JPWO2008087896A1 - Method for measuring cholesterol in low density lipoprotein and its reagent - Google Patents

Method for measuring cholesterol in low density lipoprotein and its reagent Download PDF

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Abstract

【課題】 本発明は、血清、血漿等の生体試料中の低密度リポ蛋白中コレステロール（ＬＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。【解決手段】 酵素反応による低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法において、第一反応で、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質およびカゼイン、および／または第四級アンモニウム塩、および／またはベタイン化合物を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で、第一反応における上記両酵素の低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質をさらに含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定することを特徴とする方法。【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for measuring cholesterol (LDL) in low density lipoprotein in a biological sample such as serum and plasma and a reagent thereof. In the method for measuring cholesterol in low density lipoprotein by enzymatic reaction, in the first reaction, cholesterol esterase and cholesterol oxidase and substances and caseins that inhibit the reactivity to these low density lipoproteins and / or fourth After preferentially erasing high density lipoprotein, ultra-low density lipoprotein, and cholesterol in chylomicron in the buffer containing a secondary ammonium salt and / or betaine compound, A method of measuring cholesterol in low-density lipoprotein in a buffer solution further comprising a substance that reduces or eliminates the inhibitory action of both enzymes in the reaction on cholesterol in low-density lipoprotein. [Selection figure] None

Description

本発明は、血清、血漿等の生体試料中の低密度リポ蛋白中コレステロール（ＬＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。   The present invention relates to a method for measuring cholesterol (LDL) in low-density lipoprotein in biological samples such as serum and plasma, and a reagent therefor.

血清中の脂質の主な成分は、コレステロール、中性脂肪、リン脂質等である。これら血清脂質はアポ蛋白と結合してリポ蛋白を形成し、血液中を循環している。このリポ蛋白は密度の差により高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）等に分類される。これらリポ蛋白のうち、ＨＤＬは組織に沈着した過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、抗動脈硬化作用がある。一方、ＬＤＬは肝臓から各組織へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられている。このことから、ＬＤＬ中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）は、動脈硬化症、虚血性心疾患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、ＬＤＬ−Ｃの含有量を知ることは、これら疾患の診断、治療、および予防において重要である。   The main components of lipids in serum are cholesterol, neutral fat, phospholipid and the like. These serum lipids bind to apoproteins to form lipoproteins and circulate in the blood. These lipoproteins are classified into high density lipoprotein (HDL), LDL, very low density lipoprotein (VLDL), chylomicron (CM), etc. according to the difference in density. Among these lipoproteins, HDL has an effect of transporting excess cholesterol deposited in tissues to the liver, and has an anti-atherogenic effect. On the other hand, LDL is the main transporter of cholesterol from the liver to each tissue, and the increase in LDL is considered to be closely related to the occurrence of arteriosclerosis. From this, cholesterol in LDL (LDL-C) is considered to be a risk factor for arteriosclerosis and ischemic heart disease (coronary artery disease), and knowing the content of LDL-C is a diagnosis of these diseases, Important in treatment and prevention.

従来、ＬＤＬ−Ｃの測定法としては、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法、算出式による算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法は、沈殿・遠心分離処理、超遠心分離処理、電気泳動処理により、ＬＤＬとＬＤＬ以外のリポ蛋白とを分離する前処理工程が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査分野で広く普及している自動分析機だけで直接測定を実施することができないという問題点がある。また、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の式で知られている総コレステロール値、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）値及び中性脂肪値から算出する算出法も、中性脂肪高値試料を用いた場合には食事の影響等を受け、正確なＬＤＬ−Ｃ量を測定、算出することができないという問題点がある。   Conventionally, as a method for measuring LDL-C, a precipitation method, an ultracentrifugation method and an electrophoresis method, a calculation method using a calculation formula, and the like are known. Among these conventional methods, the precipitation method, ultracentrifugation method and electrophoresis method require a pretreatment step for separating LDL and lipoproteins other than LDL by precipitation / centrifugation treatment, ultracentrifugation treatment, and electrophoresis treatment. Therefore, the operation is complicated, and there is a problem that direct measurement cannot be performed only by an automatic analyzer that is currently widely used in the clinical laboratory field. Moreover, the calculation method which calculates from the total cholesterol value known by the formula of Friedewald, the cholesterol (HDL-C) value in HDL, and a neutral fat value is also used when a high neutral fat high-value sample is used. Suffers from the influence of meals and the like, and there is a problem that an accurate LDL-C amount cannot be measured and calculated.

これに対し、これらの問題点を解消する方法としてＬＤＬ−Ｃを遠心分離等の前処理なく自動分析機で直接測定する方法が開発されてきている。ポリアニオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法として、特許文献１には、ＬＤＬのみを凝集させる水溶性ポリマーの存在下でＬＤＬ−Ｃの凝集によって上昇する反応液濁度を測定する方法が開示されている。また、特許文献２には、ＬＤＬを一旦凝集させた後ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、さらに凝集したＬＤＬを解凝集させ、ＬＤＬ−Ｃを酵素反応させてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。特許文献３には、ＬＤＬのみを反応阻害する試薬の存在下でＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを消去した後に残存したＬＤＬ−Ｃを反応させ検出する、あるいはＨＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを凝集させてＨＤＬ−Ｃを反応消去した後にＬＤＬのみに作用する酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。特許文献４、特許文献５にはＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールの酵素反応を抑制するシクロデキストリン誘導体を用いる方法が開示されている。しかし、これらポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法は、凝集体の濁りの散乱光を吸光度として測定することから特異性、精密性が劣る。またポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤と自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じることから、排液ラインがつまり自動分析機の故障もしくは他測定項目の正確性、精密性に悪影響をもたらす。
特許２７４９００９号 特許３１０７４９２号 特許３２５６２４１号 特開平１０−３１１８３３ 特開平１１−３０６１７ On the other hand, as a method for solving these problems, a method of directly measuring LDL-C with an automatic analyzer without pretreatment such as centrifugation has been developed. As a method using a lipoprotein flocculant containing a polyanion, Patent Document 1 discloses a method for measuring a reaction turbidity that is increased by aggregation of LDL-C in the presence of a water-soluble polymer that aggregates only LDL. ing. In Patent Document 2, LDL-C is measured by once aggregating LDL, erasing cholesterol in lipoproteins other than LDL, further deaggregating the aggregated LDL, and enzymatically reacting LDL-C. A method is disclosed. Patent Document 3 discloses HDL by reacting with LDL-C remaining after erasing lipoprotein cholesterol other than LDL in the presence of a reagent that inhibits only LDL, or agglutinating lipoprotein cholesterol other than HDL. A method for measuring LDL-C using an enzyme that acts only on LDL after the reaction of -C is eliminated is disclosed. Patent Documents 4 and 5 disclose a method using a cyclodextrin derivative that suppresses the enzymatic reaction of lipoprotein cholesterol other than LDL. However, the method using the lipoprotein aggregating agent containing these polyanions and divalent metal ions is inferior in specificity and precision because the turbid scattered light of the aggregate is measured as the absorbance. In addition, precipitation occurs due to the reaction between the lipoprotein aggregating agent containing polyanions and divalent metal ions and the alkaline cell washing solution of the automatic analyzer. Adversely affects precision.
Patent 2749209 Patent 3107492 Japanese Patent No. 3256241 JP-A-10-311833 JP-A-11-30617

界面活性剤を用いた方法として、特許文献６には、第一工程でＨＬＢ値が１３〜１５のポリアルキレンオキサイド誘導体等の界面活性剤を用いてＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを全て反応させた後に残存したＬＤＬ−Ｃを第二工程で別種の界面活性剤を用いて反応させ検出する方法が開示されている。しかし、ここで用いられる界面活性剤はＨＤＬ−Ｃにはよく作用するが、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、２価金属イオンを大過剰存在させる必要があり、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。特許文献７には、血清に対しポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、コレステロール測定用酵素試薬を添加し、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中コレステロールを優先的に反応させた後、その後の反応量を測定することでＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。本法においても、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、ＶＬＤＬ、ＣＭに対する反応性を増強するためにポリアニオンおよび２価金属を必要とすることから、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。特許文献８には両性界面活性剤とカルボキシル基またはスルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている。また、特許文献９には両性界面活性剤とポリアニオンの存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている。これらの方法は、第一反応においてＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等のＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を抑制し第二反応でＬＤＬ−Ｃのみを特異的に測定する方法であるが、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭに対する反応抑制が十分でなく測定値が高値化するという問題点がある。また、特許文献１０には、ＬＤＬのみに作用する化学修飾酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法も開示されている。
特許３０５８６０２号 特許３１９３６３４号 特開平１０−８４９９７ 特開平２０００−６０６００ 特開平１０−８０３００ As a method using a surfactant, Patent Document 6 discloses that after all the lipoprotein cholesterol other than LDL is reacted in the first step using a surfactant such as a polyalkylene oxide derivative having an HLB value of 13 to 15. A method is disclosed in which the remaining LDL-C is detected by reacting with another type of surfactant in the second step. However, although the surfactant used here works well on HDL-C, it does not have sufficient action on cholesterol in VLDL and CM, and it is necessary to have a large excess of divalent metal ions. Precipitation is generated by the reaction of the analyzer with the alkaline cell washing solution, which causes a problem in applicability to the automatic analyzer. In Patent Document 7, a surfactant selected from polyoxyethylene alkylene phenyl ether and polyoxyethylene alkylene tribenzyl phenyl ether and an enzyme reagent for cholesterol measurement are added to serum, and cholesterol in HDL, VLDL, and CM is preferentially added. A method of measuring LDL-C by measuring the subsequent reaction amount after reacting with the above is disclosed. Even in this method, the action on cholesterol in VLDL and CM is not sufficient, and a polyanion and a divalent metal are required to enhance the reactivity to VLDL and CM. A precipitate is generated by the reaction with the cell washing solution, which causes a problem in applicability to an automatic analyzer. Patent Document 8 discloses a method of selectively detecting LDL-C in the presence of an amphoteric surfactant and an aliphatic amine having a carboxyl group or a sulfonic acid group. Patent Document 9 discloses a method for selectively reacting and detecting LDL-C in the presence of an amphoteric surfactant and a polyanion. These methods suppress the reactivity of HDL, VLDL, CM and other lipoprotein cholesterols other than LDL in the first reaction and specifically measure only LDL-C in the second reaction. HDL, VLDL , There is a problem that the suppression of the reaction to CM is not sufficient and the measured value becomes high. Patent Document 10 also discloses a method for selectively reacting and detecting LDL-C using a chemical modifying enzyme that acts only on LDL.
Japanese Patent No. 30586602 Japanese Patent No. 3193634 JP-A-10-84997 JP 2000-60600 JP 10-80300 A

また、特許文献１１には、生体試料と膵臓由来コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体の０．０１重量％以上及び胆汁酸又はその塩が存在する条件下で反応させ、その後微生物由来コレステロールエステラーゼを作用させ測定する方法が開示されている。この方法は、第一反応においてＨＤＬ−Ｃは酵素反応により測定系外に導き、ＶＬＤＬ、ＣＭはアルブミンにより酵素反応を阻害し、第二反応においてＬＤＬ−Ｃを特異的に測定する方法であるが、ＶＬＤＬ、ＣＭを多く含む乳び検体においては、ＶＬＤＬ、ＣＭが高濃度であるため、アルブミンのこれらに対する酵素反応の阻害が不十分となり測定値が高値化してしまうという問題点がある。また、第一試薬と第二試薬に、由来の異なるコレステロールエステラーゼを作用させることから、酵素使用量が多くなることになり経済性に問題がある。また、特許文献１２には、被検試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程をアルブミンの存在下に行い、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量し、ＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。この方法は、第一反応でアルブミンを作用させ、ＶＬＤＬ、ＣＭ酵素反応後の分解物のＬＤＬへの吸着を抑えＬＤＬ−Ｃの非特異的消去による測定値低下を回避するが、一方でアルブミンはＨＤＬ−ＣおよびＶＬＤＬ−Ｃの消去反応を阻害することから問題である。
特開平１１−９３００ 特開２００１−２２４３９７ Further, in Patent Document 11, a biological sample, pancreatic cholesterol esterase and cholesterol oxidase are reacted under the condition that albumin is present in an amount of 0.01% by weight or more of the whole measurement system and bile acid or a salt thereof, and then a microorganism. A method for measuring and measuring a derived cholesterol esterase is disclosed. In this method, HDL-C is led out of the measurement system by an enzyme reaction in the first reaction, VLDL and CM inhibit the enzyme reaction by albumin, and LDL-C is specifically measured in the second reaction. In chyle specimens containing a large amount of VLDL and CM, since VLDL and CM are at high concentrations, there is a problem that the inhibition of the enzymatic reaction of albumin is insufficient and the measured value becomes high. Further, since cholesterol esterases having different origins are allowed to act on the first reagent and the second reagent, the amount of enzyme used is increased, resulting in a problem in economy. In Patent Document 12, a first step of eliminating cholesterol in lipoproteins other than LDL in a test sample is performed in the presence of albumin, and then the residual cholesterol in the test sample is quantified, and LDL- A method for measuring C is disclosed. In this method, albumin is allowed to act in the first reaction to suppress the adsorption of degradation products after VLDL and CM enzyme reactions to LDL and avoid a decrease in measured value due to nonspecific elimination of LDL-C. This is a problem because it inhibits the elimination reaction of HDL-C and VLDL-C.
JP-A-11-9300 JP-A-2001-224397

このことから、本発明が解決しようとする課題は、遠心分離、電気泳動等の前処理の必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能であり、高濃度のＶＬＤＬ、ＣＭの存在下でも特異性、精密性よくＬＤＬ−Ｃを測定する方法を提供することにある。   Therefore, the problem to be solved by the present invention is that there is no need for pretreatment such as centrifugation and electrophoresis, and it can be applied to various automatic analyzers, even in the presence of high concentrations of VLDL and CM. The object is to provide a method for measuring LDL-C with high specificity and precision.

本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、
第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに作用する、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ、これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む緩衝液中で、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、さらに、第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定することで、ＬＤＬ−Ｃを簡便に、特異性、精密性良く分別測定できることを見出した。また、本測定法ではポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく、自動分析機への適用性が優れていることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の（ａ）〜（ｄ）を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
低密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
（２）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１）記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
（３）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である（２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（４）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（２）または（３）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（５）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（６）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（７）第一反応において２価金属イオンを含有する（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（８）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（７）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（９）第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１０）ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１１）第一反応においてさらに脂肪酸を含有する（１）〜（１０）のいずれかの低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
（１２）第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１３）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（１２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１４）（１）ないし（１３）のいずれかに記載の、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に、用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の（ａ）〜（ｃ）および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の（ａ）〜（ｅ）を含むように構成されている、低密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
（１５）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１６）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である（１５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１７）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（１５）または（１６）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１８）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１９）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（１８）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２０）第一試薬に２価金属イオンを含有する（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２１）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（２０）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２２）第４級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２３）ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２４）第一試薬にさらに脂肪酸を含有する（１４）〜（２３）のいずれかの低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
（２５）第一試薬および第二試薬のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２６）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（２５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have determined in a means for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a sample by an enzymatic reaction.
In a buffer containing a cholesterol esterase and cholesterol oxidase that act on lipoprotein cholesterol in HDL, VLDL, and CM in the first reaction, and substances that inhibit these low-density lipoproteins, After preferentially clearing cholesterol in low density lipoproteins and chylomicrons,
In the second reaction, cholesterol in low-density lipoprotein is measured in a buffer containing a substance that reduces or eliminates the inhibitory effect of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein in the first reaction. Thus, it was found that LDL-C can be easily and fractionally measured with high specificity and precision. In addition, the present measurement method has found that it is not necessary to use a known lipoprotein flocculant such as polyanion, and is excellent in applicability to an automatic analyzer, thereby completing the present invention. That is, the present invention has the following configuration.
(1) A method for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a sample using an enzymatic reaction,
In the first reaction, in the buffer containing the following (a) to (d), after preferentially erasing high density lipoprotein, ultra-low density lipoprotein and cholesterol in chylomicron in the sample,
In the second reaction, cholesterol in the low density lipoprotein is measured in a buffer containing the following (a) to (e):
Method for measuring cholesterol in low density lipoprotein.
(A) cholesterol esterase,
(B) cholesterol oxidase,
(C) a substance that inhibits the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low-density lipoprotein,
(D) Casein and / or quaternary ammonium salt and / or betaine compound (e) Reducing or eliminating the inhibitory action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein in the first reaction Substance (2) The method for measuring cholesterol in low density lipoprotein according to (1), wherein the substance that inhibits the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low density lipoprotein is a cholic acid derivative.
(3) Cholic acid derivatives are 3-[(3-collamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid, N, In the low density lipoprotein of (2), which is one or more selected from N-bis (3-D-gluconamidopropyl) colamide or N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycolamide Method for Measuring Cholesterol (4) Method for Measuring Cholesterol in Low Density Lipoprotein of (2) or (3), wherein Concentration of Cholic Acid Derivative in First Reaction is 0.01 to 0.2% (5) Substances that reduce or eliminate the inhibitory effect of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein in one reaction (1) The method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to (1), which is one or more selected from polyoxypropylene polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene styryl phenyl ether, (6) cholesterol esterase in the first reaction, and Polyoxypropylene (2 mol) polyoxyethylene decyl ether is a substance that reduces or eliminates the inhibitory action of cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein (5) ) Method for measuring cholesterol in low density lipoprotein of (1) containing divalent metal ion in first reaction (8) Divalent metal ion is magnesium ion, calcium ion, manganese ion, nickel ion, copper ion, iron I (9) Method for Measuring Cholesterol in Low Density Lipoprotein (9) Measurement of Cholesterol in Low Density Lipoprotein (1) wherein the quaternary ammonium salt is choline chloride, choline bromide, acetylcholine chloride Method (10) The betaine compound is betaine, alkylimidazolium betaine, alkylbetaine, alkylamidobetaine, or a derivative thereof (1) The method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to (1) (1) The measuring method of cholesterol in the low density lipoprotein in any one of (10) containing.
(12) In any of the first reaction and the second reaction, the polyanion does not contain a polyanion (1) The method for measuring cholesterol in low density lipoprotein (13) The polyanion is heparin, phosphotungstic acid, dextran liquid acid, sulfation The method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to (12), which is cyclodextrin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, sulfated oligosaccharide, sulfated polyacrylamide, carboxymethylated polyacrylamide, or a salt thereof (14) A reagent for use in the method of measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a sample according to any one of (1) to (13) using an enzymatic reaction,
The first reagent contains the following (a) to (c) and a buffer, and
A reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, wherein the composition comprising the first reagent and the second reagent is combined with the following (a) to (e):
(A) cholesterol esterase,
(B) cholesterol oxidase,
(C) a substance that inhibits the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low-density lipoprotein,
(D) Casein and / or quaternary ammonium salt and / or betaine compound (e) Reducing or eliminating the inhibitory action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein in the first reaction Substance (15) Cholesterol esterase and cholesterol oxidase and substances that inhibit their reactivity to low-density lipoproteins are cholic acid derivatives (14) Reagent for measuring cholesterol in low-density lipoproteins (16) Cholic acid derivatives 3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid, N, N-bis (3-D -Gluconamidopropyl (15) A reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein of (15), which is one or more selected from colamide or N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycolamide (17) (15) Reagent for measuring cholesterol in low density lipoprotein of (15) or (16) having a concentration of 0.01 to 0.2% in one reaction (18) Low density lipoprotein of cholesterol esterase and cholesterol oxidase in the first reaction Cholesterol in low-density lipoprotein according to (14), wherein the substance that reduces or eliminates the inhibitory action on cholesterol in protein is one or more selected from polyoxypropylene polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene styryl phenyl ether Reagent for measurement (19) Measurement of cholesterol in low-density lipoprotein, wherein the substance that reduces or eliminates the inhibitory action of sterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein is polyoxypropylene (2 mol) polyoxyethylene decyl ether (18) Reagent (20) The first reagent contains a divalent metal ion (14) The cholesterol in low density lipoprotein measurement reagent (21) The divalent metal ion is magnesium ion, calcium ion, manganese ion, nickel ion, copper (20) Low-density lipoprotein cholesterol measurement reagent (22) which is an ion or iron ion (22) The quaternary ammonium salt is choline chloride, choline bromide or acetylcholine chloride in (14) low-density lipoprotein Cholesterol measurement reagent (23) Betaineization The compound is betaine, alkylimidazolium betaine, alkyl betaine, alkylamido betaine, and derivatives thereof. (14) The reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to (14) (24) The first reagent further contains a fatty acid ( The method for measuring cholesterol in the low density lipoprotein of any one of 14) to (23).
(25) Neither the first reagent nor the second reagent contains a polyanion. (14) The reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein (26) The polyanion contains heparin, phosphotungstic acid, dextran flow acid, sulfation. Reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to (25), which is cyclodextrin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, sulfated oligosaccharide, sulfated polyacrylamide, carboxymethylated polyacrylamide, or a salt thereof

本発明により、遠心分離、電気泳動等の試料の前処理を行なう必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能であり、高濃度のＶＬＤＬ、ＣＭの存在下でも特異性、精密性よくＬＤＬ−Ｃを測定する方法を提供することができる。   The present invention eliminates the need for pretreatment of samples such as centrifugation and electrophoresis, and can be applied to various automatic analyzers. LDL has high specificity and precision even in the presence of high concentrations of VLDL and CM. A method of measuring -C can be provided.

本発明で用いるコレステロールオキシダーゼ（コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールオキシダーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常０．５Ｕ／ｍＬ、好ましくは１Ｕ／ｍＬである。好ましい上限は通常１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。The origin of cholesterol oxidase (an enzyme having the ability to oxidize cholesterol to produce hydrogen peroxide) used in the present invention is not particularly limited. For example, microorganisms such as Nocardia and Pseudomonas, and animal organs such as bovine pancreas The thing etc. which originate in can be used. These can be obtained commercially.
In the present invention, it is preferable to use an enzyme that has better reactivity with lipoprotein cholesterol in HDL, VLDL, and CM than LDL-C.
In addition, for the purpose of improving the reactivity of these enzymes to lipoprotein cholesterol in HDL, VLDL, and CM, the above-mentioned enzymes may be used with groups mainly composed of polyethylene glycol, monosaccharides, water-soluble oligosaccharide residues, sulfopropyl groups, etc. Those chemically modified are used.
In addition, these genes are taken by genetic manipulation, introduced into another microorganism and expressed, or modified products obtained by chemically modifying these genes, or enzymes expressed by modifying these genes or chemically A modified product modified to have been suitably used.
Although the usage-amount of cholesterol oxidase is not specifically limited, A preferable minimum is 0.5 U / mL normally in a 1st reagent, Preferably it is 1 U / mL. The preferable upper limit is usually 10 U / mL, preferably 5 U / mL.

本発明に用いるコレステロールエステラーゼ（コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールエステラーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常０．０１Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０５Ｕ／ｍＬである。好ましい上限は通常１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。The origin of the cholesterol esterase (enzyme having the ability to hydrolyze cholesterol ester) used in the present invention is not particularly limited. For example, microorganisms such as Candida and Pseudomonas, and those derived from animal organs such as bovine pancreas, etc. Can be used. These can be obtained commercially.
In the present invention, it is preferable to use an enzyme that has better reactivity with lipoprotein cholesterol in HDL, VLDL, and CM than LDL-C.
In addition, for the purpose of improving the reactivity of these enzymes to lipoprotein cholesterol in HDL, VLDL, and CM, the above-mentioned enzymes may be used with groups mainly composed of polyethylene glycol, monosaccharides, water-soluble oligosaccharide residues, sulfopropyl groups, etc. Those chemically modified are used.
In addition, these genes are taken by genetic manipulation, introduced into another microorganism and expressed, or modified products obtained by chemically modifying these genes, or enzymes expressed by modifying these genes or chemically A modified product modified to have been suitably used.
Although the usage-amount of cholesterol esterase is not specifically limited, A preferable minimum is 0.01U / mL normally in a 1st reagent, Preferably it is 0.05 U / mL. The preferable upper limit is usually 10 U / mL, preferably 5 U / mL.

なお、本発明で用いるコレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼは、いずれも「第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに実用上十分に作用する酵素」を意味する。すなわち、「第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールのいずれかに対して十分に作用しない」酵素は本願発明の方法および試薬に使用することはできない。
「実用上十分」とは、血清試料中に標準的に含まれるとされる濃度の、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭそれぞれのコレステロールに作用し、これを消去するに十分であることをいう。The cholesterol oxidase and cholesterol esterase used in the present invention both mean “enzymes that sufficiently act on lipoprotein cholesterol in HDL, VLDL, and CM in the first reaction”. That is, an enzyme that does not sufficiently act on any of HDL, VLDL, and lipoprotein cholesterol in CM in the first reaction cannot be used in the method and reagent of the present invention.
“Practical enough” means that it acts on and eliminates cholesterol in HDL, VLDL, and CM at concentrations normally contained in serum samples.

本発明で用いる、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性への影響が実質的になく、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであれば特に限定はない。
このような物質として例えばコール酸誘導体がある。コール酸誘導体としては、特に限定されないが、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、１２−オキソリトコール酸、１２−オキソケノデオキシコール酸、７−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸等およびこれらの塩が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。好ましくは、少ない添加量でＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させ得ることから、Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドおよびその塩が良い。また、これらのコール酸誘導体より選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量としては特に限定されるものではないが、コール酸誘導体の総量として第一試薬中で通常０．００１〜５％の範囲で用いられ得るが、好ましくは限界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ）付近かそれ以下で使用するのがよい。これは、これらコール酸誘導体の本来ある界面活性剤としての作用が反って本発明の期待するコレステロールエステラーゼおよび／またはコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応阻害効果を弱めることに起因する。
限界ミセル濃度の測定は電気伝導度、浸透圧、氷点降下、蒸気圧、粘度、密度、可溶化能、洗浄力、光散乱、色素の変化などの物理性質の急変点を測定することで測定が可能である。例えば、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸の限界ミセル濃度は、０．５０％（ｗ／ｖ）であり、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸は０．５１％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドは０．２６％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドは０．１２％（ｗ／ｖ）であることが知られている。したがって、これらの好ましい使用量としては０．０１〜０．６％である。また、その他のコール酸誘導体についても同じく限界ミセル濃度を知ることで使用量の最適化が可能である。Substances that inhibit the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low-density lipoprotein used in the present invention have substantially no influence on the reactivity of lipoprotein cholesterol in HDL, VLDL, and CM, and LDL-C There is no particular limitation as long as it reduces the reactivity to.
An example of such a substance is a cholic acid derivative. The cholic acid derivative is not particularly limited, but 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid. N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) colamide, N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycolamide, cholic acid, deoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, Glycocholic acid, lithocholic acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, 7-oxolithocholic acid, 12-oxolithocholic acid, 12-oxochenodeoxycholic acid, 7-oxodeoxycholic acid, hyocholic acid, hyodeoxycholic Acid, dehydrocholic acid, etc. and their salts It is below. Examples of the salt include ammonium salt, lithium salt, sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt and the like. Preferably, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) colamide, N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycolla can be reduced with a small addition amount. Mido and its salts are good. Moreover, 1 type selected from these cholic acid derivatives may be used, or you may use combining several. The amount of these used is not particularly limited, but the total amount of the cholic acid derivative can be usually used in the range of 0.001 to 5% in the first reagent, but preferably the critical micelle concentration (cm C) should be used near or below. This is due to the fact that the action of these cholic acid derivatives as an inherent surfactant is warped and weakens the inhibitory effect of cholesterol esterase and / or cholesterol oxidase on the low-density lipoprotein expected by the present invention.
The critical micelle concentration can be measured by measuring sudden change points of physical properties such as electrical conductivity, osmotic pressure, freezing point depression, vapor pressure, viscosity, density, solubilization ability, detergency, light scattering, and dye changes. Is possible. For example, the limiting micelle concentration of 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid is 0.50% (w / v), and 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio ] -2-hydroxypropanesulfonic acid is 0.51% (w / v), N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) colamide is 0.26% (w / v), N , N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycolamide is known to be 0.12% (w / v). Therefore, the preferred amount of use is 0.01 to 0.6%. Similarly, other cholic acid derivatives can be used in an optimized manner by knowing the critical micelle concentration.

本発明において「阻害」とは、ＬＤＬを凝集させることなく、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼのＬＤＬに対する反応性を低下させることを意味する。   In the present invention, “inhibition” means to reduce the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to LDL without aggregating LDL.

本発明で用いるカゼインは公知のものならば特に限定なく用いられる。該カゼインとしては乳タンパク質の主体をなすもので乳に酸を加えてｐＨ４．６にする等電点沈澱することにより調製される酸性カゼインが好適に用いられる。該酸性カゼインは一般に電気泳動的にα、β、γの３成分に分離できるがα、β、γのいずれでもよくまた２種類以上の混合物として用いることも可能である。さらに加熱、加圧等の物理的分解、酸・アルカリ等での化学的分解、タンパク質分解酵素での酵素的分解により低分子化したものも同様に用いることができる。カゼイン分解物としてはブロックエース（雪印社製）が市販されている。これらの使用量は特に限定されるものではないが、第一試薬中で通常０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２〜３％（ｗ／ｖ）である。   The casein used in the present invention is not particularly limited as long as it is known. As the casein, acidic casein prepared by isoelectric precipitation by adding an acid to milk to pH 4.6 is mainly used as a main component of milk protein. The acidic casein can be electrophoretically separated into three components of α, β, and γ, but any of α, β, and γ can be used, and a mixture of two or more types can also be used. Further, those having a low molecular weight by physical decomposition such as heating and pressurization, chemical decomposition with acid / alkali, etc., and enzymatic decomposition with proteolytic enzyme can be used as well. As a casein degradation product, Block Ace (manufactured by Snow Brand) is commercially available. The amount of these used is not particularly limited, but is usually 0.05 to 10% (w / v), preferably 0.1 to 5% (w / v), more preferably 0 in the first reagent. .2 to 3% (w / v).

本発明で用いる第四級アンモニウム塩としては特に限定されないが、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリンなどが挙げられる。これらの使用量は、第一試薬中で通常０．０５〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２〜５％（ｗ／ｖ）である。   The quaternary ammonium salt used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include choline chloride, choline bromide, and acetylcholine chloride. The amount of these used is usually 0.05 to 20% (w / v), preferably 0.1 to 10% (w / v), more preferably 0.2 to 5% (w / v) in the first reagent. v).

本発明で用いるベタイン化合物としては特に限定されないが、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体等が挙げられる。これらの使用量は、第一試薬中で通常０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０２〜０．３％（ｗ／ｖ）である。   The betaine compound used in the present invention is not particularly limited, and examples include betaine, alkylimidazolium betaine, alkyl betaine, alkylamido betaine, and derivatives thereof. These use amounts are usually 0.005 to 1% (w / v) in the first reagent, preferably 0.01 to 0.5% (w / v), more preferably 0.02 to 0.3. % (W / v).

本発明では第一反応におけるＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールの消去能を向上させる目的で、遊離脂肪酸を含有するのが好ましい。遊離脂肪酸としては特に限定されないが、ブチル酸、バレリアン酸、カプロン酸、ヘプチル酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトイル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレイン酸、エレステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸およびこれらの塩が挙げられる。これらの使用量は特に限定されるものではないが、第一試薬中で通常０．０００５〜０．１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．００２〜０．０３％（ｗ／ｖ）である。   In the present invention, it is preferable to contain a free fatty acid for the purpose of improving the ability to eliminate lipoprotein cholesterol in VLDL and CM in the first reaction. The free fatty acid is not particularly limited, butyric acid, valeric acid, caproic acid, heptyl acid, caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, oleic acid, palmitic acid, palmitoic acid, margaric acid , Stearic acid, vaccenic acid, linoleic acid, linolenic acid, elestearic acid, arachidic acid, arachidonic acid, behenic acid, lignoceric acid, nervonic acid, serotic acid, montanic acid, melicic acid and salts thereof. The amount of these used is not particularly limited, but is usually 0.0005 to 0.1% (w / v) in the first reagent, preferably 0.001 to 0.05% (w / v), More preferably, it is 0.002 to 0.03% (w / v).

一方、ポリアニオン等の凝集剤等もＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであるが、自動分析機への適用性に悪影響を及ぼすことから、添加しないかまたは前述の自動分析機で用いられるアルカリ性洗剤との共存により濁りまたは沈殿が生じない程度に添加することができる。しかし、好ましくは添加しない方がよい。このようなポリアニオンとしては、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩が挙げられる。
これらの使用量としては、反応終濃度として０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０．５％（ｗ／ｖ）である。On the other hand, flocculants such as polyanions also reduce the reactivity to LDL-C, but since they adversely affect the applicability to automatic analyzers, they are not added or are used in the above-mentioned automatic analyzers. It can be added to the extent that turbidity or precipitation does not occur due to coexistence with the detergent. However, it is preferable not to add them. Such polyanions include heparin, phosphotungstic acid, dextran flow acid, sulfated cyclodextrin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, sulfated oligosaccharides, sulfated polyacrylamide, carboxymethylated polyacrylamide, or these Salt.
The amount of these used is 0 to 1% (w / v), preferably 0 to 0.5% (w / v) as the final reaction concentration.

本発明で用いる２価金属イオンとしては、第一反応におけるＨＤＬ−Ｃまたは第二反応におけるＬＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させることを目的として、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンが用いられるが、好ましくは、マグネシウムイオン、カルシウムイオンが好適である。また、これらの２価金属イオンは選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量は、自動分析機への適用性を考慮し、第一試薬中で通常０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．００５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。また、第ニ試薬中で通常０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．００５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。   The divalent metal ion used in the present invention is magnesium ion, calcium ion, manganese ion, nickel ion, copper for the purpose of improving the reactivity to HDL-C in the first reaction or LDL-C in the second reaction. Ions and iron ions are used, and magnesium ions and calcium ions are preferable. Moreover, these divalent metal ions may be used alone or in combination. These use amounts are usually 0.0005 to 0.2 mol / L, preferably 0.001 to 0.1 mol / L, more preferably 0.00 in the first reagent in consideration of applicability to an automatic analyzer. 005 to 0.05 mol / L. Moreover, it is 0.0005-0.2 mol / L normally in a 2nd reagent, Preferably it is 0.001-0.1 mol / L, More preferably, it is 0.005-0.05 mol / L.

本発明のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質とは、第一試薬中におけるＬＤＬ−Ｃに対する阻害を、当該物質を含む第二試薬の添加により軽減または消失が可能なものであれば特に限定されないが、好ましくはポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルより選択される１種または複数を組合わせて用いられる。更に好ましくはポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類より選択される１種または複数を組合わせて用いられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としては、エマルゲンＡ６０（ＨＬＢ：１２．８）、エマルゲンＡ９０（ＨＬＢ：１４．５）、エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ：１３．２）等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７（ＨＬＢ：１０）、エマレックスＤＡＰＥ０２１０（ＨＬＢ：１１）、エマレックスＤＡＰＥ０２１２（ＨＬＢ：１２）、エマレックスＤＡＰＥ０２１５（ＨＬＢ：１３）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１４）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１５）等が挙げられる。ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとしてはエマルゲンＬＳ−１０６（ＨＬＢ：１２．５）、エマルゲンＬＳ−１１０（ＨＬＢ：１３．４）、エマルゲンＬＳ−１１４（ＨＬＢ：１４．０）、エマルゲンＭＳ−１１０（ＨＬＢ：１２．７）等が挙げられる。これら界面活性剤のＨＬＢは「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版編で公知であるが、ＨＬＢの範囲として通常、１０〜１５であり、好ましくは１０〜１３、更に好ましくは１０〜１２である。これらの使用量は特に限定されるものではないが、自動分析機への適用性を考慮し、第ニ試薬中で通常０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０５〜０．３％（ｗ／ｖ）である。   The substance that reduces or eliminates the inhibitory action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase of the present invention on LDL-C means that the inhibition of LDL-C in the first reagent is reduced or eliminated by the addition of the second reagent containing the substance. Although it will not specifically limit if possible, Preferably it uses in combination of 1 type or multiple selected from polyoxypropylene polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene styryl phenyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether. More preferably, one or more selected from polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ethers are used in combination. Examples of polyoxyethylene styryl phenyl ethers include Emulgen A60 (HLB: 12.8), Emulgen A90 (HLB: 14.5), Emulgen B66 (HLB: 13.2), and the like. Examples of polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ethers include EMALEX DAPE0207 (HLB: 10), EMALEX DAPE0210 (HLB: 11), EMALEX DAPE0212 (HLB: 12), and EMALEX DAPE0215 (HLB: 13) , Emalex DAPE0220 (HLB: 14), Emarex DAPE0220 (HLB: 15), and the like. As polyoxyalkylene alkyl ethers, Emulgen LS-106 (HLB: 12.5), Emulgen LS-110 (HLB: 13.4), Emulgen LS-114 (HLB: 14.0), Emulgen MS-110 (HLB: 12.7) and the like. The HLB of these surfactants is known as “New Surfactant”, Hiroshi Horiuchi, 1986, Sankyo Publishing, but is usually 10-15, preferably 10-13 as the range of HLB. Preferably it is 10-12. Although these usage-amounts are not specifically limited, Considering the applicability to an automatic analyzer, it is 0.005-1% (w / v) normally in a 2nd reagent, Preferably it is 0.01-0. 0.5% (w / v), more preferably 0.05 to 0.3% (w / v).

本発明で用いる色原体としては特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。   Although it does not specifically limit as a chromogen used by this invention, A hydrogen donor, a leuco body, a tetrazolium salt, etc. are mentioned.

水素供与体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合わせて用いることができる。カプラーとしては４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。   Examples of hydrogen donors include N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, N-sulfopropyl. 3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3 -Sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy Aniline, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3 Sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N-sulfopropylaniline, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) ) -2,5-dimethylaniline, N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-succinylethylenediamine, N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-acetylethylenediamine and the like. . These hydrogen donors can be used in combination with a coupler. Examples of the coupler include 4-aminoantipyrine, MBTH, NCP and the like.

また、ロイコ体としては、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。   The leuco form includes 4,4'-benzylidenebis (N, N-dimethylaniline), 4,4'-bis [N-ethyl-N- (3-sulfopropylamino) -2,6-dimethylphenyl. ] Methane, 1- (ethylaminothiocarbonyl) -2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -4,5-bis (4-diethylaminophenyl) imidazole, 4,4'-bis (dimethylamino) Examples include diphenylamine, N-carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine salt, 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine salt, and the like.

また、テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。   Examples of the tetrazolium salt include 2,3,5-triphenyltetrazolium salt, 2,5-diphenyl-3- (1-naphthyl) -2H-tetrazolium salt, 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- (1,1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis [2- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium] salt, 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy -(1,1'-biphenyl) -4,4'-diyl] -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium) salt, 2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl)- 5- (2,4-Disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 3,3 ′-(1,1′-biphenyl-4,4′-diyl) -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium) Salt, 3- (4,5-dimethyl) 2-thiazolyl) -2,5-diphenyl -2H- tetrazolium salts.

色原体の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。   The amount of chromogen used is preferably 0.01 to 10 mmol / L as the final reaction concentration in consideration of solubility.

本発明では、さらにＬＤＬ−Ｃに対する特異性、精密性を損なわない範囲で、界面活性剤を共存させることができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられる。   In the present invention, a surfactant can coexist as long as the specificity and precision for LDL-C are not impaired. As the surfactant, a nonionic surfactant and / or a zwitterionic surfactant is preferably used.

本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。   Nonionic surfactants used in the present invention include polyoxyethylene lauryl ethers such as Emulgen 104P, Emulgen 105, Emulgen 106, Emulgen 108, Emulgen 109P, Emulgen 120, Emulgen 123P, Emulgen 147, Emulgen 130K, Nonion K- 204, Nonion K-215, Nonion K-220, Nonion K-230, NIKKOL BL-2, NIKKOL BL-4.2, NIKKOL BL-9EX, NIKKOL BL-21, NIKKOL BL-25, polyoxyethylene cetyl ethers Emulgen 210, Emulgen 220, NIKKOL BC-2, NIKKOL BC-5.5, NIKKOL BC-7, NIKKOL BC-10TX, NIKKOL B -15TX, NIKKOL BC-20TX, NIKKOL BC-23, NIKKOL BC-25TX, NIKKOL BC-30TX, NIKKOL BC-40TX, nonionic P-208, nonionic P-210, nonionic stearyl P-213, , Emulgen 306P, Emulgen 320P, NIKKOL BS-2, NIKKOL BS-4, NIKKOL BS-20, Nonion S-206, Nonion S-207, Nonion S-215, Nonion S-220, Polyoxyethylene oleyl ethers , Emulgen 404, Emulgen 408, Emulgen 409P, Emulgen 420, Emulgen 430, NIKKOL BO-2, NIKKOL BO-7, NIKKOL BO-10TX NIKKOL BO-20, NIKKOL BO-50, nonion E-206, nonion E-215, nonion E-230, and polyoxyethylene behenyl ethers include NIKKOL BB-5, NIKKOL BB-10, NIKKOL BB-20, NIKOL BB-20, NIKOL BB-30 etc. are mentioned.

また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０等が挙げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。   Examples of the polyoxyethylene secondary alkyl ethers include Emulgen 707, NIKKOL BT-5, NIKKOL BT-7, NIKKOL BT-9, Adekatol SO-80, Adecator SO-105, Adecator SO-120, Adecator SO-135. , Adekatol SO-145, Adekatol SO-160, Emulgen 705, Emulgen 707, Emulgen 709 and the like. Examples of polyoxyethylene alkylphenyl ethers include Emulgen 810, Emulgen 840S, Emulgen 909, Emulgen 910, Emulgen 930, Emulgen 950, Triton X-100, Triton X-114, NIKKOL NP-5, NIKKOL NP-7.5, NIKKOL NP-10, NIKKOL NP-15, NIKKOL NP-20, NIKKOL OP-10, NIKKOL OP-30, and the like. Examples of the oxyethylene / oxypropylene block copolymers include Emulgen PP-150, Emulgen PP-230, Emulgen PP-250, Emulgen PP-290, NIKKOL PBC-34, NIKKOL PBC-44, and the like. Examples of fatty acid esters include Leodol TW-L120, Leodol TW-L106, Leodol TW-P120, Leodol TW-S120, Leodol TW-O120, Leodol 460, Emanon 1112, Emanon 3115, Emanon 3170, Emanon 3299, Emanon 3130, etc. Can be mentioned. Examples of the polyoxyethylene sterols include NIKKOL BPS-10, NIKKOL BPS-20, NIKKOL BPS-30, NIKKOL BPSH-25, NIKKOL DHC-30 and the like. In addition, n-octyl-β-D-glucoside, n-dodecyl-β-D-maltoside, n-octanoyl-N-methylglucoamide, n-nonanoyl-N-methylglucoamide, n-decanoyl-N- Examples include methylglucoamide, sucrose monocaprate, sucrose monolaurate, sucrose monocholate, digitonin and the like.

本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、等が挙げられる。   Examples of the zwitterionic surfactant used in the present invention include alkylimidazolium betaines, alkylbetaines, alkylamidobetaines, alkylalanines, alkylamine oxides, and derivatives thereof. These Amphitol 20BS, Amphitol 24B, Amphitol 86B, Amphitol 20Z, etc. are mentioned.

また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。第一試薬における該緩衝液のｐＨはＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させる目的で６〜９の範囲で調整される。さらには７〜８．５が好ましい。また、第二試薬は、第二試薬との混合したときのｐＨを考慮し、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させる目的で６．０〜７．５が好ましい。これらの使用量は、通常０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。   Conventionally used buffer solutions include Tris buffer solution, phosphate buffer solution, borate buffer solution, carbonate buffer solution, GOOD buffer solution and the like. On the other hand, GOOD buffer contains N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), N-cyclohexyl. 2-aminoethanesulfonic acid (CHES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), piperazine-1,4- Bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminomethanesulfonic acid (TES), N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), N-cyclohexyl-2 -Hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid (CAPSO), 3- [N, N-bis (2-hydro) Cyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (DIPSO), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (EPPS), 2-hydroxy-3- [4- (2- Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (HEPPSO), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO), piperazine-1,4-bis (2-hydroxy) -3-propanesulfonic acid) (POPSO), N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPSO), N- (2-acetamido) iminoniacetic acid (ADA), N, N-bis (2 -Hydroxyethyl) glycine (Bicine), N- [Tris (hydro Shimechiru) methyl] glycine (Tricine), etc. are exemplified. The pH of the buffer solution in the first reagent is adjusted in the range of 6 to 9 for the purpose of reducing the reactivity to LDL-C. Furthermore, 7-8.5 are preferable. The second reagent is preferably 6.0 to 7.5 for the purpose of improving the reactivity to LDL-C in consideration of the pH when mixed with the second reagent. These usage-amounts are 0.01-0.2 mol / L normally, Preferably it is 0.02-0.1 mol / L.

本発明において、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。   In the present invention, preservatives, salts, enzyme stabilizers, chromogen stabilizers and the like may be added within a range that does not affect the reaction. Examples of antiseptics include azides, chelating agents, antibiotics, and antibacterial agents. Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and its salt. Antibiotics include gentamicin, kanamycin, chloramphenicol and the like. Examples of the antibacterial agent include imidazolidinyl urea. Examples of the salts include sodium chloride, potassium chloride, aluminum chloride and the like. Enzyme stabilizers include sucrose, trehalose, cyclodextrin, gluconate, amino acids and the like. Examples of chromogen stabilizers include chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid and its salts, and cyclodextrins.

本発明において、第一反応におけるＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを優先的に消去する方法としては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素を、例えばカタラーゼ、またはペルオキシダーゼと前述の色原体、またはペルオキシダーゼと前述のカプラーを用いて消去することができるが、特に限定されない。   In the present invention, as a method for preferentially erasing cholesterol in HDL, VLDL and CM in the first reaction, hydrogen peroxide generated by the action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase is converted into, for example, catalase or peroxidase and the aforementioned color. Although it can erase | eliminate using an active ingredient or peroxidase and the above-mentioned coupler, it is not specifically limited.

本発明の一実施態様として、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質、２価金属イオン等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。   As one embodiment of the present invention, the first reagent comprises cholesterol esterase, cholesterol oxidase, catalase, chromogen, substance that inhibits the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low-density lipoprotein, divalent metal ion, etc. In addition, the second reagent includes an LDL-C measurement reagent that constitutes a substance that reduces or eliminates the inhibitory action of peroxidase, coupler, cholesterol esterase, and cholesterol oxidase on LDL-C, divalent metal ions, and the like.

また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質、２価金属イオン等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。   The first reagent is composed of cholesterol esterase, cholesterol oxidase, peroxidase, chromogen, cholesterol esterase and a substance that inhibits the reactivity of cholesterol oxidase to low-density lipoprotein, divalent metal ions, etc. In addition, there are LDL-C measurement reagents constituting substances that reduce or eliminate the inhibitory action of couplers, cholesterol esterases and cholesterol oxidases on LDL-C, divalent metal ions, and the like.

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記組成１〜１０のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し下記測定条件で、試料としてヒト血清より精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを測定し、各測定値より各々のリポ蛋白中のコレステロール濃度を１００％として相対％を求めた。また、比較例として下記組成１１のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の検討を行なった。尚、精製リポ蛋白画分の調製はＨａｔｃｈ ａｎｄ Ｌｅｅｓの方法の、３種の密度液を用い超遠心分離にて分離・分取した。
（試薬の調製）
下記組成１〜１１のＬＤＬ−Ｃ測定試薬をそれぞれ調製した。Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. In addition, this invention is not specifically limited by an Example.
Example 1
The following LDL-C measurement reagents having the following compositions 1 to 10 were prepared, and HDL, LDL, VLDL, and CM purified from human serum were measured as samples under the following measurement conditions, and the cholesterol concentration in each lipoprotein was determined from each measurement value. Relative% was calculated as 100%. Moreover, the LDL-C measuring reagent of the following composition 11 was prepared as a comparative example, and examination similar to an Example was performed. The purified lipoprotein fraction was separated and fractionated by ultracentrifugation using three kinds of density solutions according to the method of Hatch and Lees.
(Preparation of reagents)
LDL-C measurement reagents having the following compositions 1 to 11 were prepared.

組成１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 1
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (manufactured by Dojindo) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 0.1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ether (Emalex DAPE0207: manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
ブロックエース（雪印社製） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 2
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (manufactured by Dojindo) 0.2%
Block Ace (Snow Brand) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 0.1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ether (Emalex DAPE0207: manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成３
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
塩化コリン ３ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 3
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (manufactured by Dojindo) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Choline chloride 3g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 0.1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ether (Emalex DAPE0207: manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成４
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
ベタイン一水和物 ３ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 4
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (manufactured by Dojindo) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Betaine monohydrate 3g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 0.1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ether (Emalex DAPE0207: manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成５
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 5
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (manufactured by Dojindo) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxyalkylene alkyl ether (Emulgen MS-110: manufactured by Kao Corporation) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成６
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 6
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Sodium taurocholate (Nacalai Tesque) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxyalkylene alkyl ether (Emulgen MS-110: manufactured by Kao Corporation) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成７
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 7
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid (manufactured by Dojindo) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxyalkylene alkyl ether (Emulgen MS-110: manufactured by Kao Corporation) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成８
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド（同仁化学社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 8
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) colamide (manufactured by Dojindo) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxyalkylene alkyl ether (Emulgen MS-110: manufactured by Kao Corporation) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成９
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．２％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 9
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycholamide (manufactured by Dojindo) 0.2%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxyalkylene alkyl ether (Emulgen MS-110: manufactured by Kao Corporation) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成１０
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製） ０．２％
オレイン酸ナトリウム（ナカライテスク社製） ０．０１％
カゼイン（和光純薬） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 10
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Sodium taurocholate (Nacalai Tesque) 0.2%
Sodium oleate (Nacalai Tesque) 0.01%
Casein (Wako Pure Chemical Industries) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxyalkylene alkyl ether (Emulgen MS-110: manufactured by Kao Corporation) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

組成１１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 11
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (manufactured by Dojindo) 0.2%
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 0.1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Polyoxypropylene (2) polyoxyethylene decyl ether (Emalex DAPE0207: manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.) 0.3%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．４μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍ主波長、８００ｎｍ副波長で吸光度を測定した。ＬＤＬ−Ｃ濃度未知試料のＬＤＬ−Ｃ濃度の算出は、精製水および１１０ｍｇ／ｄＬ ＬＤＬ−Ｃ標準血清の測定吸光度より算出して求めた。(Measurement method)
A Hitachi 7170 automatic analyzer was used. The first reaction was carried out by adding 180 μL of the first reagent to 2.4 μL of the sample and incubating at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, 90 μL of the second reagent was added and incubated for 5 minutes to form a second reaction. Absorbance was measured at 600 nm dominant wavelength and 800 nm subwavelength by a two-point end method, which takes the difference between the absorbances obtained by correcting the absorbances of the first reaction and the second reaction. The LDL-C concentration of the sample with unknown LDL-C concentration was calculated from the measured absorbance of purified water and 110 mg / dL LDL-C standard serum.

結果 表１に示す。実施例の組成１〜４はいずれもＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異反応は５．０％以下であり、良好な特異性が確認された。一方、比較例の組成５はＬＤＬ−Ｃの回収率が不良であり、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異が大きい。この原因としては、ＬＤＬ−Ｃが第一反応において大部分が消去され、一方、相対的にＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中の未消去のコレステロール量の比率が高くなったものと考えられる。 Results are shown in Table 1. In any of Compositions 1 to 4 in Examples, nonspecific reaction to cholesterol in HDL, VLDL, and CM was 5.0% or less, and good specificity was confirmed. On the other hand, composition 5 of the comparative example has a poor recovery rate of LDL-C, and is highly non-specific to cholesterol in HDL, VLDL, and CM. This is probably because LDL-C was largely erased in the first reaction, while the proportion of unerased cholesterol in HDL, VLDL, and CM was relatively high.

（実施例２）
実施例１に示す組成１〜１０のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として血清２０検体を測定した。また、比較例として組成１１のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の測定を行なった。各試薬における測定値は、当該検体の総コレステロール値（東洋紡社製 コレスカラー・リキッド使用）、ＨＤＬ−Ｃ値（第一化学社製 分画剤試液により分画した試料を東洋紡社製 コレスカラー・リキッドで測定）及び中性脂肪値（東洋紡社製 リピドス・リキッド）を測定し、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の計算式を用いて算出したＬＤＬ−Ｃ値を対照として相対％を求めた。(Example 2)
20 serum samples were measured as samples under the measurement conditions shown in Example 1 using the LDL-C measurement reagents having compositions 1 to 10 shown in Example 1. Moreover, the LDL-C measuring reagent of the composition 11 was prepared as a comparative example, and the same measurement as the Example was performed. The measured value in each reagent is the total cholesterol value of the sample (using Tolesbo's Cores Color Liquid) and the HDL-C value (sampled by the Daiichi Kagaku's fraction reagent solution) Measured with liquid) and neutral fat value (Lipidos Liquid manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were measured, and relative% was determined using the LDL-C value calculated using the Friedewald formula as a control.

結果 表２に測定値を示し、表３に対照の測定値に対する相対％を示す。各組成の相対％は、実施例の組成１で８３．２〜１１３．６％、組成２で９０．４〜１１０．７％、組成３で９２．２〜１０７．１％、組成４で９５．２〜１０８．９％、組成５で９５．９〜１０４．０％、組成６で９４．６〜１０４．８％、組成７で９６．６〜１０４．９％、組成８で９７．８〜１０７．１％、組成９で９７．７〜１０３．６％、組成１０で９８．５〜１０３．６％と良好であった。一方、比較例では、組成１１で５１．２〜２０５．４％と特異性に問題があった。 Results Table 2 shows the measured values, and Table 3 shows the relative% with respect to the measured values of the control. The relative percentage of each composition is 83.2 to 113.6% for composition 1 of the example, 90.4 to 110.7% for composition 2, 92.2 to 107.1% for composition 3, and 95 for composition 4. .2-108.9%, Composition 5-95.9-104.0%, Composition 6 94.6-104.8%, Composition 7 96.6-104.9%, Composition 8 97.8 -107.1%, composition 9 was 97.7-103.6%, composition 10 was 98.5-103.6%, good. On the other hand, in the comparative example, the composition 11 had a problem with specificity of 51.2 to 205.4%.

（実施例３）
実施例１に示す組成６、１０のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として血清９容に対し干渉チェックＡプラス・乳び（シスメックス社製）を３００００ホルマジン濁度に調製した試料を１容添加したもの、および乳びに変えてブランク用試料を添加したものを各々測定し、乳び３０００ホルマジン濁度の測定値をブランク用試料の測定値に対する相対％として求め、乳びの影響を算出した。また、比較例として、実施例１で示す組成１１および以下の組成１２のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例と同様の測定を行なった。Example 3
Under the measurement conditions shown in Example 1 using the LDL-C measurement reagents having the compositions 6 and 10 shown in Example 1, interference check A plus chyle (manufactured by Sysmex Corp.) 30000 formazine turbidity with respect to 9 volumes of serum. Each of the sample prepared in 1 volume added and the sample added for the blank instead of the chyle were measured, and the measurement value of the chyle 3000 formazine turbidity was obtained as a relative% to the measurement value of the blank sample. The effect of chyle was calculated. In addition, as a comparative example, the same measurement as in the example was performed using the LDL-C measurement reagent having the composition 11 shown in Example 1 and the following composition 12.

組成１２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＢ６６（花王社製） ０．２％
牛血清アルブミン（シグマ） ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
トリトンＸ−１００ ２．０％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／ＬComposition 12
First reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Magnesium chloride 10mmol / L
Emulgen B66 (Kao Corporation) 0.2%
Bovine serum albumin (Sigma) 2.5g / L
Cholesterol esterase (Toyobo COE-311) 0.1 U / mL
Cholesterol oxidase (Toyobo COO-321) 3 U / mL
Catalase (from Roche microorganisms) 100 U / mL
4-Aminoantipyrine 0.1g / L
Second reagent PIPES-NaOH 50 mM pH 7.5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt 0.2 mmol / L
Calcium chloride 0.1mmol / L
Triton X-100 2.0%
Peroxidase (Toyobo PEO-301) 8U / mL
N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (manufactured by Dojin Chemical) 0.4 g / L

結果 表４に相対％を示す。各組成の相対％は、実施例の組成６で９５．８％、組成１０で１００．０％、と良好であった。一方、比較例では、組成１１で８９．６％、組成１２で８６．３％と乳びの影響がみられた。比較例においては第一反応、第二反応を通じて徐々に吸光度の低下がみられた。この要因として、乳びに多く存在するＶＬＤＬ、ＣＭが第一反応でコレステロールエステラーゼなどの作用を受けＶＬＤＬ、ＣＭが徐々に可溶化するがその作用は遅く第一反応時間内では十分消去されないことから検体に起因する試薬の濁りが残存することになる。その後、第二試薬添加後、残存した濁りは第二試薬の界面活性剤により非特異的に可溶化し濁度（吸光度）が低下することから、負の誤差が生じたものと考察する。 Results Table 4 shows the relative percentages. The relative% of each composition was as good as 95.8% for composition 6 and 100.0% for composition 10. On the other hand, in the comparative example, the influence of chyle was seen in composition 11 at 89.6% and composition 12 at 86.3%. In the comparative example, the absorbance gradually decreased through the first reaction and the second reaction. As a cause of this, VLDL and CM, which are abundant in chyle, are affected by cholesterol esterase in the first reaction, and VLDL and CM are gradually solubilized, but the action is slow and cannot be sufficiently eliminated within the first reaction time. The turbidity of the reagent due to the residue remains. Thereafter, after the addition of the second reagent, the remaining turbidity is solubilized non-specifically by the surfactant of the second reagent and the turbidity (absorbance) decreases, so that it is considered that a negative error has occurred.

なお、実施例１における組成１〜１１、および、実施例３における組成１２の主要構成を表５にまとめた。   In addition, Table 5 summarizes the main components of Compositions 1 to 11 in Example 1 and Composition 12 in Example 3.

本発明の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法は、血中の低密度リポ蛋白中コレステロールを、高濃度の超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールの存在下でも、簡便に、特異性、精密性良く分別測定でき、ポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく自動分析機への適用性が優れていることから、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野においてより的確で迅速な診断を行なうことができる。
The method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to the present invention is characterized in that cholesterol in low-density lipoprotein in blood can be easily determined even in the presence of high-concentration ultra-low-density lipoprotein and cholesterol in chylomicron. It is possible to measure fractions with high precision, and it is not necessary to use known lipoprotein agglutinating agents such as polyanions, so it has excellent applicability to automated analyzers, so it is more accurate and quick especially in the field of clinical tests such as arteriosclerosis. Diagnosis can be performed.

Claims (10)

試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の（ａ）〜（ｄ）を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
低密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質A method for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a sample using an enzymatic reaction,
In the first reaction, in the buffer containing the following (a) to (d), after preferentially erasing high density lipoprotein, ultra-low density lipoprotein and cholesterol in chylomicron in the sample,
In the second reaction, cholesterol in the low density lipoprotein is measured in a buffer containing the following (a) to (e):
Method for measuring cholesterol in low density lipoprotein.
(A) cholesterol esterase,
(B) cholesterol oxidase,
(C) a substance that inhibits the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low-density lipoprotein,
(D) Casein and / or quaternary ammonium salt and / or betaine compound (e) Reducing or eliminating the inhibitory action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein in the first reaction material コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   The method for measuring cholesterol in low density lipoprotein according to claim 1, wherein the substance that inhibits the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low density lipoprotein is a cholic acid derivative. コール酸誘導体が３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である請求項２項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   The cholic acid derivative is 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid, N, N-bis ( The cholesterol of low density lipoprotein according to claim 2, which is one or more selected from 3-D-gluconamidopropyl) colamide or N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycolamide. Measuring method. 第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   The substance that reduces or eliminates the inhibitory action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in the low-density lipoprotein in the first reaction is selected from polyoxypropylene polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene styryl phenyl ether or The method for measuring cholesterol in low density lipoprotein according to claim 1, wherein the number of cholesterols is plural. 第一反応において２価金属イオンを含有する請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   The method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein according to claim 1, which contains a divalent metal ion in the first reaction. 第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリンである請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   2. The method for measuring cholesterol in low density lipoprotein according to claim 1, wherein the quaternary ammonium salt is choline chloride, choline bromide or acetylcholine chloride. ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体である請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   The method for measuring cholesterol in low density lipoprotein according to claim 1, wherein the betaine compound is betaine, alkylimidazolium betaine, alkyl betaine, alkylamido betaine, or a derivative thereof. 第一反応においてさらに脂肪酸を含有する請求項１〜７項のいずれかに記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   The method for measuring cholesterol in low density lipoprotein according to any one of claims 1 to 7, further comprising a fatty acid in the first reaction. 第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。   The method for measuring cholesterol in a low density lipoprotein according to claim 1, wherein neither the first reaction nor the second reaction contains a polyanion. 請求項１ないし９のいずれかに記載の、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の（ａ）〜（ｃ）および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の（ａ）〜（ｅ）を含むように構成されている、低密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
A reagent for use in a method for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a sample according to any one of claims 1 to 9, utilizing an enzymatic reaction,
The first reagent contains the following (a) to (c) and a buffer, and
A reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, wherein the composition comprising the first reagent and the second reagent is combined with the following (a) to (e):
(A) cholesterol esterase,
(B) cholesterol oxidase,
(C) a substance that inhibits the reactivity of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to low-density lipoprotein,
(D) Casein and / or quaternary ammonium salt and / or betaine compound (e) Reducing or eliminating the inhibitory action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase on cholesterol in low-density lipoprotein in the first reaction material
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