JPWO2007123035A1

JPWO2007123035A1 - 培養器

Info

Publication number: JPWO2007123035A1
Application number: JP2008512077A
Authority: JP
Inventors: 成瀬　恵治; 恵治成瀬; 石田　敬雄; 敬雄石田
Original assignee: ストレックス株式会社
Priority date: 2006-04-18
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2009-09-03
Also published as: WO2007123035A1

Abstract

細胞片へ均一に応力をかけられる培養器を提案する。変形可能な材料で形成される矩形箱状の培養器であって、底膜及び該底膜の全周縁から立設する側壁を備え、側壁の内面が多孔質に形成されている。

Description

本発明は試料細胞片へ応力を発生させつつこれを培養する培養器に関する。

試料細胞片に応力を発生させつつこれを培養すると、この応力が刺激となって培養される細胞片に特定の変化が生じることが知られている。
従来から、試料細胞片へ均一に応力をかけるための方法が提案されている。
例えば特許文献１によれば、変形可能な材料で形成されている培養器を矩形箱状とし、その底膜及び該底膜の全周縁から立設する側壁を備え、対向する一対の側壁には底膜の周縁の延長線上に係合部を形成している。底膜には係止部を設け、当該係止部へ細胞片を係止させることにより培養器を伸展したときに底膜と細胞片とのすべりを防止している。
国際公開ＷＯ2005/087913 Ａ１公報

上記従来技術の培養器を用いても細胞片へ均一に応力を加えることが可能であった。
しかしながら、昨今の細胞培養の分野においてはより精緻に制御された条件下での研究開発が求められている。そこで本発明者らは、細胞片へより均一に応力をかけるべく培養器の検討を進めてきた。
従って、この発明の第１の目的は細胞片へ極めて均一な応力をかけられる培養器を提案することにある。

本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねてきたところ、底膜に係止部を設けたとしても、細胞片と培養器との一体性を完全に担保することはできないことに気が付いた。特に、底膜の周縁部、即ち細胞片の周縁部において底膜に対するすべりを完全になくすことが困難であった。
そこで本発明者らは培養器の側壁に着目し、これを細胞片の周縁へ係止させればよいことに気が付き、本発明に想到した。即ち、この発明の第１の局面は次の様に規定される。
変形可能な材料で形成される培養器であって、
底膜及び該底膜の周縁から立設する側壁を備え、
前記側壁の内面が多孔質に形成されている、ことを特徴とする培養器。

このように構成される培養器によれば、側壁の内面が多孔質に形成されているので、底膜へ載せられる細胞片の周縁が側壁の内面の細孔に入り込んで、そこに係止される。これにより、培養器が伸展されたときその側壁の移動に伴い細胞片の周縁も伸展され、細胞片の周縁が培養器の底膜に対してすべることがない。

上記において、側壁の内面は発泡材料から形成することが好ましい。安価でかつ多孔質の制御が容易であるからである。
かかる発泡材料として、実施例では培養器の基体（シリコンエラストマー製）と同種材料であるＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を採用しているが、培養器の変形を阻害せず、かつ細胞片に対する化学的な影響のない材料であれば、任意に選択可能である。

側壁にはその内面の全周が多孔質とされることが好ましいが、少なくとも、培養器の伸展時に相互に離隔する一対の側壁の内面のみを多孔質とすればよい。また、側壁の内面において少なくとも細胞片へ接触する高さの部分のみを多孔質とすればよい。

培養器として例えば矩形箱型のものが採用される。培養器を矩形箱型とすることにより消耗品である培養器の運搬及び保管が容易になる。
かかる培養器は変形可能な材料で形成されている。これは、培養器を伸展することにより間接的に試料細胞片へ応力をかけるためである。
培養器の形成材料としてシリコーンエラストマーなどの試料細胞片へ化学的に干渉しないものが用いられる。

底膜は平面視矩形として、均一に伸展するように全体が同じ膜厚に形成されることが好ましい。光学顕微鏡で試料細胞片を観察可能なように底膜は光透過製材料で形成されることが好ましい。
底膜の全周から側壁を立設させることが好ましい。側壁を厚膜としてこれに機械的な剛性を付与する。これにより、底膜が無秩序に変形することを防止できる。
底膜と側壁とは一体であることが部品点数削減、ひいては製造コスト削減の見地から好ましいが、底膜と側壁とを別体にすることを制限するものではない。

矩形底膜の対向する一対の縁に設けられた側壁には係合部が設けられている。この係合部が伸展装置の固定プレート、及び移動プレートと係合すればよい。これにより、相対位置を制御可能な当該２つの部材の位置変化が培養器を変形させることとなる。
したがって、側壁から突起を設けてこれをプレートに係合させることもできる。２つのプレートを共に変動させることも可能である。

底膜が伸張されたとき当該伸張方向の周縁はその中央部が窪むように変形する。このような変形が生じると変形部分上の試料細胞片にかかる応力の方向が他の部分のものと異なってしまう。そこで矩形底膜の伸張方向の周縁の延長線上に係合部を形成することが好ましい。これにより、係合部に加えられた力が当該底膜の伸長方向の周縁へ加わり、これが確実に引っ張られる。よって、当該周縁の変形が防止され、もって底膜上の全試料細胞片へ均一な応力をかけられることとなる。
この発明の培養器に使用される試料細胞片の種類及び入手方法は特に限定されるものではない。例えば、血管内皮細胞（ヒト・サル・ブタ・ウシ・ラット・マウス・ウサギなど）、平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、破骨細胞、神経細胞などを使用することができる。

図１はこの発明の実施例の培養器の斜視図である。図２はこの発明の実施例の培養器を示し、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は正面図、（Ｃ）は底面図、（Ｄ）は右側面図である。図３は図２におけるＡ−Ａ線断面図である。図４は実施例の培養器の使用態様を示す断面図である。図５はＰＤＭＳ発泡バルクのを示す写真図である。図６はＰＤＭＳ発泡バルクの表面拡大写真でである。図７はＰＤＭＳ発泡バルクの表面電子顕微鏡写真である。

符号の説明

２１培養器
２３底膜
２５、２６側壁
２７係合孔
２９試料細胞片
３１突起
４１，４３発泡体

以下、この発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
図１はこの実施例の培養器２１を示し、図１はその斜視図、図２（Ａ）は平面図、図２（Ｂ）は正面図、図２（Ｃ）は底面図、図２（Ｄ）は右側面図である。なお、左側面図は図２（Ｄ）と同じであるため省略した。図３は図２（Ａ）におけるＡ−Ａ線断面図である。図４は使用態様図である。
実施例の培養器２１は透明なシリコーンエラストマーで型成形された箱型であり、薄い底膜２３と底膜２３の周縁から一体的に立設した側壁２５、２６からなる。底膜２３は約１００μｍ乃至約２００μｍの膜厚であり、側壁２５は約１ｃｍ、側壁２６は約２ｍｍの厚さである。側壁２５には係合孔２７が形成されている。
底膜２３の表面には細胞片を着床させるためにフィブロネクチンやコラーゲンなどが塗布される。

底膜２３から係止部としての突起３１が形成されている。この突起３１は試料細胞片２９へ干渉してこれと底膜２３とのすべりを防止する。よって、試料細胞片２９に対する均一な応力の付加が可能になる。突起３１の代りに、底膜２３の表面に凹凸を形成することもできる。当該凹凸や突起３１を省略することもできる。

側壁２５、２５の内面には多孔質体４１，４１が積層され、側壁２６，２６の内面には多孔質体４３，４３が積層されている。
これら多孔質体４３は次のようにして形成される。
未重合のＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）へ１０重量％の超純水を発泡剤として加え、攪拌機（THINKY社製、AR100）にて３０秒間攪拌した。
次に、１００℃に加熱したホットプレート（ASONE社製、ND-1）へ上記水を加えたＰＤＭＳを流し込んだ。ＰＤＭＳの厚さを約０．５〜２ｍｍとして１５〜３０分間、１００℃の加熱を行なった。これにより、ＰＤＭＳは発泡しながら重合した。
ホットプレートから外したＰＤＭＳの発泡バルクの写真を図５に示す。この発泡バルクの表面拡大写真を図６に示す。図６より表面に数ミリ程度の窪みが確認できる。この窪みの周壁へ細胞片が係止することとなる。また、表面の顕微鏡写真を図７に示す。図７より、発泡バルクの孔は連通しており、各孔は表面側でその直径が大きく、内部にいくに従ってその直径が小さくなっていることがわかる。

このようにして得られたＰＤＭＳの発泡バルクを所定の形状に切り分けて多孔質体４１，４３を形成する。
多孔質体４１，４３は汎用的な接着剤を用いて側壁２５，２６の内面に接着される。

図４には、実施例の伸展装置５０を示す。この伸展装置５０において固定プレート５１はレール板５６に固定され、可動プレート５３はレール板５６上に摺動自在に載置される。固定プレート５１、可動プレート５３からはそれぞれピン５２、５４が突設され、培養器２１の係合孔２７へ挿入される。
可動プレート５３はロッドを介してステップモータ５５の回転に伴い図示矢印方向へ移動する。符号５７はステップモータ５５の回転を制御する制御装置であり、実施例ではコンピュータ装置を用いた。
ステップモータ５５を回転させて可動プレート５３を固定プレート５１から離隔する方向に移動させると、ピン５４を介してその力が培養器２１の側壁２５へ伝達される。これにより、底膜２３が伸張される。

このとき係合孔２７は、図３（Ａ）に示すように、底膜２３の周縁２４、２４の延長線上に位置する。より好ましくは、図示のように、当該延長線が係合孔２７の外縁部と一致するようにする。これにより、ピン３２−ピン３４による力が底膜２３の周縁２４へより直接的にかかることになる。よって、当該周縁２４の窪みが防止され底膜２３が均一に伸展される。よって、底膜２３の上の試料細胞片２９にかかる応力が均一となる。

さらには、周壁２５及び２６の内面に多孔質体４１，４３が貼り付けられているので、細胞片２９の周縁は当該多孔質体４１，４３に係止される。これにより、伸展装置５０により培養器２１が伸展されたとき、細胞片２９も多孔質体４１、４３に付き従い伸展され、培養器２１の底膜２３に対してすべることがない。この実施例では、底膜２３に突起３１が形成されているので、底膜２３に対する細胞片２９のすべりが更に確実に防止されている。

この実施例では矩形箱型の培養器に側壁を多孔質としたが、培養器の形状構造は特に限定されるものではない。例えば、吸引により変形されるタイプの培養膜へ側壁を設けその内面を多孔質とすることもできる。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

Claims

変形可能な材料で形成される培養器であって、
底膜及び該底膜の周縁から立設する側壁を備え、
前記側壁の内面が多孔質に形成されている、ことを特徴とする培養器。
前記側壁の内面は発泡材料からなる、ことを特徴とする請求項１に記載の培養器。
前記発泡材料の気泡は表面側でその直径が大きく、内部にいくに従ってその直径が小さくなる連続気泡である、ことを特徴とする請求項２に記載の培養器。
前記発泡材料は水を発泡剤としたＰＤＭＳからなる、ことを特徴とする請求項２又は３に記載の培養器。
前記底膜には、試料細胞片に係止する係止部が形成される、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養器。