JPWO2006059655A1 - Method for separating microorganisms or cells - Google Patents

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秀二 田島
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智之 羽田野
潤子 百瀬
潤子 百瀬
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Abstract

微生物又は細胞を含有する試料から効率よく微生物又は細胞を分離する方法、及び該方法を用いて分離した微生物又は細胞から核酸を抽出する方法を提供することを目的し、この目的を達成するために、微生物又は細胞を含有する試料と、イオン交換体粒子と、リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルで表面が被覆された磁性体粒子とを含む液体を調製し、磁石を作用させて液体から微生物又は細胞とイオン交換体粒子と磁性体粒子とを含む複合体を分離することにより、試料に含有される微生物又は細胞を分離する。To provide a method for efficiently separating microorganisms or cells from a sample containing microorganisms or cells, and a method for extracting nucleic acids from microorganisms or cells separated using the method. To achieve this object A liquid containing a sample containing microorganisms or cells, ion exchanger particles, and magnetic particles whose surfaces are coated with a calcium phosphate compound hydrogel is prepared, and a magnet is used to act on the microorganisms or cells and ions from the liquid. By separating the complex containing the exchanger particles and the magnetic particles, the microorganisms or cells contained in the sample are separated.

Description

本発明は、試料から微生物又は細胞を分離する方法、及び該方法を用いて分離した微生物又は細胞から核酸を抽出する方法に関する。   The present invention relates to a method for separating microorganisms or cells from a sample, and a method for extracting nucleic acids from microorganisms or cells separated using the method.

各種環境には有用な遺伝子を有する多種類の微生物が存在しているが、各種環境からの微生物の取得が困難であるため、各種環境に存在する微生物の有用な遺伝子についてほとんど解析されていないのが現状である。
このため、各種環境から採取した試料（例えば土壌、水、泥、堆積物等）から効率よく微生物を分離する方法が求められている。There are many types of microorganisms that have useful genes in various environments, but because it is difficult to obtain microorganisms from various environments, there have been little analyzes of useful genes in microorganisms that exist in various environments. Is the current situation.
For this reason, a method for efficiently separating microorganisms from samples (for example, soil, water, mud, sediment, etc.) collected from various environments is required.

試料からの細菌類の分離方法としては、ハイドロキシアパタイト結晶を塩酸（ｐＨ２．０）で溶解した後、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調整することによりハイドロキシアパタイトゲルを形成させ、これに磁性粒子を加えて超音波処理することによりハイドロキシアパタイトゲルで表面が被覆された磁性体粒子（以下「表面被覆磁性体粒子」という。）を調製し、表面被覆磁性体粒子を大腸菌含有液に加えて表面被覆磁性体粒子と大腸菌とを含む複合体を形成させ、磁石を作用させて複合体を分離し、分離された複合体をＥＤＴＡ等のキレート剤で処理して複合体から大腸菌を解離させる方法が知られている（特許文献１)。
特開２００３−１０２４６５号公報 As a method for separating bacteria from a sample, hydroxyapatite crystals are dissolved in hydrochloric acid (pH 2.0), and then sodium hydroxide is added to adjust the pH to 8.0 to form a hydroxyapatite gel. The magnetic particles are coated with hydroxyapatite gel by adding magnetic particles to the sonication to prepare magnetic particles (hereinafter referred to as “surface-coated magnetic particles”). In addition, a complex containing surface-coated magnetic particles and E. coli is formed, the complex is separated by the action of a magnet, and the separated complex is treated with a chelating agent such as EDTA to dissociate E. coli from the complex. The method of making it known is known (patent document 1).
JP 2003-102465 A

本発明は、微生物又は細胞を含有する試料から効率よく微生物又は細胞を分離する方法、及び該方法を用いて分離した微生物又は細胞から核酸を抽出する方法を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a method for efficiently separating microorganisms or cells from a sample containing microorganisms or cells, and a method for extracting nucleic acids from microorganisms or cells separated using the method.

上記目的を達成するために、本発明は、微生物又は細胞を含有する試料から前記微生物又は前記細胞を分離する方法であって、前記試料と、イオン交換体粒子と、リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルで表面が被覆された磁性体粒子とを含む液体を調製し、磁石を作用させて前記液体から前記微生物又は前記細胞と前記イオン交換体粒子と前記磁性体粒子とを含む複合体を分離することを特徴とする方法を提供する。   In order to achieve the above object, the present invention provides a method for separating a microorganism or cell from a sample containing the microorganism or cell, the surface comprising the sample, ion exchanger particles, and a calcium phosphate compound hydrogel. Preparing a liquid containing magnetic particles coated with a magnetic material, and causing a magnet to act to separate a complex containing the microorganisms or the cells, the ion exchanger particles, and the magnetic particles from the liquid. To provide a method.

また、本発明は、試料に含有される微生物又は細胞から核酸を抽出する方法であって、本発明の方法を用いて前記試料から前記微生物又は前記細胞を分離し、分離した前記微生物又は前記細胞から核酸を抽出することを特徴とする方法を提供する。   The present invention also relates to a method for extracting nucleic acid from a microorganism or cell contained in a sample, wherein the microorganism or the cell is separated from the sample using the method of the present invention, and the separated microorganism or cell is separated. There is provided a method characterized in that nucleic acids are extracted from.

本発明によれば、微生物又は細胞を含有する試料から効率よく微生物又は細胞を分離する方法、及び該方法を用いて分離した微生物又は細胞から核酸を抽出する方法が提供される。本発明の方法によれば、リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルで表面が被覆された磁性体粒子とイオン交換体粒子とを併用することにより、リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルで表面が被覆された磁性体粒子を単独で使用する場合よりも効率よく試料から微生物又は細胞を分離することができる。   ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the method of isolate | separating microorganisms or a cell efficiently from the sample containing microorganisms or a cell, and the method of extracting a nucleic acid from the microorganisms or cell isolate | separated using this method are provided. According to the method of the present invention, a magnetic particle whose surface is coated with a calcium phosphate compound hydrogel is used alone by combining the magnetic particles whose surface is coated with the calcium phosphate compound hydrogel and the ion exchanger particles. The microorganisms or cells can be separated from the sample more efficiently than in the case of using in the above.

高温環境土壌から抽出したゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す図である。It is a figure which shows the electrophoresis result of the genomic DNA extracted from the high temperature environmental soil. 大腸菌培養液から抽出したゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す図である。It is a figure which shows the electrophoresis result of the genomic DNA extracted from E. coli culture solution.

試料は、１種類又は２種類以上の微生物又は細胞を含有する。試料に含有される微生物又は細胞の種類は既知であってもよいし、未知であってもよい。   The sample contains one type or two or more types of microorganisms or cells. The type of microorganism or cell contained in the sample may be known or unknown.

試料に含有される微生物は、原核微生物及び真核微生物のいずれであってもよく、原核微生物としては、例えば、グラム陽性菌（例えば、Micrococcus属、Staphylococcus属、Bacillus属、Clostridium属、Lactobacillus属、Corynebacterium属、Streptomyces属等）、グラム陰性菌（例えば、Rhodopseudomonas属、Pseudomonas属、Esherichia属、Salmonella属、Nitrobacter属、Thiobacillus属、Neisseria属等）等の細菌類が挙げられ、真核微生物としては、例えば、糸状菌（カビ類）、酵母等の真菌類が挙げられる。   The microorganism contained in the sample may be either a prokaryotic microorganism or a eukaryotic microorganism. Examples of the prokaryotic microorganism include gram-positive bacteria (for example, Micrococcus genus, Staphylococcus genus, Bacillus genus, Clostridium genus, Lactobacillus genus, Corynebacterium genus, Streptomyces genus), Gram negative bacteria (for example, Rhodopseudomonas genus, Pseudomonas genus, Esherichia genus, Salmonella genus, Nitrobacter genus, Thiobacillus genus, Neisseria genus etc.), and eukaryotic microorganisms, Examples thereof include fungi such as filamentous fungi (molds) and yeast.

試料に含有される細胞は、原核細胞及び真核細胞のいずれであってもよく、原核細胞としては、例えば、原核微生物の細胞等が挙げられ、真核細胞としては、例えば、真核微生物の細胞、動物又は植物の細胞等が挙げられる。   The cell contained in the sample may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. Examples of the prokaryotic cell include cells of a prokaryotic microorganism. Examples of eukaryotic cells include those of eukaryotic microorganisms. Examples include cells, animal or plant cells.

試料としては、例えば、各種環境から採取した土壌、水、泥、堆積物又はこれらの処理物等を使用することができる。各種環境から採取した土壌、水、泥、堆積物等の処理としては、例えば、緩衝液等の添加による懸濁又は希釈、フィルター等によるろ過等が挙げられる。試料としては、例えば、土壌、泥、堆積物等に緩衝液を加えて懸濁し、フィルター等でろ過して小石等の固形物を除去することにより調製した試料を使用することができる。   As the sample, for example, soil, water, mud, sediment, or a processed product thereof collected from various environments can be used. Examples of the treatment of soil, water, mud, sediment and the like collected from various environments include suspension or dilution by addition of a buffer solution, filtration by a filter, and the like. As the sample, for example, a sample prepared by adding a buffer solution to soil, mud, sediment or the like and suspending it, and filtering through a filter or the like to remove solids such as pebbles can be used.

イオン交換体粒子は、イオン交換体からなる粒子である。イオン交換体は、イオン交換基が水不溶性の基体に保持されたものであり、例えば、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース等が挙げられる。イオン交換基は、陽イオンを交換可能な酸性基及び陰イオンを交換可能な塩基性基のいずれであってもよく、陽イオンを交換可能な酸性基としては、例えば、−ＳＯ3Ｍ（Ｍ＝Ｈ，Ｎａ等）（強酸性基）、−ＣＯＯＭ（Ｍ＝Ｈ，Ｎａ等）（弱酸性基）、−Ｏ−ＣＨ２ＣＯＯＭ（Ｍ＝Ｈ，Ｎａ等）（弱酸性基）、−ＣＨ2Ｎ+(ＣＨ3)2(Ｃ2Ｈ4ＯＨ)（強塩基性基）、−ＮＸ≡(ＣＨ３)３（Ｘ＝Ｃｌ等）（強塩基性基）、−ＣＨ2Ｎ+Ｈ(ＣＨ3)2（弱塩基性基）、−Ｎ+Ｈ3（弱塩基性基）、−Ｎ(ＣＨ３)２（弱塩基性基）、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−ＮＨ２（弱塩基性基）等が挙げられる。イオン交換樹脂の基体としては、例えば、スチレン系、メタクリル系、アクリル系等の樹脂が挙げられる。イオン交換体粒子の粒径は通常０．１μｍ〜１ｍｍ、好ましくは０．５〜１０μｍである。イオン交換体粒子は通常球状であるが、不定形であってもよい。The ion exchanger particles are particles made of an ion exchanger. The ion exchanger has an ion exchange group held on a water-insoluble substrate, and examples thereof include an ion exchange resin and ion exchange cellulose. The ion exchange group may be either an acidic group capable of exchanging cations or a basic group capable of exchanging anions. Examples of acidic groups capable of exchanging cations include -SO 3 M (M = H, Na, etc.) (strongly acidic group), - COOM (M = H , Na , etc.) (weakly acidic group), - O-CH 2 COOM (M = H, Na , etc.) (weakly acidic group), - CH 2 N + (CH 3 ) 2 (C 2 H 4 OH) (strongly basic group), —NX≡ (CH 3 ) 3 (X = Cl, etc.) (strongly basic group), —CH 2 N + H ( CH 3) 2 (weakly basic groups), - N + H 3 (weakly basic groups), - N (CH 3) 2 ( weakly basic groups), - O-C 2 H 4 -NH 2 ( weak base Sex group) and the like. Examples of the ion-exchange resin substrate include styrene-based, methacrylic-based, and acrylic-based resins. The particle size of the ion exchanger particles is usually 0.1 μm to 1 mm, preferably 0.5 to 10 μm. The ion exchanger particles are usually spherical, but may be indefinite.

リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルは、網目状に凝集したリン酸カルシウム系化合物の間に水分子が保持されたものである。リン酸カルシウム系化合物におけるＣａ／Ｐモル比は通常０．５〜２．０、好ましくは１．０〜１．７である。リン酸カルシウム系化合物としては、例えば、アパタイト[Ｃａ10(ＰＯ4)6Ｘ2（Ｘ＝ＯＨ，Ｆ，Ｃｌ等）]、Ｃａ不足ハイドロキシアパタイト[Ｃａ１０−ＸＨ２Ｘ(ＰＯ４)６(ＯＨ)２]、リン酸８カルシウム[Ｃａ８Ｈ２(ＰＯ４)６・５Ｈ２Ｏ]、リン酸４カルシウム[Ｃａ４Ｐ２Ｏ９]、第三リン酸カルシウム[Ｃａ3(ＰＯ4)2]、ピロリン酸カルシウム[Ｃａ2Ｐ2Ｏ7]、メタリン酸カルシウム[Ｃａ(ＰＯ3)2]、第一リン酸カルシウム[Ｃａ(Ｈ２ＰＯ４)２・Ｈ２Ｏ]、第二リン酸カルシウム[ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，ＣａＨＰＯ４]等が挙げられるが、これらのうちアパタイト、特にヒドロキシアパタイト[Ｃａ10(ＰＯ4)6(ＯＨ)2]が好ましい。アパタイトハイドロゲル、特にヒドロキシアパタイトハイドロゲルは、その他のリン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルに比べて水に対する溶解度が小さいからである。In the calcium phosphate compound hydrogel, water molecules are held between calcium phosphate compounds aggregated in a network. The Ca / P molar ratio in the calcium phosphate compound is usually 0.5 to 2.0, preferably 1.0 to 1.7. Examples of calcium phosphate compounds include apatite [Ca 10 (PO 4 ) 6 X 2 (X = OH, F, Cl, etc.)], Ca-deficient hydroxyapatite [Ca 10-X H 2X (PO 4 ) 6 (OH) 2], phosphoric acid 8 calcium [Ca 8 H 2 (PO 4 ) 6 · 5H 2 O], tetracalcium phosphate [Ca 4 P 2 O 9], tribasic calcium phosphate [Ca 3 (PO 4) 2 ], pyromellitic Calcium phosphate [Ca 2 P 2 O 7 ], calcium metaphosphate [Ca (PO 3 ) 2 ], primary calcium phosphate [Ca (H 2 PO 4 ) 2 .H 2 O], dicalcium phosphate [CaHPO 4 .2H 2 O, CaHPO 4] and others as mentioned, apatite among these, hydroxyapatite [Ca 10 (PO 4) 6 (OH) 2] is preferred. This is because apatite hydrogels, particularly hydroxyapatite hydrogels, are less soluble in water than other calcium phosphate compound hydrogels.

リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルは常法に従って調製することができる。リン酸カルシウム系化合物としてアパタイトを使用する場合、アパタイト結晶を塩酸等の酸（ｐＨ２以下）で溶解した後、水酸化ナトリウム等のアルカリを加えてｐＨを7以上に調整することにより、アパタイトハイドロゲルを調製することができる。その他のリン酸カルシウム系化合物の場合も同様にハイドロゲルを調製することができる。   The calcium phosphate compound hydrogel can be prepared according to a conventional method. When apatite is used as the calcium phosphate compound, an apatite hydrogel is prepared by dissolving the apatite crystals with an acid such as hydrochloric acid (pH 2 or lower) and then adding an alkali such as sodium hydroxide to adjust the pH to 7 or higher. can do. In the case of other calcium phosphate compounds, a hydrogel can be similarly prepared.

磁性体粒子は、水酸化鉄、酸化鉄水和物等の磁性体からなる粒子である。磁性体粒子の粒径は通常１０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは４０ｎｍ〜１μｍである。磁性体粒子は通常球状であるが、不定形であってもよい。   The magnetic particles are particles made of a magnetic material such as iron hydroxide and iron oxide hydrate. The particle diameter of the magnetic particles is usually 10 nm to 10 μm, preferably 40 nm to 1 μm. The magnetic particles are usually spherical, but may be indefinite.

リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルで表面が被覆された磁性体粒子（以下「表面被覆磁性体粒子」という場合がある。）は、リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルに磁性体粒子を分散させた後、超音波処理等によりリン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルを複数個の塊に分離することにより調製することができる。こうして調製された表面被覆磁性体粒子は、１個の磁性体粒子が１個のリン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルの塊の内部に保持された形態をとる場合もあるが、通常、複数個の磁性体粒子が１個のリン酸カルシウム系ハイドロゲルの塊の内部に保持された形態をとる。   Magnetic particles whose surface is coated with a calcium phosphate compound hydrogel (hereinafter sometimes referred to as “surface-coated magnetic particles”) are obtained by dispersing the magnetic particles in a calcium phosphate compound hydrogel, followed by ultrasonic treatment, etc. Can be prepared by separating the calcium phosphate compound hydrogel into a plurality of lumps. The surface-coated magnetic particles thus prepared may take a form in which one magnetic particle is held inside one lump of calcium phosphate compound hydrogel. Usually, a plurality of magnetic particles are used. Takes the form of being held inside one lump of calcium phosphate hydrogel.

試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体は、試料に含有される微生物又は細胞が安定して存在することができる液体であり、このような液体としては、例えば、緩衝液、生理食塩水、液体培地又はこれらの混合物等が挙げられる。試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体は、緩衝剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を含有していてもよい。なお、「微生物又は細胞が安定して存在することができる」とは、微生物又は細胞が破壊されなければよく、必ずしも微生物又は細胞が生存することができる必要はない。   The liquid containing the sample, the ion exchanger particles and the surface-coated magnetic particles is a liquid in which microorganisms or cells contained in the sample can stably exist. Examples of such a liquid include a buffer solution. , Physiological saline, liquid medium, or a mixture thereof. The liquid containing the sample, the ion exchanger particles, and the surface-coated magnetic particles may contain a buffer, an isotonic agent, a pH adjuster, and the like. The phrase “microorganisms or cells can exist stably” means that the microorganisms or cells need not be destroyed, and the microorganisms or cells do not necessarily have to survive.

試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体は、例えば、液体試料にイオン交換体粒子（又はイオン交換体粒子含有液）及び表面被覆磁性体粒子（又は表面被覆磁性体粒子含有液)を加えることにより調製することができる。   The liquid containing the sample, the ion exchanger particles, and the surface-coated magnetic particles is, for example, an ion exchanger particle (or a liquid containing ion exchanger particles) and a surface-coated magnetic particle (or a surface-coated magnetic particle-containing liquid sample). Liquid).

試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体中では、微生物又は細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とが互いに結合し合い、微生物又は細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む複合体が形成される。   In a liquid containing a sample, ion exchanger particles, and surface-coated magnetic particles, microorganisms or cells, ion exchanger particles, and surface-coated magnetic particles are bonded to each other. A composite containing coated magnetic particles is formed.

微生物又は細胞とイオン交換体粒子との結合は、例えば、イオン交換体粒子が有するイオン交換基と、微生物又は細胞表面の官能基（イオン交換基が陽イオンを交換可能である場合、例えば、アミノ基等の官能基であり、イオン交換基が陰イオンを交換可能である場合、例えば、リン酸基、カルボキシル基等の官能基である。）との反応等により生じると考えられる。   The binding between the microorganism or cell and the ion exchanger particle is, for example, an ion exchange group possessed by the ion exchanger particle and a functional group on the microorganism or cell surface (if the ion exchange group can exchange a cation, for example, amino When the anion exchange group is capable of exchanging anions, for example, it is considered to be caused by a reaction with a functional group such as a phosphate group or a carboxyl group.

微生物又は細胞と表面被覆磁性体粒子との結合は、例えば、微生物又は細胞表面の官能基（例えばリン酸基)と、表面被覆磁性体粒子のカルシウム部位との反応、微生物又は細胞表面の官能基（例えばアミノ基）と表面被覆磁性体粒子のリン酸部位との反応等により生じると考えられる。   The binding between the microorganism or cell and the surface-coated magnetic particle is, for example, a reaction between a functional group on the surface of the microorganism or cell (for example, a phosphate group) and a calcium site of the surface-coated magnetic particle, or a functional group on the microorganism or cell surface. It is thought to be caused by a reaction between the phosphoric acid sites of the surface-coated magnetic particles (for example, amino group).

表面被覆磁性体粒子とイオン交換体粒子との結合は、例えば、陰イオン交換体が有する窒素原子部位と微生物又は細胞表面の官能基（例えばリン酸基)との反応、イオン交換樹脂の疎水性部分（例えばスチレン系の樹脂基体）と微生物又は細胞表面の疎水性部分（例えば脂質部分）との反応等により生じると考えられる。   The binding between the surface-coated magnetic particles and the ion exchanger particles is, for example, the reaction between the nitrogen atom site of the anion exchanger and the functional group (for example, phosphate group) on the microorganism or cell surface, the hydrophobicity of the ion exchange resin It is considered to be caused by a reaction between a part (for example, a styrenic resin substrate) and a hydrophobic part (for example, a lipid part) on a microorganism or cell surface.

微生物又は細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む複合体の形成効率を向上させる点から、微生物又は細胞とイオン交換体との接触効率、微生物又は細胞と表面被覆磁性体粒子との接触効率、及びイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子との接触効率を攪拌等により向上させることが好ましい。   From the viewpoint of improving the formation efficiency of a complex comprising microorganisms or cells, ion exchanger particles and surface-coated magnetic particles, contact efficiency between microorganisms or cells and ion exchangers, microorganisms or cells and surface-coated magnetic particles It is preferable to improve the contact efficiency and the contact efficiency between the ion exchanger particles and the surface-coated magnetic particles by stirring or the like.

試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体を調製する際、試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを混合する順序は特に限定されるものではなく、試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性体粒子を混合してもよいし、試料と表面被覆磁性体粒子とを混合した後にイオン交換体粒子を混合してもよいし、イオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを混合した後に試料を混合してもよいし、試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを同時に混合してもよいが、試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性体粒子を混合することが好ましい。試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性体粒子を混合する場合、その他の順序で混合する場合よりも効率よく微生物又は細胞を分離することができる。すなわち、試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性体粒子を混合すると、イオン交換体粒子と微生物又は細胞との結合により多量の微生物又は細胞が凝集し、凝集した多量の微生物が表面被覆磁性体粒子によって覆われるので、多量の微生物又は細胞が含まれる複合体を形成することができるとともに、微生物又は細胞が複合体から離脱することを防止することができる。   When preparing a liquid containing a sample, ion exchanger particles, and surface-coated magnetic particles, the order of mixing the sample, ion exchanger particles, and surface-coated magnetic particles is not particularly limited. The surface-coated magnetic particles may be mixed after mixing the exchanger particles, the ion-exchanger particles may be mixed after mixing the sample and the surface-coated magnetic particles, The sample may be mixed after the surface-coated magnetic particles are mixed, or the sample, the ion exchanger particles, and the surface-coated magnetic particles may be mixed at the same time, but the sample and the ion exchanger particles are mixed. After that, it is preferable to mix the surface-coated magnetic particles. When the surface-coated magnetic particles are mixed after mixing the sample and the ion exchanger particles, the microorganisms or cells can be separated more efficiently than when mixing in other order. That is, when the surface-coated magnetic particles are mixed after mixing the sample and the ion exchanger particles, a large amount of microorganisms or cells aggregate due to the binding between the ion exchanger particles and the microorganisms or cells, and the large amount of aggregated microorganisms are on the surface. Since it is covered with the coated magnetic particles, a complex containing a large amount of microorganisms or cells can be formed, and the microorganisms or cells can be prevented from detaching from the complex.

微生物又は細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む複合体を形成させる際の温度は通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃であり、ｐＨは通常ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ７〜９である。   The temperature for forming a complex containing microorganisms or cells, ion exchanger particles and surface-coated magnetic particles is usually 20 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C., and the pH is usually pH 4 to 9, preferably pH 7-9.

こうして形成された複合体は磁性体粒子を含むので、磁石を作用させることにより液体から分離することができる。磁石としては、例えば、永久磁石、電磁石等を使用することができる。複合体から微生物又は細胞を解離させる際には、複合体をリン酸カリウムバッファー、ＥＤＴＡ、クエン酸等のキレート剤溶液と反応させるか、又は複合体含有液のｐＨを降下させればよい。   Since the composite formed in this manner contains magnetic particles, it can be separated from the liquid by the action of a magnet. For example, a permanent magnet or an electromagnet can be used as the magnet. When dissociating microorganisms or cells from the complex, the complex may be reacted with a chelating agent solution such as potassium phosphate buffer, EDTA, or citric acid, or the pH of the complex-containing solution may be lowered.

試料から分離した微生物又は細胞からの核酸抽出は、常法に従って行うことができる。例えば、微生物又は細胞をリゾチーム等の細胞溶解剤で処理して溶解した後、核酸が結合可能な物質（例えば、シリカ、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム（ゼオライト）等）で表面が被覆された磁性体粒子を混合し、核酸と磁性体粒子とを含む複合体を形成させ、磁石を作用させて複合体を分離することにより、微生物又は細胞から抽出した核酸を取得することができる。この際、分注機を利用した核酸抽出装置（例えばＳＸ−６ＧＣ（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社製））を使用することができる。試料からの微生物又は細胞の分離及び分離した微生物又は細胞からの核酸抽出に磁性体粒子を利用することにより、微生物又は細胞の分離から核酸抽出に至る一連の工程を自動化することができる。   Nucleic acid extraction from a microorganism or cell separated from a sample can be performed according to a conventional method. For example, a magnetic substance whose surface is coated with a substance (for example, silica, alkylsilica, aluminum silicate (zeolite), etc.) to which nucleic acid can bind after treating microorganisms or cells with a cell lysing agent such as lysozyme. Nucleic acids extracted from microorganisms or cells can be obtained by mixing particles, forming a complex containing nucleic acid and magnetic particles, and separating the complex by applying a magnet. At this time, a nucleic acid extraction apparatus (for example, SX-6GC (manufactured by Precision System Science Co., Ltd.)) using a dispenser can be used. By using magnetic particles for separation of microorganisms or cells from a sample and extraction of nucleic acids from separated microorganisms or cells, a series of steps from separation of microorganisms or cells to extraction of nucleic acids can be automated.

〔実施例１〕ハイドロキシアパタイトハイドロゲルで表面が被覆されたマグネタイト粒子の調製
滅菌した超純水１００ｍｌにハイドロキシアパタイト結晶粉末（サンギ製、クロマトグラフィー用）０．４ｇを懸濁し、２Ｎの塩酸（和光製）を４ｍｌ加え、完全に溶解した。この際、ｐＨが２．０以下となる。次いで、２Ｎの水酸化ナトリウム（和光製）を４ｍｌ加えてｐＨを８．０に調整し、ハイドロキシアパタイトハイドロゲルを調製した。次いで、４０〜６０ｎｍのマグネタイト粒子（ＵＳ Ａｒｍｙ）６ｇを加え、さらに滅菌した超純水を加えて全体量を２００ｍｌにした後、超音波で５〜１０分処理し、ハイドロキシアパタイトハイドロゲルで表面が被覆されたマグネタイト粒子（以下「表面被覆マグネタイト粒子」という。）を調製した。こうして調製された表面被覆マグネタイト粒子は、複数個のマグネタイト粒子が１個のリン酸カルシウム系ハイドロゲルの塊の内部に保持された形態をとる。表面被覆マグネタイト粒子はオートクレーブにより１２１℃で１５分間滅菌処理した後、使用した。[Example 1] Preparation of magnetite particles whose surfaces are coated with hydroxyapatite hydrogel In 100 ml of sterilized ultrapure water, 0.4 g of hydroxyapatite crystal powder (manufactured by Sangi, for chromatography) is suspended, and 2N hydrochloric acid (Wako) 4 ml) was added and completely dissolved. At this time, the pH is 2.0 or less. Next, 4 ml of 2N sodium hydroxide (manufactured by Wako) was added to adjust the pH to 8.0 to prepare a hydroxyapatite hydrogel. Next, 6 g of magnetite particles (US Army) of 40 to 60 nm are added, and further sterilized ultrapure water is added to make the total amount 200 ml, and then treated with ultrasonic waves for 5 to 10 minutes, and the surface is treated with hydroxyapatite hydrogel. Coated magnetite particles (hereinafter referred to as “surface-coated magnetite particles”) were prepared. The surface-coated magnetite particles thus prepared take a form in which a plurality of magnetite particles are held inside one lump of calcium phosphate hydrogel. The surface-coated magnetite particles were used after being sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes.

〔実施例２〕イオン交換体粒子の調製
陰イオン交換樹脂（オルガノ製、アンバーライト）約１ｇを乳鉢で粉末状にすりつぶし、５ｍｌの滅菌した超純水に懸濁した。なお、使用した陰イオン交換樹脂におけるイオン交換基は第４アミン（−ＮＸ≡(ＣＨ３)３、Ｘ＝Ｃｌ）であり、イオン交換基を保持する基体はスチレン系ポリマーである。Example 2 Preparation of Ion Exchanger Particles About 1 g of anion exchange resin (Amberlite, manufactured by Organo) was ground in a mortar and suspended in 5 ml of sterilized ultrapure water. The ion exchange group in the used anion exchange resin is a quaternary amine (—NX≡ (CH 3 ) 3 , X═Cl), and the substrate holding the ion exchange group is a styrene polymer.

〔実施例３〕試料からの微生物の分離及び分離した微生物からのゲノムＤＮＡの抽出
（１）高温環境土壌の採取
各種環境に存在する微生物の有用な酵素を利用するためには、その環境に存在する微生物のＤＮＡを取得することが重要である。そこで、高温環境の代表として性質（ｐＨ）の異なる九州鹿児島県霧島温泉郷の温泉地帯を選択した。
温泉地域内の特定の領域には、マッドポット（泥が煮立っているような穴）が天然の状態（人手の入らない状態）で幾つも存在している。これらの地点から、採取地点ごとに、温度、ｐＨ等のデータとともに採取試料の色、水分量等の状態を映像等により記録した。その結果、表１に示すような環境の異なる土壌が採取できた。各地点からは、十分量のＤＮＡが回収できるように、１００ｇ程度の土壌を採取した。[Example 3] Separation of microorganisms from a sample and extraction of genomic DNA from the separated microorganisms (1) Collection of high-temperature environmental soil In order to use useful enzymes of microorganisms present in various environments, they exist in the environment. It is important to obtain the DNA of microorganisms that do. Therefore, a hot spring area in Kirishima Onsenkyo, Kyushu, Kagoshima Prefecture, which has different properties (pH), was selected as a representative high temperature environment.
There are a number of mud pots (holes in which mud is simmered) in a natural state (a state where human hands cannot enter) in a specific area within the hot spring area. From these points, the color, moisture content, and other conditions of the sample collected along with data such as temperature and pH were recorded for each sampling point by video. As a result, soils having different environments as shown in Table 1 were collected. About 100 g of soil was collected from each point so that a sufficient amount of DNA could be recovered.

（２）高温環境土壌に存在する微生物の捕獲
採取された土壌１０ｇを５０ｍｌの遠心管に分取した後、懸濁Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、和光製）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（和光製））５ｍｌを加え、ボルテックスを用いて室温でよく攪拌した。次いで、大きな石等を取り除く目的で、この土壌溶液をフィルターで分離した。石等を取り除いた土壌溶液５ｍｌに、実施例１で調製した表面被覆マグネタイト粒子５００μｌと実施例２で調製したイオン交換体粒子１００μｌとを加え、ボルテックスを用いてよく攪拌した。これにより、土壌溶液に含有される微生物とイオン交換体粒子と表面被覆マグネタイト粒子とを含む複合体が形成された。なお、複合体を形成させる際、まず土壌溶液にイオン交換体粒子を添加し、ボルテックスを用いて攪拌した後、表面被覆マグネタイト粒子を添加し、ボルテックスを用いて攪拌した。
磁石を用いて土壌溶液から複合体を分離した。分離した複合体に８００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ＫＰＢ、和光製）２００μｌを加え、室温で２０分間攪拌し、複合体から微生物を解離させた。磁石を用いてマグネタイト粒子と溶液とを分離し、溶液を回収した。(2) Capture of microorganisms present in high-temperature environment soil 10 g of the collected soil was collected into a 50 ml centrifuge tube, and then suspended Buffer (100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, manufactured by Wako)), 0. 5 ml of 05% Tween 20 (manufactured by Wako) was added, and the mixture was well stirred at room temperature using a vortex. Next, this soil solution was separated with a filter in order to remove large stones and the like. 500 μl of the surface-coated magnetite particles prepared in Example 1 and 100 μl of the ion exchanger particles prepared in Example 2 were added to 5 ml of the soil solution from which stones and the like were removed, and the mixture was well stirred using a vortex. Thereby, the composite_body | complex containing the microbe contained in a soil solution, ion-exchanger particle | grains, and surface covering magnetite particle | grains was formed. When forming the complex, first, ion exchanger particles were added to the soil solution and stirred using vortex, and then surface-coated magnetite particles were added and stirred using vortex.
The complex was separated from the soil solution using a magnet. 200 μl of 800 mM potassium phosphate buffer (KPB, manufactured by Wako) was added to the separated complex, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes to dissociate microorganisms from the complex. The magnetite particles and the solution were separated using a magnet, and the solution was recovered.

（３）高温環境土壌に存在する微生物のＤＮＡ抽出
回収した溶液２００μｌに、超純水で調製した７０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（和光製）２０μｌを加え、３７℃で１０分間処理して微生物を溶解した後、小型核酸抽出装置ＳＸ−６ＧＣ（プレシジョン・システム・サイエンス製）を用いて、ＤＮＡ抽出を行った。抽出操作は、プロトコルＩＣカード「Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ」（プレシジョン・システム・サイエンス製）に従い、プレパック試薬「ＧＣ ｓｅｒｉｅｓ Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ」（プレシジョン・システム・サイエンス製）を用いて行った。また別に、Ｕｌｔｒａ ｃｌｅａｎ Ｓｏｉｌ ｋｉｔ（Ｍｏ社製）を用いてＤＮＡ抽出を行った。(3) Extraction of DNA of microorganisms present in high-temperature environmental soil 20 μl of 70 mg / ml lysozyme (manufactured by Wako) prepared with ultrapure water was added to 200 μl of the collected solution, and the microorganisms were dissolved by treatment at 37 ° C. for 10 minutes. Then, DNA extraction was performed using the small nucleic acid extraction apparatus SX-6GC (made by Precision System Science). The extraction operation was performed according to the protocol IC card “Genomic DNA whole blood” (manufactured by Precision System Science) using a prepacked reagent “GC series Migration Genomic DNA whole blood” (manufactured by Precision System Science). Separately, DNA extraction was performed using Ultra clean Sol kit (manufactured by Mo).

実際に抽出したＤＮＡ溶液の１／２０量である５μｌを分取し、１μｌの電気泳動用濃縮染色液（０．２５％ブロモフェノールブルー，０．２５％キシレンシアノール，３０％グリセロール）を加え、１．０％アガロースゲル電気泳動で確認した。
その結果、図１に示すように、量の多少は有るが、１０キロ塩基対以上の長さのゲノムＤＮＡが回収されていることが確認できた。なお、図１中、「Ｍ」は分子量マーカー（Wide range marker（Takara））を表し、レーン１〜３は核酸抽出装置による結果（レーン１〜３はそれぞれ試料番号１〜３に対応する）を示し、レーン４〜６は既存のＤＮＡ抽出キットによる結果（レーン４〜６はそれぞれ試料番号１〜３に対応する）を示す。5 μl, which is 1/20 of the actually extracted DNA solution, is collected, and 1 μl of concentrated staining solution for electrophoresis (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% glycerol) is added. This was confirmed by 1.0% agarose gel electrophoresis.
As a result, as shown in FIG. 1, it was confirmed that genomic DNA having a length of 10 kilobase pairs or more was recovered although the amount was somewhat. In FIG. 1, “M” represents a molecular weight marker (Wide range marker (Takara)), lanes 1 to 3 are the results of the nucleic acid extraction apparatus (lanes 1 to 3 correspond to sample numbers 1 to 3, respectively). Lanes 4 to 6 show the results of existing DNA extraction kits (lanes 4 to 6 correspond to sample numbers 1 to 3, respectively).

〔実施例４〕イオン交換体粒子の有無に基づく大腸菌の捕獲効率の比較
（１）ハイドロキシアパタイトハイドロゲルで表面が被覆されたマグネタイト磁性粒子を用いた大腸菌の捕獲
ＬＢ培養液を用いて３７℃で１５時間培養した大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）溶液１ｍｌに、実施例１に調製した表面被覆マグネタイト粒子１００μｌを加え、ボルテックスを用いて室温でよく攪拌し、大腸菌と表面被覆マグネタイト粒子とを含む複合体を形成させた。磁石を用いて複合体を分離し、分離した複合体にＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光製）を２００μｌ加え、室温で２０分間攪拌した。磁石を用いてマグネタイト粒子を分離し、溶液を回収した。[Example 4] Comparison of E. coli capture efficiency based on presence or absence of ion exchanger particles (1) Capture of E. coli using magnetite magnetic particles coated with hydroxyapatite hydrogel at 37 ° C using LB culture solution To 1 ml of E. coli solution cultured for 15 hours, 100 μl of the surface-coated magnetite particles prepared in Example 1 were added and stirred well at room temperature using a vortex to prepare a complex containing E. coli and surface-coated magnetite particles. Formed. The complex was separated using a magnet, 200 μl of EDTA · 2Na (manufactured by Wako) was added to the separated complex, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. The magnetite particles were separated using a magnet, and the solution was recovered.

（２）ハイドロキシアパタイトハイドロゲルで表面が被覆されたマグネタイト磁性粒子及びイオン交換体粒子を用いた大腸菌の捕獲
ＬＢ培養液を用いて３７℃で１５時間培養した大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）溶液１ｍｌに、実施例１で調製した表面被覆マグネタイト粒子１００μｌと実施例２で調製したイオン交換体粒子１００μｌとを加え、ボルテックスを用いて室温でよく攪拌し、大腸菌とイオン交換体粒子と表面被覆マグネタイト粒子とを含む複合体を形成させた。なお、複合体を形成させる際、まず大腸菌溶液にイオン交換体粒子を添加し、ボルテックスを用いて攪拌した後、表面被覆マグネタイト粒子を添加し、ボルテックスを用いて攪拌した。磁石を用いて複合体を分離し、分子した複合体に８００ｍＭのＫＰＢ（和光製）を２００μｌ加え、室温で２０分間攪拌した。磁石を用いて磁性粒子を分離し、溶液を回収した。(2) Capturing E. coli using magnetite magnetic particles and ion exchanger particles whose surfaces are coated with hydroxyapatite hydrogel In 1 ml of E. coli solution cultured at 37 ° C. for 15 hours using LB culture solution, Add 100 μl of the surface-coated magnetite particles prepared in Example 1 and 100 μl of the ion-exchanger particles prepared in Example 2 and stir well at room temperature using a vortex to obtain E. coli, ion-exchanger particles, and surface-coated magnetite particles. A complex containing was formed. When forming the complex, first, ion exchanger particles were added to the E. coli solution and stirred using vortex, and then surface-coated magnetite particles were added and stirred using vortex. The complex was separated using a magnet, 200 μl of 800 mM KPB (manufactured by Wako) was added to the molecular complex, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. The magnetic particles were separated using a magnet, and the solution was recovered.

（３）菌体溶液からのＤＮＡ抽出
回収した２００μｌの溶液に、超純水で調整した７０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（和光製）を２０μｌ加え、３７℃で１０分間処理し、小型核酸抽出装置ＳＸ−６ＧＣ（プレシジョン・システム・サイエンス製）を用いて、ＤＮＡ抽出を行った。抽出操作は、プロトコルＩＣカード「Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ」（プレシジョン・システム・サイエンス製）に従い、プレパック試薬「ＧＣ ｓｅｒｉｅｓ Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ」（プレシジョン・システム・サイエンス製）を用いて行った。(3) DNA extraction from bacterial cell solution 20 μl of 70 mg / ml lysozyme (manufactured by Wako) adjusted with ultrapure water was added to the collected 200 μl solution, treated at 37 ° C. for 10 minutes, and a small nucleic acid extraction apparatus SX- DNA extraction was performed using 6GC (manufactured by Precision System Science). The extraction operation was performed according to the protocol IC card “Genomic DNA whole blood” (manufactured by Precision System Science) using a prepacked reagent “GC series Migration Genomic DNA whole blood” (manufactured by Precision System Science).

実際に抽出したＤＮＡ溶液の１／２０量である５μｌ（分子量マーカーは３μｌ)を分取し、１μｌの電気泳動用濃縮染色液（０．２５％ブロモフェノールブルー，０．２５％キシレンシアノール，３０％グリセロール）を加え、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ，３０分）で確認した。
電気泳動の結果を図２に示す。図２中、「Ｍ」は分子量マーカー（λ−ＨｉｎｄIII）を表し、レーン１は、大腸菌培養液からＤＮＡを直接抽出した結果を示し、レーン２は実施例４（１）の結果を示し、レーン３は、実施例４（２）の結果を示す。また、抽出したＤＮＡの定量結果を表２に示す。ＤＮＡの定量は、吸光度計ＤＵ５３０（Ｂｅｃｋｍａｎ製）を用いて測定した。5 μl (molecular weight marker is 3 μl), which is 1/20 of the actually extracted DNA solution, is collected, and 1 μl of concentrated staining solution for electrophoresis (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 30% glycerol) was added and confirmed by 1.0% agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes).
The result of electrophoresis is shown in FIG. In FIG. 2, “M” represents a molecular weight marker (λ-HindIII), lane 1 shows the result of direct extraction of DNA from the E. coli culture, lane 2 shows the result of Example 4 (1), lane 3 shows the result of Example 4 (2). Table 2 shows the quantification results of the extracted DNA. The DNA was quantified using an absorbance meter DU530 (manufactured by Beckman).

図２及び表２に示すように、表面被覆マグネタイト粒子を単独で使用する場合よりも表面被覆マグネタイト粒子とイオン交換体とを併用する場合の方がゲノムＤＮＡの回収量が多いこと、すなわち大腸菌の捕獲効率が高いことが確認できた。
As shown in FIG. 2 and Table 2, the amount of recovered genomic DNA is larger when the surface-coated magnetite particles and the ion exchanger are used in combination than when the surface-coated magnetite particles are used alone. It was confirmed that the capture efficiency was high.

Claims (2)

微生物又は細胞を含有する試料から前記微生物又は前記細胞を分離する方法であって、
前記試料と、イオン交換体粒子と、リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルで表面が被覆された磁性体粒子とを含む液体を調製し、
磁石を作用させて前記液体から前記微生物又は前記細胞と前記イオン交換体粒子と前記磁性体粒子とを含む複合体を分離することを特徴とする方法。A method for separating a microorganism or cell from a sample containing the microorganism or cell,
Preparing a liquid comprising the sample, ion exchanger particles, and magnetic particles whose surfaces are coated with a calcium phosphate compound hydrogel;
A method for separating a complex containing the microorganism, the cell, the ion exchanger particle, and the magnetic particle from the liquid by applying a magnet. 試料に含有される微生物又は細胞から核酸を抽出する方法であって、
請求項１記載の方法を用いて前記試料から前記微生物又は前記細胞を分離し、
分離した前記微生物又は前記細胞から核酸を抽出することを特徴とする方法。
A method for extracting nucleic acid from microorganisms or cells contained in a sample, comprising:
Separating the microorganism or the cell from the sample using the method of claim 1;
A method comprising extracting nucleic acid from the separated microorganism or the cell.
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