JPWO2009088037A1 - ホエイ等の乳糖含有物又は乳糖からアラビトールへの変換方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Palmer, G. M. : "Wine Production from Cheese Whey", EPA-600/2-79-189 (1979) Jin-Nam Kim, Hyang-Ok Kim, Young-Jung Wee, Doman Kim, Hwa-Won Ryu and Jong-Sun Yun : "Lactic Acid Production from Cheese Whey and Corn Steep Liquor by Lactobacillus sp. RKY2," 27th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, P4-21 (2005) Fialho, A.M., Ligia O. Martins, M-L. Donval, J.H. Leitao, M.J. Ridout, A.J. Jay, V.J. Morris and I.Sa-Correia : "Structures and Properties of Gellan Polymers Produced by Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 from Lactose Compared with Those Produced from Glucose and from Cheese Whey", Appl. Environmnt’l Microbiol., 65, 2485-2491 (1999) Ohnishi,H. and T.Suzuki : "Microbial Production of Xylitol from Glucose," Appl. Microbiol., 18, 1031-1035 (1969) Mayer,G., K.D.Kulbe and B.Nidetzky : "Utilization of Xylitol Dehydrogenase in a Combined Microbial/Enzymatic Process for Production of Xylitol from D-Glucose," Appl. Biochem. Biotechnol., 98-100, 577-589 (2002) Suzuki,S., M.Sugiyama, Y.Mihara, K.Hashiguchi and K.Yokozeki : "Novel Enzymatic Method for the Production of Xylitol from D-Arabitol by Gluconobacter oxydans," Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2614-2620 (2002) Sonoko,T. Y.Jojima, N.Tonouchi, R.Fudou and K.Yokozeki : "Microorganism Capable of Producing Xylitol or D-Xylulose," EP Patent, 0974646 (2000) Harkki,S.Z. and J.London : "Manufacture of Xylitol using Recombinant hosts, US Patent, 5631150 (1997) Povelainen,M. and A.N.Miasnikov : "Production of Xylitol by Metabolically Engineered Strain of Bacillus subtilis," J.Biotechnol., 128, 24-31 (2006) Ingram,J.M. and W.A.Wood : "Enzymatic Basis for D-Arabitol Prouction by Saccharomyces rouxii," J. Bacteriol., 89, 1186-1194 (1965) Ahmed, Z., H.Sasahara, S.H.Bhuiyan, T.Saiki, T.Shimonishi, G.Takada, K.Izumori : "Production of D-Lyxose from D-Glucose by Microbial and Enzymatic Reactions, " J. Biosci. Bioeng., 88, 676-678 (1999) Fabre,L., P.Gallezot and A.Perrard : "Catalytic Hydrogenation of Arabinonic Acid and Lactones to Arabitol," J. Catal., 208, 247-254 (2002)
本発明者らは、ホエイに多量に含まれる乳糖の有効利用として、種々の用途のある糖アルコールへの変換を検討した。糖アルコールには、例えば、糖尿病の予防や治療に用いられる、ソルビトール、マルチトール、歯牙のう蝕防止に用いられる、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、ダイエットに用いられる、エリスリトールなどが含まれる。図2には、乳糖からエタノールや糖アルコールへの代謝経路の可能性を示す。乳糖から生成する6炭糖は、グルコース、及びガラクトースであるが、ガラクトースがグルコースに異性化されると、グルコースはEmbden-Myerhof-Parnas(EMP)pathwayを経由し、条件が整えば、エタノール、グリセロール、エリスリトールに変換され得る。また、グルコースはPentose phosphate pathway(PPP)を経由し、5炭糖に変換され、条件が整えば、アラビトール、キシリトールなどの5炭糖の糖アルコールに変換され得る。グルコースから糖アルコールへの変換では、乳糖から糖アルコールへの変換では、グリセロールの事例が報告されているが、他の糖アルコールの事例は余り見受けられない。そこで、本発明者らは、乳糖を糖アルコールに変換できる微生物を探索することとした。
好浸透圧性の微生物は一般に糖アルコールを生成する傾向があると言われており、Kluyveromyces属の活用は、乳糖から有価物質を導出する可能性があると考える。そこで、本発明者らは、Kluyveromyces属の菌体を高濃度の乳糖に作用させ、エタノールや糖アルコールへの変換の可能性を評価し、有価物質の導出のために、培養の操作変数を検討した。その結果、糖アルコールの特にアラビトールへの変換に優れた菌株として、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及びKluyveromyces lactis NBRC 1903を見出した。
ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物の成分を含む水溶液又は乳糖を含む高浸透圧培地(例えば、乳糖が4重量%以上、好適には、乳糖の濃度が100g/L以上で190g/L以下の浸透圧を示す流体)を、例えば、20〜39℃、好適には、30〜37℃、より好適には、35〜37℃で、24h以上、Kluyveromyces lactis NBRC 0433及び/又はKluyveromyces lactis NBRC 1903で処理すること、具体的には、好気的に培養することで、乳糖をアラビトールに変換することができる。
前記の「3.ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物などの乳糖含有物又は乳糖からアラビトールへの変換」により生産された、アラビトールを、更にキシルロースに変換し、引き続き、キシリロースをキシリトールに変換することができる。
アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物を用いて、アラビトールを処理することで、キシルロースに変換することができる。
キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物を用いて、キシルロースを処理することで、キシリトールに変換することができる。
本実施例では、酵母であるKluyveromyces lactis var. lactis NBRC 0433及びNBRC 1903、Kluyveromyces marxianus NBRC 1735及びNBRC 10005(独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門(NBRC)より購入した)、並びにKluyveromyces marxianus ATCC 26548及びATCC 52486(American Type Culture Collection(ATCC)より購入した)を用いた。各種の菌株は、寒天プレート(グルコース:2%、酵母抽出物:1%、ペプトン:2%、寒天:2%)に、277K(ケルビン。以下、同じ)で保存した。
糖代謝に及ぼす培地成分の影響を検討する本実施例では、K. lactis NBRC1903株を用いた。
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、実施例1で用いた基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)で複合塩(硫酸アンモニウム:41.5g/L、リン酸二水素カリウム:3g/L、リン酸水素二カリウム:1g/L、硫酸マグネシウム七水和物:1g/L)を添加して調製した溶液の50mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、実施例2と同じ条件にして培養を行った。培養の開始から12h後と24h後に、乳糖一水和物:250 g/Lを、それぞれ10mLずつで添加した。その結果を図4に示す。
試験管(20mL)に、実施例1で用いた基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)で酵母抽出物の濃度を変化させて調製した溶液の2mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.010になるように植菌し、200rpm、303K、72hで(往復式の)振盪培養を行った。このとき、中位の好気的条件で培養したこととなる。その結果を図5に示す。
気泡塔反応器(30mmfx200mm)に、実施例1で用いた基本培地(乳糖一水和物:200g/L、酵母抽出物:10g/L)で酵母抽出物の濃度を変化させて調製した溶液の20mLを入れてから、K. lactis NBRC1903株を、菌体の初期濃度でOD600が0.02になるように植菌し、反応器の底部より空気を100 mL/minで連続的に供給しながら、303K、72hで培養を行った。このとき、高位の好気的条件で培養したこととなる。その結果を図6に示す。
ホエイからアラビトールの生産を検討した。ホエイUF透過液の粉末を含む培地を調製し、K. lactis NBRC1903株を植菌し、振盪培養を行った。その結果を図7に示す。
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、実施例1で用いた基本培地で複合塩(塩化ナトリウムと塩化カリウムを重量比で3:7に調整した)の濃度を変化させて調製した培地の50mLを加えてから、K. lactis NBRC1903株を植菌し、50rpm、303K、90hで振盪培養を行い、複合塩の濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した。その結果を図8に示す。
バッフル付きの三角フラスコ(500mL)に、実施例1で用いた基本培地で複合塩(塩化ナトリウムと塩化カリウムを重量比で変化させて調整した)の濃度を変化させて調製した培地の50mLを加えてから、K. lactis NBRC1903株を植菌し、50rpm、303K、90hで振盪培養を行い、各塩の濃度がアラビトール生産に及ぼす影響を検討した。その結果を図9に示す。
初期の乳糖(一水和物)濃度を20〜200g/Lとし、酵母抽出物を濃度が40g/Lとなるように添加した培地の2mLに、 K. lactis NBRC1903を植菌し、200rpmの振盪条件下、303Kで回分培養した。その結果を図13に示す。
バッフル付きのフラスコ(500mL)に、液量で50mLの培地を準備した。培地には、乳糖(一水和物)を200g/L、酵母抽出物を10g/Lの他に塩を加えた。この塩は質量比で3:7のNaClとKClを含んだ複合塩であり、その濃度が0〜50g/Lとなるように、NaClとKClを加えて調製した。また、NaCl又はKClの単一塩を濃度が0〜30g/Lの範囲で添加する実験も行った。その結果を図14に示す。図14(D)では、それぞれに条件設定したイオン濃度の合計値 ci=[Na+]+[K+]+[Cl-] (1) に対し、D-アラビトール生産量をプロットした。複合塩、単一塩、いずれの実験結果も一本の曲線状にプロットされているように見受けられる。このことより、イオン濃度に比例する浸透圧に応じて細胞は応答し、D-アラビトールを生成していることが推論される。
試験管(20mL)を用いて、液量で2mLの培地(乳糖(一水和物)、200g/L;(NH4)2SO4、3.4g/L;KH2PO0、2g/L;MgSO0・7H0O、1g/L;Glutamine、2〜10g/L;Yeast Nitrogen Base without Amino Acid)に植菌し、温度を303、308、310Kとして、200 rpmで振盪培養を行い、グルタミン濃度と培養温度の影響を調べた。その結果を図15に示す。酵母抽出物を使用した実験に比べると、全体的にD-アラビトール生産量は低いが、培養温度を高めると、D-アラビトール生産量は高まり、310K(37℃)では、グルタミン濃度の5g/Lで、D-アラビトール生産量は17.1g/Lを達していることが分かる。
K. lactis NBRC1903の濃縮操作と酸素供給操作がD-アラビトール生産量に及ぼす影響を検討した。培地には、乳糖を100g/L又は200g/L;(NH0)0SO0、3.4g/L;KH0PO0、2g/L;MgSO0・7H0O、1g/L;Glutamine、5g/L;Yeast Nitrogen Base without Amino Acidから成る液体で2mLを用いて、温度を310Kとして、200rpmで振盪培養を行った。培養開始から24h後に、遠心分離操作によって菌体濃度を2倍として、培養を継続させた。その結果を図16にを示す。菌体濃縮操作を行い、液量で2mLの培地を用いて、200rpmで振盪培養を継続させたところ、D-アラビトール生産量は、菌体濃縮操作を行わない場合と比べて若干低下した。菌体濃縮操作を行った結果、エタノール濃度が向上して、嫌気性が向上し、D-アラビトール生産量が低下したと考えられた。菌体濃縮操作を行い、液量で1mLの培地を用いて、200rpmで振盪培養を継続させたところ、D-アラビトール生産量は、菌体濃縮操作を行わない場合と比べて向上し、120h後には26.7 g/Lに達した。上記の実施例1と比べて、6.8倍に到る濃度を獲得することができた。
アラビトールからキシルロースへの変換
本参考例では、アラビトールからキシルロースへの変換を検討した。
キシルロースからキシリトールへの変換
本参考例では、キシルロースからキシリトールへの変換を検討した。
Claims (14)
- 乳糖(ラクトース)をアラビトールに変換する能力を有する微生物で、乳糖を含有する溶液を処理することによる、乳糖をアラビトールに変換する方法。
- 乳糖を含有する溶液が、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物、ホエイの濃縮液、ホエイの希釈液、ホエイの粉末の水溶液、ホエイUF透過液の濃縮液、ホエイUF透過液の希釈液、ホエイUF透過液の粉末の水溶液、脱乳糖ホエイUF透過液の濃縮液、脱乳糖ホエイUF透過液の希釈液、脱乳糖ホエイUF透過液の粉末の水溶液、ホエイ加水分解物の濃縮液、ホエイ加水分解物の希釈液、及びホエイ加水分解物の粉末の水溶液からなる群から選ばれる1種又は2種以上である請求項1記載の方法。
- 乳糖をアラビトールに変換する能力を有する微生物が乳糖資化性・好浸透圧性の酵母である請求項1又は2記載の方法。
- 乳糖資化性・好浸透圧性の酵母がKluyveromyces lactis NBRC 0433及び/又はKluyveromyces lactis NBRC 1903である請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記溶液に酵母抽出物(酵母エキス)を5〜50g/Lで含む請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記溶液が更に塩化ナトリウム塩及び/又は塩化カリウム塩を0.3〜1.0mol/Lで含む請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記溶液に空気を通気して処理する、前記溶液を穏やかに振盪させて処理する、又は前記溶液中の前記微生物の菌体濃度を高めた後に穏やかに振盪させて処理する請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 前記溶液を乳糖の初期濃度が100g/L以上となるように調製することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 前記溶液を30℃から37℃で処理することを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 以下の工程を含む、乳糖を含む溶液からキシリトールを生産する方法。
(1)乳糖をアラビトールに変換する能力を有する微生物で、乳糖を含有する溶液を処理することによる、アラビトールに変換する工程、
(2)アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物で、アラビトールを含む溶液を処理することによる、アラビトールをキシルロースに変換する工程、
(3)キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物で、キシルロースを含む溶液を処理することによる、キシルロースをキシリトールに変換する工程 - 乳糖を含有する溶液が、ホエイ、ホエイUF透過液、脱乳糖ホエイUF透過液、ホエイ加水分解物、ホエイの濃縮液、ホエイの希釈液、ホエイの粉末の水溶液、ホエイUF透過液の濃縮液、ホエイUF透過液の希釈液、ホエイUF透過液の粉末の水溶液、脱乳糖ホエイUF透過液の濃縮液、脱乳糖ホエイUF透過液の希釈液、脱乳糖ホエイUF透過液の粉末の水溶液、ホエイ加水分解物の濃縮液、ホエイ加水分解物の希釈液、及びホエイ加水分解物の粉末の水溶液からなる群から選ばれる1種又は2種以上である請求項10記載の方法。
- 乳糖をアラビトールに変換する能力を有する微生物がKluyveromyces lactis NBRC 0433及び/又はKluyveromyces lactis NBRC 1903である請求項10又は11記載の方法。
- アラビトールをキシルロースに変換する能力を有する微生物がGluconobacter属に属する微生物である請求項10〜12のいずれか1項記載の方法。
- キシルロースをキシリトールに変換する能力を有する微生物がKluyveromyces lactis NBRC 1903及び/又はCandida shehatae IAM 12953である請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
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