JPWO2006121134A1 - マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・カンサシの検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)と置換されていてもよい。以下同じ。)の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(2)配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー。
(3)配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プローブ。
(4)配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー及び/又はプローブとして用いることを特徴とするマイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
(5)配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー及び/又はプローブとして含んでなるマイコバクテリウム・カンサシ検出用試薬キット。
(1)M.カンサシに対する特異性が高いと判断された候補クローン、
(2)特開平11-155589号に記載されたM.カンサシのKAS配列を用いた結果
(3)特願2004-129272号明細書に記載されたM.tuberculosis由来の配列番号8(本明細書では配列番号81)を用いた場合の結果
(a) Cy5蛍光強度/Cy3蛍光強度の比率 ≧ 10.0 を示すライン
(b) Cy5蛍光強度/Cy3蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c) Cy5蛍光強度/Cy3蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン
(a') Cy3蛍光強度/Cy5蛍光強度の比率 ≧ 10.0 を示すライン
(b') Cy3蛍光強度/Cy5蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c') Cy3蛍光強度/Cy5蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン。
Venter et al., Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351 に記載のWhole Genome Shotgun法を改変して、下記の方法で、M.カンサシのWhole Genome Shotgun libraryの作製を行う。
続いて、下記の方法でマイクロアレイを作製する。
別に、M.カンサシ菌株から抽出、精製したゲノムDNAおよび対照用ゲノム(例えばウシ型結核菌等の結核菌)DNAを、ヘキシルアミノ-UTPを用いた間接標識法により、夫々Cy3、及びCy5でラベリングする。
前記(2)で作製したマイクロアレイ(DNAチップ)上に、上記(3)で調製したCy3Cy5標識産物溶液を全てのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせる。これをハイブリカセットにセットし、タッパーなどに蒸留水で湿らせたキムタオル等をひいて密閉し、65℃で8 時間以上反応させて(遮光)、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でマイクロアレイを静かに揺らしてカバーグラスをはずす。1×SSC、0.03%SDS溶液(60℃)で10 分間洗浄、0.2×SSC 溶液(42℃)で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液(室温)で10 分間洗浄後、新しい乾いたラックにマイクロアレイをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させる。
蛍光読み取りスキャナーを用いて、上記(4)でマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定し、Cy3及びCy5の、2チャンネルでの蛍光強度を測定して、蛍光検出データを得る。蛍光シグナルの数量化は市販のDNAチップ発現イメージ解析ソフトウェア等を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行えば良い。
配列番号7(1c_plate1_Fw3):33位〜51位、
配列番号8(1c_plate1_Fw4):212位〜231位、
配列番号9(1c_plate1_Fw5):315位〜334位、
配列番号10(1c_plate1_Rv3):185位〜204位、
配列番号11(1c_plate1_Rv4):411位〜430位、
配列番号12(1c_plate1_Rv5):461位〜481位。
配列番号17(6c_plate1_Fw3):4位〜21位、
配列番号18(6c_plate1_Fw4):48位〜67位、
配列番号19(6c_plate1_Fw5):229位〜247位、
配列番号20(6c_plate1_Fw6):279位〜296位、
配列番号21(6c_plate1_Fw7):380位〜399位、
配列番号22(6c_plate1_Rv3):166位〜184位、
配列番号23(6c_plate1_Rv4):195位〜214位、
配列番号24(6c_plate1_Rv5):368位〜387位、
配列番号25(6c_plate1_Rv6):428位〜445位、
配列番号26(6c_plate1_Rv7):523位〜542位。
配列番号31(8d_plate1_Fw3):5位〜22位、
配列番号32(8d_plate1_Fw4):54位〜72位、
配列番号33(8d_plate1_Fw5):207位〜226位、
配列番号34(8d_plate1_Fw6):289位〜308位、
配列番号35(8d_plate1_Fw7):472位〜490位、
配列番号36(8d_plate1_Rv3):151位〜169位、
配列番号37(8d_plate1_Rv4):220位〜239位、
配列番号38(8d_plate1_Rv5):335位〜353位、
配列番号39(8d_plate1_Rv6):408位〜427位、
配列番号40(8d_plate1_Rv7):616位〜635位。
配列番号45(9c_plate1_Fw3):17位〜36位、
配列番号46(9c_plate1_Fw4):117位〜135位、
配列番号47(9c_plate1_Fw5):405位〜424位、
配列番号48(9c_plate1_Fw6):492位〜512位、
配列番号49(9c_plate1_Rv3):182位〜201位、
配列番号50(9c_plate1_Rv4):263位〜281位、
配列番号51(9c_plate1_Rv5):528位〜547位、
配列番号52(9c_plate1_Rv6):654位〜673位。
(A)配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(本発明のオリゴヌクレオチド)をプライマーとして用いる方法、
(B)本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして用いる方法、
等が挙げられる。以下に、夫々の方法について説明する。
(A)の方法としては、本発明のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長物を検出する方法が挙げられ、具体的には例えば、本発明のプライマーを用いて、これを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、DNAポリメラーゼ等による核酸増幅[例えばPCR;特許文献3、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法(Tsugunori Notomi et al., Nucleic Acid Res., 28, e63, 2000)、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法(臨床病理, 51(11), 1061-1067, 2003, Nov)、LCR(ligase chain reaction)法(特開平4-211399号)、SDA(strand displacement amplification)法(特開平8-19394号)]を行ってプライマー伸長させる方法が挙げられ、これによりM.カンサシの核酸配列の特定の領域の配列を増幅させることができるので、得られたプライマー伸長物を測定することにより、M.カンサシを検出することができる。
(1)フォワードプライマーが配列番号5で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号6で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(2)フォワードプライマーが配列番号13で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号14で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(3)フォワードプライマーが配列番号15で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号16で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(4)フォワードプライマーが配列番号13で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号16で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(5)フォワードプライマーが配列番号27で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号28で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(6)フォワードプライマーが配列番号29で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号30で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(7)フォワードプライマーが配列番号27で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号30で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(8)フォワードプライマーが配列番号41で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号42で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(9)フォワードプライマーが配列番号43で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号44で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、
(10)フォワードプライマーが配列番号41で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号44で表される核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである組合せ、等が挙げられる。
(A−1)ポリメラーゼ連鎖反応を行った後、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法
この方法としては、例えば
「下記工程
(i)配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.カンサシの遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー(本発明のプライマー)として用い、試料中の核酸を鋳型としてPCRを行う、
(ii)上記(i)で得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果に基づいてM.カンサシを検出する、
を包含することを特徴とするM.カンサシの検出方法」が挙げられる。
上記の、目的とする大きさ(塩基対数)のプライマー伸長物画分を確認することにより判定する方法としては、例えば、まずPCRを行い、得られたプライマー伸長物について電気泳動を行う。PCRで用いるフォワードプライマーとリバースプライマーから、増幅産物の大きさ(塩基対数)を予測しておき、得られた泳動画分が予測された大きさの増幅産物に該当するか否かを、常法により確認すればよい。例えば、得られた画分をエチジウムブロマイド等で染色して核酸種を視覚化するといった方法で、その増幅産物の特徴的大きさにより検出する等の方法が挙げられる。
標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより判定する方法としては、例えば電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、本発明のプローブを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在の有無を、該標識プローブの標識を検出することによって確認したものを陽性と判定する方法が挙げられる。
本発明のM.カンサシの検出方法には、リアルタイム増幅検出系(例えば米国特許第5210015号、米国特許第5538848号の記載参照)も用いることができる。
すなわち、5'末端を蛍光色素(レポーター)で、3'末端をクエンチャー色素で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャー色素によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からDNAポリメラーゼを用いてPCRを行う。DNAポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが5'端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムPCR法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型DNAの初期量を正確に定量することができる。
この方法としては、本発明のプライマーを前記した方法で標識化した標識プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型としたPCRを行い、得られたプライマー伸長物の標識を測定することによって、標識を検出できた場合には、M.カンサシ陽性と判定する方法が挙げられる。この方法に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、前記のPCR法において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも前記したとおりである。
更に、本発明のM.カンサシの検出方法として、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(本発明のオリゴヌクレオチド)を標識物質で標識化したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出する方法が挙げられる。
(B−1)本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に結合して、捕捉プローブとして用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、試料中のM.カンサシ由来の核酸を固相上に固定化させる検出法、(例えば、特開昭62-265999号の記載参照)、
(B−2)(B-1)の捕捉プローブと、本発明のプローブを標識した標識プローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、固相担体上に補足プローブとM.カンサシ由来の核酸と標識プローブの複合体を形成させて、標識プローブの標識を測定するサンドイッチアッセイ(例えば、特開昭58-40099号の記載参照)を行う方法、
(B−3)ビオチンで標識した本発明のプローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーション後、試料中のM.カンサシ由来の核酸をアビジン結合担体で捕捉する方法等が、挙げられる。
(1)配列番号5で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号6で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(2)配列番号13で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号14で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(3)配列番号15で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号16で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(4)配列番号13で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号16で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(5)配列番号27で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号28で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(6)配列番号29で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号30で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(7)配列番号27で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号30で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(8)配列番号41で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号42で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(9)配列番号43で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号44で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(10)配列番号41で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと、配列番号44で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し、且つM.カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであるリバースプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。
(1)DNA試料の調製
まず、小川培地上で培養したM.カンサシ(Mycobacterium kansasii)のコロニーを精製水に懸濁し、オートクレーブ処理(120℃・2気圧、20分)した後、菌体の粉砕処理(直径2mmガラスビーズによる物理的破砕)を経て、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、(株)キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ DNA抽出精製キットGenomic-tipを用いてDNAの抽出、精製を行い、M.カンサシ由来のゲノムDNAを得た。
上記(1)で得られたDNA試料24μgを材料として、以下の方法(Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-51 Venter et al.に記載のWhole Genome Shotgun法を改変)で、Whole Genome Shotgun libraryの作製を行った。
下記の方法で、上記(2)で得られたM.カンサシゲノムのWhole Genome Shotgunクローンを用いてPCRを行い、スライドガラス上に固定するプローブ材料を調製した。
熱変性: 94℃、0.5分
アニーリング:55℃、1分
重合反応: 75℃、0.5分。
i)標的ゲノムDNAの蛍光色素標識
まず、BioPrime DNA labeling system(インビトロジェン社製)を利用し、M.カンサシ(ATCC12478)由来ゲノムおよび、対照用ゲノム(ウシ型結核菌、ATCC19274))DNAの各々2μgに対してそれぞれ製品中のrandom primer solution;20μLを混合し、熱変性(95℃、5分間)処理を行った。
上記(4) i)で得られた乾燥状態のゲノムDNAの標識化産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、ゲノムDNAの標識化産物で断片化した生成物を得た。
salmon sperm DNA(10mg/mL) ;0.5μL
formamide ;5μL
Total 40〜50μL
懸濁混和後、95℃で5 分インキュベートし、ハイブリダイゼーションまで70℃に保っておいた。
前記(3)で得られたマイクロアレイ(DNAチップ)上に、上記(4)ii)で得られたCy3標識産物とCy5標識産物の混合溶液を全てのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせた。これをハイブリカセットにセットし、タッパーに蒸留水で湿らせたキムタオルをひいいたものの上に載せて密閉し、65℃で8 時間以上反応させてハイブリダイゼーションを行った(遮光)。ハイブリダイゼーション後、DNAチップをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でDNAチップを静かに揺らしてカバーグラスをはずした。次いで1×SSC、0.03%SDS溶液(60℃)で10 分間洗浄、 0.2×SSC 溶液(42℃)で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液(室温)で10 分間洗浄した後、新しい乾いたラックにDNAチップをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させた。
蛍光読み取りスキャナー(Protein Array Scanner;日本レーザ電子社製)を用いて、上記4)iii)で得られたマイクロアレイ上の蛍光強度を測定し、2ch(Cy3、Cy5)での蛍光検出データを得た。蛍光シグナルの数量化は日立ソフト社製のDNASISTM-Array(DNAチップ発現イメージ解析ソフトウェア)を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行った。また、信頼性限界ラインを定め、それ以下の領域のデータは扱わない事で正規化され信頼性のある蛍光強度比を求めた。
(b) Cy5蛍光強度/Cy3蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c) Cy5蛍光強度/Cy3蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン
(a') Cy3蛍光強度/Cy5蛍光強度の比率 ≧ 10.0 を示すライン
(b') Cy3蛍光強度/Cy5蛍光強度の比率 ≧ 5.0 を示すライン
(c') Cy3蛍光強度/Cy5蛍光強度の比率 ≧ 2.0 を示すライン
上記(5)で選択された、候補8クローンについて、下記の方法で塩基配列決定を行った。
M13 Primer M1 ;1μL(5pmol)
premix ;8μL
上記の混合物に、総volume=20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)にて、下記の反応条件で30サイクルのシークエンス反応を行った。
96℃ 2 min → (96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min)×25 →4℃
実験例1で得られた候補8クローンについてPCR増幅系を利用したアガロースゲル電気泳動検出による評価実験を実施し、これらの候補クローンが、遺伝子増幅検出系を用いたM.カンサシの特異的検出系に利用できるかどうかを調べた。
まず、決定された候補クローン1のシークエンスの解析結果に基づき、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてPCR増幅検出のためのプライマー配列を設計した。設計した「CGGCCATTGTTCTACAGTCT」(配列番号5,以下、1c_plate1_Fw1と呼ぶ)および「TAGAGATCCATCGCTTTGGT」(配列番号6、以下、1c_plate1_Rv1と呼ぶ)を用い、下記の通りPCRを行った。ABI社DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、設計したオリゴヌクレオチドを合成した。合成手法はABI社マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を55℃で一夜加熱することにより実施した。次いでファルマシア社製FPLCを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、合成オリゴヌクレオチドを精製した。
以下に示す細菌を用い、下記の方法でDNAを抽出・精製し、DNA試料を得た。細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。
b:Mycobacterium tuberculosis(マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌)
c:Mycobacterium kansasii(M.カンサシ)
d:Mycobacterium marinum(マイコバクテリウム・マリナム)
e:Mycobacterium simiae(マイコバクテリウム・シミアエ)
f:Mycobacterium scrofulaceum(マイコバクテリウム・スクロフラセウム)
g:Mycobacterium gordonae(マイコバクテリウム・ゴルドネア)
h:Mycobacterium szulgai(マイコバクテリウム・スズルガイ)
i:Mycobacterium avium(マイコバクテリウム・アビウム)
j:Mycobacterium intracellulare(マイコバクテリウム・イントラセルラーレ)
k:Mycobacterium gastri(マイコバクテリウム・ガストリ)
l:Mycobacterium xenopi(マイコバクテリウム・ゼノピ)
m:Mycobacterium nonchromogenicum(マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム)
n:Mycobacterium terrae(マイコバクテリウム・テレ)
o:Mycobacterium triviale(マイコバクテリウム・トリビアレ)
p:Mycobacterium fortuitum(マイコバクテリウム・フォーチュイタム)
q:Mycobacterium chelonei(マイコバクテリウム・セロネイ)
r:Mycobacterium abscessus(マイコバクテリウム・アプセッサス)
s:Mycobacterium peregrinum(マイコバクテリウム・ペレグリナム)
候補クローンの塩基配列(配列番号1)をもとに、上述の方法で設計、合成したプライマー配列である1c_plate1_Fw1および1c_plate1_Rv1を用い、下記の通りPCRを行った。尚、候補クローン1の塩基配列上の、各プライマーの所在位置は図1に示した通りである。
熱変性: 94℃、0.5分
アニーリング:55℃、1分
重合反応: 75℃、0.5分。
上記(3)で得られたPCR後の反応液5μlを、1.5%アガロースゲル電気泳動した。電気泳動の電気的条件は、定電圧100V、30分行った。操作方法並びに他の条件はバイオ実験イラストレイテッド2巻, p53-63(秀潤社、中山広樹 著)に記載の一般的に用いられる方法に従った。次いでエチジウムブロマイド染色した後、UVサンプル撮影装置FAS-IIIシステム(東洋紡績(株)製)を用いて紫外線での蛍光を検出した。また、分子量マーカーも反応液と同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたDNA断片の長さを算出した。尚、分子量マーカーは、X174/HaeIII digest(マーカー4、(株)ニッポン・ジーン製)を使用した。
M4:分子量マーカー(マーカー4)
a:Escherichia coli (大腸菌)
b:Mycobacterium tuberculosis(マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌)
c:Mycobacterium kansasii(M.カンサシ)
d:Mycobacterium marinum(マイコバクテリウム・マリナム)
e:Mycobacterium simiae(マイコバクテリウム・シミアエ)
f:Mycobacterium scrofulaceum(マイコバクテリウム・スクロフラセウム)
g:Mycobacterium gordonae(マイコバクテリウム・ゴルドネア)
h:Mycobacterium szulgai(マイコバクテリウム・スズルガイ)
i:Mycobacterium avium(マイコバクテリウム・アビウム)
j:Mycobacterium intracellulare(マイコバクテリウム・イントラセルラーレ)
k:Mycobacterium gastri(マイコバクテリウム・ガストリ)
l:Mycobacterium xenopi(マイコバクテリウム・ゼノピ)
m:Mycobacterium nonchromogenicum(マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム)
n:Mycobacterium terrae(マイコバクテリウム・テレ)
o:Mycobacterium triviale(マイコバクテリウム・トリビアレ)
p:Mycobacterium fortuitum(マイコバクテリウム・フォーチュイタム)
q:Mycobacterium chelonei(マイコバクテリウム・セロネイ)
r:Mycobacterium abscessus(マイコバクテリウム・アプセッサス)
s:Mycobacterium peregrinum(マイコバクテリウム・ペレグリナム)
実験例1(6)で得られた候補クローン2について、その塩基配列をもとに実施例1(1)と同様の方法でフォワードプライマーとして6c_plate1_Fw1(候補配列13)及びリバースプライマーとして6c_plate1_Rv1 (候補配列14)のプライマーを設計し、合成を行った。次いで、実施例1(2)〜(4)と同様の試料及び試薬を用いて、同様の方法でPCR、及び電気泳動を行った。
実験例1(6)で得られた候補クローン3〜8について、その塩基配列をもとに実施例1(1)と同様の方法でプライマーの設計、合成を行い、夫々のプライマーを用いる以外は実施例1(2)〜(4)と同様の試料及び試薬を用いて、同様の方法でPCR、及び電気泳動を行った。
実施例1(1)と同じ機器を用い、同様の操作で1c_plate1_Fw1(配列番号5)、及び1c_plate1_Rv1(配列番号6)のオリゴヌクレオチドを合成した。
1c_plate1_Fw1および1c_plate1_Rv1をプライマーとして用いたPCRで増幅される配列番号53のオリゴヌクレオチド配列(167塩基対)から、プローブとして利用するための配列「ACTCAATGCCCTTCGATCCCGGCGAAC」を設計し、この配列のオリゴヌクレオチドを合成した(以下、KAN1c_F1R1_FAMTAMと記載する。配列番号80)。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素FAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを結合し、標識オリゴヌクレオチドプローブ(TaqManTMフルオレセント・プローブ、アプライドバイオシステムズジャパン社製)を得た。
実験例1(1)で調製したM.カンサシ試料から得られたDNA試料について、吸光度を測定して試料中のDNA量を測定した。得られたDNA量を、既知のM.カンサシのゲノムDNA量と比較することにより、試料中のゲノムDNA量(ゲノムコピー数)を決定した。108コピー/μlのゲノムDNAが得られた。
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてDNA試料を105, 104, 103, 102, 10, 5, 2コピー/μLの希釈系列に希釈したものを調製し、PCR用DNA試料とした。
上記(1)で調製した1c_plate1_Fw1をフォワードプライマーとして、1c_plate1_Rv1をリバースプライマーとして用い、下記の通りリアルタイムPCRを行った。
得られた実験データから、リアルタイムPCR法において行われている常法に従って、検量線を作成した。
y=−3.348x+32.61
R2=0.995
Claims (29)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)と置換されていてもよい。以下同じ。)の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ(Mycobacterium kansasii)遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号5〜79で表される核酸配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号5〜79で表される核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドに相補的な配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
且つ連続する10塩基以上を含有するものである、請求項1で表されるオリゴヌクレオチド。 - 配列番号1で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号5〜12又は配列番号53〜56で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、配列番号2に示す核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号13〜26又は配列番号57〜64で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、配列番号3で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号27〜40又は配列番号65〜72で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、配列番号4で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号41〜52又は配列番号73〜79で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、
配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号5〜79で表される核酸配列から選ばれる配列に相補的な配列を含有するものである、
請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。 - 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー。
- 配列番号1で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号5〜12で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、配列番号2に示す核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号13〜26で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、配列番号3で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号27〜40で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、配列番号4で表される核酸配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号41〜52で表される核酸配列から選ばれる配列を含有するものであり、
配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号5〜52で表される核酸配列から選ばれる配列に相補的な配列を含有するものである、
請求項4に記載のプライマー。 - プライマーを構成するヌクレオチドの数が10〜50個である、請求項4に記載のプライマー。
- 標識物質で標識化された、請求項4に記載のプライマー。
- 標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項7に記載のプライマー。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・カンサシ検出用プローブ。
- 標識物質で標識化された、請求項9に記載のプローブ。
- 標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項10に記載のプローブ。
- 5'末端がレポーター蛍光色素で標識化され、3'末端がクエンチャー蛍光色素で標識化された、請求項9に記載のプローブ。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー及び/又はプローブとして用いることを特徴とするマイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長物を検出することを特徴とする、請求項13に記載の検出方法。
- 下記工程を包含することを特徴とする、請求項13に記載の検出方法、
(1)配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載の核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
(2)(1)で得られたプライマー伸長物について電気泳動を行い、その結果からマイコバクテリウム・カンサシを検出する。 - 電気泳動を行った後、得られた塩基泳動画分について、目的とする塩基対数のプライマー伸長物の画分を確認することにより行う、請求項15記載の検出方法。
- 電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する、請求項15に記載の検出方法。
- 標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項17に記載の検出方法。
- プライマーが標識物質で標識化されており、当該プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られたプライマー伸長物の標識を測定する、請求項13記載のマイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
- 標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項19に記載の検出方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長物の標識を測定する、請求項19に記載の検出方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長物を沈殿させた後、上清を除去することにより遊離の標識プライマーを除く、請求項21に記載の検出方法
- ポリメラーゼ連鎖反応を行って得られた反応物をゲルクロマトグラフィーで処理して、遊離の標識プライマーを除く、請求項21に記載の検出方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部若しくは全部、又はその相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出することを特徴とする、請求項13に記載のマイコバクテリウム・カンサシの検出方法。
- 標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項24に記載の検出方法。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4で表される核酸配列の一部又は全部、又はその相補配列の一部又は全部を含有し且つマイコバクテリウム・カンサシ遺伝子の核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー及び/又はプローブとして含んでなる、マイコバクテリウム・カンサシ検出用試薬キット。
- プライマー及び/又はプローブが標識物質で標識化されたものである、請求項26に記載のキット。
- 標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである請求項27に記載のキット。
- プローブが、5'末端がレポーター蛍光色素で標識化され、3'末端がクエンチャー色素で標識化されたものである、請求項27に記載のキット。
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