JPWO2008001676A1 - Lactic acid bacteria to improve lactose intolerance - Google Patents

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Abstract

本発明により、乳糖不耐症を改善するのに有用な乳酸菌が提供される。本発明はラクトバチルス属乳酸菌から腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された菌を選抜することを特徴とする、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌をスクリーニングする方法、および該方法によって得られる乳酸菌に関する。According to the present invention, lactic acid bacteria useful for improving lactose intolerance are provided. The present invention comprises a method for screening a lactic acid bacterium having an ability to improve lactose intolerance, characterized by selecting a bacterium having enhanced intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity from Lactobacillus lactic acid bacteria, and the method. It relates to the lactic acid bacteria obtained.

Description

本発明は、乳糖不耐症を改善するのに有用な乳酸菌とその利用に関する。   The present invention relates to lactic acid bacteria useful for improving lactose intolerance and use thereof.

「乳糖不耐症」は、摂取した乳中のラクトース（乳糖）の消化不良が原因で、下痢や腹痛などの不快な消化器症状を容易に生じる体質である。この乳糖不耐症は、一般的には加齢に伴って顕著になると考えられているが、乳幼児期にも認められる。乳糖不耐症の症状を軽減するためには、ラクトースを含む製品の摂取を避ける必要があるが、良好なカルシウム源である乳製品を摂取できないことは、例えば高齢者の骨粗鬆症のリスクを高め、栄養面でも大きな障害となる。骨粗鬆症は高齢化が急速に進む我が国を脅かす最大の疾病の一つであり、高齢者の骨粗鬆症リスクを低減させる意味で、乳製品の積極的な摂取を促すことは殊に重要である。   “Lactose intolerance” is a constitution that easily causes uncomfortable digestive symptoms such as diarrhea and abdominal pain due to indigestion of lactose (lactose) in ingested milk. This lactose intolerance is generally considered to become more prominent with aging, but is also observed in infancy. In order to alleviate the symptoms of lactose intolerance, it is necessary to avoid consumption of products containing lactose, but the inability to take dairy products that are a good source of calcium increases the risk of osteoporosis in the elderly, for example, It becomes a big obstacle in nutrition. Osteoporosis is one of the biggest diseases that threatens Japan, which is aging rapidly, and it is particularly important to promote the active intake of dairy products in order to reduce the risk of osteoporosis in the elderly.

ラクトースは、通常、小腸内層の細胞で産生されるラクトース分解酵素によって分解され、吸収される。一方、乳酸菌等の様々な微生物がラクトース分解酵素を産生し、ラクトースを分解することが知られている。生きた乳酸菌や酵母を含むヨーグルトや乳酸菌飲料は、ラクトースの一部が分解されているため乳糖不耐症の症状を比較的起こしにくいと考えられており、さらに、それらの継続的な経口摂取によって腸内でそれらの菌が徐々に増殖し、腸内のラクトース分解能が増大する結果、乳糖不耐症自体の改善にもつながるとされている。   Lactose is normally broken down and absorbed by lactose degrading enzymes produced in cells of the lining of the small intestine. On the other hand, it is known that various microorganisms such as lactic acid bacteria produce lactose-degrading enzymes and degrade lactose. Live lactic acid bacteria and yeast-containing yogurt and lactic acid bacteria beverages are thought to be relatively less likely to cause lactose intolerance because some of the lactose is broken down. It is said that these bacteria gradually grow in the intestine and lactose resolution in the intestine increases, resulting in improvement of lactose intolerance itself.

以前から、乳酸菌のラクトース代謝には、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）およびフォスフォ-β-ガラクトシダーゼ（P-β-gal）という2種類のラクトース分解酵素が関与することが知られているが、さらに本発明者らにより、乳酸菌が有するフォスフォ-β-グルコシダーゼ（P-β-glc）という3つ目のラクトース分解酵素の存在も明らかにされた（非特許文献１）。これらラクトース分解酵素の活性が高い乳酸菌は、乳糖不耐症の症状軽減に効果的と考えられる。しかし非腸管系乳酸菌の中には、高いラクトース分解活性を有するものがあるが、一般的にヒト腸管内で生育できないものもあると認識されている。このような乳酸菌では、ヒト腸管内で持続的にラクターゼの産生ができず、経口摂取した分以上のラクターゼ活性を望めないと考えられる（非特許文献２）。従って、乳酸菌の経口投与により乳糖不耐症を改善するためには、ラクターゼ活性が高いだけでなく、ヒト腸内で持続的にラクトースを分解できる乳酸菌が必要であるが、そのような乳酸菌の探索はまだあまり進んでいない。   It has long been known that lactose metabolism in lactic acid bacteria involves two types of lactose-degrading enzymes, β-galactosidase (β-gal) and phospho-β-galactosidase (P-β-gal). The present inventors have also revealed the presence of a third lactose-degrading enzyme called phospho-β-glucosidase (P-β-glc) possessed by lactic acid bacteria (Non-patent Document 1). Lactic acid bacteria having high activity of these lactose degrading enzymes are considered to be effective in reducing the symptoms of lactose intolerance. However, some non-intestinal lactic acid bacteria have a high lactose-degrading activity, but it is generally recognized that some cannot grow in the human intestinal tract. Such a lactic acid bacterium cannot produce lactase continuously in the human intestinal tract, and it is considered that lactase activity higher than the amount taken orally cannot be expected (Non-patent Document 2). Therefore, in order to improve lactose intolerance by oral administration of lactic acid bacteria, not only high lactase activity but also lactic acid bacteria that can continuously degrade lactose in the human intestine are necessary. Hasn't made much progress yet.

ところで、腸管系乳酸菌の中には腸管付着性の高い菌が存在することが知られている。そのような腸管付着性の高い菌を探索する方法として、例えば、ヒト腸管ムチンへの結合能を測定することにより、ヒトの各血液型に適合した腸管付着性の高い乳酸菌をスクリーニングする方法がある（特許文献１）。この方法は、乳酸菌がヒトに初期感染し腸管へ定着するためには腸上皮細胞表面に接着することが不可欠であると考えられていること、高橋らの大腸ムチン（RCM）を用いた乳酸菌スクリーニングの報告［大腸ムチン（RCM）をコートしたポリスチレンビーズを用いてラクトバチルス・アシドフィルスグループ乳酸菌株をスクリーニングしたところ、そのRCMに強く結合した乳酸菌株由来の表層タンパク質（SLP）がヒト大腸粘液層にも結合したとの報告。非特許文献３など］、ヒト大腸ムチンを構成する糖鎖の化学構造がABO式血液型により異なるとの報告（例えば、非特許文献４）等に基づいて構築されたものである。しかし、各血液型に適合した乳酸菌の探索以外の用途へのこのスクリーニング方法の適用は、まだほとんどなされていない。
特開２００４−１０１２４９号公報 齋藤忠夫、伊藤敞敏、舘野義男、山崎由紀子、ヒト腸管起源のLactobacillus gasseri（ガセリ菌）におけるラクトース資化系の新経路の発見、生物工学会誌、 (2001)、79(6)、pp.172-173 Marteau P, Minekus M, Havenaar R, Huis in't Veld JH、Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation and the effects of bile.、J Dairy Sci、(1997) 80(6)、pp.1031-1037 Takahashi N, Saito T, Ohwada S, Ota H, Hashiba H, Itoh T、"A new screening method for the selection of Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria with high adhesion to human colonic mucosa."、Biosci Biotechnol Biochem、(1996)、60(9)、pp.1434-1438 天野純子、消化管ムチン上の血液型糖鎖構造−細菌感染のメカニズム解明に向けて、生化学、社団法人日本生化学会、(1999) 71(4)、pp.274〜277 By the way, it is known that intestinal lactic acid bacteria include bacteria having high intestinal adhesion properties. As a method for searching for such bacteria having high intestinal adherence, for example, there is a method for screening lactic acid bacteria having high intestinal adherence suitable for each human blood type by measuring the binding ability to human intestinal mucin. (Patent Document 1). In this method, it is considered that adhesion to the surface of intestinal epithelial cells is essential for lactic acid bacteria to infect humans and establish in the intestinal tract. Screening for lactic acid bacteria using Takahashi et al.'S colonic mucin (RCM) [Lactobacillus acidophilus group Lactobacillus strains were screened using polystyrene beads coated with colonic mucin (RCM), and surface protein (SLP) derived from Lactobacillus strains strongly bound to RCM was found in human colon mucus layer. Report that they have been combined. Non-patent document 3 etc.], and the chemical structure of the sugar chain constituting human large intestine mucin differed depending on the ABO blood group (for example, non-patent document 4). However, application of this screening method to uses other than the search for lactic acid bacteria suitable for each blood type has not been made yet.
JP 2004-101249 A Tadao Saito, Toshitoshi Ito, Yoshio Kanno, Yukiko Yamazaki, Discovery of a new pathway of lactose utilization in Lactobacillus gasseri of human intestinal origin, Journal of Biotechnology, (2001), 79 (6), pp.172 -173 Marteau P, Minekus M, Havenaar R, Huis in't Veld JH, Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation and the effects of bile., J Dairy Sci, (1997) 80 (6 ), Pp.1031-1037 Takahashi N, Saito T, Ohwada S, Ota H, Hashiba H, Itoh T, "A new screening method for the selection of Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria with high adhesion to human colonic mucosa.", Biosci Biotechnol Biochem, (1996) , 60 (9), pp.1434-1438 Junko Amano, Blood-type glycan structure on gastrointestinal mucins-To elucidate the mechanism of bacterial infection, Biochemistry, Japan Biochemical Society, (1999) 71 (4), pp.274-277

本発明は、乳糖不耐症を改善する能力を有する乳酸菌を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium having an ability to improve lactose intolerance.

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、一部のラクトバチルス属乳酸菌においては腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強されうることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that in some Lactobacillus lactic acid bacteria, both intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity can be enhanced, and based on this finding The present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下を包含する。   That is, the present invention includes the following.

[1] ラクトバチルス属乳酸菌から腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された菌を選抜することを特徴とする、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌をスクリーニングする方法。 [1] A method for screening a lactic acid bacterium having an ability to improve lactose intolerance, comprising selecting a bacterium having enhanced intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity from Lactobacillus lactic acid bacteria.

この方法では、その菌の選抜において、ヒトＡ型腸管ムチン、ヒトＢ型腸管ムチン、およびヒトＯ型腸管ムチンのうち少なくとも１つに対する乳酸菌の結合能を表面プラズモン共鳴解析を用いて測定し、その結合能を示すRU値が100 RU以上である菌を腸管付着性が増強された菌として選抜することが、より好ましい。   In this method, in the selection of the bacteria, the binding ability of lactic acid bacteria to at least one of human type A intestinal mucin, human type B intestinal mucin, and human type O intestinal mucin is measured using surface plasmon resonance analysis, It is more preferable to select a bacterium having a binding ability RU value of 100 RU or more as a bacterium having enhanced intestinal adhesion.

この方法において、選抜される菌で増強されるラクトース分解酵素活性は、好ましくは、β-ガラクトシダーゼ、フォスフォ-β-ガラクトシダーゼ、およびフォスフォ-β-グルコシダーゼのうち少なくとも１つのラクターゼ活性である。   In this method, the lactose-degrading enzyme activity enhanced in the selected bacterium is preferably at least one lactase activity of β-galactosidase, phospho-β-galactosidase, and phospho-β-glucosidase.

この方法において、好適には、スクリーニングを行うラクトバチルス属乳酸菌は、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、またはラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）である。   In this method, the Lactobacillus lactic acid bacterium to be screened is preferably Lactobacillus gasseri or Lactobacillus mucosae.

[2] 上記[1]の方法により得られる、腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された乳酸菌。 [2] A lactic acid bacterium obtained by the method of [1] above, wherein both intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity are enhanced.

[3] ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）のうちのいずれかである乳酸菌。 [3] Among Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), and Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (Accession number NITE BP-243) Lactic acid bacteria that are either.

[4] 上記[3]の乳酸菌を少なくとも1つ含有する乳糖不耐症改善剤。 [4] A lactose intolerance improving agent comprising at least one lactic acid bacterium according to [3] above.

この乳糖不耐症改善剤としては、ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）の3つの乳酸菌を少なくとも含有するものがより好適である。   The lactose intolerance-improving agents include Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), and Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (Accession number) NITE BP-243) containing at least three lactic acid bacteria is more preferable.

[5] 上記[3]の乳酸菌を少なくとも1つ含有する飲食品。 [5] A food or drink containing at least one lactic acid bacterium of [3] above.

この飲食品としては、ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）の3つの乳酸菌を少なくとも含有するものがより好適である。   These foods and drinks include Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), and Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (Accession number NITE BP-243). The one containing at least three lactic acid bacteria is more preferable.

この飲食品としては、乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機能食品、サプリメント、発酵乳、または乳酸菌飲料が好ましい。   As the food or drink, infant food, infant food, nursing food, elderly food, sick food, health functional food, supplement, fermented milk, or lactic acid bacteria beverage is preferable.

この飲食品は、とりわけ、乳糖不耐症改善用の飲食品として好適である。   This food and drink is particularly suitable as a food and drink for improving lactose intolerance.

本発明のスクリーニング方法によれば、乳糖不耐症の改善に役立つ乳酸菌株を効率良く選抜することができる。また本発明の乳酸菌株を用いれば、乳糖不耐症の改善に有用な薬剤や様々な飲食品を製造することができる。   According to the screening method of the present invention, lactic acid strains useful for improving lactose intolerance can be efficiently selected. Moreover, if the lactic acid strain of this invention is used, the chemical | medical agent useful for improvement of lactose intolerance and various food-drinks can be manufactured.

本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願第2006-175897号の開示内容を包含する。   This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2006-175897, which is the basis of the priority claim of the present application.

図１は、腸管付着性が高い代表的な菌株についてのP-β-gal活性試験の結果を示す。FIG. 1 shows the results of a P-β-gal activity test for a representative strain having high intestinal adhesion. 図２は、腸管付着性が高い代表的な菌株についてのP-β-glc活性試験の結果を示す。FIG. 2 shows the results of a P-β-glc activity test for a representative strain having high intestinal adhesion. 図３は、腸管付着性が高い代表的な菌株についてのβ-gal活性試験の結果を示す。FIG. 3 shows the results of a β-gal activity test for a representative strain having high intestinal adhesion.

以下、本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. 乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌のスクリーニング方法
本発明は、ラクトバチルス属乳酸菌から、腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された菌を選抜することにより、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌をスクリーニングする方法に関する。 1. Screening method for lactic acid bacteria having the ability to improve lactose intolerance The present invention selects lactobacilli into lactose intolerant by selecting bacteria having enhanced intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity from lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus. The present invention relates to a method for screening lactic acid bacteria having an improving ability.

本発明の方法においてスクリーニングに供する「ラクトバチルス属乳酸菌」とは、通常の分類学的手法に従ってラクトバチルス属（Lactobacillus）またはラクトバチルス属に属するいずれかの細菌種に分類される細菌を意味する。その分類学的手法は特に限定されず、既知のラクトバチルス属菌の分類に用いられてきた従来の形態学的分類法や生理・生化学的性状に基づく分類法を包含するが、例えば菌種未同定の細菌については、16S rDNA配列、特にそのV3領域の塩基配列を用いた相同性解析に基づく分子系統学的分類法を用いることが、分類を明確にする上でより好ましい。ラクトバチルス属乳酸菌に属する細菌種の具体例としては、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus、またはLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブレッキー（Lactobacillus delbrueckii、またはLactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法では、ラクトバチルス属乳酸菌として、腸管系乳酸菌が好ましく、とりわけラクトバチルス・ガセリおよびラクトバチルス・ムコサエが好ましい。本方法においてスクリーニングに供する「ラクトバチルス属乳酸菌」は、複数種のラクトバチルス属乳酸菌細胞を含む細胞集団または細胞混合物であってもよいし、ラクトバチルス属乳酸菌の個別の菌株の集合であってもよい。   The term “Lactobacillus lactic acid bacteria” used for screening in the method of the present invention means bacteria classified into any bacterial species belonging to the genus Lactobacillus or Lactobacillus according to a normal taxonomic technique. The taxonomic method is not particularly limited, and includes conventional morphological classification methods and classification methods based on physiological and biochemical properties that have been used for classification of known Lactobacillus species. For unidentified bacteria, it is more preferable to use a molecular phylogenetic classification method based on homology analysis using a 16S rDNA sequence, in particular, a base sequence of the V3 region, in order to clarify the classification. Specific examples of bacterial species belonging to Lactobacillus lactic acid bacteria include Lactobacillus bulgaricus (Lactobacillus bulgaricus or Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus), Lactobacillus delbrueckii (Lactobacillus delbrueckii, or Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii),・ Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus buchneri Lactobacillus fermentum), Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus Luz John Sony (Lactobacillus johnsonii), Lactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius), Lactobacillus gasseri (Lactobacillus gasseri), Lactobacillus Mukosae (Lactobacillus mucosae) but the like, but is not limited thereto. In the method of the present invention, enteric lactic acid bacteria are preferable as the Lactobacillus lactic acid bacteria, and Lactobacillus gasseri and Lactobacillus mucosae are particularly preferable. The “Lactobacillus lactic acid bacteria” to be subjected to screening in this method may be a cell population or a cell mixture containing multiple types of Lactobacillus lactic acid bacteria cells, or may be a collection of individual strains of Lactobacillus lactic acid bacteria. Good.

本発明では、以上のようなラクトバチルス属乳酸菌について、腸管付着性およびラクトース分解酵素活性を測定し、それらが共に増強されている菌を選抜する。   In the present invention, intestinal adherence and lactose-degrading enzyme activity are measured for the lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus as described above, and the bacteria in which both are enhanced are selected.

ここで「腸管付着性」とは、被験体の腸上皮細胞表面への乳酸菌の結合能を言う。本発明に係る乳酸菌の腸管付着性の測定には、典型的には、ヒトＡ型腸管ムチン、ヒトＢ型腸管ムチン、およびヒトＯ型腸管ムチンのうち少なくとも１つの腸管ムチンに対する乳酸菌の結合能を測定し、得られた測定値を、腸管付着性を示す値として用いることができる。腸管ムチンに対する乳酸菌の結合能の測定は、例えば特許文献１および国際出願WO2006/067940に記載の表面プラズモン共鳴解析を利用した方法によって行うことができる。表面プラズモン共鳴解析を用いる場合には、腸管ムチンに対する乳酸菌の結合能を示すRU値が100 RU以上である菌を、腸管付着性が増強された菌として選抜乳酸菌株の候補とすることが好ましい。   Here, “intestinal adherence” refers to the ability of lactic acid bacteria to bind to the intestinal epithelial cell surface of a subject. In the measurement of intestinal adherence of lactic acid bacteria according to the present invention, typically, the binding ability of lactic acid bacteria to at least one intestinal mucin of human type A intestinal mucin, human type B intestinal mucin, and human type O intestinal mucin is measured. The measured value obtained by measurement can be used as a value indicating intestinal adhesion. The binding ability of lactic acid bacteria to intestinal mucin can be measured by a method using surface plasmon resonance analysis described in, for example, Patent Document 1 and International Application WO2006 / 067940. When using surface plasmon resonance analysis, it is preferable to select a bacterium having an RU value of 100 RU or more indicating the ability of lactic acid bacteria to bind to intestinal mucin as a lactic acid strain candidate selected as a bacterium having enhanced intestinal adhesion.

この腸管ムチンへの結合能のアッセイ系を、以下にさらに具体的に説明する。まず、血液型別のヒト腸管ムチンを調製するため、各血液型（Ａ型、Ｂ型、およびＯ型）のヒト腸管から表層部分を採取し、塩酸グアニジン等の可溶化剤を用いてゲルろ過を行い、タンパク質吸収（280nmの吸光度）と中性糖含量が高いことを目安にして目的の画分を採取し、精製する。このゲルろ過精製の詳細については、例えば、Purushothaman S. S. et al, "Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin." Curr. Miorobiol., 42(6), p.381-387 (2001)に記載されたヒト大腸ムチンの精製方法を参考にすることができる。精製後、抗血液型抗原抗体を用いて、調製したヒト腸管ムチンに血液型抗原が発現していることを確認することが、より好ましい。具体例として、実施例に記載の方法を挙げることができる。血液型抗原としては、市販の糖鎖プローブ（例えば、生化学工業製）あるいはネオグリコプロテイン・Blood Group A Trisaccaride-BSA（例えば、Calbiochem社)やネオグリコプロテイン・B1ood Groop B Trisaccaride-BSA（例えば、Calbiochem社）などを用いることができ、それを抗原として、当業者に公知の各種抗体作製法により抗血液型抗原抗体を作製することができる。   This assay system for the ability to bind to intestinal mucin will be described in more detail below. First, in order to prepare human intestinal mucin for each blood type, surface layer portions were collected from the human intestinal tract of each blood type (A type, B type, and O type), and gel filtration was performed using a solubilizing agent such as guanidine hydrochloride. The target fraction is collected and purified with reference to high protein absorption (absorbance at 280 nm) and high neutral sugar content. Details of this gel filtration purification are described, for example, in Purushothaman SS et al, "Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin." Curr. Miorobiol., 42 (6), p.381-387 (2001). A method for purifying human colon mucin can be referred to. After purification, it is more preferable to confirm that the blood group antigen is expressed in the prepared human intestinal mucin using an anti-blood group antigen antibody. Specific examples include the methods described in the examples. Examples of blood group antigens include commercially available sugar chain probes (for example, manufactured by Seikagaku Corporation) or neoglycoprotein / Blood Group A Trisaccaride-BSA (for example, Calbiochem) or neoglycoprotein / B1ood Groop B Trisaccaride-BSA (for example, Calbiochem) can be used, and anti-blood group antigen antibodies can be prepared by using various antibody production methods known to those skilled in the art as antigens.

本発明のスクリーニング方法では、ヒトＡ型腸管ムチン、ヒトＢ型腸管ムチン、ヒトＯ型腸管ムチンのそれぞれのヒト腸管ムチンをプローブとして表面プラズモン共鳴スペクトル解析を行うことにより、それらヒト腸管ムチンに対する乳酸菌の結合能を測定することができる。表面プラズモン共鳴スペクトル解析には、バイオセンサー（生体分子間相互解析装置）であるBIACOREシステム（BIACORE社）、例えばBIACORE1000を用いることができる。   In the screening method of the present invention, surface plasmon resonance spectrum analysis is performed by using each human intestinal mucin of human type A intestinal mucin, human type B intestinal mucin, and human type O intestinal mucin as a probe. The binding ability can be measured. For the surface plasmon resonance spectrum analysis, a BIACORE system (BIACORE), for example, BIACORE1000, which is a biosensor (a biomolecule mutual analysis apparatus) can be used.

BIACOREシステムとは、表面プラズモン共鳴スペクトル（SPR）の原理に基づき、生体分子の相互作用（結合および解離）を、標識を用いることなく、リアルタイムでモニターする解析装置である。具体的には、リガンド（以降、プローブともいう）とアナライト間の分子間相互作用を測定する。本発明においては、アナライトとして乳酸菌を、リガンドとしてヒト大腸ムチン（A型、B型、O型）をそれぞれ用いた。表面プラズモン共鳴の原理については詳細な解説書が多数刊行されている。この装置で用いる原理を簡単に説明すれば、金膜上で物質を結合／解離させて、その結合／解離による金膜上の質量変化に伴う反射光の屈折率の変化を測定することにより、金膜上に結合した物質の量を算出するというものである。より具体的には、該装置では、センサーチップと呼ばれる金膜が貼られたガラス基板が、試料や試薬を流す流路の途中にその流れに曝露されるように設置されており、その流路に試料等を流しながら、センサーチップに760nmの偏光をプリズム等でくさび型に集光させ、金膜上で反射させて、その反射光の屈折率をモニターすると、金膜上の物質の結合量の変化に比例して、表面プラズモン共鳴スペクトルの角度の変化が示される。そこでBIACOREシステムでは、まずプローブを流路に流して予めセンサーチップの金膜上にプローブを固定化し、次いでプローブが結合していない部位をブロッキングした後、そのプローブとの結合／解離反応を調べるべき物質（アナライト）を流路に流しつつ、経時的に反射光の屈折率をモニターすることにより、その変化量から、プローブとアナライトとの結合量を算出することができる。このシステムでは、表面プラズモン共鳴スペクトルの角度0.1°の変化を1000レゾナンスユニット（RU）と定義し、レゾナンスユニットを単位とする値（RU値）に基づいて反射光の屈折率の変化を表す。ここで1レゾナンスユニット（RU）はセンサーチップ表面上での1pg／1mm2の質量変化に相当する。すなわち、センサーチップ上の金膜への物質の結合量は、物質の結合前（添加前）の時点と結合完了時点のRU値の差から算出できる。BIACOREシステムを用いれば、プローブ（本発明では各ヒト腸管ムチン）とアナライト（本発明では乳酸菌）との結合量をセンサーチップ1mm2当たりの質量変化(pg)、すなわちRU値として求めることができ、その結合量（RU値）がプローブへのアナライトの結合能に相当する。The BIACORE system is an analysis device that monitors the interaction (binding and dissociation) of biomolecules in real time based on the principle of surface plasmon resonance spectrum (SPR) without using a label. Specifically, an intermolecular interaction between a ligand (hereinafter also referred to as a probe) and an analyte is measured. In the present invention, lactic acid bacteria were used as the analyte, and human colon mucin (A type, B type, O type) was used as the ligand. Many detailed explanations have been published on the principle of surface plasmon resonance. Briefly explaining the principle used in this apparatus, a substance is bound / dissociated on a gold film, and a change in refractive index of reflected light due to a mass change on the gold film due to the bond / dissociation is measured. The amount of the substance bonded on the gold film is calculated. More specifically, in the apparatus, a glass substrate on which a gold film called a sensor chip is attached is installed so as to be exposed to the flow in the middle of a flow path for flowing a sample or a reagent. When a sample or the like is passed through the sensor chip, 760 nm polarized light is condensed into a wedge shape with a prism or the like, reflected on the gold film, and the refractive index of the reflected light is monitored. The change in the angle of the surface plasmon resonance spectrum is shown in proportion to the change in. Therefore, in the BIACORE system, the probe should first be flowed into the flow path, the probe should be immobilized on the gold film of the sensor chip in advance, and then the site where the probe is not bound should be blocked, and then the binding / dissociation reaction with the probe should be examined. By monitoring the refractive index of reflected light over time while allowing a substance (analyte) to flow through the flow path, the amount of binding between the probe and the analyte can be calculated from the amount of change. In this system, a change in the surface plasmon resonance spectrum at an angle of 0.1 ° is defined as 1000 resonance units (RU), and the change in the refractive index of reflected light is expressed based on a value (RU value) in units of resonance units. Here, one resonance unit (RU) corresponds to a mass change of 1 pg / 1 mm 2 on the sensor chip surface. That is, the amount of the substance bonded to the gold film on the sensor chip can be calculated from the difference between the RU value before the substance is bonded (before addition) and when the bonding is completed. Using the BIACORE system, the amount of binding between the probe (each human intestinal mucin in the present invention) and the analyte (lactic acid bacterium in the present invention) can be determined as the mass change per 1 mm 2 (pg), that is, the RU value. The amount of binding (RU value) corresponds to the ability of the analyte to bind to the probe.

なおBIACOREシステムで使用されうるセンサーチップには、該センサーチップに固定化する物質（プローブ）、固定化方法、使用目的などに応じていくつかの種類があり、例えば、最もスタンダードなCM5（ガラス面に金膜（典型的には50nm）が貼られ、その表面上にカルボキシルメチルデキストラン層（典型的には100nm）を備える。このカルボキシルメチルデキストラン層の持つカルボキシル基、およびリガンドの持つアミノ基、チオール基、アルデヒド基またはカルボキシル基を介してリガンド（プローブ）をセンサーチップに固定化する）以外にも、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPAなどがある。   There are several types of sensor chips that can be used in the BIACORE system, depending on the substance (probe) to be immobilized on the sensor chip, the immobilization method, the purpose of use, etc. For example, the most standard CM5 (glass surface A gold film (typically 50 nm) is applied to the surface, and a carboxymethyl dextran layer (typically 100 nm) is provided on the surface of the carboxymethyl dextran layer. In addition to immobilizing a ligand (probe) to a sensor chip via a group, an aldehyde group, or a carboxyl group, there are CM4, CM3, C1, SA, NTA, L1, and HPA.

本発明においてセンサーチップに腸管ムチンをプローブとして固定化するには、例えばBIACOREシステムのメーカー使用説明書に従って実施すればよい。固定化方法は、例えば、物理的吸着による方法または共有結合による吸着であってもよい。一例として、センサーチップとしてCM5（BIACORE社）を用いる場合には、まず、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を1:1で混合した混合試薬（EDC/NHS）を流路に流し、センサーチップ上のカルボキシルメチルデキストラン中のカルボキシル基を活性化させた後、固定化用酢酸バッファー（pH4.O）にヒト腸管ムチン溶液（A-HCM、B-HCM、O-HCMのそれぞれを別個に使用）を加えた混合溶液を調製してさらに流路に流し、アミン・カップリング反応により、ヒト腸管ムチンをセンサーチップ上のカルボキシル基に共有結合させる。さらにエタノールアミン塩酸塩-NaOH（pH8.5）を用い、プローブが結合していないセンサーチップ上のカルボキシル基部位をブロッキングして、腸管ムチン（HCM）固定化センサーチップとすることも好ましい。本発明において、センサーチップへのHCM固定化量は特に限定されないが、1000〜2000RUであるのが好ましい。   In the present invention, intestinal mucin may be immobilized on the sensor chip as a probe, for example, according to the manufacturer's instructions for the BIACORE system. The immobilization method may be, for example, a physical adsorption method or a covalent bond adsorption. As an example, when CM5 (BIACORE) is used as a sensor chip, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl-carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) are After flowing the mixed reagent (EDC / NHS) mixed in 1 through the flow path and activating the carboxyl group in the carboxymethyldextran on the sensor chip, the human intestinal mucin solution in the acetate buffer (pH 4.O) for immobilization (Use each of A-HCM, B-HCM, and O-HCM separately) and add it to the flow path. The amine coupling reaction converts human intestinal mucin to carboxyl on the sensor chip. In addition, ethanolamine hydrochloride-NaOH (pH 8.5) was used to block the carboxyl group site on the sensor chip to which the probe was not bound, and intestinal mucin (HC) M) It is also preferable to use an immobilized sensor chip In the present invention, the amount of HCM immobilized on the sensor chip is not particularly limited, but is preferably 1000 to 2000 RU.

次いで、乳酸菌菌体を含む試料（アナライト溶液）を流路に流し、各HCM固定化センサーチップ上のHCM（プローブ）と、アナライト溶液中の乳酸菌菌体（アナライト）との結合量を算出する。限定するものではないが、この解析に使用できるBIACORE1000の測定条件の一例を下記に示す。   Next, a sample containing lactic acid bacteria (analyte solution) is passed through the flow path, and the amount of binding between the HCM (probe) on each HCM-immobilized sensor chip and the lactic acid bacteria (analyte) in the analyte solution is determined. calculate. Although not limited, an example of the measurement conditions of BIACORE1000 that can be used for this analysis is shown below.

ランニング緩衝液：HBS-EPバッファー（pH7.4）
アナライト溶液（サンプル）の添加量：20μl
流速：3μl/分
反応温度：25℃
再生溶液：1Mグアニジン塩酸塩溶液 5μl
このような測定で得られた結合／解離曲線に基づき、アナライト結合後のRU値からアナライト結合前のRU値を差し引いたRU値を、アナライトである乳酸菌とプローブである各腸管ムチンとの1mm2当たりの結合量(pg)、すなわちその乳酸菌の腸管ムチンへの結合能を示す値として用いることができる。本発明では、乳酸菌の腸管ムチンへの結合能が、ヒトＡ型腸管ムチン、Ｂ型腸管ムチン、Ｏ型腸管ムチンのうち少なくとも1つに対して100 RU以上の値を示した場合、「腸管付着性が増強された」または「腸管付着性が高い」と判断することとする。Running buffer: HBS-EP buffer (pH 7.4)
Analyte solution (sample) added: 20 μl
Flow rate: 3μl / min Reaction temperature: 25 ° C
Regeneration solution: 1M guanidine hydrochloride solution 5μl
Based on the binding / dissociation curve obtained by such measurement, the RU value obtained by subtracting the RU value before the analyte binding from the RU value after the analyte binding is determined as the lactic acid bacteria as the analyte and each intestinal mucin as the probe. Can be used as a value indicating the binding amount (pg) per mm 2 , that is, the binding ability of lactic acid bacteria to intestinal mucin. In the present invention, when the ability of lactic acid bacteria to bind to intestinal mucin shows a value of 100 RU or more for at least one of human type A intestinal mucin, type B intestinal mucin, and type O intestinal mucin, Judgment is “enhanced sex” or “high intestinal adherence”.

なおRU値は、BIACOREシステムでの測定条件により変化しうる。本方法における温度条件は、例えば、20〜40℃、好ましくは、20〜30℃、より好ましくは23〜28℃である。また、本方法における好ましいアナライト溶液（サンプル）の濃度は0.1〜0.5mg/mL、本方法における好ましい流速は3〜10μl/分である。上記範囲であれば、上記諸条件を変化させてもRU値に変動はないため、腸管付着性が高いかどうかを「100 RU」を基準として判断できる。さらに、アナライト溶液の濃度等の諸条件を上記範囲外に変化させた場合でも、上記条件におけるRU値に換算した場合に100 RUと同等の結合能が示される場合には、その乳酸菌の腸管付着性は増強されている。さらに本発明のスクリーニング方法では、RU値が高い菌ほど腸管付着性が高く、すなわち通常の乳酸菌よりも腸管付着性が増強されていると言うことができる。本発明では、少なくとも1つのヒト腸管ムチンに対する結合能として100 RU以上、より好ましくは300 RU以上、特に好ましくは1000 RU以上のRU値を示す乳酸菌を、腸管付着性が増強された菌として選抜することが好ましい。   The RU value can change depending on the measurement conditions in the BIACORE system. The temperature conditions in this method are 20-40 degreeC, for example, Preferably, it is 20-30 degreeC, More preferably, it is 23-28 degreeC. Further, the concentration of the analyte solution (sample) preferred in this method is 0.1 to 0.5 mg / mL, and the preferred flow rate in this method is 3 to 10 μl / min. Within the above range, the RU value does not change even when the above conditions are changed, and therefore whether or not the intestinal tract adherence is high can be determined based on “100 RU”. Furthermore, even when various conditions such as the concentration of the analyte solution are changed outside the above range, when the binding ability equivalent to 100 RU is shown when converted to the RU value in the above conditions, the intestinal tract of the lactic acid bacteria Adhesion is enhanced. Furthermore, in the screening method of the present invention, it can be said that bacteria having a higher RU value have a higher intestinal adherence, that is, the intestinal adherence is enhanced as compared with normal lactic acid bacteria. In the present invention, a lactic acid bacterium having a RU value of 100 RU or more, more preferably 300 RU or more, particularly preferably 1000 RU or more as a binding ability to at least one human intestinal mucin is selected as a bacterium having enhanced intestinal adhesion. It is preferable.

さらに、本発明のスクリーニング方法では、上記ラクトバチルス属乳酸菌について、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）、フォスフォ-β-ガラクトシダーゼ（P-β-gal）、およびフォスフォ-β-グルコシダーゼ（P-β-glc）のうち少なくとも１つのラクトース分解酵素のラクターゼ活性（ラクトース分解酵素活性）の測定を行って、該活性が増強されている菌株を選抜する。   Furthermore, in the screening method of the present invention, β-galactosidase (β-gal), phospho-β-galactosidase (P-β-gal), and phospho-β-glucosidase (P-β-glc) are used for the above Lactobacillus lactic acid bacteria. ), The lactase activity (lactose-degrading enzyme activity) of at least one lactose-degrading enzyme is measured, and a strain having enhanced activity is selected.

具体的には、Fisher法に従って、凍結乾燥菌体を0.05Mリン酸緩衝液に懸濁し、それをトルエン-アセトン混液（1:9（v/v））を加えて激しく撹拌し、その懸濁液に、β-galのラクターゼ活性測定用であればo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPGal）を、P-β-galのラクターゼ活性測定用であればo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド-6-ホスフェート（ONPGal-6P）を、あるいはP-β-glcのラクターゼ活性測定用であればo-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド-6-ホスフェート（ONPGlc-6P）を添加したリン酸緩衝液を加えて、37℃で15分間反応させる。反応後、0.5M 炭酸ナトリウム溶液を加えて反応を停止させ、遠心分離（6,000×rpm、10分間、4℃）により菌体成分を除去し、上清の405nmにおける吸光度を、吸光光度計（例えばMultiskan MS-UV（Labsystems、Helsinki、Finland））を用いて測定する。1分間に遊離するo-ニトロフェノール（ONP）1μmolを1ユニットとして定義し、活性値に換算する。その活性値から、菌体1mg当たりの活性値および培養上清に含まれるタンパク質1mg当たりの活性値をそれぞれ算出する。   Specifically, according to the Fisher method, lyophilized cells are suspended in 0.05M phosphate buffer, and a toluene-acetone mixture (1: 9 (v / v)) is added and stirred vigorously. O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPGal) is used for measuring β-gal lactase activity, and o-nitrophenyl- is used for measuring P-β-gal lactase activity. β-D-galactopyranoside-6-phosphate (ONPGal-6P), or o-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside-6-phosphate (ONPGlc-) for measuring lactase activity of P-β-glc Add phosphate buffer with 6P) and react at 37 ° C for 15 minutes. After the reaction, 0.5M sodium carbonate solution is added to stop the reaction, the bacterial cell components are removed by centrifugation (6,000 × rpm, 10 minutes, 4 ° C.), and the absorbance of the supernatant at 405 nm is measured by an absorptiometer (for example, Measure using Multiskan MS-UV (Labsystems, Helsinki, Finland). 1 μmol of o-nitrophenol (ONP) released per minute is defined as 1 unit, and converted to activity value. From the activity value, an activity value per 1 mg of bacterial cells and an activity value per 1 mg of protein contained in the culture supernatant are calculated.

なおタンパク質の定量には、例えばBCA法に基づくMicro BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce、Rockford、Illinois、U.S.A）を用い、2時間反応後、540nmでの吸光度を吸光光度計（例えば、Multiskan MS-UV）を用いて測定することができる。検量線はウシ血清アルブミン（BSA）を用いて作成すればよい。その検量線に基づいて上清中に含まれるタンパク質の量を算出できる。   For protein quantification, for example, the Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, Illinois, USA) based on the BCA method is used. After reaction for 2 hours, the absorbance at 540 nm is measured with an absorptiometer (for example, Multiskan MS-UV ). A calibration curve may be prepared using bovine serum albumin (BSA). The amount of protein contained in the supernatant can be calculated based on the calibration curve.

以上のようにして算出した、β-gal、P-β-gal、およびP-β-glcのそれぞれについての菌体1mg当たりの活性値および培養上清に含まれるタンパク質1mg当たりの活性値から、該ラクターゼ活性が特に高い（通常の乳酸菌よりもラクトース分解酵素活性が増強されている）乳酸菌を選抜することができる。   From the activity value per mg of cells and the activity value per mg of protein contained in the culture supernatant for each of β-gal, P-β-gal, and P-β-glc calculated as described above, Lactic acid bacteria having particularly high lactase activity (in which lactose-degrading enzyme activity is enhanced as compared with normal lactic acid bacteria) can be selected.

限定するものではないが、例えばβ-galのラクターゼ活性（本発明ではβ-gal活性とも呼ぶ）が、培養上清中のタンパク質1mg当たり15ユニット以上、好ましくは100ユニット以上である菌株を選抜することが特に好ましい。またP-β-galのラクターゼ活性（本発明ではP-β-gal活性とも呼ぶ）については、培養上清中のタンパク質1mg当たり15ユニット以上、好ましくは45ユニット以上を示す菌株を選抜することが特に好ましい。さらにP-β-glcのラクターゼ活性（本発明ではP-β-glc活性とも呼ぶ）については、培養上清のタンパク質1mg当たり25ユニット以上、好ましくは50ユニット以上を示す菌株を選抜することが特に好ましい。   Although not limited, for example, a strain having a lactase activity of β-gal (also referred to as β-gal activity in the present invention) of 15 units or more, preferably 100 units or more per 1 mg of protein in the culture supernatant is selected. It is particularly preferred. For lactase activity of P-β-gal (also referred to as P-β-gal activity in the present invention), a strain showing 15 units or more, preferably 45 units or more per 1 mg of protein in the culture supernatant can be selected. Particularly preferred. Further, for lactase activity of P-β-glc (also referred to as P-β-glc activity in the present invention), it is particularly preferable to select a strain showing 25 units or more, preferably 50 units or more per mg of protein in the culture supernatant. preferable.

本発明の方法では、以上のようにして、上記ラクトバチルス属乳酸菌（より好ましくはラクトバチルス・ガセリ菌またはラクトバチルス・ムコサエ菌）について腸管付着性およびラクトース分解酵素活性をそれぞれ測定し、その結果、腸管付着性とラクトース分解酵素活性が共に増強された乳酸菌株を、効率良く選抜することができる。本発明は、そのようにして選抜された乳酸菌株にも関する。こうして得られたラクトバチルス属乳酸菌は、腸管内で良好に増殖し、定着し、ラクトース（乳糖）を非常に効率良く分解できる能力を保持するため、乳糖不耐症の改善に大変有用である。本発明において「乳糖不耐症の改善」とは、ラクトースを含む飲食品（乳製品など）を摂取する際に、乳糖不耐症の不快な消化器症状（腹痛、下痢、おなかのゴロゴロ感など）が現れる頻度を低減させるかもしくは発症を完全に阻止すること、または症状の重篤度を軽減することを意味する。また「乳糖不耐症の改善能」は、乳酸菌がそのようにして乳糖不耐症を改善することができる能力を言う。   In the method of the present invention, intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity were measured for the Lactobacillus genus lactic acid bacteria (more preferably Lactobacillus gasseri or Lactobacillus mucosae), as described above. Lactic acid strains with enhanced intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity can be selected efficiently. The present invention also relates to a lactic acid strain so selected. The Lactobacillus lactic acid bacterium thus obtained grows and settles well in the intestinal tract and retains the ability to decompose lactose (lactose) very efficiently, and is thus very useful for improving lactose intolerance. In the present invention, “improvement of lactose intolerance” refers to unpleasant digestive symptoms of lactose intolerance (abdominal pain, diarrhea, tummy feeling, etc.) ) Appears to be reduced or completely prevented, or the severity of symptoms is reduced. “Lactose intolerance improving ability” refers to the ability of lactic acid bacteria to improve lactose intolerance in this way.

本発明では、このようなスクリーニング方法を用いることにより、腸管付着性とラクトース分解酵素活性が共に顕著に増強された3菌株のラクトバチルス属乳酸菌を、実際に取得することができた。それら3つの乳酸菌は、ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（以降、OLL2836株ともいう）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（以降、OLL2948株ともいう）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（以降、OLL2848株ともいう）である。これらの乳酸菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託された。これらの寄託に関する情報は、以下の通りである。   In the present invention, by using such a screening method, three strains of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus in which both intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity were remarkably enhanced could be actually obtained. These three lactic acid bacteria are Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (hereinafter also referred to as OLL2836 strain), Lactobacillus gasseri OLL2948 strain (hereinafter also referred to as OLL2948 strain), and Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (hereinafter also referred to as OLL2848 strain). ). These lactic acid bacterial strains were deposited with the Patent Microorganism Depositary Center for Product Evaluation Technology. Information on these deposits is as follows.

（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）寄託機関の連絡先：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）寄託日（原寄託日）：平成18年（2006年）6月9日付
（４）受託番号および受領番号：
・ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）OLL2836株：
受託番号NITE BP-241（原寄託の受領番号NITE AP-241）
・ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）OLL2948株：
受託番号NITE BP-242（原寄託の受領番号NITE AP-242）、
・ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）OLL2848株：
受託番号NITE BP-243（原寄託の受領番号NITE AP-243）。(1) Name of depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center (2) Contact information of depositary institution: 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan
(3) Date of deposit (original deposit date): June 9, 2006 (4) Deposit number and receipt number:
-Lactobacillus gasseri OLL2836 strain:
Deposit number NITE BP-241 (Original deposit receipt number NITE AP-241)
・ Lactobacillus gasseri OLL2948 strain:
Deposit number NITE BP-242 (Original deposit receipt number NITE AP-242),
Lactobacillus mucosae OLL2848 strain:
Accession number NITE BP-243 (original deposit receipt number NITE AP-243).

寄託したこれらOLL2836株、OLL2948株、およびOLL2848株は、以下の表１に示す性質を有する。

Figure 2008001676
These deposited OLL2836 strain, OLL2948 strain, and OLL2848 strain have the properties shown in Table 1 below.
Figure 2008001676

表１中のLactobacilli MRS Broth（MRS培地；例えば、Difco, Ref. No.288160）は、これらの乳酸菌株の培養に好適に使用可能な培地である。MRS培地の典型的な組成を表２に示す。

Figure 2008001676
Lactobacilli MRS Broth (MRS medium; for example, Difco, Ref. No. 288160) in Table 1 is a medium that can be suitably used for culturing these lactic acid strains. A typical composition of the MRS medium is shown in Table 2.
Figure 2008001676

表１に示す3つの菌株は、乳糖不耐症の改善能が特に高いと考えられ、本発明において特に有利に使用することができる。   Three strains shown in Table 1 are considered to have particularly high ability to improve lactose intolerance, and can be used particularly advantageously in the present invention.

2. 本発明に係る乳酸菌を含有する乳糖不耐症改善剤
本発明に係る乳酸菌は、経口投与により、生存した状態で腸に届き、腸に定着し、強力なラクトース分解酵素活性を発揮することができ、その結果として乳糖不耐症を改善することができる。また本発明に係る乳酸菌を用いて製造される発酵物では、高いラクトース分解活性によりラクトース（乳糖）の分解率が向上している。 2. Lactose intolerance improving agent containing lactic acid bacterium according to the present invention The lactic acid bacterium according to the present invention reaches the intestine in a living state by oral administration, settles in the intestine, and exhibits a strong lactose-degrading enzyme activity. As a result, lactose intolerance can be improved. Moreover, in the fermented material manufactured using the lactic acid bacteria based on this invention, the decomposition rate of lactose (lactose) is improving with the high lactose decomposition activity.

従って本発明は、上記スクリーニング方法を用いて得られる、腸管付着性とラクトース分解酵素活性が共に顕著に増強されたラクトバチルス属乳酸菌（本発明に係る乳酸菌）を含有する、乳糖不耐症改善剤にも関する。この本発明の乳糖不耐症改善剤は、乳糖不耐症を示しているかまたはその疑いがある被験体に対して投与することにより、乳糖不耐症を改善する効果が得られ、すなわち、乳糖不耐症の不快な消化器症状（腹痛、下痢、おなかのゴロゴロ感など）が現れる頻度を低減させるかもしくは発症を完全に阻止し、または乳糖不耐症の症状の重篤度を軽減することができる。本発明の乳糖不耐症改善剤は、乳糖不耐症の発症予防効果も有する。   Accordingly, the present invention provides a lactose intolerance improving agent comprising a Lactobacillus lactic acid bacterium (lactic acid bacterium according to the present invention), which is obtained by using the above screening method and has both significantly enhanced intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity. Also related. This lactose intolerance improving agent of the present invention is effective for improving lactose intolerance by being administered to a subject exhibiting or suspected of lactose intolerance, that is, lactose. To reduce the frequency or completely prevent the occurrence of intolerable uncomfortable digestive symptoms (abdominal pain, diarrhea, tummy feeling, etc.), or reduce the severity of lactose intolerance symptoms Can do. The lactose intolerance improving agent of the present invention also has an effect of preventing the onset of lactose intolerance.

本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る乳酸菌を少なくとも1つ（1菌株以上）含有する。本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る乳酸菌として、ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）から選択される少なくとも1つを含有することが好ましい。特に好適な実施形態では、本発明の乳糖不耐症改善剤は、少なくとも、ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）の3つの乳酸菌をいずれも含有する。この3つの乳酸菌を組み合わせて含有する乳糖不耐症改善剤は、Ａ型、Ｂ型、Ｏ型のいずれの血液型抗原を有する腸管ムチンにも結合できるため、広範な被験体に対して有効である。   The lactose intolerance improving agent of the present invention contains at least one lactic acid bacterium according to the present invention (one or more strains). The lactose intolerance improving agent of the present invention comprises Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession No. NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession No. NITE BP-242), and lactobacillus according to the present invention. It preferably contains at least one selected from Bacillus mucosae OLL2848 strain (Accession No. NITE BP-243). In a particularly preferred embodiment, the lactose intolerance improving agent of the present invention comprises at least Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession No. NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession No. NITE BP-242), And Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (Accession No. NITE BP-243). A lactose intolerance improving agent containing a combination of these three lactic acid bacteria can bind to intestinal mucins having any blood group antigens of type A, B and O, and is effective for a wide range of subjects. is there.

本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る乳酸菌の精製菌体を含む組成物でもよいし、当該乳酸菌を用いて製造された発酵物、培養物、またはそれらの濃縮物を含む組成物でもよい。本発明の乳糖不耐症改善剤に含まれる本発明に係る乳酸菌は、生菌体であっても死菌体であってもよく、湿潤菌であっても乾燥菌であってもよい。しかし、より好ましい実施形態では、本発明の乳糖不耐症改善剤は、本発明に係る乳酸菌を生存状態で含有する組成物である。本発明の乳糖不耐症改善剤は、限定するものではないが、液体状、ゲル状、粉末状、顆粒状、固形状、カプセル状、またはタブレット状等の任意の形態であってよい。   The lactose intolerance improving agent of the present invention may be a composition containing purified lactic acid bacteria according to the present invention, or a composition containing a fermented product, a culture, or a concentrate thereof produced using the lactic acid bacterium. It can be a thing. The lactic acid bacteria according to the present invention contained in the lactose intolerance improving agent of the present invention may be live cells or dead cells, and may be wet or dry. However, in a more preferred embodiment, the lactose intolerance improving agent of the present invention is a composition containing the lactic acid bacteria according to the present invention in a living state. The lactose intolerance improving agent of the present invention is not limited, but may be in any form such as liquid, gel, powder, granule, solid, capsule or tablet.

本発明の乳糖不耐症改善剤は、適量を添加することにより、乳糖不耐症改善作用を飲食品や医薬組成物に付与することができる。本発明の乳糖不耐症改善剤は、有効成分としての本発明に係る乳酸菌またはその培養物、発酵物、もしくはそれらの濃縮物等に加えて、医薬製剤上許容される担体または添加物を含有していてもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、カルボキシメチルセルロース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。使用される添加物は、製剤の剤形に応じて適宜または組み合わせて選択される。   The lactose intolerance improving agent of the present invention can impart lactose intolerance improving action to foods and drinks and pharmaceutical compositions by adding an appropriate amount. The lactose intolerance improving agent of the present invention contains a pharmaceutically acceptable carrier or additive in addition to the lactic acid bacterium according to the present invention as an active ingredient or a culture, fermentation product or concentrate thereof. You may do it. Examples of such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, Gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, carboxymethylcellulose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, etc. Other examples include artificial cell structures such as liposomes. The additive used is selected appropriately or in combination depending on the dosage form of the preparation.

本発明の乳糖不耐症改善剤は、経口的または非経口的（例えば、胃内投与や腸内投与など）に投与することができるが、特に経口的に投与することが好ましい。経口的に投与される本発明の乳糖不耐症改善剤は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、ジェル剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の剤形であってよい。液体製剤として用いる場合には、本発明の乳糖不耐症改善剤を使用する際に再溶解させることを意図した乾燥物として供給してもよい。   The lactose intolerance improving agent of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intragastric administration, enteral administration, etc.), but is preferably administered orally. The lactose intolerance improving agent of the present invention administered orally is a solid preparation such as a tablet, granule, powder, pill, capsule or the like, a gel preparation, or a liquid preparation such as a liquid, suspension or syrup. Or the like. When used as a liquid preparation, when using the lactose intolerance improving agent of the present invention, it may be supplied as a dry product intended to be redissolved.

上記剤形のうち経口用固形製剤は、薬学上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有してもよい。また、経口用液体製剤は、薬学上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有してもよい。   Among the above dosage forms, the oral solid preparation may contain additives such as binders, excipients, lubricants, disintegrants, wetting agents and the like generally used in pharmacy. In addition, the oral liquid preparation may contain additives such as stabilizers, buffers, taste-masking agents, preservatives, fragrances, and coloring agents that are generally used in pharmacy.

本発明の乳糖不耐症改善剤の投与量は、投与対象の年齢および体重、投与経路、投与回数により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本発明の乳糖不耐症改善剤に含まれる本発明に係る乳酸菌の投与量は、1〜1000mg/kg/dayが適当である。本発明の乳糖不耐症改善剤は、単回投与でもよいが、6〜8時間の間隔で反復的に投与してもよい。   The dosage of the lactose intolerance improving agent of the present invention varies depending on the age and weight of the administration subject, the administration route, and the number of administrations, and can be widely changed at the discretion of those skilled in the art. For example, when administered orally, the dosage of the lactic acid bacterium according to the present invention contained in the lactose intolerance improving agent of the present invention is suitably 1 to 1000 mg / kg / day. The lactose intolerance improving agent of the present invention may be administered once, or may be repeatedly administered at intervals of 6 to 8 hours.

本発明の乳糖不耐症改善剤を投与する対象は、限定するものではないが、好ましくはヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物である。さらに、乳糖不耐症であるかその疑いがある乳幼児期、成人期、高齢期の哺乳動物も本発明の被験体として好ましく、また加齢もしくは病気などによりラクトース分解能が低下した哺乳動物や、乳糖不耐症の遺伝的素因または環境的素因を有する哺乳動物が、本発明の乳糖不耐症改善剤を投与する被験体としてより好ましい。本発明の乳糖不耐症改善剤は、副作用の心配が少ないことから、継続的に利用する上で非常に有用に用いることができる。   The subject to which the lactose intolerance improving agent of the present invention is administered is preferably, but not limited to, mammals including humans, domestic animals, pet animals, experimental (test) animals and the like. Furthermore, infants, adults, and elderly mammals with or suspected of lactose intolerance are also preferred as subjects of the present invention, and mammals with reduced lactose resolution due to aging or disease, and lactose Mammals having a genetic or environmental predisposition to intolerance are more preferred as subjects to which the lactose intolerance improving agent of the present invention is administered. The lactose intolerance improving agent of the present invention can be used very effectively for continuous use since it is less susceptible to side effects.

3. 本発明に係る乳酸菌を含有する飲食品
本発明は、上記スクリーニング方法を用いて得られる腸管付着性とラクトース分解酵素活性が共に顕著に増強されたラクトバチルス属乳酸菌を含有する、飲食品にも関する。本発明の飲食品は、限定するものではないが、特に乳糖不耐症改善用の飲食品であることが特に好適である。「乳糖不耐症改善用」とは、乳糖不耐症を示しているかまたはその疑いがある被験体を投与対象とし、乳糖不耐症の不快な消化器症状（腹痛、下痢、おなかのゴロゴロ感など）が現れる頻度を低減させるかもしくは発症を完全に阻止すること、または乳糖不耐症の症状の重篤度を軽減することを目的としていることを意味する。 3. Food / beverage products containing lactic acid bacteria according to the present invention The present invention provides a food / beverage product containing Lactobacillus lactic acid bacteria with significantly enhanced intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity obtained using the screening method described above. Also related. Although the food / beverage products of this invention are not limited, It is especially suitable that it is food / beverage products for lactose intolerance improvement. “Lactose intolerance amelioration” refers to subjects who have or suspected lactose intolerance, and unpleasant digestive symptoms of lactose intolerance (abdominal pain, diarrhea, tummy sensation) Is intended to reduce the frequency of occurrence or completely prevent onset, or to reduce the severity of lactose intolerance symptoms.

本発明において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品および機能性食品を包含する本発明に係る乳酸菌を含有する飲食品の種類は、特に限定されない。例えば本発明に係る乳酸菌を含む飲料として、発酵乳（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、お茶系飲料（緑茶、紅茶およびウーロン茶など）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどうなどの果汁や、トマト、ニンジンなどの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワインなど）、炭酸飲料および清涼飲料等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」(2003)（株式会社光琳）等を参考にすることができる。   In the present invention, the “food or drink” is not limited, but the type of food or drink containing the lactic acid bacteria according to the present invention including beverages, foods and functional foods is not particularly limited. For example, as beverages containing lactic acid bacteria according to the present invention, fermented milk (such as yogurt), lactic acid bacteria beverages, milk beverages (such as coffee milk and fruit milk), tea beverages (such as green tea, tea and oolong tea), fruit / vegetable beverages ( Examples thereof include beverages such as fruit juices such as oranges, apples and grapes, and beverages containing vegetable juices such as tomatoes and carrots, alcoholic beverages (beer, sparkling wine, wine, etc.), carbonated beverages and soft drinks. About the manufacturing method etc. of various drinks, the existing reference books, for example, "Latest soft drinks" (2003) (Kotsu Co., Ltd.) etc. can be referred.

本発明に係る乳酸菌を含有する食品は、特に限定されず、生鮮食品であってもよいし加工食品であってもよいが、特に好適な食品として、本発明に係る乳酸菌を生きたまま腸まで届けることが可能な発酵乳や乳酸菌飲料が挙げられる。本発明に係る乳酸菌を含有する食品は、ヨーグルトやチーズ等の乳製品・発酵乳の製造用のスターターであってもよい。   The food containing the lactic acid bacterium according to the present invention is not particularly limited, and may be a fresh food or a processed food, but as a particularly suitable food, the lactic acid bacterium according to the present invention can be left alive. Examples include fermented milk and lactic acid bacteria beverages that can be delivered. The food containing lactic acid bacteria according to the present invention may be a starter for producing dairy products and fermented milk such as yogurt and cheese.

また、本発明に係る乳酸菌を含有する飲食品として、機能性食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ[特定保健用食品]を含む）および栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセルおよび液剤などの各種剤形のもの）および美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。   Moreover, a functional food is especially preferable as food / beverage products containing the lactic acid bacteria based on this invention. The “functional food” of the present invention means a food having a certain functionality for a living body, and includes, for example, food for specified health use (including conditional tokuho [food for specified health use]) and nutritional function food. So-called health foods such as functional foods, special-purpose foods, dietary supplements, health supplements, supplements (for example, in various dosage forms such as tablets, coated tablets, dragees, capsules and liquids) and beauty foods (for example, diet foods) Includes all foods. The functional food of the present invention also includes a health food to which a health claim based on the food standards of Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) is applied.

本発明の機能性食品として好ましいより具体的な例には、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品等の特別用途食品がある。本発明に係る乳酸菌は、温和な働きで徐々に腸内環境を改善し、腸内でのラクトース分解能を向上させ、乳糖不耐症を改善し、その症状をも軽減することができるため、体力の弱い乳幼児の乳糖不耐症の治療のための乳幼児用調製粉乳または液体調製乳における使用（例えば、通常の乳幼児用調製乳の原料に添加すればよい）や、授乳婦用粉乳等の妊婦用または授乳婦用食品ならびに体力の低下した高齢者や病者の乳糖不耐症の治療のための高齢者用食品および病者用食品における使用は特に好適である。   More specific examples preferable as the functional food of the present invention include special-purpose foods such as foods for patients, milk powder for pregnant women and lactating women, infant formulas, and foods for elderly people. The lactic acid bacteria according to the present invention can gradually improve the intestinal environment with a mild action, improve the lactose resolution in the intestine, improve lactose intolerance, and reduce the symptoms, For infant formulas or liquid formulas for the treatment of lactose intolerance in weak infants (for example, it may be added to normal infant formulas), and for infants such as infant formula Or the use in the food for nursing women and the food for elderly people and the food for sick people for the treatment of lactose intolerance of elderly people and sick people who have weak physical strength is particularly suitable.

本発明の好適な機能性食品としては、さらに、先天的または後天的要因で乳糖不耐症を示す被験体のための乳幼児用サプリメント、妊産婦・授乳婦用サプリメント、高齢者用サプリメントおよび病者用サプリメントが挙げられる。   Suitable functional foods of the present invention further include supplements for infants, subjects for maternal and lactating women, supplements for the elderly, and for the sick for subjects who exhibit lactose intolerance due to innate or acquired factors. Supplements.

本発明に係る乳酸菌を含有する機能性食品の好ましい例として、保健機能食品が挙げられる。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられた。この制度の下、保健機能食品は、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型からなる。さらに、条件付きトクホ[特定保健用食品]等の新たな類型も含まれる。   Preferable examples of functional foods containing lactic acid bacteria according to the present invention include health functional foods. The health functional food system was established not only for normal foods but also for foods in the form of tablets, capsules, etc., based on trends in Japan and abroad and consistency with the conventional food system for specified health use. Under this system, functional health foods consist of two types: special health foods (individual permission type) and nutritional functional foods (standard type). In addition, new types such as conditional tokuho [food for specified health use] are included.

本発明の機能性食品は、本発明に係る乳酸菌を腸内に導入し定着させ、腸内のラクトース分解能を（好ましくは持続的に）向上させ、その結果として乳糖不耐症を改善する効果を有することが好ましい。本発明の機能性食品は、乳糖不耐症の改善以外の用途を第一目的とするものでもよい。本発明の機能性食品（好ましくは、特定保健用食品または条件付きトクホ[特定保健用食品]）は、腸内のラクトース分解能を向上させ、それにより乳糖不耐症またはその症状を改善する効果について、記載または表示したものであってよい。そのような記載または表示は、保健機能食品制度において定められた規定に基づいて表示承認されたものでありうる。例えば本発明の機能性食品においては、「おなかの調子を整えたい方に適する」「おなかの調子を良好に保つ」「腸内環境を整える」「牛乳に弱い方に適する」などの記載が考えられるが、これらに限定されない。   The functional food of the present invention introduces and establishes the lactic acid bacteria according to the present invention in the intestine, and improves (preferably continuously) lactose resolution in the intestine, and as a result, has the effect of improving lactose intolerance. It is preferable to have. The functional food of the present invention may be intended primarily for uses other than the improvement of lactose intolerance. The functional food of the present invention (preferably, food for specified health use or conditional tokuho [food for specified health use]) improves lactose intolerance in the intestine, thereby improving lactose intolerance or its symptoms , Described or displayed. Such description or labeling may be approved for labeling based on the provisions established in the health functional food system. For example, in the functional food of the present invention, descriptions such as “suitable for those who want to adjust the condition of tummy”, “keep the condition of stomach in good condition”, “condition the intestinal environment”, “suitable for those who are vulnerable to milk”, etc. However, it is not limited to these.

本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジェル剤などの製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、発酵乳、飲料、粉状茶葉、菓子など）であってもよい。   The functional food of the present invention may be in the form of solid preparations such as tablets, granules, powders, pills, capsules, liquid preparations such as liquids, suspensions and syrups, or preparations such as gels. Or the shape (for example, fermented milk, a drink, a powdered tea leaf, a confectionery, etc.) of normal food-drinks may be sufficient.

本発明に係る乳酸菌の飲食品への配合量は特に限定されず、場合に応じて様々であってよい。具体的な配合量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。しかし通常は、本発明に係る乳酸菌の総量が、0.001〜100重量％、特に0.1〜100重量％となるような配合量が適当である。   The compounding quantity to the food-drinks of the lactic acid bacteria based on this invention is not specifically limited, According to the case, it may be various. Specific blending amounts can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the type of food and drink, the desired taste and texture. However, usually, a blending amount such that the total amount of lactic acid bacteria according to the present invention is 0.001 to 100% by weight, particularly 0.1 to 100% by weight, is appropriate.

本発明に係る乳酸菌は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、飲食品に含有させればよい。例えば、本発明に係る乳酸菌を、飲食品の原料中に直接混合してもよい。本発明に係る乳酸菌は、飲食品に塗布、被覆、浸透または吹き付けてもよい。本発明に係る乳酸菌は、飲食品中に均一に分散させてもよいし、偏在させてもよい。本発明に係る乳酸菌を入れたカプセルなどを調剤してもよい。本発明に係る乳酸菌を、可食フィルムや食用コーティング剤などで包み込んでもよい。また本発明に係る乳酸菌に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。本発明に係る乳酸菌を含有させた飲食品はさらに加工してもよく、そのような加工品も本発明の範囲に包含される。さらに、本発明に係る乳酸菌を用いて製造した乳発酵物を含有する飲食品は、特に好ましい。いずれにせよ、本発明の飲食品は、限定するものではないが、本発明に係る乳酸菌を生きた状態で含有することがとりわけ好ましい。   The lactic acid bacteria according to the present invention may be contained in a food or drink by any appropriate method available to those skilled in the art. For example, you may mix the lactic acid bacteria based on this invention directly in the raw material of food-drinks. The lactic acid bacteria according to the present invention may be applied, coated, penetrated or sprayed on food and drink. The lactic acid bacteria according to the present invention may be uniformly dispersed in food or drink, or may be unevenly distributed. You may prepare the capsule etc. which put the lactic acid bacteria based on this invention. The lactic acid bacteria according to the present invention may be wrapped with an edible film or an edible coating agent. Moreover, after adding an appropriate excipient | filler etc. to the lactic acid bacteria based on this invention, you may shape | mold in the shape of a tablet. The food / beverage products containing the lactic acid bacteria according to the present invention may be further processed, and such processed products are also included in the scope of the present invention. Furthermore, the food / beverage products containing the fermented milk manufactured using the lactic acid bacteria based on this invention are especially preferable. In any case, the food or drink of the present invention is not limited, but it is particularly preferable to contain the lactic acid bacteria according to the present invention in a living state.

本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤（亜硝酸ナトリウム等）、着色料（クチナシ色素、赤１０２等）、香料（オレンジ香料等）、甘味料（ステビア、アステルパーム等）、保存料（酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロイチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（ＥＤＴＡ二ナトリウム、ビタミンＣ等）、ｐＨ調整剤（クエン酸等）、化学調味料（イノシン酸ナトリウム等）、増粘剤（キサンタンガム等）、膨張剤（炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸カルシウム）等、結着剤（ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤（カルシウム強化剤、ビタミンＡ等）等が挙げられる。さらに、オタネニンジンエキス、エゾウコギエキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添加してもよい。   In the production of the food and drink of the present invention, various additives that are conventionally used in food and drink may be used. Additives include, but are not limited to, color formers (sodium nitrite, etc.), coloring agents (garden pigment, red 102, etc.), perfumes (orange flavors, etc.), sweeteners (stevia, astel palm, etc.), storage (Sodium acetate, sorbic acid, etc.), emulsifier (sodium chondroitin sulfate, propylene glycol fatty acid ester, etc.), antioxidant (disodium EDTA, vitamin C, etc.), pH adjuster (citric acid, etc.), chemical seasoning (inosine) Sodium phosphate, etc.), thickeners (xanthan gum, etc.), swelling agents (calcium carbonate, etc.), antifoaming agents (calcium phosphate, etc.), binders (sodium polyphosphate, etc.), nutrient enhancers (calcium enhancer, vitamin A, etc.) ) And the like. Furthermore, functional materials such as ginseng extract, sorghum extract, eucalyptus extract, and Tochu tea extract may be further added.

本発明の飲食品は、本発明に係る乳酸菌を少なくとも1つ（1菌株以上）含有する。本発明の飲食品は、本発明に係る乳酸菌として、ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）から選択される少なくとも1つを含有することが好ましい。特に好適な実施形態では、本発明の飲食品は、少なくとも、ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）の3つの乳酸菌をいずれも含有する。この3つの乳酸菌を組み合わせて含有する飲食品は、Ａ型、Ｂ型、Ｏ型のいずれの血液型抗原を有する腸管ムチンにも結合できるため、広範な被験体に対して有効である。   The food or drink of the present invention contains at least one (one or more strains) of lactic acid bacteria according to the present invention. The lactic acid bacteria according to the present invention include Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession No. NITE BP-241), Lactobacillus gasseri OLL2948 strain (Accession No. NITE BP-242), and Lactobacillus mucosae OLL2848. It preferably contains at least one selected from the strain (Accession No. NITE BP-243). In a particularly preferred embodiment, the food or drink of the present invention comprises at least Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession No. NITE BP-241), Lactobacillus gasseri OLL2948 strain (Accession No. NITE BP-242), and Lactobacillus Contains all three lactic acid bacteria of Mucosae OLL2848 strain (Accession No. NITE BP-243). The food and drink containing these three lactic acid bacteria in combination can bind to intestinal mucins having any blood type antigens of type A, type B, and type O, and thus is effective for a wide range of subjects.

本発明の飲食品を摂取または投与する被験体は、限定するものではないが、好ましくは、ヒト、家畜（ブタ、ウマなど）、愛玩動物（イヌ、ネコなど）、実験（試験）動物（マウス、ラットなどの齧歯動物やウサギなど）を含む哺乳動物である。さらに、乳糖不耐症であるかその疑いがある乳幼児期、成人期、高齢期の哺乳動物も本発明の被験体として好ましく、また加齢もしくは病気などによりラクトース分解能が低下した哺乳動物や、乳糖不耐症の遺伝的素因または環境的素因を有する哺乳動物も、本発明の飲食品を摂取または投与する被験体として好ましい。   A subject who ingests or administers the food or drink of the present invention is not limited, but is preferably a human, a domestic animal (pig, horse, etc.), a pet animal (dog, cat, etc.), an experimental (test) animal (mouse). Mammals including rodents such as rats and rabbits). Furthermore, infants, adults, and elderly mammals with or suspected of lactose intolerance are also preferred as subjects of the present invention, and mammals with reduced lactose resolution due to aging or disease, and lactose Mammals having a genetic predisposition to intolerance or an environmental predisposition are also preferred as subjects to ingest or administer the food or drink of the present invention.

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.

[実施例１] 供試乳酸菌の培養および調製
以下で用いる供試乳酸菌としては、明治乳業株式会社から提供を受けたヒト由来乳酸菌株、米国American Type Culture Collection（ATCC）、理化学研究所微生物系統保存施設（JCM）、農林水産省畜産試験場（NIAI）、および英国National Collections of Food Bacteria（NCFB）より入手した乳酸菌株、ならびに本発明者らにより幼児糞便より変法LBSアガーを用いて分離した乳酸菌株の合計104株を使用した。これら供試乳酸菌には、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、およびラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）に属する様々な菌株の他、菌種未同定の株が含まれていた。なお、菌株名にOLLまたはMEPと記載された菌株は、明治乳業株式会社保有菌株を示す。[Example 1] Cultivation and Preparation of Test Lactic Acid Bacteria The test lactic acid bacteria used in the following are human-derived lactic acid strains provided by Meiji Dairies Co., Ltd., American Type Culture Collection (ATCC), RIKEN Microbial System Preservation Lactic acid strains obtained from the facility (JCM), the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Livestock Experiment Station (NIAI), and the National Collections of Food Bacteria (NCFB) in the United Kingdom, and the Lactic acid strains isolated from infant feces using modified LBS agar A total of 104 strains were used. These test lactic acid bacteria include Lactobacillus bulgaricus (Lactobacillus bulgaricus), Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gasseris (Lactobacillus gasseri) In addition to various strains belonging to crispatus, Lactobacillus johnsonii, and Lactobacillus mucosae, strains that have not been identified are included. In addition, the strain described as OLL or MEP in the strain name indicates a strain possessed by Meiji Dairies Co., Ltd.

各供試乳酸菌の菌体を、滅菌した10％（w/v）スキムミルク培地（雪印乳業株式会社、札幌）中に分散し、使用するまでディープフリーザー中で-80℃下に保存した。   The cells of each test lactic acid bacterium were dispersed in a sterilized 10% (w / v) skim milk medium (Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Sapporo) and stored at −80 ° C. in a deep freezer until use.

培養においては、各菌株は、MRS培地（Difco、Detroit, MI, USA）で3回、継代培養（37℃、24時間）した後、MRSL培地（2%グルコースをラクトースに置換したMRS培地）で2回継代培養（37℃、24時間）した。次いで、得られた菌体培養液を新たに調製したMRSL培地に1％接種し、その後37℃で18時間培養した。こうして調製した本培養液を遠心分離（6,000×g、20分間、４℃）して集菌した菌体を、0.05Mリン酸緩衝液（pH6.8）で洗浄後、蒸留水に懸濁し、その後凍結乾燥を行った。   In culture, each strain was subcultured three times in MRS medium (Difco, Detroit, MI, USA) (37 ° C, 24 hours), and then MRSL medium (MRS medium in which 2% glucose was replaced with lactose) And subcultured twice at 37 ° C. for 24 hours. Next, 1% of the obtained bacterial cell culture solution was inoculated into a newly prepared MRSL medium, and then cultured at 37 ° C. for 18 hours. The cells collected by centrifugation of the main culture thus prepared (6,000 × g, 20 minutes, 4 ° C.) were washed with 0.05M phosphate buffer (pH 6.8), suspended in distilled water, Thereafter, lyophilization was performed.

[実施例２] 腸管付着性株の選抜
上記の供試乳酸菌株の中から、本発明者らによって開発された腸管ムチンへの結合能を調べるアッセイ系を用いて、腸管付着性の高い（RU値が100以上）菌株を選抜した。使用したアッセイ系については国際出願WO2006/067940にも詳細に記載されている。[Example 2] Selection of intestinal adherence strains Among the above-mentioned test lactic acid strains, an assay system for examining the binding ability to intestinal mucin developed by the present inventors was used (RU). The strain was selected. The assay system used is also described in detail in international application WO2006 / 067940.

具体的には、ヒトＡ型腸管ムチン、ヒトＢ型腸管ムチン、ヒトＯ型腸管ムチンのそれぞれに対する乳酸菌の結合能を、バイオセンサーBIACORE1000（BIACORE社）を用いて表面プラズモン共鳴スペクトル解析を行うことにより、測定した。   Specifically, the surface plasmon resonance spectrum analysis of the binding ability of lactic acid bacteria to human A-type intestinal mucin, human B-type intestinal mucin, and human O-type intestinal mucin is performed using biosensor BIACORE1000 (BIACORE). ,It was measured.

１．アナライト溶液の調製
まず各菌株を、起菌後、MRS培地にて3回継代し、37℃で12時間培養した後、1.5ml容チューブに500μl分注した。この培養液を遠心分離（6,000rpm、4℃、10分）し、上清を除去して得た菌体をPBSバッファー（pH7.2）中で2回洗浄後、蒸留水に懸濁し、凍結乾燥した。本菌体をHBS-EPバッファー（0.01M HEPES（pH7.4）、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％ Surfactant P20）を用いて0.1mg/ml濃度に調製し、アナライト溶液とした。 1. Preparation of Analyte Solution First, each strain was inoculated, subcultured 3 times in MRS medium, cultured at 37 ° C. for 12 hours, and then dispensed in 500 μl into a 1.5 ml tube. This culture solution is centrifuged (6,000 rpm, 4 ° C, 10 minutes), and the cells obtained by removing the supernatant are washed twice in PBS buffer (pH 7.2), suspended in distilled water, and frozen. Dried. This bacterial cell was prepared to a concentration of 0.1 mg / ml using HBS-EP buffer (0.01 M HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) to prepare an analyte solution.

２．ヒト腸管ムチン（HCM）の調製およびHCM固定化センサーチップの作製
ヒト腸管ムチンの調製およびセンサーチップヘの固定化を行った。ヒトＡ型腸管（血液型Ａ型のヒト由来の大腸）、ヒトＢ型腸管（血液型Ｂ型のヒト由来の大腸）、およびヒトＯ型腸管（血液型Ｏ型のヒト由来の大腸）は、東北大学大学院医学系研究科より、標本採取試料として分譲を受けた。なお、この試料採取は、東北大学大学院医学系研究科の倫理委員会を経て実施し、また患者の同意を得て行われたものである。それら腸管の大腸正常部位から、粘液ムチン層を表層掻き取り法で採取した。粘液ムチン層は、Folch溶媒（クロロホルム-メタノール混液（2:1（v/v））；J. Folch et al., :J. Biol. Chem. (1957) 226, p.497-500）およびジエチルエーテルにより脱脂後乾燥させ、4M塩酸グアニジン溶液により37℃で2時間抽出した。次いで、この抽出物についてゲルろ過により精製を行った。ゲルろ過精製法は、Purushothaman S. S. et al, "Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin." Curr. Miorobiol., 42(6), p.381-387 (2001)に記載されたヒト大腸ムチンの精製方法に基づき実施した。移動層は4M塩酸グアニジン溶液、ゲルろ過クロマトグラフィー用のカラムはToyopearl HW-65F（90cm×2.6cm, Tosoh. Tokyo. Japan）を用いた。得られたカラム抽出液について、中性糖をフェノール硫酸法（反応後に490nmの吸光度を測定する）で、タンパク質を280nmの吸光度を測定し、その結果、タンパク質吸収（280nmの吸光度）があり、かつ中性糖含量の最も高いピークを選択し、さらにゲルろ過クロマトグラフィーにおける分子量約200万以上を目安として大腸ムチン画分を分取した。こうして得られた精製物を、由来するヒトの血液型に対応して、それぞれヒトＡ型腸管ムチン、ヒトＢ型腸管ムチン、ヒトＯ型腸管ムチンとした。以下、それらのヒト腸管ムチン（human colon mucin：HCM）のうち、Ａ型腸管ムチンをA-HCM、Ｂ型腸管ムチンをB-HCM、Ｏ型腸管ムチンをO-HCMと呼ぶことがある。得られた各HCMについては、それぞれの血液型のヒト血液型基質抗原性を抗原抗体反応により確認した。 2. Preparation of human intestinal mucin (HCM) and preparation of HCM-immobilized sensor chip Human intestinal mucin was prepared and immobilized on the sensor chip. Human type A intestine (blood type A human-derived large intestine), human type B intestinal tract (blood type B human-derived large intestine), and human type O intestine (blood type O human-derived large intestine) Received a lot of sample collection from Tohoku University Graduate School of Medicine. This sample collection was carried out through the ethics committee of the Graduate School of Medicine, Tohoku University, and with the consent of the patient. A mucus mucin layer was collected from the normal large intestine portion of the intestinal tract by a surface scraping method. The mucous mucin layer consists of Folch solvent (chloroform-methanol mixture (2: 1 (v / v)); J. Folch et al.,: J. Biol. Chem. (1957) 226, p.497-500) and diethyl It was degreased with ether, dried, and extracted with 4M guanidine hydrochloride solution at 37 ° C. for 2 hours. The extract was then purified by gel filtration. The gel filtration purification method is the purification of human colon mucin described in Purushothaman SS et al, "Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin." Curr. Miorobiol., 42 (6), p.381-387 (2001). Based on the method. 4M guanidine hydrochloride solution was used for the moving layer, and Toyopearl HW-65F (90 cm × 2.6 cm, Tosoh. Tokyo. Japan) was used for the column for gel filtration chromatography. About the obtained column extract, neutral sugar is measured by phenol sulfate method (absorbance at 490 nm after reaction), protein is measured at 280 nm, and as a result, protein absorption (absorbance at 280 nm) is present, and The peak with the highest neutral sugar content was selected, and the large intestine mucin fraction was fractionated using a molecular weight of about 2 million or more in gel filtration chromatography as a guide. The purified products thus obtained were designated as human A type intestinal mucin, human B type intestinal mucin, and human type O intestinal mucin, respectively, corresponding to the human blood group from which they were derived. Hereinafter, among these human colon mucins (HCM), the A-type intestinal mucin may be referred to as A-HCM, the B-type intestinal mucin as B-HCM, and the O-type intestinal mucin as O-HCM. About each obtained HCM, the human blood group substrate antigenicity of each blood type was confirmed by the antigen antibody reaction.

以上のようにして得られた各HCMのBIACORE用センサーチップヘの固定化は、バイオセンサーBIACORE1000（BIACORE社）において、アミンカップリング法により行った。まず、予めカルボキシメチルデキストラン基を導入したセンサーチップCM5（BIACORE社）に対して、75.0mg/mlのN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド塩酸塩（EDC）50μ1および11.5mg/mlのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）50μlを混合した混合試薬（EDC/NHS）を流し、カルボキシメチルデキストラン中のカルボキシル基を活性化させた。次いで、120μlの固定化用酢酸バッファー（10mM、pH4.O）に、上記で精製されたいずれかのHCM溶液（A-HCM、B-HCM、O-HCM）を30μl加えた混合溶液を調製して流し、アミン・カップリング反応によりHCMをセンサーチップ上のカルボキシル基に共有結合させた。さらに、1M エタノールアミン塩酸塩-NaOH（pH8.5）を用いて、プローブが結合していないセンサーチップ上の部位の残存活性基のブロッキングを行った。ランニングバッファーとしてはHBS-EPバッファーを用いた。EDC/NHS導入前とエタノールアミン溶液添加後のレポートポイントの差として示されるHCM固定化量は、1000〜2000 RUとした。こうして得られたHCM固定化センサーチップを、次に、上記アナライト溶液の試験に用いた。   The immobilization of each HCM obtained as described above on the BIACORE sensor chip was carried out by the amine coupling method in a biosensor BIACORE1000 (BIACORE). First, 75.0 mg / ml N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl-carbodiimide hydrochloride (EDC) 50 μ1 and 11.5 mg with respect to sensor chip CM5 (BIACORE) into which carboxymethyldextran group was previously introduced A mixed reagent (EDC / NHS) mixed with 50 μl of N-hydroxysuccinimide (NHS) per ml was activated to activate the carboxyl group in carboxymethyldextran, and then 120 μl of immobilizing acetate buffer (10 mM, pH 4 Prepare a mixed solution by adding 30 μl of any of the HCM solutions purified above (A-HCM, B-HCM, O-HCM) to .O), and flow HCM through the amine coupling reaction. Furthermore, 1M ethanolamine hydrochloride-NaOH (pH 8.5) was used to block the remaining active group at the site on the sensor chip where the probe was not bound. HBS-EP buffer was used as the buffer, and the HCM immobilization amount shown as the difference between the report points before EDC / NHS introduction and ethanolamine solution addition was 1000-2000 RU. The modified sensor chip was then used for testing the analyte solution.

３．表面プラズモン共鳴スペクトル解析
バイオセンサーBIACORE1000（BIACORE社）をさらに用いて、各HCM固定化センサーチップ上のHCMと、上記アナライト溶液中の乳酸菌菌体との結合量を解析した。この解析に使用したBIACORE1000の測定条件を下記に示す。 3. Surface plasmon resonance spectrum analysis Biosensor BIACORE1000 (BIACORE) was further used to analyze the amount of binding between HCM on each HCM-immobilized sensor chip and lactic acid bacteria in the analyte solution. The measurement conditions of BIACORE1000 used for this analysis are shown below.

ランニング緩衝液：HBS-EPバッファー（pH7.4）
アナライト溶液（サンプル）の添加量：20μl
流速：3μl/分
反応温度：25℃
再生溶液：1Mグアニジン塩酸塩溶液 5μl
BIOACOREシステムによる解析においては、アナライトとプローブとの結合量（相互作用）は、レゾナンスユニット（RU）を単位とした値で表される。1レゾナンスユニット（RU）とは、センサーチップの表面上1mm2当たりに物質1pgが結合したことを意味する。すなわち、この解析で得られた結合／解離曲線に基づき、結合後のRU値から結合前のRU値を差し引いた値が、アナライトである各乳酸菌とプローブである各腸管ムチンとの1mm2当たりの結合量に相当する。この結合量は、その乳酸菌と各腸管ムチンとの結合能に相当する。Running buffer: HBS-EP buffer (pH 7.4)
Analyte solution (sample) added: 20 μl
Flow rate: 3μl / min Reaction temperature: 25 ° C
Regeneration solution: 1M guanidine hydrochloride solution 5μl
In the analysis by the BIOACORE system, the binding amount (interaction) between the analyte and the probe is represented by a value in units of resonance units (RU). One resonance unit (RU) means that 1 pg of substance is bound per 1 mm 2 on the surface of the sensor chip. That is, based on the binding / dissociation curve obtained in this analysis, the value obtained by subtracting the RU value before binding from the RU value after binding is 1 mm 2 of each lactic acid bacterium as an analyte and each intestinal mucin as a probe. It corresponds to the amount of binding. This amount of binding corresponds to the binding ability between the lactic acid bacteria and each intestinal mucin.

この解析の結果、少なくとも1つの腸管ムチンに対する結合能として100 RU以上の値を示した菌株を、供試乳酸菌104株の中から選抜した。選抜された菌株では、腸管付着性が他の平均的な乳酸菌株よりも増強されている（腸管付着性が高い）と言える。選抜された菌株の代表例およびその解析結果を、図１〜３に示す。   As a result of this analysis, a strain showing a value of 100 RU or more as a binding ability to at least one intestinal mucin was selected from 104 test lactic acid bacteria. In the selected strain, it can be said that the intestinal adherence is enhanced (higher intestinal adherence) than other average lactic acid strains. Representative examples of the selected strains and analysis results thereof are shown in FIGS.

[実施例３] P-β-glc活性の測定に用いるONPGlc-6Pの合成および精製
以下では、腸管付着性が高く、かつ高いラクトース分解酵素活性をも有する菌株をさらに選抜することを試みた。そこで本実施例では、まず、その活性測定に用いるONPGlc-6Pの調製を行った。[Example 3] Synthesis and purification of ONPGlc-6P used for measurement of P-β-glc activity In the following, an attempt was made to further select strains having high intestinal adhesion and high lactose-degrading enzyme activity. Therefore, in this example, first, ONPGlc-6P used for the activity measurement was prepared.

１．ONPGlc-6Pの化学合成
フォスフォ-β-グルコシダーゼ（P-β-glc）活性の測定に用いるo-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド-6-ホスフェート（o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside 6-phosphate；ONPGlc-6P）は、HengstenbergとMorseの合成方法（Hengstenberg, W. and M.L.Morse、Synthesis of o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside 6-phosphate, Carbohydr. Res、10、 pp.463-465 (1969））の改良法に従って化学合成した。具体的には、まず、o-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（ONPGlc、Sigma、St. Louis、USA）の0.9gを、予め氷上で冷却してから混合した54μl蒸留水と840μlのオキシ塩化リンを含むリン酸トリメチル7.5mlに溶解した。次いで本混合液を氷上で5時間撹拌しながら反応させた。反応後、氷片（蒸留水）を加え、濃アンモニア水を滴下しながらpHメーターを用いて溶液を中和（pH7.0）し、反応を停止させた。 1. Chemical synthesis of ONPGlc-6P o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside 6-phosphate used to measure phospho-β-glucosidase (P-β-glc) activity ONPGlc-6P) is a synthesis method of Hengstenberg and Morse (Hengstenberg, W. and MLMorse, Synthesis of o-Nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside 6-phosphate, Carbohydr. Res, 10, pp.463-465 (1969) ) Was chemically synthesized according to the improved method. Specifically, first, 0.9 g of o-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (ONPGlc, Sigma, St. Louis, USA) was previously cooled on ice and then mixed with 54 μl distilled water and 840 μl oxychloride. Dissolved in 7.5 ml of trimethyl phosphate containing phosphorus. The mixture was then allowed to react on ice for 5 hours with stirring. After the reaction, ice pieces (distilled water) were added, and the solution was neutralized (pH 7.0) using a pH meter while adding concentrated aqueous ammonia dropwise to stop the reaction.

２．ONPGlc-6Pの精製
上記で反応を停止させた溶液について、ロータリーエバポレーター（東京理科機械、東京）を用いて40℃での濃縮乾固を繰り返すことにより、反応で生じたo-ニトロフェニル（ONP）を除去した。次いで、濃縮した反応液を活性炭（50g）と混合し、4℃下で2時間静置することにより、化学合成されたONPGlc-6Pおよび未反応のONPGlcを活性炭に吸着させた後、それを20倍量の蒸留水（２L）で洗浄し、脱塩を行った。活性炭に吸着したONPGlc-6Pの溶出は、ピリジン：水：エタノール混液（１：１：１（v/v）、600ml）を用いて行った。溶出液は40℃下でのロータリーエバポレーターで濃縮を繰り返し、ピリジンの除去を行った。続いて、調製ペーパークロマトグラフィー（PPC）に供した。すなわち、PPC用濾紙（Whatman、3MM、46×57cm、Maidstone、England）上に、100μlマイクロピペットを用いて上記の粗精製ONPGlc-6Pを直線状に塗布し、展開溶媒としてブタノール：ピリジン：水（6:4:3（v/v/v)）を用いて上昇法で単展開させた。2日間を要する展開終了後、ドラフトチャンバー内でその濾紙を乾燥させてから、UVトランスイルミネーター（302nm、フナコシ、東京）を用いてONPGlc-6PおよびONPGlcのバンドを確認し、ONPGlc-6Pのバンドのみを切り出した。切り出した濾紙を蒸留水に浸し、一晩、4℃で撹拌することで、ONPGlc-6Pの抽出を行った。抽出後、濾紙を除去し、水層をロータリーエバポレーターで濃縮した後、混在している反応副産物を、蒸留水を移動相とするTOYOPEARL HW40Sカラム（2.6φ×90cm、東ソー、東京）を用いたゲルろ過により除去した。ゲルろ過後、各溶出画分を薄層クロマトグラフィー（TLC、Silicagel 60、10×10cm、Merck、Darmstadt、Germany）を用いてONPGlc-6P画分を回収した。TLCの展開溶媒には、ブタノール：2−プロパノール：水（3：12：4（v/v/v））を用いて単展開した。風乾後、5％（v/v）硫酸-メタノール溶液を薄層板に均等に噴霧し、150℃に加温した乾燥器（Yamato、東京）内で3分間加熱して検出した。回収したONPGlc-6P画分の凍結乾燥を行い、精製ONPGlc-6Pとした。この精製品については、TLCにより純度を確認し、1H-NMRにより構造の確認を行った。 2. Purification of ONPGlc-6P Using the rotary evaporator (Tokyo Science Machine, Tokyo) for the solution whose reaction was stopped as described above, repeated drying and concentrating at 40 ° C resulted in o-nitrophenyl (ONP) produced in the reaction. Was removed. Next, the concentrated reaction solution was mixed with activated carbon (50 g) and allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours to adsorb chemically synthesized ONPGlc-6P and unreacted ONPGlc to activated carbon, Washing with double volume of distilled water (2 L) was performed for desalting. The elution of ONPGlc-6P adsorbed on activated carbon was performed using a pyridine: water: ethanol mixture (1: 1: 1 (v / v), 600 ml). The eluate was repeatedly concentrated on a rotary evaporator at 40 ° C. to remove pyridine. Subsequently, it was subjected to preparative paper chromatography (PPC). That is, on the filter paper for PPC (Whatman, 3MM, 46 × 57 cm, Maidstone, England), 100 μl micropipette was used to apply the above roughly purified ONPGlc-6P in a straight line, butanol: pyridine: water (as developing solvent) 6: 4: 3 (v / v / v)). After the development that takes 2 days is completed, the filter paper is dried in a draft chamber, and then the ONPGlc-6P and ONPGlc bands are confirmed using a UV transilluminator (302 nm, Funakoshi, Tokyo). Only cut out. The cut out filter paper was immersed in distilled water and stirred overnight at 4 ° C. to extract ONPGlc-6P. After extraction, the filter paper is removed, the aqueous layer is concentrated on a rotary evaporator, and the mixed reaction by-products are gels using a TOYOPEARL HW40S column (2.6φ × 90cm, Tosoh, Tokyo) with distilled water as the mobile phase. Removed by filtration. After gel filtration, the ONPGlc-6P fraction was recovered from each elution fraction using thin layer chromatography (TLC, Silicagel 60, 10 × 10 cm, Merck, Darmstadt, Germany). As a developing solvent for TLC, butanol: 2-propanol: water (3: 12: 4 (v / v / v)) was used for simple development. After air-drying, a 5% (v / v) sulfuric acid-methanol solution was sprayed evenly onto a thin layer plate and detected by heating for 3 minutes in a dryer (Yamato, Tokyo) heated to 150 ° C. The collected ONPGlc-6P fraction was freeze-dried to obtain purified ONPGlc-6P. The purity of this purified product was confirmed by TLC, and the structure was confirmed by 1 H-NMR.

[実施例４] β-gal、P-β-galおよびP-β-glc活性の測定
実施例１で調製した供試乳酸菌104株について、Fisher法を用いて、β-gal、P-β-galおよびP-β-glcのラクターゼ活性の測定を行った。すなわち、各菌株について、凍結乾燥菌体0.5mgを0.05Mリン酸緩衝液（pH6.8）1.0mlに懸濁し、トルエン-アセトン混液（1:9（v/v））50μlを加えて３分間激しく撹拌した。この懸濁液25μlに、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPGal）、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド-6-ホスフェート（ONPGal-6P）または上記で調製したo-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド-6-ホスフェート（ONPGlc-6P）を含む0.05Mリン酸緩衝液（pH6.8）100μlを加えて、37℃で15分間反応させた。反応後、0.5M 炭酸ナトリウム溶液125μlを加えて反応を停止させ、遠心分離（6,000×rpm、10分間、4℃）により菌体成分を除去し、上清の405nmにおける吸光度をMultiskan MS-UV（Labsystems、Helsinki、Finland）を用いて測定した。1分間に遊離するo-ニトロフェノール（ONP）1μmolを1ユニットとして定義し、該ユニットを単位として、菌体1mg当たりの活性値および培養上清に含まれるタンパク質1mg当たりの活性値をそれぞれ算出した。[Example 4] Measurement of β-gal, P-β-gal and P-β-glc activities The 104 strains of lactic acid bacteria prepared in Example 1 were subjected to β-gal, P-β- The lactase activity of gal and P-β-glc was measured. That is, for each strain, 0.5 mg of freeze-dried cells were suspended in 1.0 ml of 0.05M phosphate buffer (pH 6.8), and 50 μl of a toluene-acetone mixture (1: 9 (v / v)) was added for 3 minutes. Stir vigorously. To 25 μl of this suspension, o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPGal), o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside-6-phosphate (ONPGal-6P) or prepared above 100 μl of 0.05M phosphate buffer (pH 6.8) containing o-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside-6-phosphate (ONPGlc-6P) was added and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. After the reaction, 125 μl of 0.5 M sodium carbonate solution was added to stop the reaction, the bacterial cell components were removed by centrifugation (6,000 × rpm, 10 minutes, 4 ° C.), and the absorbance of the supernatant at 405 nm was measured using Multiskan MS-UV ( Labsystems, Helsinki, Finland). 1 μmol of o-nitrophenol (ONP) released per minute was defined as one unit, and the activity value per mg of cells and the activity value per mg of protein contained in the culture supernatant were calculated using the unit as a unit. .

なお、タンパク質の定量には、BCA法に基づくMicro BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce、Rockford、Illinois、U.S.A）を用い、2時間反応後、540nmでの吸光度をMultiskan MS-UVを用いて測定した。検量線はウシ血清アルブミン（BSA）を用いて作成し、そこからタンパク質の量を算出した。図１〜３には、実施例２で選抜された菌株の代表例についてのラクターゼ活性測定の結果を示している。   For protein quantification, Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, Illinois, U.S.A) based on the BCA method was used, and after 2 hours of reaction, the absorbance at 540 nm was measured using Multiskan MS-UV. A calibration curve was prepared using bovine serum albumin (BSA), and the amount of protein was calculated therefrom. 1 to 3 show the results of lactase activity measurement for representative examples of strains selected in Example 2.

[実施例５] 乳酸菌株の選抜
上記実施例において示された腸管付着性およびβ-gal、P-β-galおよびP-β-glc活性の測定結果に基づき、腸管付着性が高く、かつラクターゼ活性も高い乳酸菌株の選抜を行った。その結果、腸管付着性が高く、かつβ-gal、P-β-galおよびP-β-glcのうちいずれかのラクターゼ活性について顕著に高い活性を示す菌株として3つの乳酸菌株（OLL2836株、OLL2948株、およびOLL2848株）が選抜された（図１〜３）。一方で、ラクターゼ活性が比較的高い乳酸菌株の多くは、腸管付着性が低い（Ａ型、Ｂ型、Ｏ型のいずれのヒト腸管ムチンに対してもRU値が100 RU未満）ために排除される結果となった。[Example 5] Selection of lactic acid strain Based on the results of measurement of intestinal adherence and β-gal, P-β-gal and P-β-glc activities shown in the above examples, intestinal adherence is high, and lactase A lactic acid strain having high activity was selected. As a result, three lactic acid strains (OLL2836 strain, OLL2948) have high intestinal adherence and show significantly high activity for any of the lactase activities of β-gal, P-β-gal and P-β-glc. Strain and OLL2848 strain) were selected (FIGS. 1-3). On the other hand, many of the lactic acid strains with relatively high lactase activity are excluded because of their low intestinal adherence (RU value of less than 100 RU for any human intestinal mucin of type A, B, or O). It became the result.

図１〜３に示す通り、OLL2836株は46.576 ユニット/mgタンパク質のP-β-gal活性を示し、OLL2948株は50.194 ユニット/mgタンパク質のP-β-glc活性を示し、OLL2848株は107.090 ユニット/mgタンパク質のβ-gal活性を示したが、これらの活性値は、腸管付着性が高い他の乳酸菌株と比較してもそれぞれかなり高い値であった。しかもこれらの菌株は、腸管付着性を示すRU値についても、かなり高い値を示した。具体的には、OLL2836株はヒトＢ型腸管ムチンおよびヒトＯ型腸管ムチンに対してとりわけ強い結合能を示し、OLL2948株およびOLL2848株はヒトＡ型腸管ムチンに対して特に強い結合能を示した。   1-3, OLL2836 strain showed 46.576 units / mg protein P-β-gal activity, OLL2948 strain showed 50.194 units / mg protein P-β-glc activity, OLL2848 strain 107.090 units / mg. The β-gal activity of mg protein was shown, but these activity values were considerably higher than those of other lactic acid strains having high intestinal adhesion. In addition, these strains also showed a considerably high RU value indicating intestinal adhesion. Specifically, OLL2836 strain showed particularly strong binding ability to human B-type intestinal mucin and human O-type intestinal mucin, and OLL2948 and OLL2848 strains showed particularly strong binding ability to human type A intestinal mucin. .

以上の結果から、これらの乳酸菌株について、それぞれ単独で、腸管内に定着して持続的にラクトースを分解する効果が期待できることに加え、当該3菌株を組み合わせて用いることにより、いずれの血液型の被験体においても高いラクトース分解効果を得られるであろうことが示された。   From the above results, for each of these lactic acid strains, in addition to being able to expect the effect of colonizing in the intestinal tract and continuously degrading lactose, any blood group can be used by combining the three strains. It was shown that a high lactose degradation effect could also be obtained in the subject.

OLL2836株、OLL2948株およびOLL2848株については、さらに菌種同定試験を行い、OLL2836株およびOLL2948株がラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、OLL2848株がラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）に属する菌として、それぞれ同定した（後述の実施例を参照）。この3つの乳酸菌株については、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２００６年６月９日（原寄託日）付で寄託申請がなされ、受託された。この寄託申請に係る受領番号は、OLL2836株がNITE AP-241、OLL2948株がNITE AP-242、OLL2848株がNITE AP-243であり、また寄託番号はそれぞれNITE P-241、NITE P-242、NITE P-243である。これらの寄託菌株は、２００７年３月２７日付けでプダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）に移管され、２００６年６月９日を原寄託日として受託された。それら国際寄託番号は、OLL2836株がNITE BP-241、OLL2948株がNITE BP-242、OLL2848株がNITE BP-243である。これら菌株の菌類学的性質は、上述の表１の通りであることが確認された。   As for OLL2836 strain, OLL2948 strain and OLL2848 strain, further bacterial species identification test was conducted. Each was identified (see Examples below). About these three lactic acid strains, June 9, 2006 (original deposit date) is attached to the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) The application for deposit was made and accepted. The receipt number for this deposit application is NITE AP-241 for OLL2836, NITE AP-242 for OLL2948, NITE AP-243 for OLL2848, and the deposit numbers are NITE P-241, NITE P-242, NITE P-243. These deposited strains were transferred to the deposit under the Budapest Treaty (international deposit) on March 27, 2007, and were deposited on June 9, 2006 as the original deposit date. The international deposit numbers are NITE BP-241 for OLL2836, NITE BP-242 for OLL948, and NITE BP-243 for OLL2848. The mycological properties of these strains were confirmed as shown in Table 1 above.

以上のように、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、腸管付着性が高く、かつラクターゼ活性も高い乳酸菌株を取得できることが示された。さらに、β-gal、P-β-galおよびP-β-glcについてラクターゼ活性を測定し、その3種のラクトース分解酵素のそれぞれについて顕著に高い活性を示した菌株を選抜し、得られた菌株を組み合わせることにより、広範な被験者に適用できる非常に有用な乳酸菌の組み合わせも取得することができた。本発明の方法で得られる乳酸菌株は、腸管内に定着して持続的にラクトースを低減することができる有用なプロバイオティック乳酸菌株として乳糖不耐症の改善に効果的に使用できると考えられる。   As described above, it was shown that by using the screening method of the present invention, a lactic acid strain having high intestinal adhesion and high lactase activity can be obtained. Furthermore, the lactase activity of β-gal, P-β-gal and P-β-glc was measured, and the strains that showed remarkably high activity for each of the three types of lactose-degrading enzymes were selected. By combining these, a very useful combination of lactic acid bacteria applicable to a wide range of subjects could be obtained. It is considered that the lactic acid strain obtained by the method of the present invention can be effectively used to improve lactose intolerance as a useful probiotic lactic acid strain that can settle in the intestinal tract and continuously reduce lactose. .

[実施例６] 菌種同定
実施例５で選抜された3つの乳酸菌株 OLL2836株、OLL2948株およびOLL2848株について、菌種の同定を行った。同定は、V3領域の増幅・配列決定に基づく16S rDNA塩基配列解析によって行った。以下ではOLL2848株およびOLL2948株で行った同定試験を例として記載するが、OLL2836株についても基本的に同様にして同定がなされた。[Example 6] Bacterial species identification Bacterial species were identified for the three lactic acid bacterial strains OLL2836, OLL2948, and OLL2848 selected in Example 5. Identification was performed by 16S rDNA nucleotide sequence analysis based on amplification and sequencing of the V3 region. In the following, an identification test performed on OLL2848 and OLL2948 strains is described as an example, but the OLL2836 strain was identified in the same manner.

１．ダイレクトPCR法による選抜株の16S rDNA断片の検出
OLL2848株およびOLL2948株を、MRS培地で上述の通り継代培養した後、ダイレクトPCRを行った。0.6ml容マイクロチューブにミリQ水を4μlずつ分注し、これに、滅菌楊枝を用いて掻き取った菌体をそれぞれ懸濁した。この懸濁液に、Taq DNAポリメラーゼ（TaKaRa、京都）、10×PCRバッファー、dNTP Mix（TaKaRa、京都）、一組のプライマーを加えてPCR反応液とした。一組のプライマーとしては、ユニバーサルプライマー27F（5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、配列番号１）、および518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'、配列番号２）を用いた。PCR条件は、〔95℃10分間、55℃3分間、72℃1分間〕を1サイクル、〔95℃30秒間、55℃30秒間、72℃30秒間〕を39サイクル、および〔72℃1分間〕1サイクルとして、行った。 1. Detection of 16S rDNA fragments in selected strains by direct PCR
OLL2848 strain and OLL2948 strain were subcultured in MRS medium as described above, and then direct PCR was performed. 4 μl of milli-Q water was dispensed into a 0.6 ml-volume microtube, and the bacterial cells scraped with a sterile toothpick were suspended therein. To this suspension, Taq DNA polymerase (TaKaRa, Kyoto), 10 × PCR buffer, dNTP Mix (TaKaRa, Kyoto), and a set of primers were added to obtain a PCR reaction solution. As a set of primers, universal primer 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′, SEQ ID NO: 1) and 518R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ′, SEQ ID NO: 2) were used. PCR conditions include [95 ° C for 10 minutes, 55 ° C for 3 minutes, 72 ° C for 1 minute] for 1 cycle, [95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds] for 39 cycles, and 72 ° C for 1 minute. This was done as one cycle.

２．アガロースゲル電気泳動
以上のPCR反応により増幅したDNA断片を、次に電気泳動にかけた。電気泳動は、泳動ゲルに2％アガロースゲルを、泳動バッファーには1×TBEバッファー（90mM Tris-ホウ酸、２mM EDTA、pH8.0）を用い、100Vの定電圧下で行った。泳動装置は、Mupid-2（コスモバイオ、東京）を用いた。分子量マーカーは、100b DNAラダー（TaKaRa、京都）を用いた。泳動後のゲルの染色は、エチジウムブロマイド（EB）溶液（0.5μg/ml）に10分間浸すことにより行った。 2. The DNA fragment amplified by PCR reaction more than agarose gel electrophoresis was then subjected to electrophoresis. Electrophoresis was performed under a constant voltage of 100 V using 2% agarose gel as the electrophoresis gel and 1 × TBE buffer (90 mM Tris-boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) as the electrophoresis buffer. As the electrophoresis apparatus, Mupid-2 (Cosmo Bio, Tokyo) was used. As a molecular weight marker, a 100b DNA ladder (TaKaRa, Kyoto) was used. After electrophoresis, the gel was stained by immersing in ethidium bromide (EB) solution (0.5 μg / ml) for 10 minutes.

３．アガロースゲルからのDNA抽出
アガロースゲル電気泳動および染色後のゲルに、UVトランスイルミネーターTRANSILLMINATOR TM-20（フナコシ薬品株式会社、東京）でUVを照射し、目的のDNA断片を確認して、切り出した。DNA断片精製キットMagExtractor（TOYOBO、大阪）によりDNAを抽出した。すなわち、切り出したアガロースゲルを1.5ml容チューブに移した後、400μlの吸着液を加え、55℃に加温して完全に溶解させた。次いで、その反応液に15μlの磁性ビーズを加えて撹拌した後、1分間室温で放置した。遠心分離（6,000 rpm、5秒間、4℃）した後、上清を除去し、500μlの洗浄液を加え撹拌した。再び遠心分離（6,000 rpm、5秒間、4℃）した後、1mlの75％エタノールを加え撹拌して、遠心分離（15,000rpm、1分間、4℃）した後、上清を除去した。15μlの蒸留水を加え撹拌した後、遠心分離（15,000 rpm、1分間、4℃）により回収した上清を精製DNA溶液とした。 3. DNA extraction from agarose gel Agarose gel electrophoresis and stained gel were irradiated with UV with UV Transilluminator TM-20 (Funakoshi Pharmaceutical, Tokyo), and the target DNA fragment was confirmed and cut out. . DNA was extracted with a DNA fragment purification kit MagExtractor (TOYOBO, Osaka). That is, after the excised agarose gel was transferred to a 1.5 ml tube, 400 μl of an adsorbing solution was added and heated to 55 ° C. for complete dissolution. Next, 15 μl of magnetic beads were added to the reaction solution and stirred, and then allowed to stand at room temperature for 1 minute. After centrifugation (6,000 rpm, 5 seconds, 4 ° C.), the supernatant was removed, and 500 μl of washing solution was added and stirred. After centrifugation again (6,000 rpm, 5 seconds, 4 ° C.), 1 ml of 75% ethanol was added and stirred. After centrifugation (15,000 rpm, 1 minute, 4 ° C.), the supernatant was removed. After adding 15 μl of distilled water and stirring, the supernatant recovered by centrifugation (15,000 rpm, 1 minute, 4 ° C.) was used as a purified DNA solution.

４．DNA配列の決定および相同性解析
精製したDNAについて、プライマー27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、配列番号３)を用い、塩基配列決定を行った。塩基配列決定はオペロン・バイオテクノロジー株式会社にて行った。こうしてOLL2848株について決定された16S rDNAのV3領域の塩基配列を配列番号４として、OLL2948株について決定された16S rDNAのV3領域の塩基配列を配列番号５として示した。これらの塩基配列について、日本DNAデータバンク（DDBJ）のウェブ上でプログラムBLASTNにより相同性解析を行った。 4). Determination of DNA sequence and homology analysis The purified DNA was subjected to nucleotide sequencing using primer 27F (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ', SEQ ID NO: 3). The nucleotide sequence was determined by Operon Biotechnology Co., Ltd. The nucleotide sequence of the V3 region of the 16S rDNA thus determined for the OLL2848 strain is shown as SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence of the V3 region of the 16S rDNA determined for the OLL2948 strain is shown as SEQ ID NO: 5. About these base sequences, the homology analysis was performed with the program BLASTN on the web of Japan DNA data bank (DDBJ).

その結果、OLL2848株のV3領域の塩基配列は、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）のV3領域の配列との間で99.6％の相同性を示した。一方、OLL2948株のV3領域の塩基配列は、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）のV3領域の配列との間で99.2％の相同性を示した。このことから、OLL2848株はラクトバチルス・ムコサエ、OLL2948株はラクトバチルス・ガセリにそれぞれ属する乳酸菌として同定された。   As a result, the nucleotide sequence of the V3 region of OLL2848 strain showed 99.6% homology with the sequence of the V3 region of Lactobacillus mucosae. On the other hand, the nucleotide sequence of the V3 region of OLL2948 strain showed 99.2% homology with the sequence of the L3 region of Lactobacillus gasseri. From this, OLL2848 strain was identified as a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus mucosae and OLL2948 strain as belonging to Lactobacillus gasseri, respectively.

本発明の方法は、乳糖不耐症の改善に有用な乳酸菌株を効率よく選抜するために用いることができる。本発明の方法により得られる乳酸菌株は、患者に簡便に投与でき、かつ乳糖不耐症を持続的に改善できる薬剤や機能性食品等の有効成分として有利に使用することができる。   The method of the present invention can be used to efficiently select lactic acid strains useful for improving lactose intolerance. The lactic acid strain obtained by the method of the present invention can be advantageously used as an active ingredient of a drug or functional food that can be easily administered to a patient and can continuously improve lactose intolerance.

配列番号１〜３の配列はプライマーである。   The sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 are primers.

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願の全体を参照により本明細書に取り入れるものとする。   All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

Claims (11)

ラクトバチルス属乳酸菌から腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された菌を選抜することを特徴とする、乳糖不耐症の改善能を有する乳酸菌をスクリーニングする方法。   A method for screening a lactic acid bacterium having an ability to improve lactose intolerance, comprising selecting a bacterium having enhanced intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity from Lactobacillus lactic acid bacteria. ヒトＡ型腸管ムチン、ヒトＢ型腸管ムチン、およびヒトＯ型腸管ムチンのうち少なくとも１つに対する乳酸菌の結合能を表面プラズモン共鳴解析を用いて測定し、その結合能を示すRU値が100 RU以上である菌を腸管付着性が増強された菌として選抜する、請求項１に記載の方法。   The binding ability of lactic acid bacteria to at least one of human type A intestinal mucin, human type B intestinal mucin, and human type O intestinal mucin is measured using surface plasmon resonance analysis, and the RU value indicating the binding ability is 100 RU or more. The method according to claim 1, wherein the bacterium is selected as a bacterium having enhanced intestinal adhesion. ラクトース分解酵素活性が、β-ガラクトシダーゼ、フォスフォ-β-ガラクトシダーゼ、およびフォスフォ-β-グルコシダーゼのうち少なくとも１つのラクターゼ活性である、請求項１または２に記載の方法。   The method according to claim 1 or 2, wherein the lactose degrading enzyme activity is at least one lactase activity of β-galactosidase, phospho-β-galactosidase, and phospho-β-glucosidase. ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、またはラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the Lactobacillus lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri or Lactobacillus mucosae. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により得られる、腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された乳酸菌。   A lactic acid bacterium obtained by the method according to any one of claims 1 to 4, wherein both intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity are enhanced. ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）のうちのいずれかである乳酸菌。   Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), or Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (Accession number NITE BP-243) Lactic acid bacteria. 請求項５または６に記載の乳酸菌を少なくとも1つ含有する乳糖不耐症改善剤。   A lactose intolerance improving agent comprising at least one lactic acid bacterium according to claim 5 or 6. ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）の3つの乳酸菌を少なくとも含有する、請求項７に記載の乳糖不耐症改善剤。   Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), and Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (Accession number NITE BP-243) The lactose intolerance improving agent of Claim 7 contained at least. 請求項５または６に記載の乳酸菌を少なくとも1つ含有する飲食品。   A food or drink containing at least one lactic acid bacterium according to claim 5 or 6. ラクトバチルス・ガセリ OLL2836株（受託番号NITE BP-241）、ラクトバチルス・ガセリ OLL2948株（受託番号NITE BP-242）、およびラクトバチルス・ムコサエ OLL2848株（受託番号NITE BP-243）の3つの乳酸菌を少なくとも含有する、請求項９に記載の飲食品。   Lactobacillus gasseri OLL2836 strain (Accession number NITE BP-241), Lactobacillus gaseri OLL2948 strain (Accession number NITE BP-242), and Lactobacillus mucosae OLL2848 strain (Accession number NITE BP-243) The food / beverage products of Claim 9 contained at least. 乳児用食品、幼児用食品、授乳婦用食品、高齢者用食品、病者用食品、保健機能食品、サプリメント、発酵乳および乳酸菌飲料からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の飲食品。   11. Food according to claim 9 or 10, selected from the group consisting of food for infants, food for infants, food for lactating women, food for the elderly, food for the sick, functional foods, supplements, fermented milk and lactic acid bacteria beverages. Food and drink.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010009582A1 (en) * 2010-02-05 2011-08-11 Vitacare GmbH & Co. KG, 60318 Agent for use in lactase deficiency and lactose intolerance
CN102239963B (en) * 2010-05-12 2015-04-08 青岛东海药业有限公司 Preparation applied to pig and chicken breeding
WO2013168438A1 (en) * 2012-05-10 2013-11-14 国立大学法人岩手大学 Protein having lactase activity, gene encoding said protein, recombinant vector carrying said gene, transformant, method for producing said protein, and use of said protein
JP6230050B2 (en) * 2013-10-09 2017-11-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 Lactic acid bacteria with gastrointestinal mucosa adhesion
SI24570A (en) 2013-12-23 2015-06-30 Medis D.O.O. New strains of the genus Lactobacillus and use thereof
ES2673121T3 (en) * 2014-03-05 2018-06-19 Dsm Ip Assets B.V. Liquid Lactase Compositions
CN109730156A (en) * 2018-12-26 2019-05-10 李卫平 A kind of child antidiarrhea nutrition packet and preparation method thereof
TWI784326B (en) * 2019-10-07 2022-11-21 大江生醫股份有限公司 Lactobacillus fermentum tci275, composition, and uses thereof
AU2021254477A1 (en) 2020-04-08 2022-11-10 Megmilk Snow Brand Co., Ltd. Composition for improving gut microbiota
CN111979145B (en) * 2020-08-07 2022-06-28 上海交通大学 Human-derived lactobacillus mucosae and application thereof
WO2024013211A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Novozymes A/S Method for providing relief from lactose induced abdominal discomfort

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2711095B2 (en) * 1986-09-27 1998-02-10 ユニチカ株式会社 Production method of growth promoter of bifidobacterium
JP3436581B2 (en) * 1994-03-18 2003-08-11 雪印乳業株式会社 Method for producing cells with high lactose-degrading enzyme activity
US8871266B2 (en) * 2003-10-01 2014-10-28 Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation Probiotic storage and delivery
WO2006059408A1 (en) * 2004-12-01 2006-06-08 Meiji Dairies Corporation Lactic acid bacterium binding to human abo blood types

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