JPWO2008150031A1 - 植物ホルモン・オーキシンの生合成阻害剤及び該阻害剤を有効成分として含有する植物化学調節剤、除草剤並びにその使用方法 - Google Patents

Abstract

本願発明は、内在性のオーキシンの合成阻害剤を提供することを第１の課題とする。更に本願発明は、上記オーキシン生合成阻害剤を使用する植物成長抑制剤または除草剤を提供することを第２の課題とする。本願発明は、植物体にオーキシン阻害剤候補化合物を添加し、オーキシン誘導性遺伝子の発現を妨げるオーキシン生合成阻害剤の候補をスクーニングする方法、並びに候補化合物を添加後に植物体を破砕して内生オーキシン量を測定することにより、植物体内でオーキシン合成を実際に阻害している化合物を選抜する方法、並びにあらかじめ調整したトリプトファンデアミナーゼとトリプトファンの存在下でインドールピルビン酸の生成を阻害する化合物を選抜する方法を提供する。より具体的には、本願発明は、ＡＶＧ、ＡＯＡ、ＡＯＩＢＡ、Ｌ−ＡＯＰＰ又はその類縁体からなるオーキシン生合成阻害剤、及びこれら化合物を有効成分とする植物成長制御剤、除草剤を包含する。

Description

本願発明は、オーキシン（インドール−３−酢酸等）の生合成阻害剤を有効成分として含有する植物化学調節剤または除草剤に関する。更に、本願発明は、該植物化学調節剤を用いて、様々な植物種において、様々な生育段階、器官において植物の生育を人為的に制御する方法に関する。

オーキシンは、植物ホルモンとして最初に認識された物質で、植物の示す屈曲性に関与するホルモンとして、同定された。その後、主要な天然オーキシンとしては、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）であることが明らかにされ、ＩＡＡ以外にも、インドール−３−酪酸、４−クロロインドール酢酸、及びフェニル酢酸などが知られている。また合成オーキシンとしては、２，４，ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，６−ジクロロ安息香酸などが知られている（非特許文献１）。
天然オーキシンであるＩＡＡは不安定であり、植物体内では分解経路も存在するため、農業用途には、合成オーキシンが用いられていることが多い。例えば、水田での双子葉植物除草剤としては、４−（４−ｃｈｌｏｒｏ−ｏ−ｔｏｌｙｌｏｘｙ）ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＭＣＰＢ）や２，４−Ｄが用いられている。また２，３，５−トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）は、側芽の発芽、成長を高めることができる。さらに、組織培養には、２，４−Ｄやナフタレン酢酸（ＮＡＡ）が用いられる。また、発根には、ＮＡＡやインドール酪酸が用いられている。また、例えば、トマトでは、４−クロロフェノキシ酢酸は、未受精のトマトでも着果促進する効果がある（非特許文献１）。
植物体内でオーキシンはコリスミ酸から合成され、以前は、Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）を経由して合成されると考えられていたが、現在では大きく分けて（１）Ｌ−Ｔｒｐを経由する経路と、（２）Ｌ−Ｔｒｐを経由しない経路の２つの経路が確認されている。Ｌ−Ｔｒｐを経由する経路は、さらに４つ以上の枝に分岐しており、それぞれの経路は異なった酵素によって触媒されている（図１）。現在でも、どの経路が主要経路なのか、あるいはどのような役割分担があるのかは不明である。
自身はほとんどオーキシン活性を示さないが、ＩＡＡなどのオーキシンと競合してオーキシンの結合部位を奪うことにより、オーキシン作用を拮抗的に阻害する抗オーキシンも合成されている。抗オーキシンとしては、２，４−ジクロロフェノキシイソ酪酸（ＰＣＩＢ）等が知られている。また、マレイン酸ヒドラジド、マレイン酸ヒドラジドコリンなども、オーキシンの作用を抑制し、細胞分裂を阻害すると共に、伸長を抑制することが知られている。タバコの芯止め後のえき芽発生抑制や、野菜の発芽抑制に用いられている（非特許文献２）。
増田芳雄編著「植物ホルモン入門」オーム社（平成４年（１９９２年）７月３０日発行）第９−１７及び４１−４５頁 農薬ハンドブック１９９８年版編集委員会編「農薬ハンドブック１９９８年版」社団法人日本植物防除協会発行 第１０版 平成１０年（１９９８年）１２月１５日 第５２５−５２６頁

これまで、抗オーキシンと呼ばれるオーキシンの信号を阻害するとされる物質（ＰＣＩＢなど）や、オーキシン極性輸送阻害剤と呼ばれるＴＩＢＡなど、オーキシンの作用を制御する化合物としては知られていたが、内在性オーキシンの量を制御する（減少させる）物質は知られていなかった。また、モデル植物を中心に分子遺伝学が発達した今日に於いても、内生オーキシン量が減少する突然変異体は知られておらず、ＲＮＡｉ法やアンチセンス法など分子生物学的な手法を用いても内生オーキシンの量を抑制する技術は存在しなかった。本年４月になって、ＰＬＰ酵素の変異体ｔａａ１／ｓａｖ３／ｗｅｉ８が単離され、本遺伝子とそのファミリー遺伝子（ＴＡＲ２）の２重変異体ｗｅｉ８ ｔａｒ２変異体ではＩＡＡ内生量が半分以下に減少することが報告された（Ｃｅｌｌ １３３：１７７−１９１（２００８）；Ｃｅｌｌ １３３ １６４−１７６（２００８））。
今日のオーキシン生合成経路に関する知見では、オーキシンは網目状の多様な経路を通して合成されており、そもそも一つの化合物（つまり一つの酵素反応の阻害）で、その生合成を強く阻害することは困難と考えられてきた。
他方、植物の内在性のオーキシン合成量を調節できれば、更に効率的に植物成長を調節できる可能性がある。
今日、国際市場で最も良く普及している除草剤グリホサートは、芳香族アミノ酸合成経路の阻害剤である（つまり、コリスミ酸の上流で代謝を阻害）。一方、本願発明で提供される化合物は、芳香族アミノ酸合成経路経路の下流末端に位置するオーキシンの生合成経路を阻害する。従って、既存の除草剤よりも制御する経路がより狭く、特異的であるため、本願発明によって提供される薬剤は、既存の除草剤よりも副作用が少なく、作用の選択性が高く、より効率的に（すなわち低濃度で）植物を除草する効果をもたらすことが期待できる。
そこで、本願発明は、内在性のオーキシンの合成阻害剤を提供することを第１の課題とする。更に本願発明は、上記オーキシン生合成阻害剤を使用する植物成長制御剤または除草剤を提供することを第２の課題とする。
本願発明者等は、その類まれなる洞察力により、オーキシン生合成阻害作用を奏する化合物を見出して、本願発明を完成させた。
本願発明は、オーキシン誘導性遺伝子の発現を妨げるオーキシン生合成阻害剤候補をスクーニングする方法を提供する。これにはオーキシン応答性遺伝子に対するプローブを担持するマクロアレイを用いて、オーキシン誘導性遺伝子の発現を妨げる候補をスクーニングする方法を含む。さらに、本願発明は、実際に植物に前記オーキシン阻害剤候補を添加し、その後植物体を破砕して生体内のオーキシン量を測定することにより、オーキシン阻害剤の候補が植物体内でオーキシン合成を阻害しているオーキシン阻害剤候補をオーキシン阻害剤として選抜する、オーキシン生合成阻害剤のスクリーニング方法を提供する。さらに、オーキシン生合成経路のうち、Ｌ−ＴｒｐからＩｎｄｏｌｅ−３−ｐｙｒｖｉｃ ａｃｉｄ（ＩＰｙＡ）を合成する酵素抽出液に対して、前記オーキシン阻害剤候補とＬ−Ｔｒｐを添加し、ＩＰｙＡの生成を妨げる候補化合物をスクーニングする方法を含む。
また、本願発明は、オーキシン生合成阻害剤を提供する。本願発明は、Ｌ−ｔｒｐを経由してＩＡＡを合成する経路で働く、ピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）要求性の酵素又はＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎを脱アミノ化してＩｎｄｏｌｅ−３−ｐｙｒｖｉｃ ａｃｉｄ（ＩＰｙＡ）に変換するトランスデアミナーゼを阻害することにより、オーキシン生合成を阻害する阻害剤を提供する。
より具体的には、本願発明は、ＡＶＧ（ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙｖｉｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、２−ａｍｉｎｏ−４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＵＳＰ３８６９２７７））、ＡＯＡ（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、２−ａｍｉｎｏｏｘｙ ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｌｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＯＩＢＡ）、Ｌ−ａｍｉｎｏｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｌ−ＡＯＰＰ）を含有するオーキシン生合成阻害剤及びこれらを有効成分とする植物成長調節剤を包含する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００７−１５２８０８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、オーキシン合成経路を示す。オーキシンはコリスミ酸から合成され、Ｌ−Ｔｒｐを経由する経路と、経由しない経路の２つの経路が確認されている。Ｌ−Ｔｒｐを経由する経路は、４つ以上の枝に分岐しており、それぞれの経路は異なった酵素によって触媒される。それぞれの経路の中間体と生合成反応を触媒する酵素（または遺伝子）の名称（略号）を記す。
図２は、エチレン誘導性遺伝子（Ａ）とオーキシン誘導性遺伝子（Ｂ）のＡＶＧ処理に対する挙動を示す。（Ａ）エチレン応答性遺伝子の発現。（Ｂ）オーキシン応答性遺伝子の発現。
図３は、ＡＶＧ処理後のシロイヌナズナ内生ＩＡＡ量の変化を示す。
図４は、ＡＣＣとオーキシン生合成中間体を用いた、ＡＶＧ処理からの遺伝子発現回復実験を示す。
図５は、ＡＶＧ，ＡＯＡがオーキシン応答性遺伝子の発現を抑制する。
図６は、オーキシンとその生合成中間体を用いた、αメチルトリプトファン（Ｍｅｔ−Ｔｒｐ）処理からの根の伸長回復実験を示す。
図７は、オーキシンと生合成中間体を用いた、ＡＶＧ処理からの根の伸長回復実験を示す。
図８は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬ−トリプトファンからＩＰｙＡへの変換酵素（コムギ由来）に対するＡＶＧの抑制作用。
図９は、シロイヌナズナ芽生の生育へのＡＶＧ、ＡＯＡの効果。
図１０は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬ−トリプトファンからＩＰｙＡへの変換酵素（シロイヌナズナ由来）に対するＡＶＧ，Ｌ−ＡＯＰＰの効果。
図１１は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬ−トリプトファンからＩＰｙＡへの変換酵素（シロイヌナズナ由来）に対するＡＯＡ，ＡＯＩＢＡの効果。
図１２は、Ｌ−ＡＯＰＰとＤ−ＡＯＰＰによるオーキシン応答性遺伝子の発現への影響。Ｌ、Ｄ−ＡＯＰＰ処理におけるＩＡＡ応答性遺伝子発現量
図１３は、Ｌ−ＡＯＰＰのシロイヌナズナ生育への影響を示す写真。
図１４は、シロイヌナズナＩＡＡ内生量への影響。（Ａ）阻害剤１ｈ処理後のＩＡＡ内生量。（Ｂ）阻害剤１ｈ処理後の１株あたりのＩＡＡ内生量。
図１５は、イネＩＡＡ内生量への影響。コシヒカリ阻害剤処理３ｈ ＩＡＡ内生量。
図１６は、阻害剤とＩＡＡ前駆体の構造。

１．はじめに
植物体内でのオーキシンの合成経路は複雑で、網目状であることが示されてきた（図１）。現在までのところ、どの経路が、内在性のオーキシンの主要な合成経路であるかは確認されていない。そのため、どの経路のどの酵素反応を阻害すれば、内在性オーキシン生合成を阻害し、それによって植物の成長を制御または抑制できるか明らかではない。
２．遺伝子発現及びマイクロアレイを用いるオーキシン生合成阻害剤候補のスクリーニング方法
本願発明者等は、既に、オーキシンに応答して発現の影響を受ける遺伝子、つまりオーキシン誘導性遺伝子を多数分離している。
本願発明者等は、このようなオーキシン誘導性遺伝子に対するプローブを担持するマクロアレイを用いて、オーキシン誘導性遺伝子の発現を妨げるオーキシン生合成阻害剤候補をスクーニングできることを見出した。このようなマイクロアレイとしては、以下の表１に記載の任意の遺伝子を適宜選択し、該遺伝子の塩基配列と同一の少なくとも２０オリゴヌクレオチドをプローブとして、周知の任意のマイクロアレイ上に載せたものを使用できる。
例えばシロイヌナズナにおいては、表１に掲げられる任意の遺伝子を、例えば、１０種類以上選択し、各遺伝子に対するに対する２０オリゴヌクレオチド以上からなるプローブを用いるマイクロアレイ及び当該マイクロアレイを用いるオーキシン生合成阻害剤候補のスクリーニング方法を包含する。ここで、マイクロアレイシステムとしては、たとえば、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＣｈｉｐ ｓｙｓｔｅｍを用いることができる。
本マイクロアレイを用いて、例えば、オーキシン等対象化合物の存在下で発現が誘導される程度と、試験化合物の存在下で発現が抑制される程度を比較することで、オーキシン生合成阻害剤候補を選抜できる。具体的には、例えば、シロイヌナズナ（アラビドプシス）のようなモデル植物に、対象化合物としてオーキシンを与える場合の遺伝子発現のレベルを測定する。次にオーキシンを与えない場合での遺伝子発現の程度を測定して、これらを比較する。更に、該試験植物に試験化合物を与えた場合と与えない場合での遺伝子発現とを比較する。オーキシンの存在下で発現が増大する遺伝子群が、前記試験化合物の存在下で発現が減少する関係があるようであれば、当該試験化合物をオーキシン生合成阻害剤候補として選抜できる。
一方、オーキシン応答性遺伝子のプロモーターを利用して人為的に作成したマーカー遺伝子（例えば、ＤＲ５−ＧＵＳやＳＡＵＲ−ＧＵＳなど）を組み込んだ遺伝子組換え植物体に対して、候補化合物を処理し、マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによっても候補化合物を選抜することができる。あるいは、野生型植物に候補化合物を処理し、処理後の植物からトータルＲＮＡを抽出して、オーキシン応答性遺伝子の発現量を定法に従って測定することによって、オーキシン応答性遺伝子の発現を抑制する化合物の中から、候補を選抜することも可能である。
本発明者等は、このようなマイクロアレイを用いたスクリーニング方法により、オーキシン生合成阻害剤候補として、ＡＶＧを同定した。
３．ＩＡＡ生合成や酵素活性を指標としたオーキシン生合成阻害剤のスクリーニング方法
植物体内でオーキシン合成を阻害する化合物は、実際に植物体に試験化合物又はオーキシン等の対象化合物を添加して、その後植物体を破砕して、質量分析装置等を用いて、生体内のオーキシン量を測定し、スクリーニングすることができる。
また、上記２．で選ばれたオーキシン阻害剤候補が、植物体内でオーキシン合成を阻害している否かは、実際に植物体にオーキシン生合成阻害剤候補を添加して、その後植物体を破砕して、質量分析装置等を用いて、生体内のオーキシン量を測定し確認することもできる。この方法により、本願発明者らは、ＡＶＧ及びその類縁体がオーキシン生合成阻害剤であることを確認した。
さらに、オーキシン生合成経路の中間体をＡＶＧと同時に植物に投与することで、当該化合物がＡＶＧによる成育阻害を回復するか否かを検討した。これにより、本願発明者等は、ＡＶＧの成育阻害の作用点が、植物体内でのオーキシンの生合成経路上に存在することを確認した。さらに、植物より抽出した酵素活性をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて評価する系を確立した。この酵素活性の評価系を用いてＡＶＧの作用点を調べ、オーキシン生合成を阻害するターゲットの１つは、ピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）要求性の酵素、又はＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎを脱アミノ化してＩｎｄｏｌｅ−３−ｐｙｒｖｉｃ ａｃｉｄ（ＩＰｙＡ）に変換するトランスデアミナーゼ、より好適なオーキシン生合成を阻害するターゲットとしては、Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎを脱アミノ化してＩｎｄｏｌｅ−３−ｐｙｒｖｉｃ ａｃｉｄ（ＩＰｙＡ）に変換するピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）要求性のトランスデアミナーゼであることを見出した。従って、これら酵素活性の阻害剤をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングすることによっても、オーキシン合成阻害剤を探索できる。
４．ピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）要求性の酵素の阻害剤又はトリプトファンアミノ基転移酵素の阻害剤を有効成分として含有するオーキシン生合成阻害剤
本願発明のオーキシン生合成阻害剤には、ＡＶＧ及びその類縁体からなるピリドキサルリン酸要求性酵素の阻害剤を包含する。
また、本願発明は、ピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）要求性の酵素（トランスデアミナーゼ、デカルボキシラーゼ、Ｃ−Ｓライエース、ラセマーゼ等を含む）の阻害剤を用いて、オーキシンの生合成を阻害することが可能であることを初めて示す。特に、ＰＬＰ要求性酵素の阻害剤として知られる化合物の中から、前記３．の方法によってオーキシンの生合成を阻害する化合物を新たに選抜することが可能である。ＰＬＰ要求性酵素の阻害剤としては、例えば、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７３：３８３−４１５（２００４）に記載の化合物が知られている。本発明者等はこのようなスクリーニングを行うことにより、ＡＣＣ合成酵素（ＰＬＰ要求性酵素）の阻害剤として知られているＡＯＡ（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）がオーキシン生合成を阻害できることを見いだした。よって、ＡＯＡの類縁体も本願発明のオーキシン生合成阻害剤に包含する。
また、本願発明は、トランスデアミナーゼ（例えば、Ｔｒｐアミノトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）の阻害剤を用いて、オーキシンの生合成を阻害することが可能であることを初めて示す。特に、トランスアミナーゼ阻害剤として知られる化合物の中から、前記３．の方法によってオーキシンの生合成を阻害する化合物を新たに選抜することが可能である。ＰＬＰを要求しないトランスアミラーゼとしては、例えばフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）がある。ＰＡＬの阻害剤としては、例えばＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６８：４０７−４１５（２００７）やＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６２：４１５−４２２（２００３）に記載の化合物、具体的には、１−ａｍｉｎｏ−３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、１−ａｍｉｎｏ−２−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ、（Ｒ）−１−ａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｗｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ、１−ａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄが知られている。本発明者等はこのようなスクリーニングを行うことにより、ＰＡＬの阻害剤として知られているＬ−ＡＯＰＰがオーキシン生合成を阻害できることを見いだした。よって、Ｌ−ＡＯＰＰの類縁体も本願発明のオーキシン生合成阻害剤に包含する。
具体的には、下記（式Ｉ）又は（式ＩＩ）から選ばれる化合物を有効成分として含有するオーキシン生合成阻害剤が挙げられる。
（式Ｉ）
但し、Ｒ_１はカルボキシル基又はホスホン基を意味する。Ｒ_２は水素原子もしくはメチル基を示す。Ｒ_３はアミノ基、又はアミノオキシ基を示す。Ｒ_４は、水素又はＲ_５−ＣＨ_２−であって、ここで、Ｒ_５は、炭素原子が塩素又はメチル基で修飾されていてもよい、インドール環、ナフタレン環、ベンゼン環、ピリジン環、ピロール環を示す。
（式ＩＩ）
Ｒ_６は、アミノ基を有していても良い炭素数１−４のアルキル基を示す。
更に具体的には、
（式ＩＩＩ）
但し、Ｒ１はカルボキシル基、又はホスホン基を意味する。
Ｒ_２は水素原子もしくはメチル基を示す。
Ｒ_３はアミノ基、又はアミノオキシ基（−Ｏ−ＮＨ_２）を示す。
不斉炭素の立体構造は、Ｒ_１がカルボキシル基の場合にはＳ体がより好ましく、Ｒ_１がホスホン基の場合にはＲ体が好ましい。
Ｒ_５は炭素原子が塩素又はメチル基で置換されていてもよい、インドール環、ナフタレン環、ベンゼン環、ピリジン環、ピロール環を示す。具体的には、Ｒ_５とし
好適には、Ｒ１がカルボキシル基のものとしては、Ｌ−ＡＯＰＰや
２−（ａｍｉｎｏｏｘｙ）−３−（１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄが、
Ｒ１がホスホン基のものとしては、１−ａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄや
１−ａｍｉｎｏ−２−（１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄがそれぞれ挙げられる。
また、好適には、Ｒ３がアミノ基のものとしては、１−ａｍｉｎｏ−２−（１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄや１−ａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｒ３がアミノオキシ基のものとしては、ＡＯＰＰや２−（ａｍｉｎｏｏｘｙ）−３−（１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄが挙げられる。
また、具体的には、２−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＭＢ）やリゾビトキシン（２−ａｍｉｎｏ−４−（２−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を包含する。特に、Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎの類縁体、２−ａｍｉｎｏ−４−ａｌｋｏｘｙ−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄの構造を持つ化合物とそれらの塩は有効である。図１７参照。
５．植物成長制御剤
本願発明のオーキシン生合成阻害剤は、根の伸長の阻害を始め、芽生えの成長抑制などの植物成長抑制剤、植物成長制御剤、又は除草剤として使用することができる。例えば、オーキシン生合成阻害剤は、タルク、クレー、でんぷん、水等の各種担体と混合して、固体製剤としても、又は液体製剤としても使用することができる。液体製剤としては、適宜の担体を用いて、液剤、乳剤、マイクロエマルション、サスポエマルション、油剤、油性フロアブルなどの液体製剤化をすることができる。固体製剤としては、粉末剤、粒剤、顆粒剤、錠剤、水和剤、顆粒水和剤などとして用いることができる。更に、農薬等の製剤上使用される補助剤、例えば展着剤、乳化剤、着色剤等を必要に応じて添加することができる。

オーキシン誘導性遺伝子とエチレン誘導性遺伝子のＡＶＧ処理に対する挙動
野生型シロイヌナズナ（コロンビア）の種子を４℃で４８時間低温処理した後、１／２ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ）１％Ｓｕｃｒｏｓｅを含む液体培地で７日間培養した。このシロイヌナズナの芽生えを１０μＭのＡＶＧ、１０μＭのエチレン前駆体ＡＣＣ（アミノシクロプロパンカルボン酸）、又は１μＭのＩＡＡで３時間処理した。このシロイヌナズナの芽生えからトータルＲＮＡを精製した後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のプロトコールに従ってＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて遺伝子の発現レベルを測定した。結果を図２に示す。縦軸はＡＶＧ処理に対する遺伝子の発現応答を無処理のコントロールに対する比の対数（Ｓｉｇｎａｌ Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏ）で示す。横軸はそれぞれＡＣＣ処理（図２Ａ）とＩＡＡ処理（図２Ｂ）に対する遺伝子発現の応答を無処理のコントロールに対するＳｉｇｎａｌ Ｌｏｇ Ｒａｔｉｏで示す。ＡＶＧはエチレン生合成の阻害剤として知られており、ＡＣＣ処理とＡＶＧ処理をエチレン誘導性遺伝子を対象としてプロットして（図２Ａ）比較すると、既知のように負の相関が見られた。一方、ＩＡＡ処理とＡＶＧ処理を、オーキシン誘導性遺伝子をプロットして（図２Ｂ）比較すると負の相関が見られた。この結果はＡＶＧがこれまで考えられていた、エチレン抑制作用だけでなく、オーキシン抑制作用も持っていることを示唆している。なお、使用したＡＶＧは、以下の実施例も含む全てＳ体である。

ＡＶＧ処理後のシロイヌナズナ内生ＩＡＡ量の変化
野生型シロイヌナズナ（コロンビア）の種子を４℃で４８時間低温処理した後、１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅを含む液体培地で７日間培養した。このシロイヌナズナの芽生えにＡＶＧ４、１０，又は４０μＭを２４時間処理した。このシロイヌナズナの芽生えをメタノールで抽出後、内部標準物質として１３Ｃ６−ＩＡＡを添加した。抽出液を濃縮後、Ｎ（ＣＨ３）２ ＨＰＬＣカラムで精製し、ＩＡＡ溶出画分を分取。ＩＡＡ画分をトリメチルシリル化後、ＧＣ−ＭＳで定量分析した。結果を図３に示す。ＡＶＧ処理によりシロイヌナズナ内生ＩＡＡ量は処理したＡＶＧの濃度に依存して減少した。

ＡＣＣとオーキシン関連化合物を用いた、ＡＶＧ処理からの遺伝子発現回復実験
野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ．）の種子を４℃で４８時間低温処理した後、１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅを含む液体培地で７日間培養した。このシロイヌナズナの芽生えに４０μＭ ＡＶＧと１０μＭのエチレン生合成前駆体ＡＣＣ、ＩＡＡ、ＩＡＡ生合成前駆体ＩＰｙＡ（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ）、又はＩＡＡｌｄ（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）を２４時間処理した。これらシロイヌナズナの芽生えからＲＮＡを精製した後、Ｔａｑｍａｎプローブを用いた定量ＰＣＲ法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７５００）を用いてオーキシン作用の指標となる遺伝子の一つである、ＩＡＡ１９／Ａｔ３ｇ１５５４０遺伝子の発現レベルを測定した。プライマーはフォワード（ＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴ）、リバースプライマー（ＴＴＣＧＣＡＧＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣ）、ＴａｑＭａｎ プローブ（ＦＡＭ−ＡＴＡＡＧＣＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧ−ＴＡＭＲＡ）を用い、測定は文献に記載の方法によって行った（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１３１：２８７−２９７）。結果を図４に示す。
縦軸は対照区を１とした遺伝子発現レベルの相対値を示す。ＩＡＡ１９遺伝子の発現レベルはＩＰｙＡを経るオーキシン生合成の前駆体（ＩＰｙＡ，ＩＡＡｌｄ）で対照区レベルまで回復した。この傾向はＡＣＣをさらに加えても変化しなかった。この結果は、ＡＶＧはＩＡＡの生合成を阻害することにより、オーキシン応答性遺伝子の発現を抑制することを示す。また、ＡＶＧによるオーキシン応答性遺伝子の発現抑制効果はエチレンの生合成阻害を介した間接作用ではないことを示す。

ＡＶＧ、ＡＯＡ処理後のオーキシン誘導生遺伝子の発現変化
野生型シロイヌナズナ（コロンビア）の種子を４℃で４８時間低温処理した後、１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅを含む液体培地で７日間培養した。このシロイヌナズナの芽生えに、ＡＶＧまたはＡＯＡを１、５，又は２０μＭで２４時間処理した。ＡＯＡはＡＶＧと同様にピリドキサルリン酸依存性酵素の作用を阻害することで、エチレンの生合成を阻害することが知られている。処理後のシロイヌナズナの芽生えからＲＮＡを精製した後、Ｔａｑｍａｎプローブを用いた定量ＰＣＲ法を用いてオーキシン作用の指標となるＩＡＡ１、ＩＡＡ２遺伝子の発現レベルを測定した（図５）。縦軸は対照区を１とした遺伝子発現レベルの相対値を示す。ＩＡＡ１／Ａｔ４ｇ１４５６０、ＩＡＡ２／Ａｔ３ｇ２３０３０遺伝子共にＡＶＧ処理では濃度に依存してその発現量が減少した。同様にＡＯＡ処理によってもオーキシン誘導生遺伝子の発現は減少したが、その作用はＡＶＧよりもやや弱かった。

オーキシンとその関連化合物を用いた、Ｍｅｔ−Ｔｒｐ処理又はＡＶＧ処理からの根の伸長回復実験
野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ．）の種子を４℃で４８時間低温処理した後、１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅを含む寒天培地で２日間培養した。このシロイヌナズナの芽生をαメチルトリプトファン（Ｍｅｔ−Ｔｒｐ）を含む１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅ寒天培地に移植し垂直に６日間生育させた。Ｍｅｔ−ＴｒｐはＬ−Ｔｒｐの合成経路を上流で阻害するが、Ｍｅｔ−Ｔｒｐによる生育阻害をＩＡＡとその生合成前駆体が回復できるかどうか、根の伸長回復を指標に観察した。結果を図６に示す。
対照区（Ａ）と比較してＭｅｔ−Ｔｒｐ処理により根の伸長が著しく阻害された（Ｂ）。この根の伸長阻害作用はインドール（Ｉｎｄｏｌｅ）とトリプトファン（Ｔｒｐ）で回復するが（Ｃ、Ｄ）、他のオーキシン前駆物質では回復しなかった（Ｅ−Ｋ）。この結果はＭｅｔ−Ｔｒｐがトリプトファンやインドールの上流でこれらの生合成を阻害していることを示している。
同様に、発芽２日後のシロイヌナズナの芽生えをＡＶＧとオーキシンとその前駆物質を含む１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅ寒天培地培地に垂直に並べ、６日後根の伸長回復を観察した。結果を図７に示す。対照区（Ａ）と比較してＡＶＧ処理により根の伸長が著しく阻害された（Ｂ）。この根の伸長阻害作用はインドールとＬ−トリプトファン（Ｃ、Ｄ）、ＩＰｙＡを経るオーキシン合成経路の前駆体で回復するが（Ｉ−Ｊ）、ＩＰｙＡを経由しない他の前駆体では回復しなかった（Ｅ−Ｈ）。またインドールやＬ−トリプトファンの回復と比較してインドールピルビン酸を経るオーキシン合成経路の化合物での回復は顕著であった。この結果はＡＶＧがインドールからＩＡＡが合成される途中のステップでオーキシン合成を阻害していることを示している。一方、インドールや、Ｌ−トリプトファンでも根の伸長が部分的に回復するのは、ＩＡＡの合成経路が複数有り、インドールやＬ−トリプトファンがＡＶＧによって阻害されない経路を経由してＩＡＡに変換されるからであると考えられる。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬ−トリプトファンからＩＰｙＡの変換に対するＡＶＧ，ＡＯＡの抑制作用
コムギ胚芽抽質物（Ｗｇ）と５ｍＭ Ｌ−トリプトファン、０．２ｍＭ ピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）、０．５ｍＭ ２オキソグルタル酸（２０Ｘ）、及び４ｍＭ ＥＤＴＡを、ホウ酸緩衝液中で３０℃で９０分間反応した。産物をＭｅＯＨを含むイミダゾールバッファー中でヒドロキシアミンによりオキシムに誘導体化する。溶液を塩酸酸性にした後、酢酸エチルで抽出、ＯＡＳＩＳ ＭＣＸカラムで精製し、生成したＩＰｙＡの量をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した（ＬＣ： ＨＰ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＭＳ： ＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒ（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））。結果を図８に示す。なお、図８中、−ＴｒｐはＬ−トリプトファンを添加しなかったことを、−２０Ｘは２オキソグルタル酸（２０Ｘ）を添加しなかったことを、更に−ＰＬＰはピリドキサルリン酸（ＰＬＰ）を添加しなかったことを、それぞれ示す。Ｌ−トリプトファンから生じるＩＰｙＡの量は、ＰＬＰ，２０Ｘの添加に依存して増加した。またその量はＡＶＧまたはＡＯＡを加えることにより減少した。このことはトリプトファンからインドールピルビン酸へのオーキシン生合成ステップがＰＬＰ酵素によって触媒されており、その活性をＡＶＧ、ＡＯＡが阻害していることを示している。

シロイヌナズナ芽生えの生育へのＡＶＧ、ＡＯＡの効果
野生型シロイヌナズナ（コロンビア）の種子を４℃で４８時間処理した後、１／２ＭＳ１％ＳｕｃｒｏｓｅにＡＶＧを１０μＭ（Ｂ）、２μＭ（Ｄ）含む寒天培地で培養した。結果を図９に示す。（Ａ）（Ｃ）は対照区。２１℃で培養し、１４日目（Ｃ）（Ｄ）と３０日目（Ａ）（Ｂ）に観察をおこなった。２μＭ ＡＶＧ処理により発芽後の芽生えの育成が阻害された（Ｄ）。また、１０μＭでは、芽生えは発芽直後に白化して枯死した。根の伸長方向は、重力に従わず、方向が定まっていない。
野生型シロイヌナズナ（コロンビア）の種子を４℃で７２時間処理した後、１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅに１００μＭ ＡＯＡを含む液体培地（Ｆ）で２１℃で６日間培養した。（Ｅ）は対照区。ＡＯＡの添加により、芽生えは地上部、地下部共に生育が抑えられたが、その作用はＡＶＧよりも緩やかであった（図９）。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬ−トリプトファンからＩＰｙＡの変換酵素（シロイヌナズナ由来）に対するＡＶＧ，Ｌ−ＡＯＰＰの効果
シロイヌナズナの芽生えを１／２ＭＳ １％Ｓｕｃｒｏｓｅの培地で３日間生育させた。この芽生えを−８０℃で凍結して粉砕し、抽出バッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＯＫＨ（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ｐｏｔａｓｓｉｍｕ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，５ｍＭ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２ｍＭ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，４ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）でタンパク質を抽出した。これを２００００ｇ１０分間遠心したのち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを用いてゲル濾過を行い、高分子画分を粗酵素抽出液として得た。これを用いて、Ｌ−トリプトファンからインドールピルビン酸への酵素反応を行った。
反応は、抽出タンパク質７６μｇ／ｍｌ，０．１Ｍ ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５），０．２５ｍＭ Ｌ−トリプトファン、０．５ｍＭ ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ、０．０５ｍＭ ＰＬＰの存在下で、３５℃１時間暗所でインキュベートした。インドールピルビン酸の生成量は実施例６に従って定量した。結果を図１０に示す。コントロールとして、シロイヌナズナの抽出酵素を９５℃５分間処理したものを用いた（ＥＥ Ｈｅａｔ）。また、反応からＰＬＰと２オキソグルタル酸を抜いた際に出来るＩＰｙＡの量も示した（Ｎｏ ＣｏＥ）。抽出液を熱処理すると活性は検出されず、ＰＬＰと２オキソグルタル酸を除いた際は活性が５０％以下となることから、この反応は、ＰＬＰと２オキソグルタルに依存した酵素反応であることがわかる。
次ぎに、阻害剤無し（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）、ＡＶＧ（１０，２０，５０，１００μＭ）又はＬ−ＡＯＰＰ（０．１，０．３，１，２μＭ）を加えて反応を行った。
縦軸はＩＰｙＡの生成量を相対値で示す。図１０Ａには３回繰り返しの平均値を示す。ＡＶＧ，Ｌ−ＡＯＰＰは共にシロイヌナズナのＩＰｙＡ合成酵素の活性を阻害した。
この結果を基に、ＩＣ５０を算出したところ、ＡＶＧは４７．９μＭ，Ｌ−ＡＯＰＰは０．７７μＭとなり、Ｌ−ＡＯＰＰはＡＶＧよりも２桁程度高活性であった。（図１０ Ｂ，Ｃ）

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬ−トリプトファンからＩＰｙＡの変換酵素（シロイヌナズナ由来）に対するＡＯＡ，ＡＯＩＢＡの効果
実施例８と同様にシロイヌナズナの芽生えから粗酵素抽出液を生成し、酵素反応を行った。反応条件は実施例８と同一とした。コントロールとして、シロイヌナズナの抽出酵素を９５℃５分間処理したもの（ＥＥ Ｈｅａｔ）と、反応からＰＬＰと２オキソグルタル酸を除いた際のＩＰｙＡの生成量を示した（Ｎｏ ＣｏＥ）。インドールピルビン酸は実施例６に従って定量した。結果を図１１に示す。縦軸はインドールピルビン酸の生成量を相対値で示す。グラフは３回繰り返しの平均値を示す。
次に、阻害剤無し（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）とＡＯＩＢＡ（１，３，１０，３０μＭ），又はＡＯＡ（０．１，０．３，１，３μＭ）を加えて反応を行った。
ＡＯＩＢＡ，ＡＯＡは共にシロイヌナズナのＩＰｙＡ合成酵素活性を阻害した。結果を基に、ＩＣ５０を算出したところ、ＡＯＡは０．４μＭ，ＡＯＩＢＡは１．２６μＭとなり、いずれもＡＶＧより高活性であった。

Ｌ−ＡＯＰＰとＤ−ＡＯＰＰによるオーキシン応答性遺伝子の発現への影響
ＡＯＰＰがインドールピルビン酸合成酵素を阻害する際の立体構造の特異性を明らかにするために、Ｌ−ＡＯＰＰとＤ−ＡＯＰＰのオーキシン応答性遺伝子発現に対する影響を調べた。
シロイヌナズナを１／２ＭＳ、１％ｓｕｃｒｏｓｅを含む液体培地で７日間生育させ、Ｌ−ＡＯＰＰ（１，３，１０，３０μＭ）とＤ−ＡＯＰＰ（１，３，１０，３０μＭ）で３ｈ処理し、植物体をサンプリングして、ＲＮＡを精製した。実施例３の方法に従って、ＩＡＡ１９／Ａｔ３ｇ１５５４０およびＩＡＡ１／Ａｔ４ｇ１４５６０遺伝子の発現レベルを定量ＰＣＲを用いて測定した。結果を図１２に示す。Ｄ−ＡＯＰＰはＩＡＡ遺伝子の発現を３μＭから抑制した。一方、Ｄ−ＡＯＰＰはＩＡＡ１遺伝子の発現を３０μＭで阻害したが、ＩＡＡ１９遺伝子の発現は阻害しなかった。このことから、Ｓ体はＲ体よりもＩＡＡ遺伝子発現の阻害により効果的であると言える。Ｓ体の立体構造はＬ−トリプトファンの立体構造と相同の関係があり、これら化合物がＬ−トリプトファンのアナログとして働いていること、つまり、オーキシン生合成阻害にはＳ体がより効果的であることが示された。（実験は２回繰り返しの平均値である。）

Ｌ−ＡＯＰＰのシロイヌナズナ生育への影響
シロイヌナズナをＬ−ＡＯＰＰを含む１％シュークロース１／２ＭＳ培地で生育させたが、生育阻害は見られなかった。これはＬ−ＡＯＰＰがＭＳ培地中で不安定であることが原因であった。そこで、ＭＳ培地成分を含まない糖寒天でＬ−ＡＯＰＰのシロイヌナズナの生育への影響を調べた。シロイヌナズナ芽生えを４日間１％シュークロースを含む１／２ＭＳ培地で主根の長さが約１ｃｍまで育てた。これらの幼植物体を薬剤を添加した１％シュークロースの寒天に移植し、４日間２１℃で培養した。結果を図１３及び図１４に示す。
３０μＭのＬ−ＡＯＰＰの存在下ではシロイヌナズナの根は左側に傾斜し、かつ波打って伸長した。これは根の重力屈性が正常に働いていないことを示しているとされている。これに対して、インドール、Ｌトリプトファン，インドールピルビン酸を加えた場合には、根の重力屈性は回復した。また、１ｎＭ ＩＡＡを添加した場合には重力屈性はほぼ回復したのに対し、１０ｎＭ ＩＡＡを添加した場合には、根の伸長に若干阻害が見られるが、根の重力屈性は完全に回復した。このことから、Ｌ−ＡＯＰＰは重力屈性を制御するオーキシンの生合成を阻害し、この阻害はトリプトファンを経由するＩＡＡの中間体とＩＡＡで回復することが示された。なお、Ｌ−ＡＯＰＰを５０μＭ以上の濃度で処理すると主根の伸長が阻害され、この阻害はＩＡＡ、ＩＰｙＡで回復した。

シロイヌナズナＩＡＡ内生量への影響
シロイヌナズナの芽生えを１／２ＭＳ寒天培地で６日間２２℃連続光下で培養した。生育がそろっている芽生えを２０株ずつ１／２ＭＳ液体培地（５ｍｌ）に移植し、２４時間培養し、３０μＭのＡＶＧまたはＬ−ＡＯＰＰで１時間処理した。内部標準としてｄ５−ＩＡＡを添加して、ＭｅＯＨで抽出し、オアシスＨＬＢ，ＭＣＸカラムで精製し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでＩＡＡ量を定量した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量分析は実施例６に記載の方法に従って行った。結果は図１５に示し、３回の独立した実験結果の平均と標準誤差で、縦軸はＩＡＡ量を示す。左が生重量１ｇ当たりのＩＡＡ量を示し、右が芽生え１本あたりのＩＡＡ量を示す。この結果、ＡＶＧとＬ−ＡＯＰＰはどちらもＩＡＡの内生量を大きく減少させた。

イネＩＡＡ内生量への影響
イネ（コシヒカリ）の種を滅菌し、２５℃３日間吸水させて発芽させた。これを寒天上に播種し、２８℃で２日間培養した。
生育がそろった芽生えを１０ｍｌの水に１０本ずつ移して、３０μＭの阻害剤Ｍｅｔ−Ｔｒｐ，ＡＶＧ，ＡＯＡ，Ｌ−ＡＯＰＰの存在下で２８℃３時間振とう培養した。培養後、芽生えを地上部、根、種子に分け、地上部と地下部のそれぞれに１００ｐｇ／ｍｇＦＷ（Ｆｒｅｓｈ Ｗｅｉｇｈｔ、他の図面中のＦＷも同じ。）となるようにｄ５−ＩＡＡを内部標準物質として加え、実施例１２に従って、ＩＡＡの量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量した。結果を図１６に示す。グラフの縦軸は生重量１ｍｇあたりのＩＡＡ量を示す。この実験を３回繰り返した平均値と標準誤差を示している。トリプトファンの生合成を阻害するＭｅｔ−ＴｒｐはＩＡＡの内生量に影響を与えなかった。一方、ＡＶＧ，ＡＯＡ，Ｌ−ＡＯＰＰはＩＡＡの内生量を減少させた。

本願発明は、初めて、オーキシン生合成阻害剤及びそのスクリーニング方法を提供するというきわめて優れた効果を奏するものである。これにより従来不可能であった、植物体内でのオーキシン量を制御することが可能となり、今後まったく新たな植物成長調節剤、除草剤の開発が可能となる。
本願発明は、植物成長調節剤、除草剤及びその製造分野で利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims (10)

1. 試験化合物及び対照化合物で植物を処理し、オーキシン応答性遺伝子の発現レベルを測定し、オーキシン応答性遺伝子の発現を抑制する化合物の中からオーキシン生合成阻害剤候補をスクリーニングする方法において、オーキシン応答性遺伝子に対するプローブを担持したマイクロアレイを用い、試験化合物又は対照化合物で植物を処理し遺伝子発現を測定し、オーキシン応答性遺伝子群の発現を抑制する化合物をオーキシン生合成阻害剤候補として選択する、オーキシン生合成阻害剤候補をスクリーニングする方法。
2. 試験化合物として、ピリドキサルリン酸要求性酵素又はアミノ基転移酵素の阻害剤を用いる、請求項１のオーキシン生合成阻害剤候補をスクリーニングする方法。
3. 試験化合物及び対照化合物で植物を処理し、処理した植物から内生オーキシンを抽出し、その量を測定し、オーキシン合成を阻害するものをオーキシン生合成阻害剤として選択する、オーキシン生合成阻害剤をスクリーニングする方法。
4. 試験化合物として、ピリドキサルリン酸要求性酵素又はアミノ基転移酵素の阻害剤を用いる、請求項３記載のオーキシン生合成阻害剤をスクリーニングする方法。
5. 試験化合物及び対照化合物でトリプトファンを含有するトリプトファンデアミナーゼ抽出物を処理し、処理した抽出物中のインドールピルビン酸量を測定し、インドールピルビン酸の生成を阻害するものをオーキシン生合成阻害剤として選択する、オーキシン生合成阻害剤をスクリーニングする方法。
6. 試験化合物として、ピリドキサルリン酸要求性酵素又はアミノ基転移酵素の阻害剤を用いる、請求項５記載のオーキシン生合成阻害剤をスクリーニングする方法。
7. 下記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）から選ばれる化合物を有効成分として含有するオーキシン生合成阻害剤。
   （Ｉ）
   但し、Ｒ_１はカルボキシル基、又はホスホン基を意味する。Ｒ_２は水素原子もしくはメチル基を示す。Ｒ_３はアミノ基又はアミノオキシ基（−Ｏ−ＮＨ_２）を示す。Ｒ_４は、水素又はＲ_５−ＣＨ_２−であって、ここで、Ｒ_５は炭素原子が塩素又はメチル基で修飾されていてもよい、インドール環、ナフタレン環、ベンゼン環、ピリジン環、ピロール環を示す。
   （ＩＩ）
   Ｒ_６は、アミノ基を有していても良い炭素数１−４のアルキルを示す。
8. ＡＶＧ、ＡＯＡ、ＡＯＩＢＡ、ＡＯＰＰ又はそれらの類縁体を有効成分として含有するオーキシン生合成阻害剤。
9. ピリドキサルリン酸要求性酵素の阻害剤又はトリプトファンアミノ基転移酵素阻害剤からなるオーキシン生合成阻害剤。
10. オーキシン生合成阻害剤を有効成分として含有する植物成長制御剤または除草剤。