JPWO2009098885A1 - デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物 - Google Patents

Abstract

デクチン−２遺伝子欠損動物の提供。ゲノム中のデクチン−２遺伝子の機能を欠損した非ヒト動物、及びその利用。

Description

本発明は、Ｃ型レクチンの一種であるデクチン−２遺伝子が欠損した非ヒト動物及びその用途に関する。

マクロファージ、樹状細胞は全身の末梢組織に広く存在しており、末梢から侵入する異物を殺傷、除去する自然免疫の担い手であるとともに、外来抗原を取り込んだ後に自身が移動してこれを二次リンパ器官へ運搬、Ｔリンパ球に抗原提示することにより獲得免疫を作動させる。近年、マクロファージ、樹状細胞に特異的に発現するＣ型レクチン（結合のためにカルシウムイオンが必要な動物レクチン）が多数同定され、マクロファージや樹状細胞の機能への関与について研究されている。

Ｃ型レクチンの中には、外来異物の捕捉のための受容体として機能するもの（ＤＣ−ＳＩＧＮなど）、樹状細胞が血管外遊走する際のＩＣＡＭ−３との初期接着に関与するもの（ＤＣ−ＳＩＧＮ）等が知られている。

樹状細胞に特異的に発現するＣ型レクチンとしてデクチン−１及びデクチン−２が同定された（非特許文献１、２、特許文献１）。このうち、デクチン−１については、β−グルカンをリガンドとするレクチンであり、カンジダやザイモザンを認識する機能を有することが知られている（非特許文献３）。また、本発明者らはデクチン−１のノックアウトマウスを作成し、デクチン−１がβグルカンを認識し、サイトカイン産生や活性酸素種（ＲＯＳ）を産生すること、カリニの感染防御に重要な役割を果たしていることを報告した（非特許文献４）。

先行技術文献

特表２００１−５１３６２４号公報 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２０１５７−６７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１１９５７−６３ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７，１１１９−２４ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，３９−４６

しかしながら、デクチン−２については、遺伝子はクローニングされているものの、その機能については何ら明らかにされていない。
従って、本発明の課題は、Ｃ型レクチンの一種であるデクチン−２遺伝子欠損動物を提供し、さらにデクチン−２の機能を解明し、当該動物の用途を提供することにある。

そこで本発明者らは、遺伝子ターゲティング法を用いてデクチン−２遺伝子の機能を欠損させた動物を作製し、その機能を検討したところ、（１）デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物由来の樹状細胞がα−マンナン刺激によるサイトカイン産生能を消失していたことから、デクチン−２が、α−マンナン刺激による樹状細胞からのサイトカイン産生リセプターであること、（３）樹状細胞より産生されたサイトカインによるＴｈ１又はＴｈ１７分化モデルになること、（４）さらにデクチン−２遺伝子欠損動物由来の樹状細胞が真菌刺激によるサイトカイン産生能を消失していたことから、真菌認識分子であること、（５）デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物では野生型に比べて真菌感染を防御できないこと、（６）デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物では野生型に比べて癌細胞の増殖を抑制できないこと、（７）デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物では野生型に比べて破骨細胞形成が抑制されること、（８）デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物では野生型に比べて関節炎が抑制されることを見出し、その結果デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物又は当該動物由来細胞は、樹状細胞によるサイトカイン産生、真菌感染症、癌、骨疾患及び関節炎のモデル動物又はモデル細胞として有用であり、またデクチン−２を発現している細胞を用いれば関節炎治療薬、骨疾患治療薬、Ｔｈ１又はＴｈ１７分化調整剤のスクリーニングができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ゲノム中のデクチン−２遺伝子の機能を欠損した非ヒト動物を提供するものである。
また本発明は、当該デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物又は当該動物由来細胞よりなる、樹状細胞によるサイトカイン産生、樹状細胞より産生されたサイトカインによるＴｈ１又はＴｈ１７分化、真菌感染症、癌、骨疾患又は関節炎のモデル動物又はモデル細胞を提供するものである。
また本発明は、当該デクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物又は当該動物由来細胞を用いることを特徴とする、樹状細胞によるサイトカイン産生関連疾患治療薬、真菌感染症治療薬、癌治療薬、骨疾患治療薬又は関節炎治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
さらに本発明は、被験物質をデクチン−２を発現している細胞に作用させる工程と、デクチン−２の活性を測定する工程とを含む、関節炎治療薬、骨疾患治療薬又はＴｈ１もしくはＴｈ１７分化調節剤のスクリーニング方法を提供するものである。

本発明のデクチン−２遺伝子欠損非ヒト動物又は当該動物由来細胞を用いれば、デクチン−２が関与する種々の疾患、例えば、樹状細胞によるサイトカイン産生関連疾患、真菌感染症、癌、骨疾患、関節炎等の治療薬のスクリーニングができる。また、さらに当該動物は、新たなデクチン−２の機能解明用の研究対象としても有用であり、例えばデクチン−２の内在性のリガンドの解明、デクチン−２が介在するシグナル経路の解明に利用できる。

デクチン−２遺伝子欠損ターゲティングベクターの模式図を示す（ＷＴ ａｌｌｅｌｅ：野生型、ターゲティングベクター、ＫＯ ａｌｌｅｌｅ）。 サザン及びノザンハイブリダイゼーションによるデクチン−２^−／−の確認を示す。 α−マンナン又はマンナン刺激による樹状細胞からのサイトカインの産生量を示す図である。 真菌刺激による樹状細胞からのサイトカインの産生量を示す図である。 Ｔ細胞のＴｈ１又はＴｈ１７への分化誘導能を示す図である。 カンジダアルビカンスに対する感染抵抗性を示す図である。 コラーゲン誘導関節炎の発症率を示す図である。 破骨細胞の形成状態を示す図である。 破骨細胞の形成状態を示す図である。 移植した腫瘍のサイズを示す図である。 腫瘍の大きさを示す図である。

発明を実施するための形態

本発明のデクチン−２遺伝子の機能を欠損した非ヒト動物としては、ゲノム中のデクチン−２遺伝子の一部又は全部を改変させた非ヒト動物が例示できる。

本発明において「ゲノム中のデクチン−２遺伝子の一部を改変する」とは、デクチン−２遺伝子の一部に変更、削除、挿入又は置換を生じさせることをいう。デクチン−２遺伝子を機能不能にするためには、デクチン−２遺伝子に対して、変更、削除、挿入又は置換のうち２又はそれ以上の方法を同時に使用してもよい。本発明において、デクチン−２遺伝子の変更、削除、挿入又は置換とは、デクチン−２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列中の１又は２以上の塩基を、置換、削除、又は挿入し、当該変異させたデクチン−２遺伝子の発現産物がデクチン−２分子として機能しないようにすることをいう。

非ヒト動物としてはげっ歯類が好ましく、特にマウスが好ましい。

当該遺伝子の一部又は全部の改変は、ターゲティングベクターの構築により行なわれる。得られたターゲティングベクターによるＥＳ細胞の相同組換えを行い、得られた相同組換えＥＳ細胞を胚内に移植し、ＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮に移植して出産させることによりキメラ動物を作製することができる。以下、各工程毎に説明する。

デクチン−２遺伝子は、すでにクローニングされており、その塩基配列及びアミノ酸配列は配列番号１に示すとおりである。

ターゲティングベクターの構築
デクチン−２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、デクチン−２遺伝子とは関連しないＤＮＡ配列、たとえば選択マーカー遺伝子ＤＮＡ配列などと置換する方法により、ターゲティングベクターを作製する。これは、ターゲティングベクター中のＤＮＡによって相同組換えされた相同組換え体を、選択マーカーなどを用いることで、より容易にスクリーニングすることができるようにするためである。より具体的には、単離されたデクチン−２遺伝子のゲノムＤＮＡの一部を制限酵素処理により削除し、削除されたＤＮＡ領域の代わりにプロモーターを連結した選択マーカー遺伝子を挿入することにより、デクチン−２遺伝子のターゲティングベクターを作製する。

ＥＳ細胞中で強い発現活性を有するプロモーターとしてはホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ−１）プロモーター、伸長因子２（ＥＦ−２）プロモーター、ＭＣ−１プロモーターなどを使用することができる。ターゲティングを行う遺伝子座、及びそのＤＮＡ領域により、プロモーター活性は大きく影響されるため、一般にはプロモーターは強力であるほどよい。従ってより望ましくは、ＰＧＫ−１プロモータを使用する。

選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ネガティブ選択用にはチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子断片などを目的に応じて使用することができる。

プロモーターと連結した選択マーカー遺伝子は、たとえばネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏカセット、ｐＫＪ２として供与）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子カセット（ｈｐｈカセット）、チミジンキナーゼ遺伝子カセット（ｔｋカセット、ｐＭＣｔｋとして供与）、ジフテリア毒素Ａ遺伝子断片カセット（ＤＴ−Ａカセット、ｐＭＣＤＴ−Ａ又はｐＭＣ１ＤＴ−Ａとして供与）などの、プラスミドに挿入された状態で市販されている選択マーカー遺伝子を使用してもよい。ターゲティングベクターは、これらのプロモーターを連結した選択マーカーのうち、どの選択マーカーを使用して構築してもよい。

ターゲティングベクターによる相同組換え
次いで、上記の方法により作製したターゲティングベクターを使用して、ＥＳ細胞の相同組換えを行う。用いることができるマウス由来のＥＳ細胞は、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞、Ｅ１４．１細胞などがある。キメラ動物を作出するために、これらのうちいずれのＥＳ細胞を用いるかは、採取したゲノムＤＮＡの由来するマウス系統、キメラ動物の選別方法など、実験の目的や方法により任意に決定することができる。

デクチン−２遺伝子を機能不能な配列にしたターゲティングベクターをＥＳ細胞中に導入する。そしてＥＳ細胞中の目的とするデクチン−２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクター中の機能不能にしたデクチン−２遺伝子ＤＮＡ配列による相同組換えによって置換する。相同組換えは、デクチン−２遺伝子ゲノムＤＮＡ配列と、ターゲティングベクター中の非改変部分の配列との相同性を利用して、生じさせることができる。

ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などを使用することができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。

相同組換え体のスクリーニング
得られた組換えＥＳ細胞の中から、培養液中で、相同組換えによってＥＳ細胞に導入された選択マーカーを用いて、第一段階のスクリーニングである選択培養を行う。当該第一段階の選択工程においては、前述した選択マーカーのうち、複数の選択マーカー遺伝子を用いることもできる。

耐性クローンをピックアップし、増殖させる。その後、目的とするデクチン−２遺伝子がターゲティングされているかどうかを確実に調べるため、第二段階のスクリーニングを行うことができる。第二段階のスクリーニングは、ＤＮＡレベルで目的とするデクチン−２遺伝子がターゲティングされたかどうかを確認する工程である。このような方法としては、ＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などが存在するが、そのうちのいずれを用いてもよく、またその中から２以上の方法を組み合わせて用いてもよい。

本発明においては、第一段階のスクリーニングにより選択されたＥＳ細胞クローンのプールのそれぞれからゲノムＤＮＡを調製し、このゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行うことで、ＥＳ細胞について第二段階のスクリーニングをするのが好ましい。このＰＣＲ法を用いたスクリーニングにより組換えが起こったクローンを単離する。

ＰＣＲプライマーは、ターゲティングにより目的とするゲノムＤＮＡ領域を外来性の遺伝子により置換することができたか否かをより効率的に確認できるように設計することが望ましい。そのためにはターゲティングベクターの配列のうち目的とする遺伝子の外側のゲノムＤＮＡ領域上と、選択マーカー遺伝子カセット領域上とに設定し、挿入部位を増幅することができるように設計するとよい。

第二段階のスクリーニングにおいて、ＥＳ細胞が相同組換え体であることを確認するため、ＥＳ細胞クローンに対してサザンブロットハイブリダイゼーション法による解析を行うことができる。サザンブロットハイブリダイゼーション解析は、ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識するプローブとターゲティングベクター中に存在する領域を認識するプローブを併用して行うことが望ましい。二種類のプローブを用いることにより相同組換えのほかに非相同組換えが存在するか否かを知ることができ、目的とするゲノム領域に相同組換えが起こったことをより正確に確認することができる。

デクチン−２遺伝子欠損（ＫＯともいう）動物の作出 （Ｄｅｃｔｉｎ−２ ^−／− ）
次いで、相同組換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期又は胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製することができる。

ＥＳ細胞を胚内に移植する方法としては、たとえばマイクロマニピュレーション法、凝集法などが知られているがいずれを用いてもよい。マウスの場合、まず、ホルモン剤（たとえば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧ及びＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このように回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて注入し、キメラ胚を作製する。

一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作成したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラ動物を作製することができる。

このようなキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスを選択する。このように、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖することにより目的とする遺伝子を欠損する個体を得ることができる。得られたデクチン−２遺伝子欠損ヘテロ接合体マウスどうしを交配させることにより、目的とする遺伝子欠損ホモ接合体マウスを得ることができる。

得られた本発明の非ヒト動物は、ゲノム中のデクチン−２遺伝子の機能が欠損している。従来、デクチン−２がどのような機能を有しているかを確認した報告はなく、デクチン−２遺伝子欠損動物がどのような特性を有しているかは不明であった。本発明者らは、本発明の非ヒト動物が次の機能を有することを確認した。

（１）デクチン−２遺伝子欠損動物由来の樹状細胞は、α−マンナン及びマンナン刺激によるサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６）産生能が消失していた。一方、野生型由来の樹状細胞は、α−マンナン刺激によりＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６等を産生する。従って、デクチン−２は、樹状細胞におけるα−マンナン刺激によるサイトカイン産生のキーリセプターである。

（２）デクチン−２遺伝子欠損動物由来の樹状細胞は真菌刺激によるサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３）産生能が消失する。一方、野生型由来の樹状細胞は真菌刺激によりＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−２３を産生する。
（３）真菌で刺激をしたデクチン−２遺伝子欠損動物由来の樹状細胞培養上清はＴ細胞をＴｈ１７に分化させなかった。一方、真菌で刺激をした野生型マウス由来の樹状細胞培養上清はＴ細胞をＴｈ１７に分化させた。従って、デクチン−２は、樹状細胞における真菌刺激によるサイトカイン産生のキーリセプターである。また、デクチン−２遺伝子欠損動物又は当該動物由来細胞は、樹状細胞により産生されたサイトカインによるＴｈ１又はＴｈ１７分化モデルとして有用である。
（４）デクチン−２遺伝子欠損動物では、野生型に比べて真菌感染症に対する防御力が低下していた。従って、デクチン−２は、真菌感染症防御機構に関与していることがわかる。
（５）デクチン−２遺伝子欠損動物では、野生型に比べて移植された癌細胞の増殖を抑制できなかった。従って、デクチン−２は癌細胞の増殖抑制機構に関与していることがわかる。
（６）デクチン−２遺伝子欠損動物では、野生型に比べて破骨細胞形成が抑制されていた。従って、デクチン−２は破骨細胞形成に関与していることがわかる。
（７）デクチン−２遺伝子欠損動物では、野生型に比べて関節炎の発症を抑制されていた。従って、デクチン−２は関節炎の発症、進展に関与していることがわかる。

本発明のデクチン−２遺伝子欠損動物又はその由来細胞は、上記のような性質を有することから、樹状細胞によるサイトカイン産生、樹状細胞より産生されたサイトカインによるＴｈ１又はＴｈ１７分化真菌感染症、癌、骨疾患及び関節炎のモデル動物又はモデル細胞として有用である。ここでサイトカインとしてはＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ｆ等が挙げられるが、ここに挙げたサイトカインに限定されるものではなく、デクチン−２が起因する他のサイトカインを含めることができる。真菌としては、マイクロスポラム、トリコフィトン、アコリオン、エピダーモフィトン、ケラチノマイセス、カンジダ、カリニ、クリプトコッカス、アスペルギルス等が挙げられ、特にカンジダ、カリニ、クリプトコッカス、アスペルギルス等が好ましい。癌としては、腺癌、肉腫、白血病、上皮性腫瘍等が挙げられ、より具体的には、咽頭癌を代表とする口唇、口腔及び咽頭癌；食道癌、胃癌、結腸・直腸癌などを代表とする消化器癌；肺癌を代表とする呼吸器及び胸腔内臓器癌；骨及び関節軟骨癌、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞癌及びその他の皮膚の癌；中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌を代表とする女性性器癌；前立腺癌を代表とする男性性器癌；膀胱癌を代表とする尿路癌：脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系癌、甲状腺及びその他の内分泌腺癌、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織癌、及びこれらを原発巣とする転移組織の癌等が挙げられる。骨疾患としては、骨代謝性疾患、特に骨粗しょう症等が挙げられる。また、関節炎としては、関節リウマチ等が挙げられる。

また、本発明のデクチン−２遺伝子欠損動物又はその由来細胞を用いれば、サイトカイン産生関連疾患、真菌感染症、癌、骨疾患及び関節炎の治療薬をスクリーニングすることができる。これらの医薬のスクリーニングは、本発明のデクチン−２遺伝子欠損動物又はその由来細胞に、被験物質を投与又は添加し、各疾患の発症又は進展を観察すればよい。ここで、各疾患の発症及び進展の観察は、各疾患のマーカーとなるサイトカインを測定することにより行うこともできる。同時にコントロール物質を投与した群をコントロール群とするのが好ましい。さらに野生型も同時に試験するのが好ましい。

本発明の関節炎治療薬又は骨疾患治療薬のスクリーニングは、被験物質をデクチン−２を発現している細胞に作用させる工程と、デクチン−２の活性を測定する工程によっても行うことができる。ここで、デクチン−２を発現している細胞としては、デクチン−２ＫＯ樹状細胞でなければ特に制限されず、広く動物細胞の樹状細胞が挙げられる。また、このスクリーニング方法には、インビトロだけでなくインビボも含まれるため、被験物質をデクチン−２を発現している細胞に作用させる工程には、動物から採取した細胞や動物由来の株化細胞に直接被験物質を作用させる工程だけでなく、そのような細胞を保有している動物に被験物質を投与する場合も含まれる。次の工程であるデクチン−２活性の測定手段としては、例えばデクチン−２遺伝子の発現量の測定、デクチン−２の作用により変動するサイトカイン量の測定等が挙げられる。ここでデクチン−２の作用による変動するサイトカインとしては、前記ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ｆ等が挙げられる。かかるデクチン−２活性を測定した結果、デクチン−２活性を抑制した被験物質を選択すれば、関節炎治療薬、骨疾患治療薬がスクリーニングできる。また、デクチン−２からのシグナルによりＴｈ１、Ｔｈ１７の分化を誘導することができる。そのため、本スクリーニングにより、デクチン−２の活性を測定した結果、デクチン−２の活性を抑制する物質を選別することにより、Ｔｈ１やＴｈ１７の分化を抑制し得る物質を得ることができる。逆に、デクチン−２の活性を促進する物質を選別することにより、Ｔｈ１やＴｈ１７の分化を促進し得る物質を得ることができる。Ｔｈ１やＴｈ１７の分化を抑制する物質は、上記関節炎治療薬以外にも、Ｔｈ１やＴｈ１７分化促進が起因する疾患の治療薬になり得る。Ｔｈ１やＴｈ１７の分化促進する物質は、Ｔｈ１やＴｈ１７分化促進により治療効果がもたらされる疾患、例えば、感染症の治療薬になり得る。

本発明のデクチン−２遺伝子欠損動物又はその由来細胞は、デクチン−２に対する抗体を作製するための動物又は細胞として利用できる。すなわち、デクチン−２遺伝子欠損動物は、デクチン−２を発現しないので、良好なヒト型抗デクチン−２抗体産生材料として有用である。例えば、ヒト型抗デクチン−２抗体を産生するマウスと、デクチン−２遺伝子欠損マウスとを交配して、抗デクチン−２抗体を産生し、かつデクチン−２遺伝子欠損マウスを作製すれば、当該マウスはヒト型抗デクチン−２抗体として良好な抗体を産生する。また、ヒト型抗デクチン−２抗体を産生するマウス由来のＥＳ細胞を用いて本発明と同様の手段によりデクチン−２遺伝子欠損マウスを作製すれば、そのマウスはヒト型抗デクチン−２抗体として良好な抗体を産生する。このようにして得られる抗デクチン−２抗体は、前記各種疾患の治療に有用な医薬となり得る。例えば、骨疾患、関節炎についてはデクチン−２の活性を抑制し得る抗体を、癌や真菌感染症に対してはデクチン−２の活性を促進し得る抗体を選択すれば、これらの疾患又は治療薬となり得る。

さらに本発明のデクチン−２遺伝子欠損動物は、デクチン−２の内在性リガンドの解明、デクチン−２が外在するシグナル経路の解明のためのツールとしても有用である。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１
Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスの作製
デクチン−２をコードする遺伝子Ｃｌｅｃ４ｎのエキソン１と２（デクチン−２の細胞内及び膜貫通領域をコード）をネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｒ）で置換するためのターゲティングベクターを構築した（図１）。ターゲティングベクターは、ｎｅｏｒとネガティブ選抜遺伝子であるジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子を持つカセットプラスミドｐＢｌ−ｌｘ−ｎｅｏ−ＤＴを用い、そのＢａｍＨＩ部位に及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にそれぞれＥＳ細胞（Ｅ１４．１）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法にて増幅した５’側相同領域（プライマーセット：ＴＴＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣ（配列番号２）及びＡＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＧ（配列番号３））と３’側相同領域（プライマーセット：ＴＴＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＣ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＧＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＡ（配列番号４）及びＣＣＴ ＣＴＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＡＣＧ（配列番号５））を対応する制限酵素で処理後、挿入した。ＮｏｔＩ 消化により直鎖化したターゲティングベクター２５μｇを１×１０^７細胞のＥ１４．１にＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて電気穿孔法（５００μＦ／０．２５Ｖ）により導入した。培養２４時間後より、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ナカライ）を含むＥＳ培地（１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ）、１，０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び５０μｇ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））にて１週間薬剤選抜を行ない、耐性クローンの単離を行なった。相同組換えクローンはＰＣＲ法（プライマーセット：ＡＡＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＴＧＧ（配列番号６）及びＣＡＴ ＴＡＴ ＡＣＧ ＡＡＧ ＴＴＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＧＴＣ ＧＣ（配列番号７））及びサザンハイブリダイゼーション法により同定した。なお、サザンハイブリダイゼーション法はＢａｍＨＩ 消化したゲノムＤＮＡに対して、プローブとしては、ＰＣＲ法によって増幅したゲノム領域のＤＮＡ断片を用いて、５’側（ＴＴＧ ＧＣＡ ＴＡＣ ＣＡＡ ＣＣＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＡＧＴ Ｔ（配列番号８）ＡＡＣ ＴＡＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＧＴＧ（配列番号９）及びＡＡＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＴＧＧ（配列番号１０）とＡＡＴ ＧＡＧ ＧＴＡ ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＧＴ ＣＣＣ Ｔ（配列番号１１））３’側（ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ＴＧＴ ＡＧＧ ＣＴＴ Ｃ（配列番号１２）ＴＴＧ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＡＧ（配列番号１３））についてそれぞれ行なった。相同組換えＥＳクローンは、凝集胚キメラ法を用いてＢＤＦ１オスマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウス（日本ＳＬＣ）との交配により得られた８細胞期胚とのキメラ胚を作製した後、偽妊娠処理をした仮親のＩＣＲメスマウス（日本ＳＬＣ）の子宮に移植することにより、キメラマウスを誕生させた。キメラマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、ヘテロ接合体のＦ１マウスを得た。Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスを得るため、ヘテロ接合体のＦ１子孫を兄妹交配した。また、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ背景のＤｅｃｔｉｎ−２^−／−を得るためにヘテロ接合体のＦ１子孫をさらに５世代又は７世代Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに戻し交配を行い、最終的に６世代目あるいは８世代目のヘテロ接合体マウスを兄妹交配した。ＢＬＡＢ／ｃＡ背景のＤｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスを得るためにはＢＡＬＢ／ｃＡマウスとキメラマウスを交配し、得られたＦ１へテロ接合体マウスを最終的に８世代ＢＡＬＢ／ｃＡマウスに戻し交配した。得られたヘテロ接合体マウスを兄妹交配し、ＢＡＬＢ／ｃＡ背景のＤｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスを得た。

デクチン−２ターゲティングベクターを１２９／Ｏｌａ由来のＥＳ細胞であるＥ１４．１に導入し、２５７クローンについてスクリーニングを行ない、４つの相同組換えクローンの単離・同定に成功した。これらは凝集胚キメラ法によりキメラマウスの作製を行ない、交配によりＤｅｃｔｉｎ−２ＫＯマウスの樹立・系統化を行なった。デクチン−２欠損遺伝子座については、尻尾より抽出したゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ消化した後、サザンハイブリダイゼーション法により確認した。さらに、脾臓より抽出したＲＮＡを用いたノザンハイブリダイゼーション法により、Ｄｅｃｔｉｎ−２ＫＯマウスではデクチン−２ｍＲＮＡの発現が消失していることを確認し（図２）、デクチン−２遺伝子が完全に破壊されていることを確認した。

実施例２
樹状細胞によるサイトカインの産生
（１）骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）及び試薬
Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスあるいは野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの大腿骨、脛骨、腰骨より骨髄細胞を採取し、ＭＥＭ培地（大日本製薬）中に拡散させた。０．０１７Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２），、０．１４Ｍ ＮＨ４Ｃｌを含む緩衝液で、赤血球を除去後、２×１０^６細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）、１０％ウシ胎児血清（ＢｉｏＷｅｓｔ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ）１０ｍｌに懸濁し、直径１０ｃｍのペトリ皿で培養した。３日後に同じ組成の培地を１０ｍｌ加え、培養液を２０ｍｌとした。６日後に半量である１０ｍｌの培地をとり、新しく調整した１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）、１０％ＦＣＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ）１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ）に交換した。８日後に再度２０ｍｌの培養液のうち１０ｍｌを新しい培地と交換した。１０日後の細胞をＢＭＤＣとして利用した。２×１０^６細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、Ｃａｎｄｉａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）由来のαマンナン及びマンナンを最終濃度０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌになる様に加え２４時間培養し、培養上清を回収した。

Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＮＢＲＣ１３８５株）はＢＭＤＣの刺激に用いる２日前にポテトデキストロース寒天培地（栄研化学）に播種し、３０℃の恒温槽で培養した。生えて来たＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのうち、独立したコロニーを４０個程度エーゼでかき取り、２０ｍｌの生理的食塩水に懸濁した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを生理的食塩水で２回洗った後、１×１０^６細胞／ｍｌ及び５×１０^５になる様に濃度を調整し、６５℃の恒温槽で２時間培養した。これをＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ死菌としてＢＭＤＣの刺激に用いた。ＢＭＤＣにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ死菌を加え、４８時間後に培養上清を回収し、サイトカイン濃度の測定、あるいはＴ細胞の培養に用いた。
Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのリンパ節細胞を採取し細胞を単離後、抗マウスＣＤ４抗体、抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体で染色し、ＣＤ４陽性、ＣＤ６２Ｌ陽性細胞をセルソーターで分離した。あらかじめ抗マウスＣＤ３抗体を個層化した４８穴プレートにＴ細胞を４×１０^５細胞になる様に播種し、無血清培地とＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ死菌で刺激を行ったＢＭＤＣの培養上清を１対１になるように混合し、５日間培養した。５日目にＴ細胞を回収し、細胞内のＩＬ−１７とＩＦＮ−γの存在量をフローサイトメーターで測定した。

（２）ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β産生量の測定
酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法で回収した培養上清中のＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−１βの産生量の測定を行った。キットはＩＬ−２３はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のものを使用し、ＩＬ−２３以外は全てＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のものを使用し、添付の測定方法に従い、測定した。

（３）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ 由来マンナンに対する反応性の低下
Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＤＣを用いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来αマンナン及びマンナンで刺激し２４時間後の培養上清中のサイトカイン産生量を測定した。その結果、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１０全てにおいて、野生型マウス由来ＢＭＤＣからはαマンナン、マンナンの用量依存的にサイトカイン産生が見られたが、Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウス由来ＢＭＤＣは反応性を失い、ほぼ完全にサイトカイン産生が消失した。また、マンナンで刺激をした場合には野生型マウス由来ＢＭＤＣは用量依存的にＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ４０を産生したが、Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウス由来ＢＭＤＣは反応性を失い、ほぼ完全にサイトカイン産生が消失した（図３）。この結果からデクチン−２はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来αマンナン及びマンナンを認識し、サイトカイン産生するために必須であることが示された。

Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＤＣを用いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ死菌で刺激し４８時間後の培養上清中のサイトカイン産生量を測定した。その結果、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２３全てにおいて、野生型マウス由来ＢＭＤＣからはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ死菌用量依存的にサイトカイン産生が見られたが、Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウス由来ＢＭＤＣは反応性を失い、ほぼ完全にサイトカイン産生が消失した（図４）。この結果からデクチン−２はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを認識し、サイトカイン産生するために必須であることが示された。

Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＤＣを用いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ死菌で刺激し４８時間後の培養上清中を採取し、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体存在下にナイーブＴ細胞に添加すると野生型マウス由来ＢＭＤＣ培養上清はＴ細胞をＴｈ１７細胞とＴｈ１細胞に分化させたが、デクチン−２−／−由来ＢＭＤＣの培養上清はＴ細胞をＴｈ１７細胞に分化させなかった（図５）。この結果からデクチン−２はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを認識し、Ｔ細胞をＴｈ１７細胞に分化させるために必須であることが示された。

実施例３
感染実験
Ｃ５７ＢＬ／６背景のＤｅｃｔｉｎ−２^−／−と野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用い、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの感染実験を行った。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＴＨＫ５１９株）はマウスに感染させる２日前にポテトデキストロース寒天培地（栄研化学）に播種し、３０℃の恒温槽で培養した。生えて来たＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのうち、独立したコロニーを４０個程度エーゼでかき取り、２０ｍｌの生理的食塩水に懸濁した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを生理的食塩水で２回洗った後、１．２５×１０^６細胞／ｍｌになる様に濃度を調整し、そのうち１匹当たり２００μｌを尾静脈より投与し、その後毎日生死の確認を行った。

野生型マウスと比較し、Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスでは有意に生存率が低下していた。この結果からデクチン−２はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する感染防御に重要な役割を果たしていることが示された（図６）。

実施例４
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ；ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）
ＣＩＡの誘導には１２９×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｆ１のＤｅｃｔｉｎ−２^−／−及びＤｅｃｔｉｎ−２^＋／＋マウスを使用した。ＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ）と等量の４ｍｇ／ｍｌチキンＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）（シグマ）をエマルジョン化し、１匹当たり０．１ｍｌを後背部の皮下に投与した。ＣＦＡには１ｍｌに対して結核死菌（Ｄｉｆｃｏ）５ｍｇを予め添加した。初回免疫から２１日後に同様に調整したＩＩＣを用いて追加免疫を行った。
野生型マウスと比較し、Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスではＣＩＡの発症率が低下した（図７）。この結果から、デクチン−２は関節炎の発症に重要な役割を果していることが示された。

実施例５
破骨細胞分化
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景のＤｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスの大腿骨、脛骨より骨髄細胞を採取し、５×１０^５細胞を５００μｌの培地（Ｍ−ＣＳＦ（ペプロテック）１０ｎｇ／ｍｌ、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））に懸濁し、２４ウェルプレートで２日間培養した。その後、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（ペプロテック）、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むαＭＥＭで３日間培養した。培地をのぞき、１０％中性緩衝ホルマリン（ナカライ）を加え、２分間放置後、除去した。その後、５０％アセトン（ナカライ）、５０％エタノール（ナカライ）を加え１分間放置後除去した。ＴＲＡＰ染色液を加え、２０分間放置した。その後水洗、乾燥し、顕微鏡で観察、計数した。ＴＲＡＰ染色液は４５ｍＭ酢酸（ナカライ）、５０ｍＭ酒石酸（ナカライ）、０．０１％ナフトール ＡＳ−ＭＸ フォスファターゼ（ナカライ）、０．０６％Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｖｉｏｌｅｔ ＬＢ Ｓａｌｔ ＬＢ（ナカライ）。

野生型マウスと比較し、Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスでは破骨細胞形成が抑制されていた。このことから、デクチン−２は破骨細胞の分化・成熟に重要な役割を果たしていることが示された（図８、図９）。

実施例６
可移植性腫瘍細胞株としてＢＡＬＢ／ｃ由来繊維肉腫細胞であるＭｅｔｈＡ（理研ＢＲＣより入手）を用いた。ＭｅｔｈＡは、１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ）を用い、５％ＣＯ_２、３７℃の炭酸ガス恒温槽内で培養を行なった。
実験用マウスとしては、ＭｅｔｈＡと同系であるＢＡＬＢ／ｃＡ背景Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−あるいは野生型ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（日本クレアより導入）の１０週齢のオスを用いた。
それぞれのマウスの右後肢足蹠皮下にＰＢＳに懸濁したＭｅｔｈＡ１．５×１０^６細胞を接種し、対照として左後肢足蹠皮下にはＰＢＳのみを注射した。ＭｅｔｈＡ接種右足蹠の測定値から対照左足蹠の測定値を引いたものをＭｅｔｈＡによる腫瘤の大きさとした。

ＭｅｔｈＡを接種した４日後より２日毎に足蹠の厚さを測定した。Ｄｅｃｔｉｎ−２^−／−マウスでは野生型ＢＡＬＢ／ｃＡマウスに比較してＭｅｔｈＡの腫瘤形成が有意に促進されて果たしていることが示された（図１０、図１１）。

Claims (11)

1. ゲノム中のデクチン−２遺伝子の機能を欠損した非ヒト動物。
2. 非ヒト動物がマウスである請求項１記載の非ヒト動物。
3. 請求項１又は２記載の非ヒト動物又は当該動物由来細胞よりなる、樹状細胞によるサイトカイン産生モデル動物又はモデル細胞。
4. サイトカインが、ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β又はＩＬ−１７Ｆである請求項３記載のモデル動物又はモデル細胞。
5. 請求項１又は２記載の非ヒト動物又は当該動物由来細胞よりなる、樹状細胞より産生されたサイトカインのＴｈ１又はＴｈ１７分化モデル。
6. 請求項１又は２記載の非ヒト動物又は当該動物由来細胞よりなる、真菌感染症モデル動物又はモデル細胞。
7. 請求項１又は２記載の非ヒト動物又は当該動物由来細胞よりなる、癌モデル動物又はモデル細胞。
8. 請求項１又は２記載の非ヒト動物又は当該動物由来細胞よりなる、骨疾患モデル動物又はモデル細胞。
9. 請求項１又は２記載の非ヒト動物又は当該動物由来細胞よりなる、関節炎モデル動物又はモデル細胞。
10. 被験物質をデクチン−２を発現している細胞に作用させる工程と、デクチン−２の活性を測定する工程とを含む、関節炎治療薬又は骨疾患治療薬のスクリーニング法。
11. 被験物質をデクチン−２を発現している細胞に作用させる工程と、デクチン−２の活性を測定する工程とを含む、Ｔｈ１又はＴｈ１７分化調節剤のスクリーニング法。