JPWO2008078420A1 - Arteriosclerosis inhibitor - Google Patents
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Abstract
エストロゲン受容体に結合し、かつ、ABCA1活性を活性化する物質、例えば、エストロゲン受容体に対する拮抗阻害物質又は選択的エストロゲン受容体作動物質を有効成分とすることを特徴とする動脈硬化抑制剤を提供する。本発明の動脈硬化抑制剤は、マクロファージ細胞においてABCA1の発現を増強するが、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させず、優れた動脈硬化抑制機能を有する動脈硬化抑制剤である。An arteriosclerosis inhibitor characterized by comprising a substance that binds to an estrogen receptor and activates ABCA1 activity, for example, a competitive inhibitor for estrogen receptor or a selective estrogen receptor agonist. To do. The arteriosclerosis inhibitor of the present invention enhances the expression of ABCA1 in macrophage cells, but does not enhance the expression of a gene encoding a protein involved in lipid synthesis in the liver and has an excellent arteriosclerosis inhibitory function It is an agent.
Description
本発明は、動脈壁からのコレステロールの排出を即す生体内物質である、ABCA1の働きを活性化することにより、動脈硬化等の予防・治療を行うことが可能な動脈硬化抑制剤に関する発明である。 The present invention relates to an arteriosclerosis inhibitor capable of preventing or treating arteriosclerosis and the like by activating the action of ABCA1, which is an in vivo substance that facilitates the discharge of cholesterol from the arterial wall. is there.
動脈硬化を抑制するために高脂血症改善薬として現在使用されている薬剤の多くは、コレステロール合成に関与する酵素の阻害剤である。これらにより血中コレステロール値は低下するが、臨床知見より、血中コレステロール値と動脈硬化発症が必ずしも関連しないことが知られている。また、これらの動脈硬化への関与は直接的なものではなく、コレステロール合成を通じた間接的なものである。 Many of the drugs currently used as hyperlipidemia improving drugs for suppressing arteriosclerosis are inhibitors of enzymes involved in cholesterol synthesis. Although blood cholesterol level falls by these, it is known from clinical knowledge that blood cholesterol level and arteriosclerosis onset are not necessarily related. Also, their involvement in arteriosclerosis is not direct, but indirectly through cholesterol synthesis.
このことから、従来の高脂血症改善薬では動脈硬化に対する効果は限定的なものである可能性が強い。 Therefore, there is a strong possibility that conventional antihyperlipidemic drugs have a limited effect on arteriosclerosis.
以上のことにより、直接的に動脈硬化を引き起こす現象に作用することで、その症状を低減させる薬が望まれる。 As described above, a drug that reduces the symptom by directly acting on a phenomenon causing arteriosclerosis is desired.
動脈硬化は、（１）マクロファージ細胞が障害を受けた血管内皮に進入、（２）マクロファージ細胞内へのコレステロールの蓄積、（３）血管平滑筋の増殖等、が複合的に起きている病態である。 Atherosclerosis is a pathological condition in which (1) macrophage cells enter the damaged vascular endothelium, (2) cholesterol accumulation in macrophage cells, (3) proliferation of vascular smooth muscle, etc. is there.
これらの中でも、マクロファージ細胞内へのコレステロールの蓄積が症状の悪化に深く関与していると考えられている。 Among these, the accumulation of cholesterol in macrophage cells is thought to be deeply involved in the worsening of symptoms.
マクロファージ細胞内へのコレステロールの蓄積を低減させる方法として、マクロファージ細胞においてコレステロール排出に関与することが知られているABCA1タンパク質の量を制御することが考えられる。 As a method for reducing the accumulation of cholesterol in macrophage cells, it is conceivable to control the amount of ABCA1 protein known to be involved in cholesterol excretion in macrophage cells.
ＡＴＰ結合タンパク質(ATP binding cassette)の一種であるABCA1タンパク質をコードする遺伝子の発現は、核内受容体ファミリーに属する肝臓X受容体（LXR）により制御されていることが知られており、LXRアゴニスト存在下で発現が増強することが知られている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2002,99,7604-7609：非特許文献１)。 It is known that the expression of the gene encoding ABCA1 protein, which is a kind of ATP binding protein, is regulated by liver X receptor (LXR) belonging to the nuclear receptor family. It is known that expression is enhanced in the presence (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99, 7604-7609: Non-Patent Document 1).
一方、LXRの活性化は、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させることも知られており(Mol. Cell. Biol.2006,26,6786-6798：非特許文献２)、LXRアゴニストは好ましくない作用を及ぼすことが考えられ、実用に供されていない。
以上のことより、本発明は、マクロファージ細胞においてABCA1の発現を増強するが、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させない物質を有効成分とする動脈硬化抑制剤を提供することを課題とする発明である。 Based on the above, the present invention provides an arteriosclerosis inhibitor comprising as an active ingredient a substance that enhances ABCA1 expression in macrophage cells but does not enhance expression of a gene encoding a protein involved in lipid synthesis in the liver. It is an invention which makes this a subject.
本発明者は、上記の課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、女性ホルモンの一種であるエストロゲン受容体に対する結合物質、特に、当該受容体に対する拮抗阻害物質（以下、エストロゲンアンタゴニストともいう）又は選択的エストロゲン受容体作動物質に、優れたABCA1の活性化能（ABCA1タンパク質の発現量を増大させる機能）が認められ、かつ、肝臓細胞において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させないことを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive investigations aimed at solving the above problems, the present inventor has surprisingly found that a binding substance for an estrogen receptor, which is a type of female hormone, in particular, a competitive inhibitory substance for the receptor (hereinafter referred to as the following). Also known as an estrogen antagonist) or a selective estrogen receptor agonist that has excellent ABCA1 activation ability (a function that increases the expression level of ABCA1 protein) and encodes a protein involved in lipid synthesis in liver cells And the present invention was completed.
すなわち、本発明は、エストロゲン受容体に結合し、かつ、ABCA1活性を活性化する物質、具体的には、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質を有効成分とすることを特徴とする、動脈硬化抑制剤（以下、本抑制剤ともいう）を提供する発明である。 That is, the present invention relates to an arterial characterized by comprising a substance that binds to an estrogen receptor and activates ABCA1 activity, specifically, an estrogen antagonist or a selective estrogen receptor agonist. It is an invention that provides a curing inhibitor (hereinafter also referred to as the present inhibitor).
なお、本発明で、「エストロゲン受容体」とは、特に断らない限り、エストロゲン受容体αとβの双方を含むこととする。 In the present invention, “estrogen receptor” includes both estrogen receptors α and β unless otherwise specified.
本発明により、マクロファージ細胞においてABCA1の発現を増強するが、肝臓において脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強させず、優れた動脈硬化抑制機能を有する動脈硬化抑制剤が提供される。 The present invention provides an arteriosclerosis inhibitor that enhances the expression of ABCA1 in macrophage cells but does not enhance the expression of a gene encoding a protein involved in lipid synthesis in the liver and has an excellent arteriosclerosis-suppressing function. .
［有効成分］
ABCA1の発現を増強する本抑制剤の有効成分であるエストロゲンアンタゴニストならびに選択的エストロゲン受容体作動物質は、既存の薬剤であっても、未知の薬剤であっても、エストロゲン受容体に結合して、生体内におけるABCA1タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する物質であれば特に限定されない。[Active ingredients]
Estrogen antagonists and selective estrogen receptor agonists, which are active ingredients of this inhibitor that enhances the expression of ABCA1, bind to estrogen receptors, whether existing drugs or unknown drugs, The substance is not particularly limited as long as it is a substance that controls expression of a gene encoding ABCA1 protein in vivo.
エストロゲンアンタゴニストとしては、例えば、ICI 182780(fulvestrant)を挙げることができる。また、選択的エストロゲン受容体作動物質としては、例えば、タモキシフェン(tamoxifen:TAM))、ラロキシフェン(Raloxifen:Ral)を挙げることが出来る。ここで、選択的エストロゲン受容体作動物質とは、臓器や組織の部位によって作用が異なり、ある部位ではエストロゲン様の作用を示すが、別の部位ではエストロゲンに対する拮抗作用を示す物質を意味する。 Examples of the estrogen antagonist include ICI 182780 (fulvestrant). Examples of selective estrogen receptor agonists include tamoxifen (TAM)) and raloxifen (Raloxifen: Ral). Here, the selective estrogen receptor agonist means a substance that acts differently depending on the site of the organ or tissue, shows an estrogen-like action at a certain site, but shows an antagonistic action against estrogen at another site.
エストロゲンアンタゴニストであるICI 182780は、タモキシフェン治療後に転移した閉経後の女性におけるホルモンレセプター陽性の乳がんの治療に用いられている物質で7-alpha-[9-(4,4,4,5,5-pentafluoropent-ylsulphinyl)nonyl]estra-1,3,5-(10)-triene-3,17beta-diolとして規定される化合物である。ICI 182780は、公知の方法により製造して、これを本抑制剤の有効成分とすることが可能である。また、ICI 182780は、癌治療薬として、アストラゼネカ社から入手することが出来る。 ICI 182780, an estrogen antagonist, is a substance used to treat hormone receptor positive breast cancer in postmenopausal women who have metastasized after tamoxifen treatment and is 7-alpha- [9- (4,4,4,5,5- pentafluoropent-ylsulphinyl) nonyl] estra-1,3,5- (10) -triene-3,17beta-diol. ICI 182780 can be produced by a known method and used as an active ingredient of the present inhibitor. ICI 182780 can be obtained from AstraZeneca as a cancer therapeutic agent.
選択的エストロゲン受容体作動物質のうち、タモキシフェンは、現在、乳ガン、卵巣癌等のエストロゲンの増加が癌の進行を助長する癌の治療剤として用いられている物質で、具体的には(Z)-2-[p-(1,2-diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethylamine。タモキシフェンは、公知の方法により製造して、これを本抑制剤の有効成分とすることが可能である。また、タモキシフェンは、癌治療薬として、アストラゼネカ社から入手することが出来る。 Among selective estrogen receptor agonists, tamoxifen is a substance currently used as a therapeutic agent for cancer in which an increase in estrogen such as breast cancer and ovarian cancer promotes cancer progression, specifically (Z) -2- [p- (1,2-diphenyl-1-butenyl) phenoxy] -N, N-dimethylethylamine. Tamoxifen can be produced by a known method and used as an active ingredient of the present inhibitor. Tamoxifen can be obtained from AstraZeneca as a cancer therapeutic agent.
また、ラロキシフェンは、閉経後女性における骨粗鬆症の治療に用いられている物質で、［6-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）benzo［b］thien-3-yl］［4-（2-piperidin-1-ylethoxy）phenyl］methanone。ラロキシフェンは、公知の方法により製造して、これを本抑制剤の有効成分とすることが可能である。ラロキシフェンは、骨粗鬆症治療薬として、中外製薬から入手することが出来る。 Raloxifene is a substance used to treat osteoporosis in postmenopausal women. [6-hydroxy-2- (4-hydroxyphenyl) benzo [b] thien-3-yl] [4- (2-piperidin- 1-ylethoxy) phenyl] methanone. Raloxifene can be produced by a known method and used as an active ingredient of the present inhibitor. Raloxifene can be obtained from Chugai as a therapeutic agent for osteoporosis.
また、エストロゲンアンタゴニスト作用ならびに選択的エストロゲン受容体作動作用が知られていない既存物質や、新たな合成物質ならびに天然物質のエストロゲンアンタゴニスト作用ならびにABCA1タンパク質発現の増強を検出して、当該物質を本抑制剤の有効成分として用いることも可能である。 In addition, it detects existing substances whose estrogen antagonistic action and selective estrogen receptor agonistic action are not known, new synthetic substances and estrogen antagonistic action of natural substances, and enhancement of ABCA1 protein expression, and makes the substance an inhibitor. It can also be used as an active ingredient.
このようなエストロゲンアンタゴニストの検出には、被験物質に対して、エストロゲンアンタゴニストとして検出することができるスクリーニングアッセイならびにABCA1タン
パク質の発現量を検出することができるスクリーニングアッセイを施して、被験物質の一部又は全部をABCA1タンパク質の発現を増強することが出来るエストロゲンアンタゴニストとして選択することができる。For detection of such an estrogen antagonist, the test substance is subjected to a screening assay that can be detected as an estrogen antagonist as well as a screening assay that can detect the expression level of ABCA1 protein. All can be selected as estrogen antagonists that can enhance the expression of ABCA1 protein.
エストロゲンアンタゴニストとして検出することができるスクリーニングアッセイ法としては、例えば、遺伝子の発現を検出する方法（J. Med. Chem., 2004, 47, 2171-2175：非特許文献３）や受容体とリガンドの結合を検出する方法（Bioorg. Med. Chem. Lett., 2005, 15, 1675-1681：非特許文献４）を挙げることができる。典型的には、レポーターベクターとして、レポーター遺伝子としてホタル由来ルシフェラーゼを使用し、その上流にエストロゲン受容体結合領域を含む塩基配列を組み込んだベクターと、エストロゲン受容体発現ベクターとして、動物細胞用遺伝子発現ベクターに、エストロゲン受容体βをコードする遺伝子(配列番号１)、又は、エストロゲン受容体αをコードする遺伝子(配列番号２)、を組み込んだベクターを動物細胞に導入し、エストロゲン(和光純薬工業)のみ、あるいはエストロゲンと被験物質とを共存させた動物細胞の培地に添加し、ルシフェラーゼの発現量をルシフェラーゼで分解されると発光する物質を使用し発光量を比較することでエストロゲンアンタゴニストを検出することが可能である。 Examples of screening assays that can be detected as estrogen antagonists include a method for detecting gene expression (J. Med. Chem., 2004, 47, 2171-2175: Non-Patent Document 3), a receptor and a ligand. Examples include a method for detecting binding (Bioorg. Med. Chem. Lett., 2005, 15, 1675-1681: Non-Patent Document 4). Typically, as a reporter vector, a firefly-derived luciferase is used as a reporter gene and a base sequence including an estrogen receptor binding region is incorporated upstream thereof, and an estrogen receptor expression vector is a gene expression vector for animal cells. Vector into which an estrogen receptor β-encoding gene (SEQ ID NO: 1) or estrogen receptor α-encoding gene (SEQ ID NO: 2) is incorporated is introduced into an animal cell, and estrogen (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Estrogen antagonists can be detected by adding a substance that emits luminescence when luciferase is decomposed by luciferase, by adding to the medium of animal cells in which estrogen and test substance coexist. Is possible.
ABCA1タンパク質の発現量を検出することができるスクリーニングアッセイ法としては、例えばタンパク質を膜に固定し検出する方法(J. Biol. Chem., 2002, 277, 5692-5697：非特許文献５)やタンパク質をプラスチックに固定し検出する方法(EMBO Rep., 2000, 1, 190-196：非特許文献６) を挙げることができる。典型的には、タンパク質を還元、変性後、ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、ニトロセルロース膜あるいはポリフッ化ビニリデン膜に電気的に固定後、ABCA1タンパク質を認識する抗体と、この抗体を認識する西洋わさび由来パーオキシダーゼが結合した抗体を使用し、パーオキシダーゼにより分解されると発光する物質を使用し発光量を比較することでABCA1タンパク質の発現量を比較、検出することが可能である。 Examples of screening assays that can detect the expression level of ABCA1 protein include a method in which the protein is immobilized on a membrane and detected (J. Biol. Chem., 2002, 277, 5692-5697: Non-patent document 5) and protein. Can be mentioned as a method of detecting and fixing to a plastic (EMBO Rep., 2000, 1, 190-196: Non-Patent Document 6). Typically, after reducing and denaturing the protein, the protein is separated using a polyacrylamide gel, electrically immobilized on a nitrocellulose membrane or polyvinylidene fluoride membrane, and then an antibody that recognizes the ABCA1 protein and a Western that recognizes this antibody. It is possible to compare and detect the expression level of ABCA1 protein by using an antibody bound with wasabi-derived peroxidase and using a substance that emits light when it is degraded by peroxidase and comparing the amount of luminescence.
上記のようなスクリーニング方法により選別された新たなABCA1タンパク質発現の増強能を有するエストロゲンアンタゴニストを、本抑制剤の有効成分として用いることができる。 A new estrogen antagonist having the ability to enhance ABCA1 protein expression selected by the screening method as described above can be used as an active ingredient of the inhibitor.
本抑制剤による、有効成分に換算した投与量は、具体的に選択されたエストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質、により異なり、適宜決定されるものであるが、例えば、タモキシフェン又はラロキシフェンの場合には、大人１日あたり20mg〜40mg程度であり、ICI 182780の場合には、大人１日あたり4mg〜8mg程度である。また、投与経路は限定されず、例えば、経口であっても、皮下であってもよい。 The dose converted to the active ingredient by this inhibitor varies depending on the specifically selected estrogen antagonist or selective estrogen receptor agonist, and is determined as appropriate. For example, in the case of tamoxifen or raloxifene In the case of ICI 182780, it is about 4 mg to 8 mg per day for adults. Further, the administration route is not limited, and for example, it may be oral or subcutaneous.
本抑制剤の剤型は、特に限定されず、散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤等が例示可能である。 The dosage form of this inhibitor is not particularly limited, and examples thereof include powders, fine granules, granules, pills, tablets, capsules, and liquids.
また、本抑制剤には、各種の添加剤をその剤型等に応じて添加することが可能である。当該添加剤としては、例えば、基礎剤として、溶剤、基剤、賦形剤を添加することが可能である。また、補助剤として、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、可塑剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保湿剤等の補助剤を添加することが可能である。また、緩衝剤、等張化剤、安定剤、無痛化剤、保存剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、着色剤等を添加することも可能である。 Moreover, it is possible to add various additives to this inhibitor according to the dosage form. As the additive, for example, a solvent, a base, and an excipient can be added as a base agent. As auxiliary agents, auxiliary agents such as solubilizing agents, emulsifiers, suspending agents, thickeners, plasticizers, binders, disintegrating agents, lubricants, and moisturizing agents can be added. It is also possible to add buffering agents, isotonic agents, stabilizers, soothing agents, preservatives, sweetening agents, flavoring agents, fragrances, coloring agents and the like.
これらの製剤組成物中のエストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の配合量は、具体的な当該アンタゴニスト等に応じて適宜選択可能であるが、概ね、製剤組成物全体に対して１〜４０質量％程度である。 The compounding amount of the estrogen antagonist or the selective estrogen receptor agonist in these pharmaceutical compositions can be appropriately selected depending on the specific antagonist and the like, but is generally 1 to 40 with respect to the whole pharmaceutical composition. It is about mass%.
以下に、本発明を、実施例を用いてさらに具体的に説明するが、この記載により、本発明が限定的に解釈されるべきものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention should not be construed as being limited to this description.
［試験例１］エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、ＡＢＣＡ１タンパク質の細胞内量に対する影響の検討
ヒト単球細胞株であるTHP-1細胞を、PMA処理によりマクロファージ化させ、エストロゲンアンタゴニストであるICI 182780（ICI）、選択的エストロゲン受容体作動物質であるタモキシフェン(TAM)及びラロキシフェン（Ral）を、100nMとなるよう添加して、以後、37℃、湿度100%、CO2濃度 5%の条件にてインキュベーションを行った。T0901317［N-Ethyl-N-[4-(1-hydroxy-1-methyl-ethyl)-phenyl]-benzenesulfonamide：Liver X Receptor(LXR)に対するアゴニスト］は、ABCA1の発現が増加するポジティブコントロールとして用いた。図１では、各被験物質を添加後、24時間培養したTHP-1細胞より得られた細胞抽出液を、抗ABCA1モノクローナル抗体（AB.H10、abcam社）を用いたウェスタン解析法にてABCA1タンパク質を検出した結果、エストロゲン受容体βのアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加により、当該タンパク質量が増加していることが確認されたことを示している。[Test Example 1] Examination of the effect of the addition of an estrogen antagonist or a selective estrogen receptor agonist on the intracellular amount of ABCA1 protein Macrophages of THP-1 cells, a human monocyte cell line, were treated with PMA to estrogen. Antagonists ICI 182780 (ICI), selective estrogen receptor agonists tamoxifen (TAM) and raloxifene (Ral) were added to 100 nM, and then 37 ° C., humidity 100%, CO 2 concentration 5 Incubation was performed under the condition of%. T0901317 [N-Ethyl-N- [4- (1-hydroxy-1-methyl-ethyl) -phenyl] -benzenesulfonamide: agonist for Liver X Receptor (LXR)] was used as a positive control to increase ABCA1 expression . In FIG. 1, a cell extract obtained from THP-1 cells cultured for 24 hours after adding each test substance was subjected to ABCA1 protein by Western analysis using anti-ABCA1 monoclonal antibody (AB.H10, abcam). As a result, it was shown that the amount of the protein was confirmed to be increased by adding an antagonist of estrogen receptor β or a selective estrogen receptor agonist.
［試験例２］エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、ＡＢＣＡ１プロモーター遺伝子の活性化についての検討
ヒト繊維芽細胞株である293細胞に、ABCA1プロモーターのレポータープラスミドとエストロゲン受容体α、βの発現プラスミドを共に導入し、上記試験例１と同様の被験物質を100nMとなるよう添加し、以後、37度、湿度100%、CO2濃度 5%の条件にてインキュベーションを行った。ABCA1プロモーターのレポータープラスミドは、ABCA1遺伝子の上流-176―+37の領域をPCR法にて増幅し、pGL3ベクター(Promega)のマルチクローニングサイトに導入することで得た。図２は、各被験物質を添加後、24時間培養した293細胞より得られた細胞抽出液に含まれるルシフェラーゼ活性を、エストロゲン受容体α、βを導入していない場合（図中「−」）を１とした、相対的な活性を各被験物質毎に示している。ルシフェラーゼ活性はDual luciferase reporter assay system(Promega)を用いてルミノメーターにて測定した。これにより、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質は、ABCA1プロモーターの転写能を強く活性化することが明らかとなった。[Test Example 2] Examination of activation of ABCA1 promoter gene by addition of estrogen antagonist or selective estrogen receptor agonist A reporter plasmid of ABCA1 promoter and estrogen receptor α, A β-expression plasmid was introduced together, and the same test substance as in Test Example 1 was added to 100 nM. Thereafter, incubation was performed at 37 ° C., humidity of 100%, and CO 2 concentration of 5%. The ABCA1 promoter reporter plasmid was obtained by amplifying the upstream -176− + 37 region of ABCA1 gene by PCR and introducing it into the multicloning site of pGL3 vector (Promega). FIG. 2 shows the luciferase activity contained in the cell extract obtained from 293 cells cultured for 24 hours after the addition of each test substance, when the estrogen receptors α and β are not introduced (“−” in the figure). The relative activity is shown for each test substance, with 1 being 1. Luciferase activity was measured with a luminometer using Dual luciferase reporter assay system (Promega). This revealed that estrogen antagonists or selective estrogen receptor agonists strongly activate the transcriptional ability of ABCA1 promoter.
［試験例３］エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加による、コレステロールの細胞外排出についての検討
上述した要領でマクロファージ化したTHP-1細胞に、エストロゲンアンタゴニストであるICI 182780、選択的エストロゲン受容体作動物質であるタモキシフェン、ラロキシフェンを、100nMとなるように添加して（ネガティブコントロールは、被験物質の配合なし）、以後、37℃、湿度100%、CO2濃度 5%の条件にてインキュベーションを行い、これらの細胞内におけるコレステロールの蓄積を検討した。図３（Ａ）は、THP-1細胞におけるコレステロールの蓄積が、上記被験物質の添加により減少することを示す、oil red O染色を行った細胞の顕微鏡写真である。これにより、THP-1細胞内のコレステロール（ネガティブコントロールにおいては斑点として認められる）が、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質により減少することが明らかになった。図３（Ｂ）は、THP-1細胞からのコレステロールの排出を、コレステロールフラックスアッセイにより測定した結果、コレステロールの排出が、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質の添加により増加していることが明らかになった。コレステロールエフラックスアッセイは培養培地及び細胞抽出液に含まれるコレステロール量をコレステロールアッセイキット(Cayman)とプレートリーダーを用いて測定することで行った。[Test Example 3] Examination of extracellular excretion of cholesterol by addition of an estrogen antagonist or a selective estrogen receptor agonist THP-1 cells macrophageized as described above, ICI 182780, an estrogen antagonist, selective estrogen Add tamoxifen and raloxifene, which are receptor agonists, to a concentration of 100 nM (negative control is not mixed with the test substance), and then incubate at 37 ° C, humidity 100%, CO 2 concentration 5% The accumulation of cholesterol in these cells was examined. FIG. 3 (A) is a photomicrograph of cells subjected to oil red O staining, showing that cholesterol accumulation in THP-1 cells decreases with the addition of the test substance. This revealed that cholesterol in THP-1 cells (recognized as spots in the negative control) was decreased by estrogen antagonists or selective estrogen receptor agonists. FIG. 3 (B) shows that cholesterol excretion from THP-1 cells was measured by a cholesterol flux assay. As a result, cholesterol excretion was increased by the addition of an estrogen antagonist or a selective estrogen receptor agonist. It was revealed. The cholesterol efflux assay was performed by measuring the amount of cholesterol contained in the culture medium and cell extract using a cholesterol assay kit (Cayman) and a plate reader.
上記の試験例１〜３の結果から、驚くべきことに、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質とは、動脈硬化の原因となる、マクロファージにおけるコレステロールの蓄積を、コレステロールを外部に排出することにより防御し得ることが明らかとなった。また、このような減少は、本抑制剤のABCA1活性化作用に基づくものであることが強く示唆された。このようにして、エストロゲンアンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体作動物質は、動脈硬化抑制剤の有効成分として用いることができることが明らかになった。 Surprisingly, from the results of the above Test Examples 1 to 3, an estrogen antagonist or a selective estrogen receptor agonist means that cholesterol accumulation in macrophages that causes arteriosclerosis is excreted to the outside. It became clear that it can defend. Moreover, it was strongly suggested that such a decrease was based on the ABCA1 activation action of this inhibitor. In this way, it has been revealed that an estrogen antagonist or a selective estrogen receptor agonist can be used as an active ingredient of an arteriosclerosis inhibitor.
以下に本抑制剤の製剤例を記載する。なお、下記の製剤例において、ICI 182780を成分１と記載し、タモキシフェンを成分２と記載し、ラロキシフェンを成分３と記載する。
The formulation example of this inhibitor is described below. In the following formulation examples, ICI 182780 is described as
［製剤例１］ 錠剤
（配合成分） （質量部）
成分１ ２．０
結晶セルロース ９８．９
ショ糖脂肪酸エステル １．０[Formulation Example 1] Tablet (Compounding ingredient) (parts by mass)
Crystalline cellulose 98.9
Sucrose fatty acid ester 1.0
上記の配合で常法に従い錠剤を製造する。 A tablet is manufactured according to a conventional method with the above composition.
［製剤例２］ カプセル剤
（配合成分） （質量部）
成分１ １．５
ラクトース ８５．０
コーン・スターチ ５８．０
ステアリン酸マグネシウム ２．０[Formulation Example 2] Capsule (blending component) (parts by mass)
Lactose 85.0
Corn starch 58.0
Magnesium stearate 2.0
上記で示される各成分の粉末を良く混合し、60メッシュの篩（メッシュの基準はTyler基準による）を通す。得られる粉末をはかり分け、ゼラチンカプセル(No. 3)に充填し、カプセル剤を調製する。 Mix the powder of each component shown above well and pass through a 60 mesh sieve (mesh standard is Tyler standard). The obtained powder is weighed and filled into gelatin capsules (No. 3) to prepare capsules.
［製剤例３］ 錠剤
（配合成分） （質量部）
成分２又は成分３ ２０．０
ラクトース ３５．０
コーン・スターチ ３４．０
微結晶セルロース ２０．０
ステアリン酸マグネシウム １．０ [Formulation Example 3] Tablet (compound component) (parts by mass)
Component 2 or Component 3 20.0
Lactose 35.0
Corn Starch 34.0
Microcrystalline cellulose 20.0
Magnesium stearate 1.0
上記で示される各成分の粉末を良く混合し、錠剤に圧縮成型する。必要ならば、これらの錠剤は糖またはフィルムで被覆してもよい。 The powder of each component shown above is mixed well and compressed into a tablet. If necessary, these tablets may be coated with sugar or film.
Claims (4)
(Z)-2-[p-(1,2-diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethylamine、
7-alpha-[9-(4,4,4,5,5-pentafluoropent-ylsulphinyl)nonyl]estra-1,3,5-(10)-triene-3,17beta-diol、及び、
［6-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）benzo［b］thien-3-yl］［4-（2-piperidin-1-ylethoxy）phenyl］methanone
からなる群から選ばれる１種以上の物質であることを特徴とする、請求項１記載の動脈硬化抑制剤。The active ingredient of the arteriosclerosis inhibitor is
(Z) -2- [p- (1,2-diphenyl-1-butenyl) phenoxy] -N, N-dimethylethylamine,
7-alpha- [9- (4,4,4,5,5-pentafluoropent-ylsulphinyl) nonyl] estra-1,3,5- (10) -triene-3,17beta-diol, and
[6-hydroxy-2- (4-hydroxyphenyl) benzo [b] thien-3-yl] [4- (2-piperidin-1-ylethoxy) phenyl] methanone
The arteriosclerosis inhibitor according to claim 1, which is one or more substances selected from the group consisting of:
Applications Claiming Priority (3)
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| JP2006349254 | 2006-12-26 | ||
| JP2006349254 | 2006-12-26 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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