JPWO2007063898A1 - Protein crystallization method and apparatus, and protein crystallization treatment apparatus - Google Patents
Protein crystallization method and apparatus, and protein crystallization treatment apparatus Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007063898A1 JPWO2007063898A1 JP2007547972A JP2007547972A JPWO2007063898A1 JP WO2007063898 A1 JPWO2007063898 A1 JP WO2007063898A1 JP 2007547972 A JP2007547972 A JP 2007547972A JP 2007547972 A JP2007547972 A JP 2007547972A JP WO2007063898 A1 JPWO2007063898 A1 JP WO2007063898A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- droplet
- crystallization
- sample
- electrode
- electric field
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B29/00—Single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the material or by their shape
- C30B29/54—Organic compounds
- C30B29/58—Macromolecular compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C30—CRYSTAL GROWTH
- C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
- C30B7/00—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions
- C30B7/12—Single-crystal growth from solutions using solvents which are liquid at normal temperature, e.g. aqueous solutions by electrolysis
Abstract
本発明に係るマイクロバッチ法における結晶化方法は、微量のタンパク質溶液の液滴に、タンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加してサンプル液滴を生成し、該サンプル液滴を所定の環境下においてサンプル液滴内のタンパク質を結晶化させるマイクロバッチ法おいて、各サンプル液滴の上方または下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加することを特徴とする。【選択図】 図１In the microbatch method according to the present invention, a sample droplet is generated by directly adding a droplet of a reagent necessary for protein crystallization to a small amount of a protein solution droplet. In a microbatch method in which protein in a sample droplet is crystallized under a predetermined environment, a pair of electrodes are arranged side by side above or below each sample droplet, and crystallized from above or below the sample droplet by the electrodes. It is characterized by applying an electric field for crystallization. [Selection] Figure 1
Description
本発明は、タンパク質を結晶化する方法及び装置並びに前記タンパク質を結晶化する方法を適用したタンパク質結晶化処理装置に関する。 The present invention relates to a method and apparatus for crystallizing a protein, and a protein crystallization treatment apparatus to which the method for crystallizing the protein is applied.
生物学や医学の見地からタンパク質の構造や機能を知るためにタンパク質の構造解析の研究が盛んに行われている。
タンパク質の三次元構造を解析するための最も一般的な手法はＸ線構造解析法である。そして、このＸ線構造解析法によりタンパク質の三次元構造を解析するためには、タンパク質の良質な単結晶が必要になる。
このためタンパク質の構造解析のためには、タンパク質の結晶化が不可欠である。
タンパク質の結晶は、タンパク質の結晶化のために必要な試薬とタンパク質溶液とを適当な濃度で混合し、混合した溶液を適当な環境下に置くことで析出して成長する。
しかしながら、結晶化条件が確認できているタンパク質は非常に少ない。結晶化条件が確認できていないタンパク質の結晶化条件を確認するためには、試薬の種類、試薬濃度及び温度条件等を試行錯誤的に変化させ、数千種類を超える結晶化条件をスクリーニングする必要がある。
タンパク質の結晶化条件のスクリーニングを非常に多くの種類の結晶化条件に対して行うためには、非常に多くのサンプル溶液が必要になる。このため、非常に多くのサンプル溶液を確保して、保管しておく必要がある。また、同様の理由で、タンパク質の結晶化のために必要な試薬も多数保管しておく必要がある。その結果、非常に大きな保管設備が必要になる。
発明者等は、上記した問題を解決し、サンプル溶液に微小液滴を使ったマイクロバッチ法を既に提案している（特許文献１〜５参照）。これにより、大きな保管設備を必要とせずに多数のサンプル溶液のスクリーニングを行うことができるようになる。
一方、タンパク質等の生体高分子は非常に大きな分子量を有し、サンプル溶液中での自己拡散係数が小さいため、結晶核形成に必要な分子同士の集合又は会合が起こりにくく、このため、多数のサンプル溶液を用意しても結晶化が得られないサンプル溶液も多い。
このように結晶化が困難なタンパク質等の生体高分子の結晶化を促進するためにサンプル溶液に電圧を印加することが既に提案されている（特許文献６参照）。In order to know the structure and function of proteins from the viewpoint of biology and medicine, research on protein structure analysis is being actively conducted.
The most common method for analyzing the three-dimensional structure of a protein is an X-ray structure analysis method. In order to analyze the three-dimensional structure of the protein by this X-ray structure analysis method, a high-quality single crystal of the protein is required.
For this reason, protein crystallization is indispensable for protein structural analysis.
Protein crystals are precipitated and grown by mixing reagents necessary for protein crystallization and a protein solution at an appropriate concentration and placing the mixed solution in an appropriate environment.
However, very few proteins have confirmed crystallization conditions. In order to confirm the protein crystallization conditions for which the crystallization conditions have not been confirmed, it is necessary to change the reagent type, reagent concentration, temperature condition, etc. by trial and error, and to screen over several thousand crystallization conditions. There is.
In order to perform screening of protein crystallization conditions against a great variety of crystallization conditions, a very large number of sample solutions are required. For this reason, it is necessary to secure and store a very large number of sample solutions. For the same reason, it is necessary to store a large number of reagents necessary for protein crystallization. As a result, a very large storage facility is required.
The inventors have already proposed a microbatch method that solves the above problems and uses microdroplets as a sample solution (see Patent Documents 1 to 5). As a result, a large number of sample solutions can be screened without requiring a large storage facility.
On the other hand, biopolymers such as proteins have a very large molecular weight and a small self-diffusion coefficient in the sample solution, so that the aggregation or association of molecules necessary for crystal nucleation is unlikely to occur. There are many sample solutions in which crystallization is not obtained even if a sample solution is prepared.
In order to promote the crystallization of biopolymers such as proteins that are difficult to crystallize, it has already been proposed to apply a voltage to the sample solution (see Patent Document 6).
上記したように、サンプル溶液に電圧を印加することにより、溶液中の結晶化させるべき分子を電気泳動させることができ、分子の移動量が増大し、溶液中における分子同士の衝突が起こりやすくなり、結晶核の形成が促進される。
しかし、上記した従来の結晶化方法は、一対の電極でサンプル溶液を挟んでサンプル溶液に電圧を印加するように構成されているため装置自体が非常に特殊で複雑な構造になる。
特に、この従来の結晶化方法を、発明者等が提案する微小液滴を用いたマイクロバッチ法に適用しようとすると、生成した微小サンプル液滴を所定の保管位置に静電搬送した後、一対の電極を有する結晶化装置へ微小サンプル液滴を移動して電圧を印加しなければならないため装置の構造が複雑になるばかりでなく、当然装置全体の大きさも大きくなるため小型化の目的に反することになる。
また、Ｘ線構造解析を行う際に、得られた結晶にＸ線を照射して、Ｘ線の反射像又は透過像を撮影する。しかし、得られた結晶の質が良くないと、撮影した結晶の解像度が低くなり、正確な三次元構造の解析が行えないないという問題もある。
本発明は、上記した従来の問題点を解決し、微小液滴を用いたマイクロバッチ法において、装置構造を複雑化することなく、かつ、装置自体を大きくすることなく、結晶化の促進を可能すると共に、X線回折の解像度が高くなる質の高い結晶を得ることができる結晶化方法及び装置並びに同結晶化方法を適用したタンパク質結晶化処理装置を提供することを目的としている。As described above, by applying a voltage to the sample solution, the molecules to be crystallized in the solution can be electrophoresed, the amount of movement of the molecules increases, and molecules collide with each other in the solution. The formation of crystal nuclei is promoted.
However, since the conventional crystallization method described above is configured to apply a voltage to the sample solution with the sample solution sandwiched between a pair of electrodes, the apparatus itself has a very special and complicated structure.
In particular, when this conventional crystallization method is to be applied to the microbatch method using microdroplets proposed by the inventors, the generated microsample droplets are electrostatically transported to a predetermined storage position, Therefore, not only the structure of the apparatus is complicated but also the size of the entire apparatus is increased, which is contrary to the purpose of miniaturization. It will be.
In addition, when performing X-ray structural analysis, the obtained crystal is irradiated with X-rays, and an X-ray reflection image or transmission image is taken. However, if the quality of the obtained crystal is not good, there is a problem that the resolution of the photographed crystal is lowered and the accurate three-dimensional structure analysis cannot be performed.
The present invention solves the above-mentioned conventional problems, and can promote crystallization without complicating the structure of the apparatus and enlarging the apparatus itself in the microbatch method using microdroplets. In addition, an object of the present invention is to provide a crystallization method and apparatus capable of obtaining high-quality crystals with high resolution of X-ray diffraction, and a protein crystallization treatment apparatus to which the crystallization method is applied.
上記した目的を達成するために本発明に係るマイクロバッチ法における結晶化方法は、微量のタンパク質溶液の液滴に、タンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加してサンプル液滴を生成し、該サンプル液滴を所定の環境下においてサンプル液滴内のタンパク質を結晶化させるマイクロバッチ法おいて、各サンプル液滴の上方または下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加することを特徴とする。
また、本発明に係るマイクロバッチ法において用いられる結晶化装置は、微量のタンパク質溶液の液滴にタンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加して生成されたサンプル液滴を保持する保持手段と、前記保持手段の上方または下方であって、各サンプル液滴の上方または下方に並べて配置された一対の電極とを有し、前記電極により、保持手段で保持されたサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加するように構成したことを特徴とする。
さらに、本発明に係るタンパク質結晶化処理装置は、進行波電場発生用電極並びに、該進行波電場発生用電極の上に配置されるサンプル液滴と混じりあわない溶液層を有する液滴保持手段とを備え、前記進行波電場発生用電極に所定の周波数で電圧を印加することにより、前記液滴保持手段中に供給されたタンパク質の結晶化のために必要な試薬の液滴と、タンパク質溶液の液滴とを移動して合体させてサンプル液滴を生成し、次いで、前記サンプル液滴を前記液滴保持手段内で保持するように構成された溶液処理手段と、前記溶液処理手段における液滴保持手段に、前記液滴を供給する液滴供給手段と、前記サンプル液滴を保持した液滴保持手段における各サンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を付与できるように電極が配置された結晶化手段と、結晶化手段において結晶化がなされている液滴保持手段中のサンプル液滴の結晶化成長を監視するための結晶化成長監視手段と、前記液滴保持手段をサンプル液滴保持後に結晶化手段へ移送し、結晶化手段と結晶化成長監視手段との間で液滴保持手段を移送することができる移送手段とを有することを特徴とする。In order to achieve the above-described object, the crystallization method in the microbatch method according to the present invention adds a reagent droplet necessary for protein crystallization directly to a minute amount of a protein solution droplet to form a sample droplet. In a microbatch method for generating and crystallizing proteins in a sample droplet under a predetermined environment, a pair of electrodes are arranged side by side above or below each sample droplet, and the sample is sampled by the electrode. An electric field for crystallization is applied to the droplet from above or below.
In addition, the crystallization apparatus used in the microbatch method according to the present invention holds a sample droplet generated by directly adding a reagent droplet necessary for protein crystallization to a minute amount of a protein solution droplet. A holding means, and a pair of electrodes arranged above or below the holding means and above or below each sample droplet. The sample droplets held by the holding means are formed by the electrodes. The present invention is characterized in that an electric field for crystallization is applied from above or below.
Furthermore, the protein crystallization treatment apparatus according to the present invention comprises a traveling wave electric field generating electrode, and a droplet holding means having a solution layer that does not mix with the sample droplet disposed on the traveling wave electric field generating electrode. And applying a voltage to the traveling-wave electric field generating electrode at a predetermined frequency, whereby droplets of a reagent necessary for crystallization of the protein supplied in the droplet holding means, and a protein solution A liquid processing unit configured to move and combine the droplets to generate a sample droplet, and then hold the sample droplet in the droplet holding unit; and a droplet in the solution processing unit An electrode is provided so that an electric field for crystallization can be applied from above or below to each sample droplet in the droplet supply unit for supplying the droplet to the holding unit and the droplet holding unit for holding the sample droplet. Arrangement Crystallization means, crystallization growth monitoring means for monitoring crystallization growth of sample droplets in the droplet holding means crystallized in the crystallization means, and the droplet holding means as a sample liquid It is characterized by having transfer means capable of transferring to the crystallization means after holding the drops and transferring the drop holding means between the crystallization means and the crystallization growth monitoring means.
本発明に係る結晶化方法は、マイクロバッチ法において、各サンプル液滴の上方又は下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を印加することにより、サンプル液滴中の結晶化を促進することができ、及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶を得ることができるので、一対の電極でサンプル液滴を挟んで結晶化の促進を行う従来の促進方法に比べて簡単な構造で結晶化の促進及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出を行うことが可能になるという効果を奏する。
前記結晶化のために印加される電場は200V/mm以上であり得る。印加する電場を200V/mm以上にすることにより、サンプル液滴中の結晶化が促進される。
また、前記結晶化のために印加する電場を1000V/mm以上にすることで、サンプル溶液中にX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶が析出される。
また、本発明に係る結晶化装置は、微量のタンパク質溶液の液滴にタンパク質の結晶化に必要な試薬の液滴を直接添加して生成されたサンプル液滴を保持する保持手段と、前記保持手段の上方または下方であって、各サンプル液滴の上方または下方に並べて配置された一対の電極とを有し、前記電極により、保持手段で保持されたサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加するように構成しているので、単に並べて配置された電極の上方又は下方にサンプル液滴を配置できるように構成するだけで結晶化の促進及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出を図ることが可能になる。従来の一対の電極でサンプル液滴を挟んで結晶化の促進を行う装置の場合には、一対の電極間にサンプル液滴を配置しなければならないので、構造が複雑になり、また、各サンプル液滴を一対の電極で挟むため装置が大型化してしまうという問題があるが、本発明に係る結晶化装置は、単に並べて配置された電極の上方又は下方にサンプル液滴を配置できるように構成するだけでよいので、装置の構造が簡単であり、また、装置自体も従来の装置に比べて小型化することが可能になる。
さらに、本発明に係るタンパク質結晶化装置は、進行波電場発生用電極並びに、該進行波電場発生用電極の上に配置されるサンプル液滴と混じりあわない溶液層を有する液滴保持手段とを備え、前記進行波電場発生用電極に所定の周波数で電圧を印加することにより、前記液滴保持手段中に供給されたタンパク質の結晶化のために必要な試薬の液滴と、タンパク質溶液の液滴とを移動して合体させてサンプル液滴を生成し、次いで、前記サンプル液滴を前記液滴保持手段内で保持するように構成された溶液処理手段と、前記溶液処理手段における液滴保持手段に、前記液滴を供給する液滴供給手段と、前記サンプル液滴を保持した液滴保持手段における各サンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を付与できるように電極が配置された結晶化手段と、結晶化手段において結晶化がなされている液滴保持手段中のサンプル液滴の結晶化成長を監視するための結晶化成長監視手段と、前記液滴保持手段をサンプル液滴保持後に結晶化手段へ移送し、結晶化手段と結晶化成長監視手段との間で液滴保持手段を移送することができる移送手段とを備えているためサンプル液滴の生成から結晶化及び観察迄の一連の作業を自動的に行うことが可能になる。また、サンプル液滴の生成から結晶化及び結晶化観察の作業を、共通の液滴保持手段を用いて行うことができるので、サンプル液滴の移動等を非常に簡単に行うことが可能になる。The crystallization method according to the present invention is a microbatch method in which a pair of electrodes are arranged side by side above or below each sample droplet, and an electric field for crystallization is applied to the sample droplet from above or below by the electrodes. By doing so, it is possible to promote crystallization in the sample droplet and / or to obtain a high quality crystal with high X-ray diffraction resolution, so that the sample droplet is sandwiched between a pair of electrodes. Compared with the conventional accelerating method for accelerating crystallization, there is an effect that crystallization can be promoted and / or high-quality crystals can be precipitated with higher resolution of X-ray diffraction with a simple structure.
The electric field applied for the crystallization may be 200 V / mm or more. By setting the applied electric field to 200 V / mm or more, crystallization in the sample droplet is promoted.
Further, by setting the electric field applied for the crystallization to 1000 V / mm or more, high quality crystals with high X-ray diffraction resolution are precipitated in the sample solution.
In addition, the crystallization apparatus according to the present invention includes a holding unit that holds a sample droplet generated by directly adding a droplet of a reagent necessary for protein crystallization to a small amount of a protein solution droplet; A pair of electrodes arranged above or below the means and arranged above or below each sample droplet, and crystallized from above or below the sample droplet held by the holding means by the electrodes. Because it is configured to apply an electric field for crystallization, simply configuring it so that sample droplets can be placed above or below the side-by-side electrodes facilitates crystallization and / or X-ray diffraction resolution. This makes it possible to precipitate high quality crystals. In the case of a conventional apparatus for promoting crystallization by sandwiching a sample droplet between a pair of electrodes, the sample droplet must be disposed between the pair of electrodes, so that the structure becomes complicated and each sample is Although there is a problem that the apparatus becomes large because the droplet is sandwiched between a pair of electrodes, the crystallization apparatus according to the present invention is configured so that the sample droplet can be arranged above or below the electrodes arranged side by side. Therefore, the structure of the apparatus is simple, and the apparatus itself can be reduced in size as compared with the conventional apparatus.
Furthermore, the protein crystallization apparatus according to the present invention comprises a traveling wave electric field generating electrode and a droplet holding means having a solution layer that does not mix with the sample droplet disposed on the traveling wave electric field generating electrode. A droplet of a reagent necessary for crystallizing the protein supplied in the droplet holding means and a solution of a protein solution by applying a voltage at a predetermined frequency to the traveling wave electric field generating electrode A liquid processing means configured to move and coalesce the droplets to form a sample droplet and then hold the sample droplet in the droplet holding means; and a droplet holder in the solution processing means An electrode is arranged so that an electric field for crystallization can be applied from above or below to each sample droplet in the droplet supply means for supplying the droplet and the droplet holding means for holding the sample droplet. The Crystallization means, crystallization growth monitoring means for monitoring the crystallization growth of the sample droplet in the droplet holding means crystallized in the crystallization means, and the droplet holding means as the sample droplet Since it is transferred to the crystallization means after holding, and the transfer means capable of transferring the droplet holding means between the crystallization means and the crystallization growth monitoring means, it is provided with crystallization and observation from the generation of sample droplets. It becomes possible to automatically perform a series of operations up to. In addition, since the operation from the generation of the sample droplet to the crystallization and the crystallization observation can be performed using the common droplet holding means, it is possible to move the sample droplet and the like very easily. .
以下、添付図面に示した一実施例を参照して、本発明に係る結晶化方法及び装置並びに同結晶化方法を適用した結晶化処理装置の実施の形態を説明していく。 DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Embodiments of a crystallization method and apparatus according to the present invention and a crystallization processing apparatus to which the crystallization method is applied will be described below with reference to one embodiment shown in the accompanying drawings.
図１（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係る結晶化方法の原理を説明するための結晶化装置の概略斜視図及び概略横断面図である。
図面に示すように、この結晶化装置は、
基板１上に一対の電極２ａ及び２ｂを複数列配置した電極板６と、
サンプル液滴５を保持するためのサンプル液滴と混じりあわない溶液４からなる液滴保持手段と
を有する。前記電極２ａ及び２ｂは絶縁体３で覆われている。
沈殿剤、塩及び界面活性剤等のような様々なタンパク質結晶化のための試薬とタンパク質溶液との混合物から成るサンプル液滴５は、絶縁体３の上に配置され、各サンプル液滴５が一対の電極の中間に位置するように配置される。
サンプル液滴５は、蒸発を防止するために油等のようなサンプル液滴と混じりあわない溶液４で囲まれている。このサンプル液滴と混じりあわない溶液４によってサンプル液滴５を囲むセットアップは、いわゆる、マイクロバッチ方法に対応している。
電極２ａ及び２ｂ間に電位差を与えると、サンプル液滴５が置かれている電極２ａ及び２ｂ上に電場が生じる。継続的な電場を作り出すために不図示の高圧電源が用いられる。また、図示していないが、例えば、増幅器に接続された信号発生器を用いることにより交流電場を生成することも可能である。
前記サンプル液滴５は、例えば、疎水性の表面上に親水化スポットを作ることによって位置決めすることができる。親水化スポットにより位置決めされた液滴は、しっかりと固定される。1A and 1B are a schematic perspective view and a schematic cross-sectional view of a crystallization apparatus for explaining the principle of a crystallization method according to the present invention.
As shown in the drawing, this crystallization apparatus is
An electrode plate 6 in which a plurality of rows of a pair of electrodes 2a and 2b are arranged on the substrate 1,
And a droplet holding means made of a solution 4 that does not mix with the sample droplet for holding the sample droplet 5. The electrodes 2a and 2b are covered with an insulator 3.
Sample droplets 5 consisting of a mixture of various protein crystallization reagents and protein solutions, such as precipitants, salts and surfactants, etc. are placed on the insulator 3 and each sample droplet 5 is It arrange | positions so that it may be located in the middle of a pair of electrode.
The sample droplet 5 is surrounded by a solution 4 that does not mix with the sample droplet, such as oil, in order to prevent evaporation. The setup in which the sample droplet 5 is surrounded by the solution 4 that does not mix with the sample droplet corresponds to a so-called microbatch method.
When a potential difference is applied between the electrodes 2a and 2b, an electric field is generated on the electrodes 2a and 2b on which the sample droplet 5 is placed. A high voltage power source (not shown) is used to generate a continuous electric field. Although not shown, it is also possible to generate an AC electric field by using, for example, a signal generator connected to an amplifier.
The sample droplet 5 can be positioned, for example, by creating a hydrophilized spot on a hydrophobic surface. The droplet positioned by the hydrophilization spot is firmly fixed.
図２及び図３は、上記したタンパク質結晶化装置を用いて、実際にサンプル液滴５に所定の電場を付与して、タンパク質（卵白リゾチーム）の結晶化を経時的に観察した結果を示すグラフである。
この実験では、卵白リゾチームを0.2 Mリン酸緩衝液（pH 4.6）に溶解し、40 mg/mLに調製したものをタンパク溶液とし、沈殿剤としてNaCl、0.2 Mリン酸緩衝液（pH 4.6）を用い、それぞれ0.5 μl（直径1 mm ）を混合したサンプル液滴（1 μl、直径1.2mm）を60個生成して、パラフィンオイルから成るサンプル液滴と混じりあわない溶液中で前記サンプル液滴を保持したサンプルホルダーを３つ準備し、
第１のサンプルホルダーには電場を付与せず、
第２のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流200V/mm(60V)の電場を付与し、
第３のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流400V/mm(120V)の電場を付与し、
第４のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流600V/mm(180V)の電場を付与し、
第５のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流800V/mm(240V)の電場を付与し、
結晶化の状態を1週間観察した。
尚、実験に使用したタンパク質結晶化装置における電極板の電極間の間隔は０．３ｍｍであり、上記括弧内に記載した電圧は実際に印加した電圧値を示している。
図２は、最終的に各サンプルの各サンプル液滴に生成された最大結晶の大きさと、結晶の数との関係を示すグラフである。
図３は、最終的に各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶の数と、液滴中に占める結晶の割合を示したグラフである。
さらに、図４は、第１〜５のサンプルから一つずつピックアップして上方から撮影したサンプル液滴の概略上面写真である。
図２〜図４の実験結果から明らかなように、電場を全く付与しない第１のサンプルに比べて電場を付与した場合に、電場強度を上げるにつれて１つの液滴中に生成する結晶数が1-3になる割合が増加することを表している。一方、結晶サイズでは、400 V/mmの電場を付与した場合に0.3mm以上の結晶が得られたが、他の条件ではすべて0.3mm未満であった。このことより、電場を付与した場合、結晶化が促進され、析出される結晶のサイズが増加することが分かる。特に、卵白リゾチームにおいては、200 V/mmから600 V/mmの電場を付与すると、結晶化が促進され、結晶サイズが増加する効果が顕著に現れていることが分かる。
電場を付与しない第１のサンプルのように各サンプル液滴中に生成される結晶の数が多いと、大きな結晶に成長しないため必要な結晶が得られないが、前記条件の電場を与えると、各サンプル液滴中に生成される結晶の数が少なくなり、その分、結晶の大きさが大きくなるため必要な結晶が得られる。
尚、液滴の直径は、典型的には、１ｍｍ以下（容積１μｌ以下）であるため、非常に多くの数の液滴を小さい表面上にセットすることが可能になる。例えば、容積が１μｌの液滴であれば、３×４．５ｃｍの表面上に、８×１２の列に配置して９６個の液滴を簡単に乗せることができる。2 and 3 are graphs showing the results of observing the crystallization of protein (egg white lysozyme) over time by actually applying a predetermined electric field to the sample droplet 5 using the protein crystallization apparatus described above. It is.
In this experiment, egg white lysozyme was dissolved in 0.2 M phosphate buffer (pH 4.6), and the protein solution prepared at 40 mg / mL was used as a protein solution. NaCl, 0.2 M phosphate buffer (pH 4.6) was used as a precipitant. Use 60 sample droplets (1 μl, 1.2 mm in diameter) each mixed with 0.5 μl (1 mm diameter), and place the sample droplets in a solution that does not mix with paraffin oil sample droplets. Prepare three sample holders,
No electric field is applied to the first sample holder,
The second sample holder is given an electric field of DC 200V / mm (60V) to each sample droplet by the electrode placed below,
The third sample holder is given an electric field of DC 400V / mm (120V) to each sample droplet by the electrode placed below,
The fourth sample holder is applied with an electric field of 600V / mm (180V) DC to each sample droplet by the electrode placed below.
The fifth sample holder is applied with an electric field of DC 800V / mm (240V) to each sample droplet by the electrode placed below.
The state of crystallization was observed for 1 week.
In addition, the distance between the electrodes of the electrode plate in the protein crystallization apparatus used in the experiment is 0.3 mm, and the voltage described in the parenthesis indicates the actually applied voltage value.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the maximum crystal size finally generated in each sample droplet of each sample and the number of crystals.
FIG. 3 is a graph showing the number of crystals finally generated in each sample droplet of each sample and the ratio of the crystals in the droplet.
FIG. 4 is a schematic top view of sample droplets picked up from the first to fifth samples and photographed from above.
As is apparent from the experimental results of FIGS. 2 to 4, when an electric field is applied compared to the first sample that does not apply an electric field, the number of crystals generated in one droplet increases as the electric field strength increases. This means that the ratio of -3 increases. On the other hand, with respect to the crystal size, crystals of 0.3 mm or more were obtained when an electric field of 400 V / mm was applied, but all other conditions were less than 0.3 mm. From this, it can be seen that when an electric field is applied, crystallization is promoted and the size of the precipitated crystals increases. In particular, in egg white lysozyme, it can be seen that when an electric field of 200 V / mm to 600 V / mm is applied, crystallization is promoted and the effect of increasing the crystal size appears remarkably.
If the number of crystals generated in each sample droplet is large as in the first sample that does not apply an electric field, it will not grow into a large crystal and the necessary crystals will not be obtained. Since the number of crystals generated in each sample droplet is reduced and the size of the crystal is increased correspondingly, the necessary crystals can be obtained.
In addition, since the diameter of a droplet is typically 1 mm or less (volume 1 μl or less), a very large number of droplets can be set on a small surface. For example, if the droplet has a volume of 1 μl, 96 droplets can be easily placed in an 8 × 12 row on a 3 × 4.5 cm surface.
図５は、上記したタンパク質結晶化装置を用いて、実際にサンプル液滴５に所定の電場を付与して、別のタンパク質（ソーマチン）の結晶化を観察した結果を示すグラフである。
この実験では、ソーマチンを0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.25）に溶解し、100 mg/mL に調製したものをタンパク溶液とし、沈殿剤として1.0 M酒石酸ナトリウム溶液を0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.25）に溶解したものを用い、それぞれ1.0 μL （直径1.2 mm ）を混合したサンプル液滴（2 μL ）を60個生成して、パラフィンオイルから成る不活性溶液中で前記サンプル液滴を保持したサンプルホルダーを４つ準備し、
第１のサンプルホルダーには電場を付与せず、
第２のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流500V/mm(100V)の電場を付与し、
第３のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流1000V/mm(200V)の電場を付与し、
第４のサンプルホルダーには各サンプル液滴に下方に配置された電極により直流1350 V/mm(270V)の電場を付与し、結晶化の状態を観察した。
尚、実験に使用したタンパク質結晶化装置における電極板の電極間の間隔は０．２ｍｍであり、上記括弧内に記載した電圧は実際に印加した電圧値を示している。
図５は、最終的に各サンプルの各サンプル液滴に生成された結晶数の平均値を示したグラフである。
図５の実験結果から明らかなように、電場を全く付与しない第１のサンプルに比べて電場を付与した場合に、電場強度を上げるにつれて１つの液滴中に生成する結晶数が減少することを表している。このことより、電場を付与した場合、結晶化が促進され、析出される結晶のサイズが増加することが分かる。特に、ソーマチンの場合、1000 V/mm から1350 V/mm の電場を付与した場合に電場により結晶数が減少する効果が顕著に現れていることが分かる。
電場を付与しない第１のサンプルのように各サンプル液滴中に生成される結晶の数が多いと、大きな結晶に成長しないため必要な結晶が得られないが、前記条件の電場を与えると、各サンプル液滴中に生成される結晶の数が少なくなり、その分、結晶の大きさが大きくなるため十分なX線回折の解像度を得るために必要な結晶が得られる。
図６は、第１〜４のサンプルから一つずつピックアップした結晶に対してＸ線回折装置（超高輝度Ｘ線発生装置 FR-E SuperBright（リガク））を用いてＸ線を照射し、検出器（高速イメージングプレートＸ線検出器 R-AXIS VII（リガク））により検出した回折像である。その解像度を表１に示す。
In this experiment, thaumatin was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.25) and adjusted to 100 mg / mL as a protein solution, and 1.0 M sodium tartrate solution as a precipitant was added to 0.1 M phosphate buffer (pH 60 sample droplets (2 μL) mixed with 1.0 μL each (diameter 1.2 mm) were generated using the solution dissolved in 6.25), and the sample droplets were held in an inert solution of paraffin oil. Prepare 4 sample holders,
No electric field is applied to the first sample holder,
The second sample holder is given an electric field of DC 500V / mm (100V) to each sample droplet by the electrode placed below,
To the third sample holder, an electric field of 1000V / mm (200V) DC is applied to each sample droplet by the electrode placed below,
The fourth sample holder was applied with an electric field of direct current 1350 V / mm (270 V) to each sample droplet by an electrode disposed below, and the crystallization state was observed.
In the protein crystallization apparatus used in the experiment, the distance between the electrodes of the electrode plate is 0.2 mm, and the voltage described in the parentheses indicates the actually applied voltage value.
FIG. 5 is a graph showing an average value of the number of crystals finally generated in each sample droplet of each sample.
As is clear from the experimental results in FIG. 5, when an electric field is applied compared to the first sample that does not apply an electric field at all, the number of crystals generated in one droplet decreases as the electric field strength increases. Represents. From this, it can be seen that when an electric field is applied, crystallization is promoted and the size of the precipitated crystals increases. In particular, in the case of thaumatin, it can be seen that when an electric field of 1000 V / mm to 1350 V / mm is applied, the effect of reducing the number of crystals by the electric field appears remarkably.
If the number of crystals generated in each sample droplet is large as in the first sample that does not apply an electric field, it will not grow into a large crystal and the necessary crystals will not be obtained. Since the number of crystals generated in each sample droplet is reduced and the size of the crystal is increased correspondingly, crystals necessary for obtaining sufficient X-ray diffraction resolution can be obtained.
Fig. 6 shows the detection by irradiating X-rays to the crystals picked up from the first to fourth samples one by one using an X-ray diffractometer (ultra-high brightness X-ray generator FR-E SuperBright). It is the diffraction image detected by the instrument (high-speed imaging plate X-ray detector R-AXIS VII (Rigaku)). The resolution is shown in Table 1.
次に、図７を参照して、本発明に係る結晶化装置のさらに好ましい実施例を説明してく。
図７（ａ）及び（ｂ）は、結晶化装置の第２実施例の概略横断面図を各々示しており、（ａ）は、電極２を有する基板１にサンプル液滴保持手段がセットされた状態を示しており、（ｂ）は、電極２を有する基板１からサンプル液滴保持手段が分離された状態を示している。
尚、本実施例では、図１に示した要素と同一又は同等の要素には、図１に用いた符号を同じ符号を付して、詳細な説明は省略する。
電極板６は、基板１上に一対の電極２ａ及び２ｂを複数列配置して成る。
基板１の材料は、ガラスやプラスチック板のような任意の非導電性材料であり得る。電極２の加工には、例えば、銅、金、ITO（イソジウムスズ酸化物）等の任意の導電性材料が用いられ得る。
上記した電極板６の上には、サンプル液滴保持手段９が着脱可能に設けられる。
分離可能なサンプル液滴保持手段９は、ホルダー８にプラスチックフィルム７を固定することにより形成され、その内部にサンプル液滴と混じりあわない溶液４が収容されている。サンプル液滴５は、上記したサンプル液滴保持手段９におけるサンプル液滴と混じりあわない溶液４内に配置される。この実施例では、プラスチックフィルム７が絶縁体として機能するため、電極板６に絶縁体（図１の実施例における絶縁体３）を設ける必要がない。
プラスチックフィルム７の厚さは、５μｍ〜１００μｍの間の範囲であり、好ましくは、５μｍ〜４０μｍの間の範囲である。フィルム材料は、任意の絶縁性材料、好ましくは、サンプル液滴と混じりあわない溶液が油の場合には、油に対して非浸透性の材料であり得る。
上記したように構成されたタンパク質結晶化装置は、電極２ａ及び２ｂ間に電位差を与えることにより、サンプル液滴５が置かれている電極２ａ及び２ｂ上に電場を生じさせる。Next, a further preferred embodiment of the crystallization apparatus according to the present invention will be described with reference to FIG.
FIGS. 7A and 7B respectively show schematic cross-sectional views of the second embodiment of the crystallization apparatus, and FIG. 7A shows that the sample droplet holding means is set on the substrate 1 having the electrodes 2. (B) shows a state in which the sample droplet holding means is separated from the substrate 1 having the electrodes 2.
In this embodiment, the same or equivalent elements as those shown in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals used in FIG. 1, and detailed description thereof is omitted.
The electrode plate 6 is formed by arranging a plurality of pairs of electrodes 2 a and 2 b on the substrate 1.
The material of the substrate 1 can be any non-conductive material such as glass or plastic plate. For the processing of the electrode 2, for example, any conductive material such as copper, gold, ITO (isodium tin oxide) can be used.
A sample droplet holding means 9 is detachably provided on the electrode plate 6 described above.
The separable sample droplet holding means 9 is formed by fixing a plastic film 7 to a holder 8 and contains therein a solution 4 that does not mix with sample droplets. The sample droplet 5 is disposed in the solution 4 that does not mix with the sample droplet in the sample droplet holding means 9 described above. In this embodiment, since the plastic film 7 functions as an insulator, it is not necessary to provide the electrode plate 6 with an insulator (insulator 3 in the embodiment of FIG. 1).
The thickness of the plastic film 7 is in the range between 5 μm and 100 μm, preferably in the range between 5 μm and 40 μm. The film material can be any insulating material, preferably a material that is impermeable to oil when the solution that does not mix with the sample droplets is oil.
The protein crystallization apparatus configured as described above generates an electric field on the electrodes 2a and 2b on which the sample droplet 5 is placed by applying a potential difference between the electrodes 2a and 2b.
最後に、上記したように構成された結晶化装置を備えたタンパク質結晶化処理装置の実施例を説明する。 Finally, an embodiment of a protein crystallization treatment apparatus provided with the crystallization apparatus configured as described above will be described.
図８は、本発明に係るタンパク質結晶化装置を備えたタンパク質結晶化処理装置（以下、単に結晶化処理装置と称する。）の概略ブロック図である。
図面に示すように、このタンパク質結晶化処理装置は、
試薬及びタンパク質溶液の液体微粒子を供給する液体微粒子供給部Ａ、
液体微粒子供給部Ａから供給された試薬及びタンパク質溶液を混合してサンプル液滴保持手段９上に保持させる溶液処理部Ｂと、
サンプル液滴保持手段９上に保持されたサンプル液滴５に電場を印加してタンパク質の結晶化を促進させるタンパク質結晶化装置Ｃと、
前記タンパク質結晶化装置Ｃにおいて結晶化の促進がなされているサンプル液滴におけるタンパク質の結晶化成長を定期的に監視する結晶化成長監視部Ｄと、
サンプル液滴保持手段９を溶液処理部Ｂから結晶化装置Ｃへ移送すると共に、必要に応じて、結晶化装置Ｃから結晶化成長監視部Ｄへ、また、結晶化成長監視部Ｄから結晶化装置Ｃへ移送する移送手段Ｅと
を有する。FIG. 8 is a schematic block diagram of a protein crystallization treatment apparatus (hereinafter simply referred to as a crystallization treatment apparatus) provided with a protein crystallization apparatus according to the present invention.
As shown in the drawing, this protein crystallization treatment apparatus is
A liquid fine particle supply unit A for supplying liquid fine particles of a reagent and a protein solution;
A solution processing unit B that mixes the reagent and protein solution supplied from the liquid fine particle supply unit A and holds them on the sample droplet holding means 9;
A protein crystallization apparatus C that promotes protein crystallization by applying an electric field to the sample droplet 5 held on the sample droplet holding means 9;
A crystallization growth monitoring unit D for periodically monitoring the crystallization growth of the protein in the sample droplet in which crystallization is promoted in the protein crystallization apparatus C;
The sample droplet holding means 9 is transferred from the solution processing unit B to the crystallization device C, and, if necessary, from the crystallization device C to the crystallization growth monitoring unit D and from the crystallization growth monitoring unit D to crystallization. And transfer means E for transferring to the apparatus C.
始めに、溶液処理部Ｂについて説明する。
図９は溶液処理部Ｂの回路構成を示す概略図であり、図１０は溶液処理部Ｂの図１０におけるＡ−Ａ断面に相当する概略断面図である。
溶液処理部Ｂは、基板１１上に複数の静電気発生用の電極線を配置した回路部１３と、回路部１３に着脱可能に構成されたサンプル液滴保持手段９とを有する。
前記回路部１１は、図９に示すように、
１８本の電極線を同芯状に９０度の扇型に配置した第１電極郡１３ａと、
第１電極郡１３ａにおける中心に位置する電極線と平行に配置された２６本の電極線から成る第２電極郡１３ｂと、
第２電極郡１３ｂに隣接するように配置され、第２電極郡１３ｂの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第３電極郡１３ｃと、
第３電極郡１３ｃに隣接するように配置され、第３電極郡１３ｃの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第４電極郡１３ｄと、
第４電極郡１３ｄに隣接するように配置され、第４電極郡１３ｄの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第５電極郡１３ｅと、
第５電極郡１３ｅに隣接するように配置され、第５電極郡１３ｅの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第６電極郡１３ｆと、
第６電極郡１３ｆに隣接するように配置され、第６電極郡１３ｆの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第７電極郡１３ｇと、
第７電極郡１３ｇに隣接するように配置され、第７電極郡１３ｇの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第８電極郡１３ｈと、
第８電極郡１３ｈに隣接するように配置され、第８電極郡１３ｈの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第９電極郡１３ｉと、
第９電極郡１３ｉに隣接するように配置され、第９電極郡１３ｉの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された２６本の電極線から成る第１０電極郡１３ｊと、
第１０電極郡１３ｊに隣接するように配置され、第１０電極郡１３ｊの各電極線の向きと直交する向きに平行に配置された５本の電極線から成る第１１電極郡１３ｋと
を有する。
溶液処理部Ｂは、各電極郡１３ａ〜１３ｋの電極線の電圧を制御する一つ又は複数の制御装置（図示せず）を有する。
サンプル液滴保持手段９は、図１０に示すように、電気絶縁性材料から成る基部１６を備えている。この基部１６は、回路部１３に着脱可能に構成された下側部分１６ａと、サンプル液滴と混じりあわない溶液（例えば、油）を収容する上側部分１６ｂとから成る。尚、図１０はサンプル液滴保持手段９が回路部１３に取り付けられている状態を、図１１はサンプル液滴保持手段９を回路部１３から取り外した状態を各々示している。
上側部分１６ｂの内部の底面には親水性膜１７が形成されており、この親水性膜７の上面にはさらに疎水性膜８が形成されている。
前記疎水性膜８における第４電極郡１３ｄ、第６電極郡１３ｆ、第８電極郡１３ｈ及び第１０電極郡１３ｊに対応する位置には、複数の親水化スポット１９が形成されている。
これらの親水化スポット１９は、例えば、親水性膜１７上に疎水性膜１８を堆積させる前に、予めレジストを所定のパターンで形成しておき、疎水性膜１８を堆積させた後に、レジスト部分を除去して親水性膜１７を部分的に露出させることにより形成される。
また、基部１６の上側部分１６ｂの上壁における第１電極郡１３ａに対応する位置には、液体微粒子供給部１からの液体微粒子を導入するための開口１６ｃが必要数設けられている（この実施例では２つ）。
図１２は、回路部１３の電極郡と、サンプル液滴保持手段９の親水化スポット１９及び開口１６ｃとの位置関係を示す図である。
上記したように構成されたサンプル液滴保持手段９は、サンプル液滴の生成時には回路部１３に取り付けて使用され、必要数のサンプル液滴が生成保持された後は、回路部１３から取り外されて、移送手段Ｅにより結晶化装置Ｃ及び結晶化成長監視部Ｄへ移送される。First, the solution processing unit B will be described.
FIG. 9 is a schematic diagram illustrating a circuit configuration of the solution processing unit B, and FIG. 10 is a schematic cross-sectional view corresponding to the AA cross section in FIG.
The solution processing unit B includes a circuit unit 13 in which a plurality of electrode lines for generating static electricity are arranged on a substrate 11 and a sample droplet holding unit 9 configured to be detachable from the circuit unit 13.
As shown in FIG.
A first electrode group 13a in which 18 electrode wires are concentrically arranged in a fan shape of 90 degrees;
A second electrode group 13b composed of 26 electrode lines arranged in parallel with the electrode line located in the center of the first electrode group 13a;
A third electrode group 13c composed of five electrode lines arranged adjacent to the second electrode group 13b and arranged in parallel to the direction orthogonal to the direction of each electrode line of the second electrode group 13b;
A fourth electrode group 13d composed of 26 electrode lines arranged adjacent to the third electrode group 13c and arranged in parallel to the direction orthogonal to the direction of each electrode line of the third electrode group 13c;
A fifth electrode group 13e composed of five electrode lines arranged adjacent to the fourth electrode group 13d and arranged in parallel to a direction orthogonal to the direction of each electrode line of the fourth electrode group 13d;
A sixth electrode group 13f composed of 26 electrode lines arranged adjacent to the fifth electrode group 13e and arranged in parallel to a direction orthogonal to the direction of each electrode line of the fifth electrode group 13e;
A seventh electrode group 13g consisting of five electrode lines arranged adjacent to the sixth electrode group 13f and arranged parallel to the direction orthogonal to the direction of each electrode line of the sixth electrode group 13f;
An eighth electrode group 13h composed of 26 electrode lines arranged adjacent to the seventh electrode group 13g and arranged parallel to the direction orthogonal to the direction of each electrode line of the seventh electrode group 13g;
A ninth electrode group 13i composed of five electrode lines arranged adjacent to the eighth electrode group 13h and arranged parallel to the direction orthogonal to the direction of each electrode line of the eighth electrode group 13h;
A tenth electrode group 13j composed of 26 electrode lines arranged adjacent to the ninth electrode group 13i and arranged parallel to the direction orthogonal to the direction of each electrode line of the ninth electrode group 13i;
An eleventh electrode group 13k composed of five electrode lines arranged adjacent to the tenth electrode group 13j and parallel to the direction orthogonal to the direction of each electrode line of the tenth electrode group 13j.
The solution processing unit B includes one or a plurality of control devices (not shown) that control the voltage of the electrode lines of the electrode groups 13a to 13k.
As shown in FIG. 10, the sample droplet holding means 9 includes a base portion 16 made of an electrically insulating material. The base portion 16 includes a lower portion 16a configured to be detachable from the circuit portion 13 and an upper portion 16b that contains a solution (for example, oil) that does not mix with the sample droplet. 10 shows a state in which the sample droplet holding means 9 is attached to the circuit unit 13, and FIG. 11 shows a state in which the sample droplet holding unit 9 is detached from the circuit unit 13.
A hydrophilic film 17 is formed on the bottom surface inside the upper portion 16 b, and a hydrophobic film 8 is further formed on the upper surface of the hydrophilic film 7.
A plurality of hydrophilized spots 19 are formed at positions corresponding to the fourth electrode group 13d, the sixth electrode group 13f, the eighth electrode group 13h, and the tenth electrode group 13j in the hydrophobic film 8.
These hydrophilization spots 19 are formed by, for example, forming a resist in a predetermined pattern in advance before depositing the hydrophobic film 18 on the hydrophilic film 17, and then depositing the hydrophobic film 18 on the resist portion. And the hydrophilic film 17 is partially exposed.
In addition, a necessary number of openings 16c for introducing liquid particles from the liquid particle supply unit 1 are provided at positions corresponding to the first electrode groups 13a on the upper wall of the upper portion 16b of the base 16 (this implementation). Two in the example).
FIG. 12 is a diagram showing the positional relationship between the electrode group of the circuit unit 13 and the hydrophilization spot 19 and the opening 16 c of the sample droplet holding means 9.
The sample droplet holding means 9 configured as described above is used by being attached to the circuit unit 13 when generating sample droplets, and is removed from the circuit unit 13 after the required number of sample droplets are generated and held. Then, it is transferred to the crystallization apparatus C and the crystallization growth monitoring unit D by the transfer means E.
ここで、上記したように複数の電極線に電圧を印加して液滴を移動させる原理について説明する。
始めに、同方向に並べられた電極線に印加する電圧と液滴の移動との関係について図１３を参照しながら説明する。これは、各電極郡内において液滴の移動させる時の原理である。
電極線には、図１３（ａ）〜（ｄ）に示すように、適当なサイクル時間で電極線を一本づつ移動するように６相の電圧（＋＋＋―――）が順次印加される。電圧を移動する方向が液滴の進行方向になる（尚、電圧の印加パターンは本実施例に限定されるものではない。）
上記したように、適当なサイクル時間で６相の電圧（＋＋＋―――）が移動している電極線上に液滴が載ると、マイナスに帯電している液滴は、負の電圧が印加されている電極とは反発し、正の電圧が印加されている電極には引き寄せられるため、電圧が移動する方向に移動することになる。そして、電圧を移動を止めると、液滴はその位置で止まる。
各電極郡内においては、上記した原理で液滴は移動する。
次に、異なる方向に並べられた電極線に印加する電圧と液滴の移動との関係を図１４（ａ）及び（ｂ）を参照して説明する。これは、電極線の方向が異なる電極郡間で液滴を移動させる原理である。
図１４において、電極郡Ｘと電極郡Ｙとは、その電極線の方向が異なっている。図１４（ａ）においては、電極郡Ｘには、６相の電圧（＋＋＋―――）が印加されているが、電極郡Ｘ内において電圧の移動がないため液滴は、正の電圧が印加された電極と負の電圧が印加された電圧との間で停止している。
そして、図１４（ａ）に示す状態から、図１４（ｂ）に示すように、電極郡Ｘの全電極線に負の電圧を印加し、電極郡Ｙにおける電極郡Ｘと隣接している電極線（全ての電極線でもよい）に正の電圧を印加することにより、マイナスに帯電している液滴は、電極部Ｘの電極線とは反発し、電極部Ｙの電極線には引き寄せられるため電極部Ｘから電極部Ｙに移り変わる。
電極線の方向が異なる電極部間においては、上記した原理で液滴は移動する。Here, the principle of moving a droplet by applying a voltage to a plurality of electrode lines as described above will be described.
First, the relationship between the voltage applied to the electrode lines arranged in the same direction and the movement of the droplet will be described with reference to FIG. This is the principle when droplets are moved within each electrode group.
As shown in FIGS. 13A to 13D, six-phase voltages (++++) are sequentially applied to the electrode lines so as to move the electrode lines one by one at an appropriate cycle time. The direction in which the voltage is moved is the traveling direction of the droplet (note that the voltage application pattern is not limited to this embodiment).
As described above, when a droplet is placed on an electrode line in which a six-phase voltage (++++) is moving in an appropriate cycle time, a negative voltage is applied to the negatively charged droplet. The electrode repels and is attracted to the electrode to which a positive voltage is applied, so that the voltage moves in the moving direction. When the voltage stops moving, the droplet stops at that position.
Within each electrode group, the droplet moves on the principle described above.
Next, the relationship between the voltage applied to the electrode lines arranged in different directions and the movement of the droplet will be described with reference to FIGS. 14 (a) and 14 (b). This is the principle of moving a droplet between electrode groups having different electrode line directions.
In FIG. 14, the electrode group X and the electrode group Y have different electrode line directions. In FIG. 14A, a six-phase voltage (++++) is applied to the electrode group X. However, since there is no voltage movement in the electrode group X, the droplet has a positive voltage. There is a stop between the applied electrode and the negative voltage applied.
Then, from the state shown in FIG. 14A, as shown in FIG. 14B, a negative voltage is applied to all electrode lines of the electrode group X, and the electrode adjacent to the electrode group X in the electrode group Y By applying a positive voltage to a line (or all electrode lines), a negatively charged droplet repels the electrode line of the electrode part X and is attracted to the electrode line of the electrode part Y. Therefore, the electrode part X is changed to the electrode part Y.
The droplet moves between the electrode portions having different electrode line directions on the principle described above.
開口１６ｃを介して、第１電極郡１３ａに供給されたタンパク質溶液の液滴５ａと結晶化のために必要な試薬の液滴５ｂとは、上記した原理により第１電極郡１３ａにおいて静電搬送された結果、第１電極郡１３ａの中心において衝突して合体し、サンプル液滴５となる（図１５参照）。
次いで、サンプル液滴５は、上記した原理により、第２電極郡１３ｂから所定の電極郡の親水化スポット１９まで静電搬送される。
親水化スポット１９は、親水性膜が露出しているため、サンプル液滴は、親水化スポットに到達した時に、露出された親水性膜に接触する。サンプル液滴は、親水性膜に接触すると、その球状形状が崩れるため電極線に印加した電圧の作用ではそれ以上移動しなくなり、結果的に、親水化スポット上で保持される。したがって、一度、親水化スポット上で保持されると電極線に電圧を印加しなくてもサンプル液滴５は移動しない。
図１６は、サンプル液滴が親水化スポットに保持される状態を概念的に示す図である。
以上説明した処理を、必要回数連続して繰り返して親水化スポット上に必要数のサンプル液滴を保持させた状態を図１７に示す。
前記したように、一度、親水化スポット上で保持されると電極に電圧を印加しなくてもサンプル液滴は動かないので、この状態で、サンプル液滴保持手段９は、回路部１３から取り外され（図１１参照）、移送手段４０によりタンパク質結晶化装置Ｃへ運ばれる。
尚、上記した実施例では、ある電極群から、その電極群の電極線と電極線の方向が異なる他の電極群へ液滴を移動させる時に、乗せかえ前の電極群の全ての電極線に正の電圧を印加すると共に、乗せかえ後の電極群の全ての電極線に負の電圧を印加しているが、これは本実施例に限定されることなく、乗せかえ前の電極群と乗せかえ後の電極群に逆相の電圧を印加すればよい。Through the opening 16c, the droplet 5a of the protein solution supplied to the first electrode group 13a and the droplet 5b of the reagent necessary for crystallization are electrostatically transported in the first electrode group 13a according to the principle described above. As a result, they collide at the center of the first electrode group 13a and coalesce into a sample droplet 5 (see FIG. 15).
Next, the sample droplet 5 is electrostatically conveyed from the second electrode group 13b to the hydrophilization spot 19 of the predetermined electrode group according to the principle described above.
Since the hydrophilic film 19 is exposed in the hydrophilization spot 19, the sample droplet contacts the exposed hydrophilic film when it reaches the hydrophilization spot. When the sample droplet comes into contact with the hydrophilic film, its spherical shape collapses, so that the sample droplet does not move any more by the action of the voltage applied to the electrode wire, and as a result, is held on the hydrophilic spot. Therefore, once held on the hydrophilization spot, the sample droplet 5 does not move even if no voltage is applied to the electrode wire.
FIG. 16 is a diagram conceptually illustrating a state in which the sample droplet is held in the hydrophilization spot.
FIG. 17 shows a state in which the necessary number of sample droplets are held on the hydrophilization spot by repeating the above-described process continuously the required number of times.
As described above, once held on the hydrophilization spot, the sample droplet does not move even if no voltage is applied to the electrode. In this state, the sample droplet holding means 9 is removed from the circuit unit 13. (Refer to FIG. 11) and conveyed to the protein crystallization apparatus C by the transfer means 40.
In the above-described embodiment, when a droplet is moved from one electrode group to another electrode group in which the direction of the electrode line is different from that of the electrode group, all the electrode lines of the electrode group before the change are transferred. While a positive voltage is applied and a negative voltage is applied to all electrode lines of the electrode group after replacement, this is not limited to the present embodiment, and this is not limited to this example. A reversed-phase voltage may be applied to the electrode group after replacement.
タンパク質結晶化装置Ｃは、サンプル液滴保持手段９を装着可能な電極板６を備えている。
図１８は、タンパク質結晶化装置Ｃにおいて電極板６にサンプル液滴保持手段９を装着した状態を示す概略横断面図、図１９は、電極板６からサンプル液滴保持手段９を取り外した状態示す概略横断面図である。
図面に示すように、電極板６は基板１に一対の電極２を複数列配置して成り、電極板６にサンプル液滴保持手段９を装着した状態において、親水化スポット１９上に保持されたサンプル液滴５が、一対の電極２ａ及び２ｂの中間に位置するように構成されている。
この状態において、不図示の制御装置を用いて電極２ａ及び２ｂ間に電位差を与えてサンプル液滴５が置かれている電極２ａ及び２ｂ上に電場を生じさせ、サンプル液滴における結晶化を促進させ、及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出を図る。The protein crystallization apparatus C includes an electrode plate 6 on which a sample droplet holding means 9 can be attached.
18 is a schematic cross-sectional view showing a state in which the sample droplet holding means 9 is mounted on the electrode plate 6 in the protein crystallization apparatus C, and FIG. 19 shows a state in which the sample droplet holding means 9 is removed from the electrode plate 6. It is a schematic cross-sectional view.
As shown in the drawing, the electrode plate 6 is formed by arranging a plurality of rows of a pair of electrodes 2 on the substrate 1 and is held on the hydrophilization spot 19 in a state where the sample droplet holding means 9 is mounted on the electrode plate 6. The sample droplet 5 is configured to be positioned between the pair of electrodes 2a and 2b.
In this state, a potential difference is applied between the electrodes 2a and 2b using a control device (not shown) to generate an electric field on the electrodes 2a and 2b on which the sample droplet 5 is placed, thereby promoting crystallization in the sample droplet. And / or precipitation of high quality crystals with high X-ray diffraction resolution.
ここで、上記したように構成された溶液処理部Ｂに、液滴を供給する液滴供給部Ａについて簡単に説明する。
液滴供給部Ａは、溶液処理部Ｂにタンパク質溶液の液滴と試薬の液滴とを供給するよう構成されている。
好ましくは、この液滴供給部Ａから供給される液滴は、合体したサンプル液滴が１ｍｍ以下（容積１μｌ以下）になるように調整される。Here, the droplet supply unit A that supplies droplets to the solution processing unit B configured as described above will be briefly described.
The droplet supply unit A is configured to supply the solution processing unit B with a protein solution droplet and a reagent droplet.
Preferably, the droplets supplied from the droplet supply unit A are adjusted so that the combined sample droplets are 1 mm or less (volume is 1 μl or less).
最後に、結晶化成長監視部Ｄの構成について説明する。
移送手段Ｅは、定期的に結晶化部Ｃからサンプル液滴保持手段９を取り出し、結晶化成長監視部Ｄに移送する。
結晶化成長監視部Ｄは、移送手段Ｅにより移送されてきたサンプル液滴保持手段９のサンプル液滴の結晶化を光学的又は電気的に監視し、その結果を記録及び／又は表示する。
結晶化成長監視部Ｄとしては、様々な構成が考えられるが、ここで、幾つかの例を説明する。
例えば、結晶化成長監視部Ｄは、光源と光電子増倍管を備え、前記光源によりサンプル液滴保持手段上のサンプル液滴に光を照射し、光電子増倍管によりサンプル液滴の屈折率を検出し、検出した屈折率の変化に基づいてサンプル液滴中のタンパク質の結晶化成長度合いを判断し得る。この場合、例えば、検出した屈折率の増加に伴ってサンプル液滴中のタンパク質の結晶化が進んでいると判断することができる。検出結果は、適当な記録装置に記録することができ、また、必要に応じて、ディスプレイ、プリンタ、ランプ及び／又はスピーカー等により視覚的及び／又は聴覚的に、タンパク質の結晶化成長度合いを使用者に表示することができる。
別の例としては、例えば、結晶化成長監視装置Ｄは、自動焦点合わせ機能を有する光学測定手段を備え、自動焦点合わせ機能によりサンプル液滴保持手段上のサンプル液滴中の焦点位置を検出し、焦点位置の検出によりタンパク質の結晶化成長度合いを判断し得る。この場合、例えば、焦点位置が検出できない場合は結晶化成長が進んでいないが、焦点位置が検出できた場合には結晶化成長が進んでいると判断することができる。検出結果は、適当な記録装置に記録することができ、また、必要に応じて、ディスプレイ、プリンタ、ランプ及び／又はスピーカー等により視覚的及び／又は聴覚的に、タンパク質の結晶化成長度合いを使用者に表示することができる。
さらに別の例としては、例えば、結晶化成長監視装置Ｄは、光源と受光手段を備え、光源によりサンプル液滴保持手段上のサンプル液滴に光を照射した後、受光手段で照射した光を受光し、受光手段で受光した光量に基づいて、サンプル液滴の吸光量を検出し、検出した吸光量に基づいてタンパク質の結晶化成長度合いを判断し得る。この場合、例えば、吸光量の増加に伴ってサンプル液滴中のタンパク質の結晶化が進んでいると判断することができる。検出結果は、適当な記録装置に記録することができ、また、必要に応じて、ディスプレイ、プリンタ、ランプ及び／又はスピーカー等により視覚的及び／又は聴覚的に、タンパク質の結晶化成長度合いを使用者に表示することができる。Finally, the configuration of the crystallization growth monitoring unit D will be described.
The transfer means E periodically takes out the sample droplet holding means 9 from the crystallization part C and transfers it to the crystallization growth monitoring part D.
The crystallization growth monitoring unit D optically or electrically monitors the crystallization of the sample droplets of the sample droplet holding unit 9 transferred by the transfer unit E, and records and / or displays the result.
Various configurations are conceivable as the crystallization growth monitoring unit D. Here, some examples will be described.
For example, the crystallization growth monitoring unit D includes a light source and a photomultiplier tube, irradiates the sample droplet on the sample droplet holding means with the light source, and sets the refractive index of the sample droplet by the photomultiplier tube. The degree of crystallization growth of the protein in the sample droplet can be determined based on the detected change in the refractive index. In this case, for example, it can be determined that the crystallization of the protein in the sample droplet is progressing as the detected refractive index increases. The detection result can be recorded in an appropriate recording device, and the crystallization growth degree of the protein is used visually and / or audibly by a display, a printer, a lamp, and / or a speaker, if necessary. Can be displayed.
As another example, for example, the crystallization growth monitoring apparatus D includes an optical measurement unit having an automatic focusing function, and detects the focal position in the sample droplet on the sample droplet holding unit by the automatic focusing function. The degree of crystallization growth of the protein can be determined by detecting the focal position. In this case, for example, when the focal position cannot be detected, crystallization growth does not proceed, but when the focal position can be detected, it can be determined that crystallization growth proceeds. The detection result can be recorded in an appropriate recording device, and the crystallization growth degree of the protein is used visually and / or audibly by a display, a printer, a lamp, and / or a speaker, if necessary. Can be displayed.
As still another example, for example, the crystallization growth monitoring apparatus D includes a light source and a light receiving unit, and after irradiating the sample droplet on the sample droplet holding unit with the light source, the light irradiated by the light receiving unit is emitted. The absorbance of the sample droplet can be detected based on the amount of light received and received by the light receiving means, and the degree of protein crystallization growth can be determined based on the detected absorbance. In this case, for example, it can be determined that the crystallization of the protein in the sample droplet is progressing as the amount of light absorption increases. The detection result can be recorded in an appropriate recording device, and the crystallization growth degree of the protein is used visually and / or audibly by a display, a printer, a lamp, and / or a speaker, if necessary. Can be displayed.
尚、上記した結晶化処理装置の実施例では、構成が分かりやすいように一つのサンプル液滴保持手段に８つの液滴を保持する例を示しているが、サンプル液滴保持手段に保持すべき液滴の数は本実施例に限定されるものではない。
前述したが、液滴の直径は、典型的には、3ｍｍ以下（容積１0μｌ以下）であるため、非常に多くの数の液滴を小さい表面上にセットすることが可能になる。例えば、容積が１0μｌの液滴であれば、３×４．５ｃｍの表面上に、８×１２の列に配置して９６個の液滴を簡単に乗せることが可能である。
また、上記した実施例では、液滴保持手段の下方に電極を配置し、サンプル液滴に対して下方から結晶化のための電場を印加しているが、これは本実施例に限定されることなく、例えば、電極を液滴保持手段の上方に配置して、サンプル液滴に対して上方から電場を印加するように構成してもよい。
さらにまた、上記したタンパク質結晶化処理装置の実施例では、溶液処理部Ｂとタンパク質結晶化装置Ｃとが個々に異なる電極を有するように構成しているが、この構成は本実施例に限定されることなく、溶液処理部Ｂの進行波電場発生用電極とタンパク質結晶化装置Ｃの結晶化のための電場発生用電極とを共通化して、溶液処理部Ｂの電極を用いてサンプル液滴に結晶化のための電圧を印加するように構成してもよい。
また、上記した実施例では、結晶化装置においてサンプル液滴に始めから結晶化のための電圧を印加しているが、好ましくは、結晶化のための電圧を印加する前に、サンプル液滴に対して瞬間的（好ましくは、1秒以下）に少なくとも800V/mmより高い電場を印加するように構成され得る。このようにサンプル液滴に瞬間的に高い電場を印加することにより、高電場下でサンプル液滴が電極に強く引き付けられて変形し、液滴が電極面に接触する面積が増加し、その後の電場付与による結晶化促進効果及び／又はX線回折の解像度が高くなる質の高い結晶の析出の増大を図ることができる。また、液滴を電極面に多く接触するように変形させることで、液滴周辺の影（黒い部分）が少なくなる。サンプル液滴における結晶化の観察を画像処理によって行う場合、液滴周辺の影の部分が多いと、その影の部分に重なる結晶が、影なのか結晶なのか判別し難くなるが、このように液滴を電極面に多く接触するように変形させることで液滴周辺の影の部分を少なくすることができ、結果として、結晶化の観察が行いやすくなる。
図２０（ａ）及び（ｂ）は、同じ条件のサンプル液滴に対して800V/mmの電圧を１週間印加した後のサンプル液滴の状態と、880V/mmの電圧を１秒印加した後のサンプル液滴の状態を示す写真である。この実験結果から、800V/mmの電圧では１週間印加してもサンプル液滴の形状が変形していないのに対して、880V/mmの電圧を印加すると１秒間でサンプル液滴を変形できることが分かる。よって、少なくとも800V/mmより高い電圧（好ましくは、880V/mm以上の電圧）を瞬間的に印加することにより、サンプル液滴を変形させることができることがわかる。
さらにまた、前述したが、電極には、例えば、銅、金、ITO（イソジウムスズ酸化物）等の任意の導電性材料を用いることができる。尚、先に説明した図４の写真は、銅電極を用いて実験を行った結果のサンプル液滴の上面写真である。銅電極を用いる場合は、銅に透光性がないため反射光を用いた写真しか撮影することができない。このため図４に示すように、写真に電極が写りこんでしまう。しかし、電極にITO膜を用いると、ITO膜が透明であるため図２１に示すように、電極板３０の上に、サンプル液滴保持手段３５を搭載したまま、透過光の偏光を使って顕微鏡４０等で結晶の観察を行うことができる。
尚、図２１は、電極板３０の上にサンプル液滴保持手段３５を搭載したまま顕微鏡４０等で結晶の観察を行う場合の結晶化装置の概略横断面図であり、図中、符号３１はITO電極、符号３２はITO電極を配したガラス基板、符号３６はプラスチックフィルム等の絶縁膜、符号３７はホルダー、符号３８はサンプル液滴と混じりあわない溶液（例えば、油等）、符号３９は液滴、符号４１及び４２は偏向板、符号４３は光源を各々示している。
図２２は、ITO膜を利用した図２１の結晶化装置を用いて実際に結晶化させた結晶を透過光の偏光を使って撮影した写真である。In the embodiment of the crystallization processing apparatus described above, an example is shown in which eight droplets are held in one sample droplet holding means so that the configuration is easy to understand, but should be held in the sample droplet holding means. The number of droplets is not limited to this embodiment.
As described above, since the diameter of the droplet is typically 3 mm or less (volume of 10 μl or less), a very large number of droplets can be set on a small surface. For example, if the droplet has a volume of 10 μl, it is possible to easily place 96 droplets in an 8 × 12 row on a 3 × 4.5 cm surface.
In the above-described embodiment, an electrode is disposed below the droplet holding unit, and an electric field for crystallization is applied to the sample droplet from below, but this is limited to this embodiment. Instead, for example, the electrode may be disposed above the droplet holding means, and the electric field may be applied to the sample droplet from above.
Furthermore, in the above-described embodiment of the protein crystallization processing apparatus, the solution processing unit B and the protein crystallization apparatus C are configured to have different electrodes, but this configuration is limited to the present embodiment. The electrode for traveling wave electric field generation of the solution processing unit B and the electrode for electric field generation for crystallization of the protein crystallization apparatus C are used in common without using the electrode of the solution processing unit B. You may comprise so that the voltage for crystallization may be applied.
In the above-described embodiment, a voltage for crystallization is applied to the sample droplet from the beginning in the crystallization apparatus. However, preferably, before applying the voltage for crystallization, the sample droplet is applied to the sample droplet. In contrast, an electric field higher than at least 800 V / mm may be applied instantaneously (preferably less than 1 second). By applying a high electric field instantaneously to the sample droplet in this way, the sample droplet is strongly attracted to the electrode and deforms under a high electric field, and the area where the droplet contacts the electrode surface increases, and thereafter It is possible to increase the precipitation of high-quality crystals that increase the crystallization promoting effect and / or X-ray diffraction resolution by applying an electric field. Further, by deforming the droplets so as to come into contact with the electrode surface, shadows (black portions) around the droplets are reduced. When observing crystallization in a sample droplet by image processing, if there are many shadow portions around the droplet, it will be difficult to determine whether the crystal overlapping the shadow portion is a shadow or a crystal. By deforming the droplets so as to be in contact with the electrode surface, the shadow portion around the droplets can be reduced, and as a result, crystallization can be easily observed.
FIGS. 20A and 20B show the state of a sample droplet after applying a voltage of 800 V / mm for one week to a sample droplet under the same conditions, and after applying a voltage of 880 V / mm for 1 second. It is a photograph which shows the state of the sample droplet. From this experimental result, the shape of the sample droplet is not deformed even if it is applied for one week at a voltage of 800 V / mm, whereas the sample droplet can be deformed in one second when a voltage of 880 V / mm is applied. I understand. Therefore, it can be seen that the sample droplet can be deformed by instantaneously applying a voltage higher than at least 800 V / mm (preferably a voltage of 880 V / mm or more).
Furthermore, as described above, for the electrode, any conductive material such as copper, gold, ITO (isodium tin oxide), or the like can be used. Note that the above-described photograph of FIG. 4 is a top view photograph of a sample droplet as a result of an experiment using a copper electrode. When a copper electrode is used, only a photograph using reflected light can be taken because copper does not transmit light. For this reason, as shown in FIG. 4, the electrode is reflected in the photograph. However, when an ITO film is used as the electrode, the ITO film is transparent, and therefore, as shown in FIG. 21, a microscope using the polarized light of the transmitted light with the sample droplet holding means 35 mounted on the electrode plate 30 is used. Crystals can be observed at 40 mag.
FIG. 21 is a schematic cross-sectional view of the crystallization apparatus when observing crystals with the microscope 40 or the like while the sample droplet holding means 35 is mounted on the electrode plate 30. ITO electrode, reference numeral 32 is a glass substrate on which an ITO electrode is disposed, reference numeral 36 is an insulating film such as a plastic film, reference numeral 37 is a holder, reference numeral 38 is a solution that does not mix with sample droplets (for example, oil), and reference numeral 39 is Droplets, reference numerals 41 and 42 are deflecting plates, and reference numeral 43 is a light source.
FIG. 22 is a photograph of a crystal actually crystallized using the crystallization apparatus of FIG. 21 using an ITO film, using the polarization of transmitted light.
１ 基板
２ 電極
３ 絶縁体
４ サンプル液滴と混じりあわない溶液
５ サンプル液滴
６ 電極板
７ プラスチックフィルム
８ ホルダー
９ サンプル液滴保持手段
Ａ 液体微粒子供給部
Ｂ 溶液処理部
１１ 基板
１３ 回路部
１３ａ〜１３ｋ 電極郡
１６ 基部
１６ａ 下側部分
１６ｂ 上側部分
１６ｃ 開口（液滴導入部）
１７ 親水性膜
１８ 疎水性膜
１９ 親水化スポット
Ｃ タンパク質結晶化促進装置
Ｄ 結晶化成長監視部
Ｅ 移送手段DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Substrate 2 Electrode 3 Insulator 4 Solution not mixed with sample droplet 5 Sample droplet 6 Electrode plate 7 Plastic film 8 Holder 9 Sample droplet holding means A Liquid fine particle supply unit B Solution processing unit 11 Substrate 13 Circuit unit 13a 13k Electrode group 16 Base 16a Lower part 16b Upper part 16c Opening (droplet introduction part)
17 Hydrophilic film 18 Hydrophobic film 19 Hydrophilization spot C Protein crystallization promoting device D Crystallization growth monitoring unit E Transfer means
Claims (12)
各サンプル液滴の上方または下方に一対の電極を並べて配置し、前記電極によりサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加する
ことを特徴とするマイクロバッチ法における結晶化方法。A droplet of a reagent necessary for protein crystallization is directly added to a small amount of protein solution droplet to generate a sample droplet, and the sample droplet is crystallized in a predetermined environment. In the microbatch method,
A crystallization method in a microbatch method, wherein a pair of electrodes are arranged side by side above or below each sample droplet, and an electric field for crystallization is applied to the sample droplet from above or below with the electrodes.
ことを特徴とする請求項１に記載の結晶化方法。Before applying the electric field for crystallization, an electric field higher than 800 V / mm is instantaneously applied to the sample droplet by the electrode, and the area where the droplet contacts the electrode surface is expanded. The crystallization method according to claim 1.
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の結晶化方法。The crystallization method according to claim 1 or 2, wherein the electric field is a DC electric field or an AC electric field.
ことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の結晶化方法。The electrode according to any one of claims 1 to 3, wherein the electrode is made of a transparent material so that the sample droplet can be observed with the electrode disposed above or below the sample droplet. The crystallization method as described.
前記保持手段の上方または下方であって、各サンプル液滴の上方または下方に並べて配置された一対の電極と
を有し、
前記電極により、保持手段で保持されたサンプル液滴に上方または下方から結晶化のための電場を印加するように構成した
ことを特徴とするマイクロバッチ法において用いられる結晶化装置。Holding means for holding a sample droplet generated by directly adding a droplet of a reagent necessary for protein crystallization to a small amount of a protein solution droplet;
A pair of electrodes arranged above or below the holding means and above or below each sample droplet;
A crystallization apparatus for use in a microbatch method, wherein the electrode is configured to apply an electric field for crystallization from above or below to a sample droplet held by a holding means.
該電気絶縁疎水性層に隣接してサンプル液滴と混じりあわない溶液層から成る保持手段が配置され、
前記サンプル液滴と混じりあわない溶液層内でサンプル液滴が保持される
ことを特徴とする請求項５に記載の結晶化装置。An electrically insulating hydrophobic layer is provided above or below the electrode;
A holding means consisting of a solution layer that does not mix with the sample droplets is disposed adjacent to the electrically insulating hydrophobic layer;
The crystallization apparatus according to claim 5, wherein the sample droplet is held in a solution layer that does not mix with the sample droplet.
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の結晶化装置。Before applying the electric field for crystallization, an electric field higher than 800 V / mm is instantaneously applied to the sample droplet by the electrode, and the area where the droplet contacts the electrode surface is expanded. The crystallization apparatus according to claim 5 or 6.
ことを特徴とする請求項５〜７の何れか一項に記載の結晶化装置。The crystallization apparatus according to claim 5, wherein the electric field is a DC electric field or an AC electric field.
ことを特徴とする請求項５〜８の何れか一項に記載の結晶化装置。The electrode according to any one of claims 5 to 8, wherein the electrode is made of a transparent material so that the sample droplet can be observed with the electrode arranged above or below the sample droplet. The crystallization apparatus as described.
該進行波電場発生用電極の上に配置されるサンプル液滴と混じりあわない溶液層を有する液滴保持手段とを備え、
前記進行波電場発生用電極に所定の周波数で電圧を印加することにより、前記液滴保持手段中に供給されたタンパク質の結晶化のために必要な試薬の液滴とタンパク質溶液の液滴とを移動して合体させてサンプル液滴を生成し、次いで、前記サンプル液滴を前記液滴保持手段内で保持するように構成された溶液処理手段と、
前記溶液処理手段における液滴保持手段に、前記液滴を供給する液滴供給手段と、
前記サンプル液滴を保持した液滴保持手段における各サンプル液滴に上方又は下方から結晶化のための電場を付与できるように電極が配置された結晶化手段と、
結晶化手段において結晶化がなされている液滴保持手段中のサンプル液滴の結晶化成長を監視するための結晶化成長監視手段と、
前記液滴保持手段をサンプル液滴保持後に結晶化手段へ移送し、結晶化手段と結晶化成長監視手段との間で液滴保持手段を移送することができる移送手段と
を有することを特徴とするタンパク質結晶化処理装置。A traveling wave electric field generating electrode; and
A droplet holding means having a solution layer that does not mix with the sample droplets disposed on the traveling wave electric field generating electrode;
By applying a voltage at a predetermined frequency to the traveling wave electric field generating electrode, a reagent droplet and a protein solution droplet necessary for crystallization of the protein supplied in the droplet holding means are formed. Solution processing means configured to move and coalesce to produce sample droplets and then hold the sample droplets in the droplet holding means;
Droplet supply means for supplying the droplets to the droplet holding means in the solution processing means;
Crystallization means in which electrodes are arranged so that an electric field for crystallization can be applied from above or below to each sample droplet in the droplet holding means holding the sample droplet;
Crystallization growth monitoring means for monitoring the crystallization growth of the sample droplet in the droplet holding means being crystallized in the crystallization means;
A transfer means capable of transferring the droplet holding means to the crystallization means after holding the sample droplet and transferring the droplet holding means between the crystallization means and the crystallization growth monitoring means. A protein crystallization treatment apparatus.
ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質結晶化処理装置。The protein crystallization treatment apparatus according to claim 10, wherein the traveling wave electric field generating electrode of the solution treatment means and the electrode of the crystallization means are separate electrodes.
ことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質結晶化処理装置。The protein crystallization treatment apparatus according to claim 10, wherein the traveling wave electric field generating electrode of the solution treatment means and the electrode of the crystallization means are the same electrode.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005344697 | 2005-11-29 | ||
| JP2005344697 | 2005-11-29 | ||
| PCT/JP2006/323812 WO2007063898A1 (en) | 2005-11-29 | 2006-11-29 | Method and apparatus for crystallization of protein, and apparatus for protein crystallization treatment |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007063898A1 true JPWO2007063898A1 (en) | 2009-05-07 |
Family
ID=38092231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007547972A Pending JPWO2007063898A1 (en) | 2005-11-29 | 2006-11-29 | Protein crystallization method and apparatus, and protein crystallization treatment apparatus |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPWO2007063898A1 (en) |
| WO (1) | WO2007063898A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8945303B2 (en) | 2009-03-03 | 2015-02-03 | Institute Of National Colleges Of Technology, Japan | Device for crystallizing biopolymer, cell of solution for crystallizing biopolymer, method for controlling alignment of biopolymer, method for crystallizing biopolymer and biopolymer crystal |
| JP7222331B2 (en) * | 2019-08-07 | 2023-02-15 | 日本精工株式会社 | MANIPULATION SYSTEM AND METHOD FOR DRIVING MANIPULATION SYSTEM |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3360616B2 (en) * | 1998-08-12 | 2002-12-24 | 住友金属工業株式会社 | Crystal growth method and crystal growth apparatus |
| JP2001213699A (en) * | 2000-01-31 | 2001-08-07 | Sumitomo Metal Ind Ltd | Crystal preparation equipment, crystal preparation method, and its equipment kit |
| JP2003332266A (en) * | 2002-05-13 | 2003-11-21 | Kansai Tlo Kk | Wiring method for nanotube and control circuit for nanotube wiring |
| FR2842747B1 (en) * | 2002-07-23 | 2004-10-15 | Commissariat Energie Atomique | METHOD AND DEVICE FOR SCREENING MOLECULES IN CELLS |
| JP3980493B2 (en) * | 2003-01-23 | 2007-09-26 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Protein crystallization method and apparatus by electrostatic transport |
| JP2005069893A (en) * | 2003-08-25 | 2005-03-17 | Shimadzu Corp | Surface plasmon resonance device and analyzer using the same |
-
2006
- 2006-11-29 WO PCT/JP2006/323812 patent/WO2007063898A1/en active Application Filing
- 2006-11-29 JP JP2007547972A patent/JPWO2007063898A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007063898A1 (en) | 2007-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8222014B2 (en) | Planar electroporation apparatus and method | |
| US4894343A (en) | Chamber plate for use in cell fusion and a process for production thereof | |
| DE69737883T2 (en) | LIGHT-REGULATED, ELECTROKINETIC COMPOSITION OF PARTICLES TO SURFACES | |
| JP4530991B2 (en) | Microinjection method and apparatus | |
| US6379916B1 (en) | Device and process for the examination of cells using the patch-clamp method | |
| Chayen et al. | Macromolecular crystallization and crystal perfection | |
| CN106663584B (en) | The observation method of electron microscope and sample | |
| US20060275924A1 (en) | Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces | |
| WO2002057763A2 (en) | Apparatus and method for identification of crystals by in-situ x-ray diffraction | |
| US20110042215A1 (en) | Ac field induced biomolecule cyrstallization and hydration cage disruption | |
| Vogel et al. | Electrochemical microscopy based on spatial light modulators: A projection system to spatially address electrochemical reactions at semiconductors | |
| CN103582809A (en) | Method and device for optical analysis of biopolymer | |
| DE10253717B4 (en) | Device for contacting for the test of at least one test object, test system and method for testing test objects | |
| US7161148B1 (en) | Tip structures, devices on their basis, and methods for their preparation | |
| WO2005038048A1 (en) | Apparatus and methods for detecting nucleic acid in biological samples | |
| JPWO2007063898A1 (en) | Protein crystallization method and apparatus, and protein crystallization treatment apparatus | |
| Vielzeuf et al. | Multilevel modular mesocrystalline organization in red coral | |
| Zhao et al. | A simple pressure-assisted method for MicroED specimen preparation | |
| WO2011127962A1 (en) | Method and device for contacting a row of contact surfaces with probe tips | |
| Watanabe et al. | Semi-automatic protein crystallization system that allows in situ observation of X-ray diffraction from crystals in the drop | |
| US7335882B1 (en) | High resolution low dose transmission electron microscopy real-time imaging and manipulation of nano-scale objects in the electron beam | |
| JP2008137961A (en) | Protein crystallization method | |
| US8876569B2 (en) | Vacuum cell-assembling device and cell-assembling method | |
| Al-haq et al. | Protein crystallization under an electric field | |
| US20190383764A1 (en) | Graphene-based electro-microfluidic devices and methods for protein structural analysis |