステップでは、ヒータ１５をオンとし、三方コック１８を動かして真空ポンプ２１と反応容器２とを接続して反応容器２の真空引きを行いつつ、モータ３を駆動させる。こうして、モータ３を駆動させて、反応空間２Ａ内において反応空間２Ａ内に貯留された脂質を溶解させたクロロホルムに渦流を発生させる。この状態で、真空ポンプ２１を駆動させ反応空間２Ａを減圧させてクロロホルムを反応空間２Ａから気化させて、反応容器２の内壁に脂質の薄膜を調製する。
ステップ１２では、三方コック１８を動かして窒素ボンベ１９と反応容器２とを接続し、反応容器２に窒素ガスを10秒間送る。
ステップ１３〜１９では、薄膜からMLVを調製する。ステップ１３では、ボトル９Ｃ（３）から水溶液5mLを反応容器２に送液する。ステップ１７では、再び反応容器２に窒素ガスを5秒間送る。ステップ１８及び１９では、ヒータ１５をオンとし、モータ３を駆動させて、反応容器２の内部空間において水溶液に渦流を発生させる。
ステップ２０では、反応容器２中のMLVをボトル９Ｂ（２）に回収する。ステップ２２では、反応容器２への窒素ガスの流入を止め、5秒間停止する。ステップ２５でプログラムが停止する。
表中において、使用していないステップ番号は、他のリポソームを製造するためのオプションステップである。
ステップ１〜ステップ２５を行うことにより、一サイクル分のリポソームの製造を完了できる。一サイクルの実施には約30分間〜60分間を必要とするので、約８時間〜１２時間サイクルを繰り返すことにより、10回分程度以上のリポソームを製造できる。
製造したMLVは、0.4μm のポリカルボネートメンブレンフィルターを用いて加圧濾過し、0.4μm 以下の粒径に揃えた。
（ii）リン定量
サンプル及びコントロールとして使用するKH2PO4溶液に10N H2SO4を0.4ml 加えて170℃で30 分以上加熱した後、過酸化水素水（30％）を0.1ml 加えて再度170℃で30 分加熱した。次に、室温に戻したサンプル及びコントロール溶液に0.25N H2SO4に溶かしたモリブデン酸アンモニウムを4.6ml 加えてボルテックスした後、発色試薬を0.2mL 加え、沸騰水中で 10分加熱した。サンプル及びコントロール溶液を室温にした後、それぞれを 830nm で測定し、サンプル中のリン含有量を測定した。このリン濃度をリポソーム濃度とした。
（iii）ゲルカラムによる分画
カルセイン封入MLV を10mM Tris-HCl/150mM NaCl（pH7.5）で平衡化させたSephadex G-50カラムにかけ、自然滴下によってカルセイン封入MLV を回収した。
（iv）界面活性剤による処理
ゲルカラムにより分画したMLV画分500μLに5%Triton-X100を5μL加え撹拌することで、MLVの界面活性剤処理とした。カルセインは、濃度消光の性状を蛍光物質である。MLV内に封入されたカルセインは、濃度が高いため蛍光が抑えられるので赤褐色を呈し、放出されるとカルセイン濃度が低くなり黄緑色の蛍光を発する。界面活性剤処理により蛍光発光した場合には、MLVが製造されていると判断した。
２−２．水溶性物質（高分子）封入リポソームの製造
上記２−１の製造工程において、カルセインに代えて、抗原（緑色蛍光タンパク質）、抗体（抗緑色蛍光物質抗体）、酵素（蛍光標識ルシフェラーゼ）あるいは核酸（pBR322ベクター）を溶解させたものを用いた。その他の工程については、２−１と同様に行った。
２−３．油溶性物質膜内封入リポソームの製造
上記２−１の製造工程において、クロロホルムに溶解したリン脂質に、油溶性物質として、ジフェニルヘキサトリエンを加えたものを用いた。その他の工程については、２−１と同様に行った。
２−４．エバポレータとしての使用
上記２−１の薄膜調製工程において、「クロロホルムに溶解したリン脂質溶液」に代えて、「油溶性物質＋揮発性有機溶媒」を用いた。油溶性物質として、オレイン酸を用い、揮発性有機溶媒として、エタノールを用いた。
試験結果
水溶性物質の場合、ゲルカラムによる分画により、未封入カルセインとカルセイン封入MLV の2 層に分離し、かつカルセイン封入MLV に界面活性剤処理を行った。蛍光強度の増幅が確認されたので、MLV が作製されたことが判った。同様に、抗原、抗体、酵素、または核酸を封入したMLVを製造できた。
油溶性物質の場合、ジフェニルヘキサトリエンを膜内に封入したMLVが作製された。
こうして、多目的リポソーム自動製造装置試作機を用いた脂質（油溶性物質）溶液の送液、水溶液の送液、脂質薄膜作製、薄膜剥離、MLV 作製、及びMLV 回収が可能であることが判明した。
さらに、揮発性有機溶媒を適度に揮発させたところ、油溶性物質を濃縮できた。こうして、上記２−１における「薄膜調製」に代えて、「油溶性物質の濃縮」を行うことができた。
このように、本実施形態の製造装置１をエバポレータとして使用できた。
＜再構成リポソーム製造装置＞
１．再構成リポソーム製造装置の構成
再構成リポソーム製造装置とは、予め調製されたリポソームに対して、所定の物質（例えば、膜タンパク質、薬剤、核酸、水溶性タンパク質など）を反応させて、脂質膜中に、その物質を組み込ませた再構成リポソームを製造する装置を意味する。再構成リポソームには、(i)脂質膜中に所定の膜タンパク質を含ませたリポソーム、(ii)膜中に所定の膜タンパク質を含むウイルス類似の構成を備えたリポソーム、(iii)水溶性タンパク質を膜表面に結合させたリポソームなどが含まれる。
図５には、再構成リポソーム製造装置４０の概要を示した。以下、製造装置４０と記載する。製造装置４０と、前述の製造装置１とは、図４に示すように、兼用できる。但し、本製造装置４０を単体として構成する場合には、製造装置１の装置の一部（例えば、有機溶媒回収装置２０、真空ポンプ２１など）は、必ずしも必要ではない。
図５において、図１と同様の作用を備えた構成については、同一の符号を付して説明を省略する。製造装置４０では、予め調製されたリポソーム溶液と、タンパク質溶液とを混合することで再構成リポソームを製造し、再構成リポソーム溶液を回収するという操作を行う。
コック１８’は、窒素ボンベ１９と反応容器２との間を接続または切断する。ライン６Ａ（水溶液ライン、反応液ライン）の上端部には、三方コック１３Ａ’が設けられている。三方コック１３Ａ’には、ボトル９（反応液ボトル）とボトル４２（水溶液ボトル、回収用ボトル）が連結されている。ボトル４２と三方コック１３Ａ’との間には、ポンプ４１（水溶液ポンプ）が設けられている。ポンプ４１は、ボトル４２内の溶液を反応容器２に供給する操作、または反応容器２内の溶液をボトル４２に回収する操作を行える。ポンプ１４Ａは、ボトル９に貯留された反応液を反応容器２に供給する反応液ポンプである。
図中の矢印Ｋ，Ｌ，Ｍは、それぞれボトル９，４２の溶液を反応容器２に供給するときの溶液の移動方向を示す。矢印Ｎは、反応容器２内の溶液をボトル４２に回収するときの溶液の移動方向を示す。矢印Ｊは、ボトル１０（リポソーム溶液ボトル）内の液体を反応容器２に供給するときの液体の移動方向を示す。矢印Ｑは、窒素ガスを反応容器２に供給するときのガスの流れを示す。ライン６Ｂはリポソーム溶液ラインであり、ポンプ１４Ｂはリポソーム用ポンプである。図には示さないが、製造装置４０も、図２及び図３に示すように、ライン６Ａ，６Ｂの他端側を複数に分枝させて図６に開示した構成とできる。
２．製造装置を用いた再構成リポソームの製造
製造装置４０を用いて再構成リポソームを製造する方法について説明する。図４と図６とにおいて、同一の作用・効果を奏する構成については、同一の符号を付して説明を省略する。
２−１．ペプチド結合リポソームの製造
(i)MLVの製造
再構成リポソームの製造に用いるリポソーム溶液を製造装置１を用いて製造した。クロロホルムに溶解したリン脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン 10μmol、ジオレオイルホスファチジルセリン 10μmol、NHS-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（NHS-DSPE)4μmol）2.5mLをボトル１０Ｂにセットした。10mM 酢酸−酢酸Na/175mM NaCl（pH5.0）5mLをボトル９Ｃにセットした。NHS-DSPEは、弱アルカリ性環境（pH8.0程度）において、タンパク質・ペプチドのアミノ基と反応して共有結合を形成する。ボトルをセット後、MLVを製造した。製造後のMLV溶液をボトル９Ｂに回収した。製造ステップは、表１に従った。
製造したMLVは、0.4μm のポリカルボネートメンブレンフィルターを用いて加圧濾過し、0.4μm 以下の粒径に揃えた。SUV およびLUVを除くために、MLVを遠心処理（6,000×g、20min、4℃）した。得られた沈殿物を水溶液に懸濁し、その懸濁溶液を上記と同じ条件で再度遠心処理した。上記操作を5回行い、得られた沈殿物を10mM 酢酸−酢酸Na/175mM NaCl(pH5.0) 1ml に懸濁し、再構成リポソーム製造用MLVとした。
次に、上記「２．製造装置を用いた多目的リポソームの製造(ii)リン定量」に従って、MLV濃度を測定した。
（ii）MLV への膜結合型水溶性ペプチドの結合
製造装置４０を用いて、再構成リポソームを製造した。リポソームの脂質二分子膜に結合させる水溶性ペプチドとして、配列番号１に記載の13個のアミノ酸からなるペプチド（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His：アンジオテンシノーゲンのＮ末端)を用いた。ペプチドは、株式会社ペプチド研究所のもの（商品コード：4133-v）を購入した。ペプチド（１μmol）は、10mM酢酸−酢酸Na/175mM NaCl(pH5.0) 2ml に溶解し、反応液とした。
MLV溶液をボトル９Ａ（リポソーム溶液ボトル）、ペプチド溶液をボトル９Ｃ（反応液ボトル）、反応用水溶液（10mM HEPES-NaOH/175mM NaCl(pH8.0)）をボトル９Ｂ（水溶液ボトル）にセットした後、再構成リポソームを製造した。
製造ステップ（Ｓｔｅｐ：共通、０〜３１）を下表２に示した。表２では、ボトル９Ａ，９Ｂ，９Ｃを順に、ボトル６，３，５と記載した。
実際の使用形態に応じて、ボトル１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃには、それぞれアルコール、ライン洗浄水などを貯留できる。
Figure 2010041727
各ステップの内容は次の通りである。各ステップにおける詳細なコック、ポンプなどの駆動・停止の動作については省略するが、当業者であれば表２の内容に応じて容易に理解できる。
ステップ共通は、各種リポソームを製造するための共通ステップである。このステップでは、初期設定を行う。
ステップ０では、装置が駆動するまでの時間（10秒）を設定する。ステップ２及びステップ４では、コック１８’を操作して、窒素ボンベ１９と反応容器２とを接続し、反応容器２に窒素ガスを10秒間送る。このときコック１７は開放されているので、余分な窒素ガスは大気に開放され、反応容器２内が高圧とはならない。ステップ５では、ボトル９Ａ（６）からMLV溶液5mLを反応容器２に送液する。ステップ６では、ボトル９Ｂ（３）から反応用水溶液5mLを反応溶液２に送液する。ステップ１３では、コック１８’を動かして、窒素ボンベ１９と反応容器２との接続を解除し、窒素ガスの流入を停止し、10秒間待機する。
ステップ１４及びステップ１５では、モータ３を駆動させることにより内部の溶液に渦流を発生させ、MLVと反応用水溶液とを混合する。このステップで、反応容器２内は、弱アルカリ性環境となる。ステップ１６では、コック１８’を動かして窒素ボンベ１９と反応容器２とを接続し、反応容器２に窒素ガスを10秒間送る。
ステップ１７では、ボトル９Ｃ（５）から、反応液5mLを反応容器２に送液する。ステップ２１では、窒素ガスの流入を停止し、5秒間待機する。ステップ２２及びステップ２３では、ヒータ１５をオンとし、モータ３を駆動させて、全溶液で反応容器２の内部空間において渦流を発生させる。このステップで、ペプチドはMLVのNHS-DSPEと結合し、脂質膜表面に固定される。
ステップ２４で、窒素ガスの流入を停止し5秒間待機した後、ステップ２５にて10分間待機する。ステップ２６で、反応容器２中の再構成リポソームをボトル９Ｃ（３）に回収する。
ステップ３０では、反応容器２への窒素ガスの流入を止め、5秒間停止する。ステップ３１でプログラムが停止する。こうして、再構成リポソームを製造した。
なお、表中の使用していないステップ番号は、他のリポソームを製造するためのオプションステップである。
（iii）蛍光光度分析による結合評価
リポソームとペプチドとの結合反応後、サンプル300μLを遠心分離（7,000×g、20min、4℃）した。沈殿を含まないように、各溶液の上清200μLを回収した。上清に10mM HEPESNaOH/175mM NaCl（pH8.0）を加えて1mLにしたものの蛍光強度を測定した。このとき励起波長を495nm 、蛍光波長を520nmとした。ペプチドのみの蛍光強度と比較し、MLVとの結合反応において結合しなかったペプチドの蛍光強度を未結合率とし、減少した蛍光強度の割合を結合率とした。
２−２．タンパク質（抗原等）結合リポソームの製造
上記２−１の製造工程において、「ペプチド溶液」に代えて、「タンパク質（抗原等）溶液」を用い、その他の工程については同様に行った。「タンパク質（抗原等）溶液」として、緑色蛍光タンパク質を緩衝液に溶解させたものを用いた。
２−３．組換えプロテオリポソームの製造
(i)MLVの製造
上記２−１の製造工程において、「リン脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン 10μmol、ジオレオイルホスファチジルセリン 10μmol、NHS-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（NHS-DSPE)4μmol）」に代えて「リン脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン 10μmol、ジオレオイルホスファチジルセリン 10μmol）」を用い、「緩衝液10mM 酢酸−酢酸Na/175mM NaCl（pH5.0）」に代えて「緩衝液10mM Tris-HCl/10mM NaCl(pH7.5)」をそれぞれ用いた。他の工程は同様に行った。
(ii)組換えプロテオリポソーム（MLV）の製造
上記２−１の製造工程において、「反応用緩衝液100mM Tris-HCl/175mM NaCl(pH8.0)」に代えて「反応用緩衝液10mM CH3COOH-CH3COONa/10mM NaCl (pH4.0)」を、「ペプチド溶液」に代えて「膜タンパク質搭載バキュロウイルス懸濁液」を、それぞれ用いた。その他の工程については同様に行った。
「膜タンパク質搭載バキュロウイルス懸濁液」は、本願発明者の発明に係る特許出願（WO2007/094395-A1）に開示された技術によって製造したものを用いた。
２−４．バイオリアクターとしての使用
製造装置４０をバイオリアクターとして使用する一例について説明する。
上記２−３の製造工程において、「反応用緩衝液10mM CH3COOH-CH3COONa/10mM NaCl (pH4.0)」に代えて「反応用緩衝液（10mM CH3COOH-CH3COONa/10mM NaCl (pH5.6)」を、「膜タンパク質搭載バキュロウイルス懸濁液」に代えて「ホスホリパーゼＤ（シグマＰ８８０４）溶液」を、それぞれ用いた。その他の工程については同様に行った。
試験結果
多目的リポソーム製造装置１により製造したペプチド結合用MLV を用い、再構成リポソーム製造装置４０を使用して、モデルペプチドとMLV を結合させた。その結果、モデルペプチドとMLVとの結合率が、73%という高い値でモデルペプチド結合MLV を作製できた。
同様に、タンパク質（抗原等）結合リポソーム、及び組換えプロテオリポソームを製造できた。
本工程によって、脂質二分子層の外側のみがＰＣ（ホスファチジルコリン）からＰＡ(ホスファチジン酸)に変換された。このように、本実施形態の製造装置４０をバイオリアクターとして使用できた。
このように本実施形態によれば、MLV、LUV、SUV、GUVなどの各種リポソームを製造する多目的リポソーム製造装置を提供できた。この製造装置は、超音波を用いず、温度コントロールも容易なので、タンパク質などの変性を防ぎ、安定なリポソームを提供できる。また、脂質二分子膜にタンパク質・ペプチドなどを結合させた再構成リポソームを製造可能な装置を提供できた。
本実施形態のリポソーム製造装置を用いることにより、薬物・抗体・酵素・遺伝子などを封入した多目的リポソーム、及び予め調製されたリポソームに対して、所定の物質（例えば、膜タンパク質、薬剤、核酸、水溶性タンパク質など）を反応させて、脂質膜中に、その物質を組み込ませた再構成リポソームを容易に提供できた。また、バイオリアクターとして使用できた。
１…多目的リポソーム製造装置
２…反応容器
２Ａ…反応空間
３…モータ（偏心モータ）
６Ａ…ライン（水溶液ライン）
６Ａ１，６Ａ２，６Ａ３…ライン（水系ライン）
６Ｂ…ライン（脂質ライン）
６Ｂ１，６Ｂ２，６Ｂ３…ライン（有機系ライン）
７Ｂ…ライン（不活性ガスライン、減圧ライン）
９…ボトル（第１ボトル）
９Ａ，９Ｂ，９Ｃ…ボトル（水系ボトル）
１０…ボトル（第２ボトル）
１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ…ボトル（有機系ボトル）
１４Ａ…ポンプ（第１ポンプ）
１４Ａ１，１４Ａ２，１４Ａ３…ポンプ（水系ポンプ）
１４Ｂ…ポンプ（第２ポンプ）
１４Ｂ１，１４Ｂ２，１４Ｂ３…ポンプ（有機系ポンプ）
１５…ヒータ
２１…真空ポンプ
４０…再構成リポソーム製造装置

Claims (6)

  1. 下記構造を備えた多目的リポソーム製造装置；
    本体に保持された円筒状の反応容器と、
    前記反応容器内部において反応空間に貯留された溶液に渦流を発生させる偏心モータと、
    前記反応容器を所定の温度とするヒータと、
    前記反応容器に設けられ前記反応空間に水溶液を導入可能な水溶液ラインと、
    前記水溶液ラインの他端に設けられて前記水溶液を貯留しておく第１ボトルと、
    前記第１ボトル内の水溶液を前記水溶液ラインを経由して前記反応空間に移動させる第１ポンプと、
    前記反応容器に設けられ前記反応空間内に不活性ガスを導入可能な不活性ガスラインと、
    前記反応空間内を減圧する減圧ラインと、
    この減圧ラインを通じて減圧する真空ポンプと、前記反応容器に設けられ前記反応空間に脂質を溶解させた有機溶媒を導入可能な脂質ラインと、
    前記脂質ラインの他端に設けられて前記有機溶媒を貯留しておく第２ボトルと、
    前記第２ボトル内の有機溶媒を前記脂質ラインを経由して前記反応空間に移動させる第２ポンプと、
    前記有機溶媒を回収する有機溶媒回収装置とを備え、
    前記不活性ガスを前記反応容器内に導入し、前記偏心モータを駆動させて前記反応空間内において反応空間に貯留された脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させた状態において、前記真空ポンプを駆動させ、前記反応空間を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記有機溶媒回収装置によって回収しつつ、前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を形成させた後、前記反応空間に不活性ガスを導入し、前記水溶液を前記脂質薄膜の形成した前記反応空間内へ移動させ前記偏心モータを駆動することで水溶液に渦流を発生させてリポソームを作製する。
  2. 請求項１に記載の多目的リポソーム製造装置であって、前記水溶液ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、水を主成分とする溶媒を貯留可能な水系ボトルと、この水系ボトル内の溶媒を前記水溶液ラインを通して前記反応空間内に移動させる水系ポンプとが設けられており、前記脂質ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、有機溶媒を主成分とする溶媒を貯留可能な有機系ボトルと、この有機系ボトル内の溶媒を前記脂質ラインを通して前記反応空間内に移動させる有機系ポンプとが設けられている多目的リポソーム製造装置。
  3. 下記工程を備えたことを特徴とする多目的リポソーム製造方法、
    （１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、
    （２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水溶液を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水溶液に渦流を発生させて、多目的リポソームを調製するリポソーム調製工程。
  4. 下記構造を備えた再構成リポソーム製造装置；
    本体に保持された円筒状の反応容器と、
    前記反応容器内部において反応空間に貯留された溶液に渦流を発生させる偏心モータと、
    前記反応容器を所定の温度とするヒータと、
    前記反応空間に設けられ前記反応空間にリポソーム溶液を導入可能なリポソーム溶液ラインと、
    前記リポソーム溶液ラインの他端に設けられて前記リポソーム溶液を貯留しておくリポソーム溶液ボトルと、
    前記リポソーム溶液ボトル内のリポソーム溶液をリポソーム溶液ラインを経由して前記反応空間に移動させるリポソーム用ポンプと、
    前記反応容器に設けられ前記反応空間に前記リポソームとの反応を行う反応液を導入可能な反応液ラインと、
    前記反応液ラインの他端に設けられて前記反応液を貯留しておく反応液ボトルと、
    前記反応液ボトル内の反応液を前記反応液ラインを経由して前記反応空間に移動させる反応液ポンプと、
    前記反応容器に設けられ前記反応空間内に不活性ガスを導入可能な不活性ガスラインとを備え、
    前記反応空間内に不活性ガスを導入した状態で、前記リポソーム溶液と前記反応液とを前記反応空間に移動させ、前記偏心モータを駆動させて前記反応空間内に貯留されたリポソーム溶液と反応液とを反応させて、再構成リポソームを調製する。
  5. 下記工程を備えたことを特徴とする再構成リポソーム製造方法、
    （１）反応空間内に不活性ガスを満たした状態で、予め調製しておいたリポソーム溶液と所定の物質を含む反応溶液とを前記反応空間内に導入する工程、
    （２）前記反応空間内の溶液に渦流を発生させることで、リポソームと前記物質とを反応させて再構成リポソームを調製する再構成リポソーム調製工程。
  6. 請求項１または２に記載の多目的リポソーム製造装置と、請求項４に記載の再構成リポソーム製造装置とが兼用されていることを特徴とするリポソーム製造装置。
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