JPWO2006093289A1 - Method for producing UDP-xylose - Google Patents
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Abstract
キシロース付加糖鎖を合成するために必要なUDP-キシロースの効率のよい生産方法を確立し、より大量に供給するために、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のUDP-キシロース合成の際に前半の反応を触媒するUDP-glucose dehydrogenase をコードする遺伝子とUDP-キシロース合成の後半の反応を触媒するＵＤＰ-グルクロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が導入された形質転換体により、これら遺伝子を共発現させることによって、生体内および生体外で効率よくUDP-キシロースを合成する。In order to establish an efficient production method of UDP-xylose necessary for synthesizing xylose-added sugar chains and supply them in large quantities, the first half of the reaction was catalyzed during Arabidopsis thaliana UDP-xylose synthesis. By co-expressing these genes in vivo and in vivo using a transformant introduced with a gene encoding UDP-glucose dehydrogenase and UDP-glucuronic acid decarboxylase gene that catalyzes the latter reaction of UDP-xylose synthesis. UDP-xylose is efficiently synthesized outside.
Description
本発明は、UDP-キシロースの合成に関与するするＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ（UDP-glucose dehydrogenase ）遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター、該組み換えベクター及びＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）遺伝子を有する組換えベクターにより、形質転換された形質転換体、ならびに該形質転換体を利用したUDP-キシロース及びUDP-グルクロン酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a UDP-glucose dehydrogenase gene involved in the synthesis of UDP-xylose, a recombinant vector having the gene, the recombinant vector and UDP-glucuronic acid decarboxylase The present invention relates to a transformant transformed with a recombinant vector having a gene, and a method for producing UDP-xylose and UDP-glucuronic acid using the transformant.
糖タンパク質などの糖鎖は生体において、非常に重要な働きをしていることが明らかとなっており、このことから糖鎖の構造を自在に変換する糖鎖工学が重要技術となってきている。現在糖鎖を改変する技術としては、化学合成により目的の糖鎖を合成したものをタンパク質に結合させる化学的手法や、細胞が本来持つ内在性の糖鎖合成機能を遺伝子工学の手法を用いて目的の糖鎖に改変する、あるいは糖転移酵素そのものをタンパク質と反応させることで目的の糖タンパク質を得る生物学的手法などがある。化学的手法では、大量合成の手法に道が開けてきてはいるが、糖鎖の複雑性から、いまだに全ての種類の糖鎖を簡単に供給するには至ってはいない、また化学合成した糖鎖を効率良くかつ大量にタンパク質に結合させるのは困難である。一方、生物学的手法は、遺伝子工学の発展により、糖鎖合成関連遺伝子の発現及び機能を制御することが可能となったため、生物の細胞を用いた生体内での糖鎖改変が可能となってきている。また、糖鎖合成酵素を用いた生体外の糖鎖合成も非常に有用であり、均一で、大量の糖鎖の生産が可能となる。一方、生物学的手法を用いた生体内外での糖鎖合成では、糖ヌクレオチドが糖転移酵素の糖供与体として必須となるが、この糖ヌクレオチドは非常に高価であるので、大量生産に用いることは困難となっている。糖ヌクレオチドは、生体内に微量存在するものであり、かつ、高エネルギー結合で結ばれた非常に反応性に富む不安定な物質であるので、各生物においてその産生量はあまり多くないため大量に生産することは困難であるのが原因である。 It has been clarified that sugar chains such as glycoproteins play an extremely important role in the living body, and this makes sugar chain engineering that freely converts the structure of sugar chains an important technology. . Currently, the technology for modifying sugar chains includes chemical methods for synthesizing the target sugar chains by chemical synthesis and binding them to proteins, and the inherent sugar chain synthesis function of cells using genetic engineering techniques. There are biological methods for obtaining a target glycoprotein by modifying the target sugar chain or reacting glycosyltransferase itself with a protein. Chemical methods have opened the way to mass synthesis methods, but due to the complexity of sugar chains, all types of sugar chains have not yet been easily supplied. Is difficult to bind to proteins efficiently and in large quantities. On the other hand, the development of genetic engineering has made it possible to control the expression and function of sugar chain synthesis-related genes in biological techniques, so it is possible to modify sugar chains in vivo using living cells. It is coming. Furthermore, in vitro sugar chain synthesis using a sugar chain synthase is also very useful, and it is possible to produce a uniform and large amount of sugar chains. On the other hand, in the synthesis of sugar chains in vivo and in vivo using biological techniques, sugar nucleotides are essential as sugar donors for glycosyltransferases, but these sugar nucleotides are very expensive and should be used for mass production. Has become difficult. Since sugar nucleotides are present in trace amounts in living organisms and are highly reactive and unstable substances linked by high-energy bonds, their production is not so high in each organism. This is because it is difficult to produce.
近年、バクテリアを用いた生産系により、比較的多種類の糖ヌクレオチドの大量生産系が実用的なものへ近づいてきており、その供給は安定する方向へ向かっている。しかしながら、このバクテリアを用いる系では、２種の微生物を混合して、なおかつ、細胞中に含まれる一方の原料を他方の細胞中に送り込むために細胞を破壊した状況で生産を行うことから、ある程度反応過程の長いものでは生産量はそれほど多くなく、新たな手法の開発が求められている。また、バクテリアを用いた生産系によるUDP-キシロースの大量生産系に関する報告は無い。 In recent years, a production system using bacteria has brought a mass production system of relatively many kinds of sugar nucleotides closer to a practical one, and its supply is in a stable direction. However, in this system using bacteria, production is performed in a situation where cells are destroyed in order to mix two kinds of microorganisms and to send one raw material contained in the cells into the other cells. In the case of a long reaction process, the production volume is not so large, and the development of a new method is required. Moreover, there is no report about the mass production system of UDP-xylose by the production system using bacteria.
糖ヌクレオチドのうち、UDP-キシロースはキシロース転移酵素の糖供与体としてキシロースを含んだ糖鎖合成を行う際には必須のものである。キシロースを含んだ糖鎖にはプロテオグリカンに代表されるように機能的に重要な役割を果たすことが多いことから、糖供与体の大量で安価な供給が望まれている。また、キシロースを含んだO-結合型糖鎖やある種の植物ホルモンにはキシロースが結合しているものがあり、これらの生合成にもUDP-キシロースが糖供与体として用いられる。よって今後、これらのキシロース含有物質の研究開発が進み重要な機能が明らかになることで新たな需要の拡大が見込まれる。このUDP-キシロースはUDP-グルコースから2段階の反応を2つの酵素で触媒し合成されることが報告されている（1, 2；(図１)）。 この２段階の反応を触媒する酵素は、最初の１段階目の反応であるUDP-グルコースから脱水反応を起こしてUDP-グルクロン酸に変換する反応を触媒するUDP-glucose dehydrogenaseと、UDP-グルクロン酸から脱カルボン酸反応を起こしてUDP-キシロースに変換する反応を触媒するUDP-glucuronic acid decarboxylaseの２つである。
これらの酵素は植物や、真核生物では線虫からヒトなどの高等哺乳類まで、UDP-キシロースを使用する生物であればもっている普遍的な酵素である。ただし、このような生物は合成したUDP-キシロースを使用していくため、細胞内にUDP-キシロースが蓄積していくことはない。このため、生物体からUDP-キシロースを単離する場合、その生産量は極めて低くかつ高価である。また、遺伝子工学的手法を用いてUDP-キシロースを合成した例は見あたらない。
1, Tenhaken R, Thulke O (1996) Cloning of an enzyme that synthesizes a key nucleotide sugar precursor of hemicellulose biosynthesis from soybean: UDP-glucose dehydrogenase. Plant Physiol 112:1127-1134
2, Harper AD, Bar-Peled M (2002) Biosynthesis of UDP-xylose. Cloning and characterization of a novel Arabidopsis gene familiy, UXS, encoding soluble and putative membrane-bound UDP-glucuronic acid decarboxylase isoforms. Plant Physiol 130:2188-219Of the sugar nucleotides, UDP-xylose is essential when synthesizing sugar chains containing xylose as a sugar donor for xylose transferase. Since sugar chains containing xylose often play a functionally important role as typified by proteoglycan, a large-scale and inexpensive supply of sugar donors is desired. In addition, some O-linked sugar chains containing xylose and certain plant hormones have xylose bound thereto, and UDP-xylose is also used as a sugar donor for their biosynthesis. Therefore, in the future, new research and development of these xylose-containing substances will advance and new functions will be expected as important functions become clear. It has been reported that this UDP-xylose is synthesized from UDP-glucose by catalyzing a two-step reaction with two enzymes (1, 2; (FIG. 1)). The enzymes that catalyze these two-step reactions are UDP-glucose dehydrogenase, which catalyzes the reaction of dehydration from UDP-glucose, which is the first step reaction, and converted to UDP-glucuronic acid, and UDP-glucuronic acid. It is a UDP-glucuronic acid decarboxylase that catalyzes the reaction of decarboxylation and conversion to UDP-xylose.
These enzymes are universal enzymes possessed by plants and organisms that use UDP-xylose, from nematodes to higher mammals such as humans in eukaryotes. However, since such organisms use the synthesized UDP-xylose, UDP-xylose does not accumulate in the cells. For this reason, when UDP-xylose is isolated from an organism, its production is extremely low and expensive. In addition, no examples of UDP-xylose synthesis using genetic engineering techniques have been found.
1, Tenhaken R, Thulke O (1996) Cloning of an enzyme that synthesizes a key nucleotide sugar precursor of hemicellulose biosynthesis from soybean: UDP-glucose dehydrogenase.Plant Physiol 112: 1127-1134
2, Harper AD, Bar-Peled M (2002) Biosynthesis of UDP-xylose.Cloning and characterization of a novel Arabidopsis gene familiy, UXS, encoding soluble and putative membrane-bound UDP-glucuronic acid decarboxylase isoforms.Plant Physiol 130: 2188- 219
本発明の課題は、多機能なキシロース付加糖鎖を合成するために必要なUDP-キシロースの効率のよい生産方法を確立し、より大量に供給することにある。 An object of the present invention is to establish an efficient production method of UDP-xylose necessary for synthesizing a multifunctional xylose-added sugar chain and supply it in a larger amount.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のUDP-キシロース合成の際に前半の反応を触媒するUDP-glucose
dehydrogenase をコードする遺伝子(UGD1遺伝子)を初めて単離し、この遺伝子の構造を明らかにするとともに、この遺伝子を同じくシロイヌナズナのUDP-キシロース合成の後半の反応を触媒するUXS3遺伝子とともに共発現することによって、生体内および生体外で効率よくUDP-キシロースが合成されることを見いだし、本発明を完成させるに到った。As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have discovered that UDP-glucose catalyzes the first half of the reaction during Arabidopsis thaliana UDP-xylose synthesis.
By first isolating the dehydrogenase-encoding gene (UGD1 gene), elucidating the structure of this gene, and co-expressing this gene with the UXS3 gene, which also catalyzes the second half of Arabidopsis UDP-xylose synthesis, It has been found that UDP-xylose is efficiently synthesized in vivo and in vitro, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下（１）〜（１３）に示されるとおりである。
（１） 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（２） 配列番号１で示される塩基配列を有するか、あるいは配列番号１で示される塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドが、欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、ＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３） 上記（１）または（２）に記載のＤＮＡにより組換えられていることを特徴とする、組み換えベクター。
（４） 上記（３）に記載の組換えベクターにより宿主細胞が形質転換されていることを特徴とする、形質転換体。
（５） 宿主細胞が、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質の生産能を有することを特徴とする、上記（４）に記載の形質転換体。
（６） 宿主細胞が、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡにより組換えられたベクターにより形質転換されていることを特徴とする、上記（５）に記載の形質転換体。
（７） 宿主細胞が、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡにより組み換えられた組換えベクターにより形質転換されていることを特徴とする、上記（６）に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
（８） 宿主細胞が、UDP-グルクロン酸及び／又はＵＤＰ-キシロースを消費する酵素系を保持していないことを特徴とする、上記（５）〜（７）のいずれかに記載の形質転換体。
（９） 宿主細胞が酵母細胞である、（４）〜（８）のいずれかに記載の形質転換体。
（１０） 上記（５）〜（９）のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、培養物からUDP-グルクロン酸もしくはＵＤＰ-キシロースを採取することを特徴とする、UDP-グルクロン酸及び／又はUDP-キシロースの製造方法。
（１１） 上記（５）〜（９）のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素をＵＤＰ-グルコースと接触させることにより、ＵＤＰ-グルコースをUDP-グルクロン酸及び／又はＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、UDP-グルクロン酸及び／又はＵＤＰ-キシロースの製造方法。
（１２） 上記（４）に記載の形質転換体の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ生産細胞の培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素とを順次または同時に、ＵＤＰ-グルコースに作用させ、ＵＤＰ-グルコースをUDP-グルクロン酸及び／又はＵＤＰ-キシロースに変換させることを特徴とする、UDP-グルクロン酸及び／又はＵＤＰ-キシロースの製造方法。
（１３） （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するか、または（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１あるいは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
That is, the present invention is as shown in the following (1) to (13).
(1) DNA encoding the following protein (a) or (b).
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added, and UDP -A protein having glucose dehydrogenase activity.
(2) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or having a base sequence in which one to several nucleotides are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA encoding a protein having glucose dehydrogenase activity.
(3) A recombinant vector characterized by being recombined with the DNA according to (1) or (2) above.
(4) A transformant, wherein a host cell is transformed with the recombinant vector according to (3) above.
(5) The transformant according to (4) above, wherein the host cell has the ability to produce a protein having UDP-glucuronic acid decarboxylase activity.
(6) The transformant according to (5) above, wherein the host cell is transformed with a vector recombined with a DNA encoding a protein having UDP-glucuronic acid decarboxylase activity.
(7) The transformation according to (6) above, wherein the host cell is transformed with a recombinant vector recombined with a DNA encoding the following protein (a) or (b): body.
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added, and UDP -A protein having glucuronic acid decarboxylase activity.
(8) The transformant according to any one of (5) to (7) above, wherein the host cell does not have an enzyme system that consumes UDP-glucuronic acid and / or UDP-xylose. .
(9) The transformant according to any one of (4) to (8), wherein the host cell is a yeast cell.
(10) UDP-glucuronic acid characterized by culturing the transformant according to any of (5) to (9) above in a medium and collecting UDP-glucuronic acid or UDP-xylose from the culture And / or a method for producing UDP-xylose.
(11) Culturing the transformant according to any one of (5) to (9) above in a medium, and bringing the obtained culture, culture treatment product, enzyme extract or purified enzyme into contact with UDP-glucose A method for producing UDP-glucuronic acid and / or UDP-xylose, which comprises converting UDP-glucose into UDP-glucuronic acid and / or UDP-xylose.
(12) Culture, culture-treated product, enzyme-extracted solution or purified enzyme of cultured product, culture-treated product, enzyme extract or purified enzyme and UDP-glucuronic acid decarboxylase producing cell according to (4) above And UDP-glucose are converted to UDP-glucuronic acid and / or UDP-xylose by sequentially or simultaneously with UDP-glucose, and a method for producing UDP-glucuronic acid and / or UDP-xylose.
(13) (a) an amino acid sequence having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (b) an amino acid sequence having one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 And a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity.
本発明によれば、糖鎖において非常に重要な機能をもつキシロースの付加を行うために必須なUDP-キシロースを多量に効率よく生産することができる。現時点において糖タンパク質糖鎖を均一に合成する技術は確立されておらず、最終的には生体外での糖鎖の修飾を行うことで糖鎖の均一な合成を行うことが考えられるが、この際、糖供与体として糖ヌクレオチドは必須なものである。特に、キシロースにおいてはUDP-キシロースが非常に高価なため、生体外での修飾反応を大量に行うことは現在非現実的であるが、本発明により、多量のUDP-キシロースの供給が可能となれば、キシロースが付加された高機能な糖鎖の合成を生体外で行うことができる。したがって、本発明は糖タンパク質の糖鎖の研究において多大な貢献をするものである。 According to the present invention, UDP-xylose essential for adding xylose having a very important function in a sugar chain can be efficiently produced in a large amount. At the present time, the technology for uniformly synthesizing glycoprotein sugar chains has not been established, and it is conceivable that the sugar chains will be uniformly synthesized by modifying the sugar chains in vitro. In this case, sugar nucleotides are essential as sugar donors. In particular, in xylose, UDP-xylose is very expensive, so it is currently unrealistic to perform a large amount of modification reaction in vitro, but the present invention makes it possible to supply a large amount of UDP-xylose. For example, a highly functional sugar chain to which xylose is added can be synthesized in vitro. Therefore, the present invention makes a great contribution in the study of glycoprotein sugar chains.
本発明における、シロイヌナズナのＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。また、本発明のシロイヌナズナのUGD1遺伝子は、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。具体的な塩基配列は、配列番号１に示されるが、これのみでなく、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであっても、ＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであれば、本発明において使用できる。
本発明においては、上記シロイヌナズナのUGD1遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によりＵＤＰ-キシロースを効率よく生産可能であるが、この製造法には大別して生体内で生産する方法と生体外で生産する方法の２つがある。In the present invention, Arabidopsis UDP-glucose dehydrogenase has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. The Arabidopsis UGD1 gene of the present invention is a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence. A specific base sequence is shown in SEQ ID NO: 1, but not only this, but in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it has an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added Even if it encodes, it can be used in the present invention as long as it encodes a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity.
In the present invention, UDP-xylose can be efficiently produced by a genetic engineering technique using the UGD1 gene of Arabidopsis thaliana, but this production method is roughly divided into a method for producing in vivo and a method for producing in vitro. There are two.
このうち、UDP-キシロースを生体内で製造方法の概要は、下記の行程よりなる。
（１）シロイヌナズナのＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ（UDP-glucose dehydrogenase）遺伝子(以下、UGD1遺伝子という場合がある。)を取得する。
（２）シロイヌナズナUGD1遺伝子を発現用プラスミド等のベクターに導入し、UGD1遺伝子を発現するベクターを構築する。
（３）上記発現ベクターを、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）産生能を有する宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する。
上記ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ産生能を有する宿主細胞としては、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞でもよいし、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換された細胞でもよい。すなわち、該細胞内で、UGD1遺伝子産物（ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ）を発現させると共にUXS3遺伝子産物（ＵＤＰ-グルクロン酸デカルボキシラーゼ）を活性を保ったまま発現させ、UDP-グルコースよりUDP-キシロースに変換する。UXS3遺伝子としては、例えば、シロイヌナズナ由来の遺伝子が挙げられ、該遺伝子は、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、具体的には配列番号３に示される塩基配列を有するが、これのみでなく、配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含される。
（４）上記（３）の組換え体を培地に培養し、得られた培養物あるいは細胞破砕物等の培養処理物から抽出によりUDP-キシロースを採取し、さらに単離・精製する。Among these, the outline of the method for producing UDP-xylose in vivo consists of the following steps.
(1) Obtain an Arabidopsis UDP-glucose dehydrogenase gene (hereinafter sometimes referred to as UGD1 gene).
(2) An Arabidopsis thaliana UGD1 gene is introduced into a vector such as an expression plasmid to construct a vector that expresses the UGD1 gene.
(3) The expression vector is introduced into a host cell capable of producing UDP-glucuronic acid decarboxylase, and the host cell is transformed.
The host cell capable of producing UDP-glucuronic acid decarboxylase may be a cell that naturally produces UDP-glucuronic acid decarboxylase, or a UDP-glucuronic acid decarboxylase gene (hereinafter referred to as UXS3). A cell transformed with an expression vector having a gene, which may express a UGD1 gene product (UDP-glucose dehydrogenase) and a UXS3 gene product (UDP-glucuronic acid decarboxylase). ) Is expressed while maintaining the activity, and is converted from UDP-glucose to UDP-xylose, for example, a gene derived from Arabidopsis thaliana, which encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 DNA, specifically shown in SEQ ID NO: 3 In addition to this, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, one to several amino acids have an amino acid sequence deleted, substituted or added, and UDP-glucuronic acid Also included is a DNA encoding a protein having carboxylase activity.
(4) The recombinant of (3) above is cultured in a medium, and UDP-xylose is collected by extraction from the obtained culture or a cell-cultured product such as a cell disrupted product, and further isolated and purified.
本発明において、UDP-キシロースを生体外で製造する方法は、下記の工程よりなる。
（１）シロイヌナズナのUDP-glucose dehydrogenase遺伝子(UGD1遺伝子)を取得する；
（２）シロイヌナズナUGD1遺伝子を発現用プラスミド等のベクターに導入し、UGD1遺伝子を発現するベクターを構築する；
（３）上記発現ベクターを、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase）産生能を有する宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する。
上記ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ産生能を有する宿主細胞としては、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞でもよいし、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換された細胞でもよい。
すなわち、該細胞内で、UGD1遺伝子産物（ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ）を発現させると共にUXS3遺伝子産物（ＵＤＰ-グルクロン酸デカルボキシラーゼ）を活性を保ったまま発現させる。
（４）上記の形質転換体の培養物、細胞破砕物等の培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素を酵素源とし、UDP-グルコースおよびNADHを添加することによりUDP-グルコースをUDP-キシロースに変換し、単離・精製を行う。該UDP-キシロースはキシロース含有糖鎖の合成の際に糖供与体として必須なものであるので、機能的に重要と思われる糖鎖へのキシロース付加の際に有用なものである。In the present invention, the method for producing UDP-xylose in vitro comprises the following steps.
(1) Obtain the Arabidopsis UDP-glucose dehydrogenase gene (UGD1 gene);
(2) An Arabidopsis thaliana UGD1 gene is introduced into a vector such as an expression plasmid to construct a vector that expresses the UGD1 gene;
(3) The expression vector is introduced into a host cell capable of producing UDP-glucuronic acid decarboxylase, and the host cell is transformed.
The host cell capable of producing UDP-glucuronic acid decarboxylase may be a cell that naturally produces UDP-glucuronic acid decarboxylase, or a UDP-glucuronic acid decarboxylase gene (hereinafter referred to as UXS3). It may be a cell transformed with an expression vector having a gene).
That is, the UGD1 gene product (UDP-glucose dehydrogenase) is expressed in the cells and the UXS3 gene product (UDP-glucuronic acid decarboxylase) is expressed while maintaining the activity.
(4) By using the above transformant culture, cultured product such as cell disruption, intracellular extract or enzyme isolated and purified from the extract as an enzyme source and adding UDP-glucose and NADH Convert UDP-glucose to UDP-xylose for isolation and purification. Since UDP-xylose is essential as a sugar donor in the synthesis of a xylose-containing sugar chain, it is useful in the addition of xylose to a sugar chain that is considered to be functionally important.
また別法として、シロイヌナズナUGD1遺伝子を含む発現用ベクターにより形質転換した形質転換体の培養物、培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素と、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼを本来的に産生する細胞あるいはＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ（UDP-glucuronic acid decarboxylase遺伝子（以下、UXS3遺伝子という場合がある。）を有する発現ベクターで形質転換体された細胞の培養物、培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素を、各々別途に調整し、これらを順次あるいは同時にＵＤＰ-グルコースに作用させて、ＵＤＰ-グルコースをＵＤＰ-キシロースに変換させることにより、ＵＤＰ-キシロースを製造してもよい。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の略号による表示は、IUPAC-IUBの規定および当該分野における通称または慣行に従うものとする。Alternatively, a culture of a transformant transformed with an expression vector containing the Arabidopsis UGD1 gene, a culture treated product, an intracellular extract or an enzyme isolated and purified from the extract, and UDP-glucuronic acid decarboxylase Or a culture treated product of cells transformed with an expression vector having UDP-glucuronic acid decarboxylase gene (hereinafter sometimes referred to as UXS3 gene) In addition, the intracellular extract or the enzyme isolated and purified from the extract is separately prepared, and these are allowed to act on UDP-glucose sequentially or simultaneously to convert UDP-glucose into UDP-xylose. -Xylose may be produced.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail. In the present specification, amino acid sequences and base sequence abbreviations are in accordance with the provisions of IUPAC-IUB and common names or practices in the art.
１．ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子（UGD1遺伝子）の単離
本発明のUGD1遺伝子の取得は、一般的手法に従ってシロイヌナズナから調製したcDNAライブラリを鋳型とし、PCR法により単離することができる。1. Isolation of UDP-glucose dehydrogenase gene (UGD1 gene) The UGD1 gene of the present invention can be obtained by PCR using a cDNA library prepared from Arabidopsis thaliana in accordance with a general technique.
シロイヌナズナのcDNAライブラリは、通常用いられているプラスミドベクターまたはλファージ由来のベクターを用い、通常の方法に従い作成することができる。 A cDNA library of Arabidopsis thaliana can be prepared according to a usual method using a commonly used plasmid vector or a vector derived from λ phage.
PCR法は、生体外でDNAの特殊な領域を、そのセンス・アンチセンスプライマー、耐熱性のDNAポリメラーゼ、DNA増幅システム糖の組み合わせを用いて、約2-3時間で10-100万倍に特異的に増幅することができる技術であり、本発明遺伝子およびその断片は、他種の酵素との塩基配列の相同性等をもとに、このPCR法での増幅が可能である。 PCR uses a combination of sense / antisense primers, heat-resistant DNA polymerase, and DNA amplification system sugars to identify specific regions of DNA in vitro in about 100,000 to 1,000,000 times in about 2-3 hours. The gene of the present invention and fragments thereof can be amplified by this PCR method based on the homology of the base sequence with other types of enzymes.
DNAを組み込むベクタターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも使用することができる。例えば大腸菌由来のプラスミドベクターpBR322やpUC19などを挙げることができる。
ベクターを組み込む方法としては、例えばT.Maniatisらの方法[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982)]に従うことができる。Any vectorer can be used as long as it can be replicated and maintained in the host. Examples thereof include plasmid vectors pBR322 and pUC19 derived from E. coli.
As a method for incorporating the vector, for example, the method of T. Maniatis et al. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982)] can be followed.
クローン化された遺伝子は、発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結して発現ベクターを得ることができる。ベクターとしては、酵母由来のプラスミドYEp352GAP、YEp51、pSH19、などが挙げられる。 The cloned gene can be ligated downstream of a promoter in a vector suitable for expression to obtain an expression vector. Examples of the vector include yeast-derived plasmids YEp352GAP, YEp51, pSH19, and the like.
該遺伝子はその5'末端に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また、3'末端には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有してよい。また、5'末端あるいは3'末端に例えばヘマグルチニンタンパク質の一部分である標識抗原遺伝子やGSTタンパク質などの標識タンパク質遺伝子を結合させて発現させてもよい。さらに該遺伝子を発現させるためには、その上流にプロモータを接続するが、本発明で用いられるプロモーターとしては遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであれば、いかなるものでもよい。
また、形質転換する宿主が酵母である場合、ENO1プロモーター、GAL10プロモーター、GAPDHプロモーター、ADHプロモーターなどが挙げられる。The gene may have ATG as a translation start codon at its 5 ′ end and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3 ′ end. In addition, a labeled protein gene such as a labeled antigen gene or a GST protein, which is a part of a hemagglutinin protein, may be bound and expressed at the 5 ′ end or 3 ′ end. Further, in order to express the gene, a promoter is connected upstream thereof. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
Further, when the host to be transformed is yeast, ENO1 promoter, GAL10 promoter, GAPDH promoter, ADH promoter and the like can be mentioned.
このように構築されたUGD1遺伝子を有する組換えDNAを含むベクターを用いて、該ベクターを保持する形質転換体を作成する。
宿主としては、UDP-キシロースを生体内で消費しない出芽酵母(Saccharomyces
cerevisia)などが挙げられるが、この他UDP-キシロースを消費しない他の酵母(Pichia pastorisなど)などでもよい。また、酵母以外でも、UDP-キシロースの消費する酵素系を持たない宿主であればいかなるものでもよい。
また、細胞破砕物、酵素抽出物等を用い、生体外でUDP-キシロースを生産する場合、細胞質内で該遺伝子産物を生産することが可能な宿主であれば、いかなるものでも用いることができる。
上記形質転換体の作成は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。または一般的ではなくても適用可能な方法ならばよい。例として、宿主が酵母であれば、リチウム法あるいはエレクトロポレーション法により組み換えDNAを含むベクターを導入する。
また、例えば、ＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼとＵＤＰ-グルクロン酸でカルボキシラーゼを共に産生する形質転換体を得る場合、UGD1遺伝子により形質転換される宿主は、あらかじめシロイヌナズナのUXS3遺伝子を有する組み換えDNAを含むベクターで形質転換されているか、あるいは本来的にUXS3遺伝子産物を発現しているものである必要がある。Using the vector containing the recombinant DNA having the UGD1 gene constructed as described above, a transformant carrying the vector is prepared.
As a host, a budding yeast (Saccharomyces) that does not consume UDP-xylose in vivo.
cerevisia), and other yeasts that do not consume UDP-xylose (Pichia pastoris, etc.) may also be used. In addition to yeast, any host that does not have the enzyme system consumed by UDP-xylose may be used.
Further, when UDP-xylose is produced in vitro using a cell disrupted product, an enzyme extract or the like, any host can be used as long as it can produce the gene product in the cytoplasm.
The transformant is prepared by a method generally used for each host. Alternatively, any method that is applicable but not general may be used. For example, if the host is yeast, a vector containing recombinant DNA is introduced by the lithium method or electroporation method.
In addition, for example, when obtaining a transformant that produces both carboxylase with UDP-glucose dehydrogenase and UDP-glucuronic acid, the host transformed with the UGD1 gene is previously transformed with a vector containing a recombinant DNA having the UDS3 gene of Arabidopsis thaliana. It must have been converted, or must be one that expresses the UXS3 gene product in nature.
このようにして、UXS3遺伝子が発現され、なおかつUGD1遺伝子を有する組み換えDNAを含むベクターを保持する形質転換体が得られ、該形質転換体を培養することにより、主に該形質転換体の細胞内においてUDP-キシロースとUDP-キシロース製造に必要な酵素が産生、蓄積する。 In this way, a transformant expressing the UXS3 gene and retaining a vector containing a recombinant DNA having the UGD1 gene is obtained. By culturing the transformant, mainly the intracellular form of the transformant is obtained. Produces and accumulates UDP-xylose and enzymes necessary for UDP-xylose production.
形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地は、それぞれの宿主について一般的に用いられているものを使用する。または、一般的でなくとも適用可能な培地ならばよい。例としては、宿主が酵母であればYPD培地、SD培地などを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。また、一般的でなくとも適用可能な条件であればよい。例としては、宿主が酵母であれば約25-37℃で、約12時間-5日間行い、必要により通気や撹拌を行うことができる。 When cultivating a transformant, a medium generally used for each host is used for the culture. Alternatively, it may be an applicable medium if it is not general. For example, if the host is yeast, YPD medium, SD medium, etc. are used. Culturing is performed under conditions generally used for each host. Moreover, it is sufficient if the condition is applicable even if it is not general. As an example, if the host is yeast, it is carried out at about 25-37 ° C. for about 12 hours-5 days, and if necessary, aeration or stirring can be carried out.
例えば、上記培養物からUDP-キシロースあるいは酵素を抽出する際は、宿主細胞を遠心分離によって培地と分け、宿主細胞を破砕してUDP-キシロースあるいは酵素を抽出する。宿主が酵母の場合、例えばグラスビーズによって細胞を破壊し、遠心分離する。この際、酵素及びＵＤＰ-キシロースは、上清画分に存在する。
上記の遠心分離によって分離された上清画分からUDP-キシロースを分離する場合は、ゲルろ過法等により低分子量の画分を集め、さらにHPLCによる分離を行うことにより、精製単離する。
また、生体外で酵素変換反応を行い、ＵＤＰ-キシロースを製造する場合においては、上清画分に硫酸アンモニウムを75%の濃度に溶かし、これにより沈殿してくるタンパク質画分を集め、透析等により脱塩したものを酵素源として使用することができる。For example, when extracting UDP-xylose or enzyme from the culture, the host cell is separated from the medium by centrifugation, and the host cell is disrupted to extract UDP-xylose or enzyme. When the host is yeast, for example, the cells are disrupted with glass beads and centrifuged. At this time, the enzyme and UDP-xylose are present in the supernatant fraction.
When separating UDP-xylose from the supernatant fraction separated by the above-mentioned centrifugation, the low molecular weight fractions are collected by gel filtration or the like, and further purified and isolated by HPLC separation.
In addition, in the case of producing UDP-xylose by performing an enzyme conversion reaction in vitro, ammonium sulfate is dissolved in the supernatant fraction at a concentration of 75%, and the precipitated protein fraction is collected by dialysis or the like. The desalted product can be used as an enzyme source.
上記酵素源を用いて、基質となるUDP-glucoseもしくはUDP-glucuronic acidおよびNADHを加え反応させた後、HPLCでUDP-キシロースを単離精製することにより、UDP-キシロースを得ることができる。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。
Using the above enzyme source, UDP-glucose or UDP-glucuronic acid and NADH as substrates are added and reacted, and then UDP-xylose is isolated and purified by HPLC to obtain UDP-xylose.
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕UGD1遺伝子の単離
シロイヌナズナのcDNAライブラリを用いてPCR法により遺伝子のクローニングを行った。cDNAライブラリはCLONTECH社のQUICK-Clone cDNAを用いた。プライマーの設計においては、制限酵素でタンパク質をコードしている部分が容易に切り出せるようにN-末端Eco RIサイト、C-末端部分にSal Iサイトに位置させ、また、N-末端には、あらかじめ標識抗原をコードするvsv-g配列を付加せしめた。それぞれのプライマーの配列を以下に示す。
AGAATTCATGTATACTGATATTGAAATGAATAGATTGGGTAAAATGGTGAAGATATGCTGCATAGGAG（配列番号５）
AAAAAAAGTCGACTCATGCCACAGCAGGCATATCCTTGAGCC（配列番号６）
PCRの条件は以下の通り。
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 2分
30サイクル
この条件で得られた約1.5 kbpのDNA増幅断片をアガロース電気泳動で分離した後、TAクローニングキットを用いてpGEM-5Z f(+)ベクターに挿入した。このクローニングされた遺伝子をダイデオキシ法を用いたシークエンスキットにより塩基配列を確認し、配列番号２に示した塩基配列であることを確認した。
[Example 1] Isolation of UGD1 gene The gene was cloned by PCR using a cDNA library of Arabidopsis thaliana. The cDNA library used was CLONTECH's QUICK-Clone cDNA. In designing the primer, the N-terminal Eco RI site is located at the N-terminal Eco RI site, the Sal I site is located at the C-terminal portion so that the portion encoding the protein with the restriction enzyme can be easily excised, A vsv-g sequence encoding a labeled antigen was added in advance. The sequence of each primer is shown below.
AGAATTCATGTATACTGATATTGAAATGAATAGATTGGGTAAAATGGTGAAGATATGCTGCATAGGAG (SEQ ID NO: 5)
AAAAAAAGTCGACTCATGCCACAGCAGGCATATCCTTGAGCC (SEQ ID NO: 6)
PCR conditions are as follows.
94 ℃ 30 seconds
55 ℃ 30 seconds
72 ° C 2 minutes
30 cycles The DNA amplification fragment of about 1.5 kbp obtained under these conditions was separated by agarose electrophoresis and then inserted into the pGEM-5Z f (+) vector using a TA cloning kit. The base sequence of this cloned gene was confirmed using a sequence kit using the dideoxy method, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 was confirmed.
〔実施例２〕UGD1遺伝子発現ベクターおよびUXS3遺伝子発現ベクターの作成およびこのプラスミドを含む酵母形質転換体の作成
pGEM-5Z f(+)ベクターに挿入されているUGD1遺伝子をEco RI及びSal Iで切り出し、酵母の解糖系のプロモーターであるGAPDHとそのターミネーターの間にpUC18のマルチクローニングサイトのうちEco RIからSal Iまでの部分を持つ発現用ベクターYEp352GAP-IIのEco RI 及びSal Iサイトに挿入した。さらにこのベクターからGAPDHプロモーター、UGD1-vsv-g、GAPDHターミネーターの３つの部分を含む断片をBam HIを用いて切り出し、酵母の染色体組み込み型ベクターでありLUE2マーカーを持つpRS-305のBamHIサイトに挿入しpONJ-UGD1-vsv-gを構築した。UXS3遺伝子もUGD1と同様にPCRを用いてクローニングしたあとYEp352GAP-IIのEco RI 及びSal Iサイトに挿入した。さらにこのベクターからGAPDHプロモーター、pONJ-UXS3-c-myc、GAPDHターミネーターの３つの部分を含む断片をBam HIを用いて切り出し、酵母の染色体組み込み型ベクターでありTRP1マーカーを持つpRS-304のBamHIサイトに挿入しpONJ-UXS3-c-mycを構築した。また、C-末端にはあらかじめc-myc標識抗原遺伝子をプライマーに付加しておいた。これらの発現ベクターは、それぞれ単独あるいは２つ一緒に酵母のW303-1A株(ura3, lue2, his3, trp1,ade2)に導入し、３種の形質転換体、すなわち、UGD1遺伝子導入株（W303/pONJ-UGD1-vsv-g株）、UXS3遺伝子導入株（W303/pONJ-UXS3-c-myc株）並びにUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）を得た。なお、このうちUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに 受託日：２００６年２月２４日 受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５３８として寄託されている。[Example 2] Preparation of UGD1 gene expression vector and UXS3 gene expression vector and preparation of yeast transformant containing this plasmid
The UGD1 gene inserted in the pGEM-5Z f (+) vector was excised with Eco RI and Sal I, and from the yeast glycolysis promoter GAPDH and its terminator to the pUC18 multiple cloning site from Eco RI. The expression vector YEp352GAP-II having a portion up to Sal I was inserted into the Eco RI and Sal I sites. Furthermore, a fragment containing the three parts of the GAPDH promoter, UGD1-vsv-g, and GAPDH terminator was excised from this vector using Bam HI and inserted into the BamHI site of pRS-305, a yeast chromosomally integrated vector with LUE2 marker. PONJ-UGD1-vsv-g was constructed. The UXS3 gene was cloned using PCR in the same manner as UGD1, and then inserted into the Eco RI and Sal I sites of YEp352GAP-II. Furthermore, a fragment containing the three parts of the GAPDH promoter, pONJ-UXS3-c-myc and GAPDH terminator was excised from this vector using Bam HI, and the yeast chromosomally integrated vector pRS-304 BamHI site with TRP1 marker. PONJ-UXS3-c-myc was constructed. In addition, a c-myc labeled antigen gene was previously added to the primer at the C-terminus. These expression vectors were introduced into yeast strain W303-1A (ura3, lue2, his3, trp1, ade2) alone or in combination, and three transformants, ie, UGD1 gene-introduced strain (W303 / pONJ-UGD1-vsv-g), UXS3 gene-introduced strain (W303 / pONJ-UXS3-c-myc strain) and UGD1 / UXS3 gene-introduced strain (W303 / pONJ-UGD1-vsv-g, pONJ-UXS3-c- myc strain). Of these, UGD1 and UXS3 gene-introduced strains (W303 / pONJ-UGD1-vsv-g and pONJ-UXS3-c-myc strains) are independent administrative corporations located in the center of Tsukuba City 1-1-1 Higashi 1-1-1 Deposited at National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center Deposit date: February 24, 2006 Deposit number: FERM BP-10538
〔実施例３〕UGD1タンパク質、UXS3タンパク質の酵母内での発現の確認
〔実施例２〕で得られた形質転換体について、それぞれの細胞内でタンパク質が発現されているかどうかをウエスタンブロッティングを用いて確認した。まず、上記３種の形質転換体〔W303/pONJ-UGD1-vsv-g株、W303/pONJ-UXS3-c-myc株、W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）およびW303株をSD培地で24時間30℃で培養し、得られた酵母細胞をガラスビーズで破砕した。得られた破砕物を遠心操作を用いて細胞壁画分及びミクロソーム画分を取り除き、細胞質画分だけを分離した。このタンパク質を含む細胞質画分を20mM Tris-HCl pH7.4に溶かし、タンパク質定量をBCAキットを用いて行った。それぞれ100μgのタンパク質をとってSDS-PAGEを行った後、PVDF膜に電気的に転写し、それぞれ、抗-vsv-g抗体もしくは抗c-myc抗体を用いてタンパク質の発現を確認した(図２)。その結果、UGD1遺伝子導入株（W303/pONJ-UGD1-vsv-g株）及びUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）ではUGD1タンパク質が、及びUGD1・UXS3遺伝子導入株（W303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-myc株）ではUXS3タンパク質が発現していることが確かめられた。すなわちUGD1遺伝子とUXS3遺伝子が導入された形質転換体は、UGD1タンパク質とUXS3タンパク質と共発現していることが分かる[Example 3] Confirmation of expression of UGD1 protein and UXS3 protein in yeast Regarding the transformant obtained in [Example 2], whether or not the protein is expressed in each cell is determined by Western blotting. confirmed. First, the above three transformants [W303 / pONJ-UGD1-vsv-g strain, W303 / pONJ-UXS3-c-myc strain, W303 / pONJ-UGD1-vsv-g, pONJ-UXS3-c-myc strain] ) And W303 strain were cultured in SD medium for 24 hours at 30 ° C., and the resulting yeast cells were disrupted with glass beads. The obtained crushed material was centrifuged to remove the cell wall fraction and the microsomal fraction, and only the cytoplasmic fraction was separated. The cytoplasmic fraction containing this protein was dissolved in 20 mM Tris-HCl pH 7.4, and protein quantification was performed using a BCA kit. Each 100 μg of protein was subjected to SDS-PAGE and then electrically transferred to a PVDF membrane, and the expression of the protein was confirmed using anti-vsv-g antibody or anti-c-myc antibody, respectively (FIG. 2). ). As a result, in UGD1 gene-introduced strain (W303 / pONJ-UGD1-vsv-g strain) and UGD1 / UXS3 gene-introduced strain (W303 / pONJ-UGD1-vsv-g, pONJ-UXS3-c-myc strain) It was confirmed that the UDS3 protein was expressed in the UGD1 and UXS3 gene-introduced strains (W303 / pONJ-UGD1-vsv-g, pONJ-UXS3-c-myc strain). That is, it can be seen that the transformant introduced with UGD1 gene and UXS3 gene co-expressed with UGD1 protein and UXS3 protein.
〔実施例４〕UDP-キシロース合成活性測定
UDP-キシロース活性測定は基質としてUDP-グルコースを、補助因子として5 mM NADHを用い、100 mM Tris-HCl、pH 7.4という条件で30℃、2時間反応を行い、フェノール：クロロホルム溶液 (24: 1) を加え撹拌した後、遠心分離を行い、上清を回収した。上清を0.2 マイクロメートルポアサイズのフィルターに通し、HPLCによりUDP-キシロースとUDP-グルコースの測定を行った。HPLCはC18カラムを用いて1%アセトニトリルを含む20 mMトリエチルアミン(pH 5.8) 溶液を1 ml/minで流して分離を行い、さらに、各分画についてＥＳＩ−ＭＳ測定を行った（図４）。その結果、UXS3タンパク質とUGD1タンパク質を共発現させたW303/ pONJ-UGD1-vsv-g、pONJ-UXS3-c-mycのみでUDP-キシロース合成活性を検出した(図３、４)。また、UGD1タンパク質のみを発現させたW303/pONJ-UGD1-vsv-g株では、UDP-グルクロン酸合成活性が検出された。なお、UXS3遺伝子のみ発現させたW303/pONJ-UXS3-c-myc株ではUDP-グルクロン酸を基質として用いた場合にのみＵＤＰ-キシロース合成活性が検出された。[Example 4] Measurement of UDP-xylose synthesis activity
UDP-xylose activity was measured by using UDP-glucose as a substrate and 5 mM NADH as a cofactor and reacting at 30 ° C. for 2 hours under conditions of 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, and a phenol: chloroform solution (24: 1 ) Was added and stirred, followed by centrifugation, and the supernatant was collected. The supernatant was passed through a 0.2 micrometer pore size filter, and UDP-xylose and UDP-glucose were measured by HPLC. For HPLC, a 20 mM triethylamine (pH 5.8) solution containing 1% acetonitrile was flowed at 1 ml / min using a C18 column, and further, ESI-MS measurement was performed for each fraction (FIG. 4). As a result, UDP-xylose synthesis activity was detected only with W303 / pONJ-UGD1-vsv-g and pONJ-UXS3-c-myc in which UXS3 protein and UGD1 protein were co-expressed (FIGS. 3 and 4). In addition, UDP-glucuronic acid synthesis activity was detected in the W303 / pONJ-UGD1-vsv-g strain in which only the UGD1 protein was expressed. In the W303 / pONJ-UXS3-c-myc strain in which only the UXS3 gene was expressed, UDP-xylose synthesis activity was detected only when UDP-glucuronic acid was used as a substrate.
Claims (13)
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルコース デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。DNA encoding the following protein (a) or (b):
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted or added, and UDP -A protein having glucose dehydrogenase activity.
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＵＤＰ-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。The transformant according to claim 6, wherein the host cell is transformed with a recombinant vector recombined with a DNA encoding the following protein (a) or (b).
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added, and UDP -A protein having glucuronic acid decarboxylase activity.
(A) having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 or (b) having the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 And a protein having UDP-glucose dehydrogenase activity.
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