JPWO2006033352A1

JPWO2006033352A1 - Antibacterial peptide and lactic acid bacterium producing the peptide

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Publication number: JPWO2006033352A1
Application number: JP2006536395A
Authority: JP
Inventors: 古賀　祥子; 祥子古賀; 森山　恵; 恵森山; 川上　いずみ; いずみ川上
Original assignee: オーム乳業株式会社; 熊本製粉株式会社
Priority date: 2004-09-22
Filing date: 2005-09-21
Publication date: 2008-05-15
Also published as: WO2006033352A1

Abstract

中性やアルカリ性領域においても有効な食品の保存や殺菌・消毒等に用いられる抗菌剤として好適なMet−Ala−Gly−Phe−Leu−Lys−Val−Val−Gln−Leu−Leu−Ala−Lys−Tyr−Gly−Ser−Lys−Ala−Val−Gln−Trp−Ala−Trp−Ala−Asn−Lys−Gly−Lys−Ile−Leu−Asp−Trp−Leu−Asn−Ala−Gly−Gln−Ala−Ile−Asp−Trp−Val−Val−Ser−Lys−Ile−Lys−Gln−Ile−Leu−Gly−Ile−Lysアミノ酸配列から成る一次構造を有する新規な抗菌性ペプチド（バクテリオシン）が開示されている。新規なラクトコッカス・ラクティス菌株QU1005菌株（NITE BP-23）によって生産される。Met-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys-Val-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Lys that is suitable as an antibacterial agent used for the preservation, sterilization, and disinfection of foods that are effective even in neutral and alkaline regions -Tyr-Gly-Ser-Lys-Ala-Val-Gln-Trp-Ala-Trp-Ala-Asn-Lys-Gly-Lys-Ile-Leu-Asp-Trp-Leu-Asn-Ala-Gly-Gln-Ala Disclosed is a novel antibacterial peptide (bacteriocin) having a primary structure consisting of an amino acid sequence of Ile-Asp-Trp-Val-Val-Ser-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Leu-Gly-Ile-Lys ing. Produced by a novel Lactococcus lactis strain QU1005 (NITE BP-23).

Description

本発明は、新規な乳酸菌株と該菌株によって生産される新規な抗菌性ペプチドに関する。 The present invention relates to a novel lactic acid strain and a novel antibacterial peptide produced by the strain.

乳酸菌が生産する抗菌物質としては、乳酸などの有機酸、過酸化水素、ジアセチル等の低分子がすでに知られている。その他、ペプチドからなる抗菌物質（バクテリオシン）の存在も知られており、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）が生産するナイシンＡ（J. Am. Chem. Soc. 1971 Sep 8; 93(18): 4634-5）、ナイシンZ（Eur. J.
Biochem. 1991 Nov 1; 201(3): 581-4）などが挙げられている。ナイシンは乳酸菌由来で、ヒトの消化酵素により分解される、安全性の高い抗菌物質として、欧米を中心に広く食品保存剤として使用されている。しかし、ナイシンは酸性域では安定であるが、中性、アルカリ性域では不安定であるため、食品保存剤として利用できる食品が酸性、弱酸性のものに限られる。
また医療分野では、抗生物質の多用による多剤耐性菌の出現により、MRSAやVREなどの弱毒微生物による院内感染症が問題となっている。現在は主にエタノール製剤での殺菌・消毒が主であるが、高濃度のエタノールは手荒れの原因となり、その部分からの感染や、付着細菌の伝播が懸念されるため、高濃度のエタノール製剤に代わる殺菌・消毒薬が求められている。
J. Am. Chem. Soc. 1971 Sep 8; 93(18): 4634-5 Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1; 201(3): 581-4 As antibacterial substances produced by lactic acid bacteria, organic acids such as lactic acid, and low molecules such as hydrogen peroxide and diacetyl are already known. In addition, the existence of an antibacterial substance (bacteriocin) comprising a peptide is also known, for example, Nisin A (J. Am. Chem. Soc. 1971 Sep 8; 93 (18) produced by Lactococcus lactis. ): 4634-5), Nisin Z (Eur. J.
Biochem. 1991 Nov 1; 201 (3): 581-4). Nisin is derived from lactic acid bacteria and is a highly safe antibacterial substance that is decomposed by human digestive enzymes and is widely used as a food preservative mainly in Europe and the United States. However, although nisin is stable in the acidic range, it is unstable in the neutral and alkaline range, so that foods that can be used as food preservatives are limited to those that are acidic and weakly acidic.
In the medical field, nosocomial infections caused by attenuated microorganisms such as MRSA and VRE have become a problem due to the emergence of multidrug-resistant bacteria due to heavy use of antibiotics. At present, sterilization and disinfection with ethanol preparations are mainly used, but high concentrations of ethanol cause rough hands, and there are concerns about infection from that part and the spread of adherent bacteria. There is a need for alternative disinfectants.
J. Am. Chem. Soc. 1971 Sep 8; 93 (18): 4634-5 Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1; 201 (3): 581-4

本発明の目的は、従来から知られていない抗菌物質を生産し得る新規な乳酸菌を見出し、中性やアルカリ性領域においても有効な、食品の保存や、殺菌・消毒等に有用な技術を提供することにある。 An object of the present invention is to find a novel lactic acid bacterium capable of producing an antibacterial substance that has not been known so far, and to provide a technique useful for food preservation, sterilization, disinfection, etc. that is effective even in a neutral or alkaline region. There is.

本発明者は乳酸菌が生産する抗菌物質に着目し研究を重ねた結果、バチルス（Bacillus）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、リステリア（Listeria）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属に属する、食品劣化の原因微生物に対して抗菌性を有する（すなわち、感受性グラム陽性細菌に対する阻害活性を有する）物質を生産する新規な乳酸菌株ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）を見出し、該抗菌性物質（ペプチド）の精製・同定、一次構造の解明、および諸性質の解明を行うことにより、本発明を導き出した。
かくして、本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなる一次構造を有する抗菌性ペプチドを提供するものである。なお、Ｎ末端のメチオニンはホルミル化されている。As a result of repeated researches focusing on antibacterial substances produced by lactic acid bacteria, the present inventor has developed the genus Bacillus, Micrococcus, Listeria, Pediococcus, Enterococcus. It has antibacterial activity against food-causing microorganisms belonging to the genus, Lactococcus genus, Lactobacillus genus, Leuconostoc genus (ie, has inhibitory activity against sensitive gram-positive bacteria) ) By discovering a novel lactic acid strain Lactococcus lactis that produces a substance, purifying and identifying the antibacterial substance (peptide), elucidating the primary structure, and elucidating various properties, Derived.
Thus, the present invention provides an antibacterial peptide having a primary structure consisting of the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1). The N-terminal methionine is formylated.

さらに、本発明に従えば、上記の抗菌性ペプチドを生産するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）新規菌株、すなわちQU 1005菌株（受託番号：NITE BP-23）が提供される。 Furthermore, according to the present invention, a novel strain of Lactococcus lactis that produces the above-mentioned antibacterial peptide, that is, the QU 1005 strain (accession number: NITE BP-23) is provided.

本発明に従えば、食品保存や抗菌・消毒などの目的に有用な抗菌剤の素材として好適な抗菌性ペプチドが提供される。 According to the present invention, an antibacterial peptide suitable as a material for an antibacterial agent useful for food preservation, antibacterial / disinfection and the like is provided.

本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）をナイシンＺと比較したｐＨ安定性試験の結果を示す。The result of the pH stability test which compared the antibacterial peptide (lacticin Q) of this invention with the nisin Z is shown. 本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）をナイシンＺと比較した熱安定性試験の結果を示す。The result of the thermal stability test which compared the antimicrobial peptide (lacticin Q) of this invention with the nisin Z is shown. 本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）をナイシンＺと比較したエタノール安定性試験の結果を示す。The result of the ethanol stability test which compared the antimicrobial peptide (lacticin Q) of this invention with nisin Z is shown.

本発明によって得られる抗菌性物質は、熊本県阿蘇市産のトウモロコシから分離されたラクトコッカス・ラクティス菌株によって生産される新規なペプチド（バクテリオシン）であり、従来知られているナイシンやラクトコッシンなどとは異なるアミノ酸配列から構成される新しいタイプのバクテリオシン類と考えられる。
以下、新規菌株の単離やその特性分析、該菌株からの抗菌性ペプチドの生産や精製、コードするDNAの配列の決定、および該ペプチドの諸性質の解明などに沿って本発明の実施の形態を詳細に説明する。The antibacterial substance obtained by the present invention is a novel peptide (bacteriocin) produced by a Lactococcus lactis strain isolated from corn produced in Aso City, Kumamoto Prefecture, and conventionally known nisin, lactococcin and the like Is considered a new type of bacteriocin composed of different amino acid sequences.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described along with isolation of a new strain and analysis of its characteristics, production and purification of an antibacterial peptide from the strain, determination of the sequence of the encoding DNA, and elucidation of various properties of the peptide. Will be described in detail.

（１）乳酸菌の単離方法
乳酸菌の天然野生株を取得するために、様々な食材を分離源として、乳酸菌選択性の高いMRS培地（OXOID社製）やM17（MERCK社製）培地、または滅菌蒸留水を用いて集積培養を行った。集積培養液から分離した菌を用いて抗菌活性を指標としたスクリーニングを行った。すなわち、MRS寒天培地にコロニーを増殖させた後、指標菌となる各種グラム陽性細菌（上記の食品劣化の原因微生物）の培養液を混釈した軟寒天培地を重層し、至適温度にて培養後、コロニー周辺に形成される指標菌の増殖阻止円が観察された菌株を単離した。(1) Isolation method of lactic acid bacteria To obtain natural wild strains of lactic acid bacteria, MRS medium (OXOID) or M17 (MERCK) medium with high selectivity for lactic acid bacteria, or sterilization, using various ingredients as the source of separation. Accumulation culture was performed using distilled water. Screening using antibacterial activity as an index was performed using bacteria isolated from the enrichment culture. That is, after growing colonies on the MRS agar medium, the culture medium of various gram positive bacteria (the above-mentioned microorganisms that cause food deterioration) serving as indicator bacteria is layered and cultured at an optimum temperature. Thereafter, a strain in which a growth inhibition circle of indicator bacteria formed around the colony was observed was isolated.

（２）分離菌株の性質分析
スクリーニングの結果、優れた抗菌性を有する菌株を発見した。本菌株は、熊本県阿蘇市にて収穫されたトウモロコシから分離されたものである。グラム染色、カタラーゼ活性試験、運動性試験、細胞の形態観察、糖類発酵性試験、生産乳酸量、生産乳酸旋光性、グルコースからのガス発生テストについて調査した。菌株の特性は、通性嫌気性、グラム陽性、カタラーゼ陰性、運動性なし、細胞の形態は楕円双球菌、ホモ型発酵性菌であった。また、49種類の糖類発酵性テスト（APIシステム）を行った結果、本菌株は表１に示される糖類発酵性を示した。この結果より、本菌株をラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）であると同定し、これをLactococcus lactis QU 1005菌株と命名した。本QU
1005菌株は特許微生物寄託センターに寄託しており、受託番号はNITE BP-23（原寄託日２００４年９月１５日）である。(2) As a result of the property analysis screening of the isolated strain, a strain having excellent antibacterial properties was discovered. This strain was isolated from corn harvested in Aso City, Kumamoto Prefecture. Gram staining, catalase activity test, motility test, cell morphology observation, saccharide fermentability test, produced lactic acid amount, produced lactic acid rotation, and gas generation test from glucose were investigated. The characteristics of the strain were facultative anaerobic, gram positive, catalase negative, no motility, and cell morphology was elliptical bacilli and homofermentative bacteria. Moreover, as a result of 49 types of saccharide fermentability tests (API system), this strain showed saccharide fermentability shown in Table 1. From this result, this strain was identified as Lactococcus lactis and named Lactococcus lactis QU 1005 strain. This QU
The 1005 strain has been deposited with the Patent Microorganism Depositary, and the deposit number is NITE BP-23 (original deposit date September 15, 2004).

16S rDNAシーケンス解析による菌株の同定
現在、微生物の系統分類の指標として最も広く用いられている方法が16S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列（16S rDNA）である。QU 1005の系統分類学的位置を明確にするために16S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列（16S rDNA）を決定し、データベースによる相同性検索を行った。すなわち、16S rDNAの約1.5 kbpのうち上流部分の約500bpについて検討を行った。
QU 1005菌株の培養液よりMagExtractor Kit -Genome-（TOYOBO社製）を用いて全ゲノムDNAを抽出した。これを鋳型として配列番号Ａに示すプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により単一な増幅断片を得た。その後、増幅断片をpGEM-T cloning vector（プロメガ社製）にライゲーションし、このライゲーション産物を用いて、ヒートショック法によりE. coli JM109を形質転換した。形質転換体をLB培地で8時間培養後、MagExtractor-Plasmid（TOYOBO社製）を用い、プラスミドを抽出した。このプラスミドをシーケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応にはThermo Sequence fluorescent labeled primer cycle
sequencing kit（ファルマシア社製）を使用した。
結果として、配列番号Ｂの塩基配列（ヌクレオチド配列）が得られた。配列番号Ｂの塩基配列のデータベースによる相同性検索を行った結果、Lactococcus lactisと100%の相同性を示した。 Identification of strains by 16S rDNA sequence analysis At present, the most widely used method as an indicator of phylogenetic classification of microorganisms is the base sequence (16S rDNA) of a gene encoding 16S rRNA. In order to clarify the phylogenetic position of QU 1005, the base sequence (16S rDNA) of the gene encoding 16S rRNA was determined, and homology search was performed using a database. That is, about 500 bp in the upstream portion of about 1.5 kbp of 16S rDNA was examined.
Total genomic DNA was extracted from the culture solution of QU 1005 strain using MagExtractor Kit -Genome- (manufactured by TOYOBO). Using this as a template and the primer shown in SEQ ID NO: A, a single amplified fragment was obtained by polymerase chain reaction. Thereafter, the amplified fragment was ligated into pGEM-T cloning vector (Promega), and E. coli JM109 was transformed by the heat shock method using this ligation product. The transformant was cultured in LB medium for 8 hours, and then the plasmid was extracted using MagExtractor-Plasmid (manufactured by TOYOBO). This plasmid was used as a template for the sequence reaction. For sequence reactions, Thermo Sequence fluorescent labeled primer cycle
A sequencing kit (Pharmacia) was used.
As a result, the base sequence (nucleotide sequence) of SEQ ID NO: B was obtained. As a result of homology search using the database of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: B, it showed 100% homology with Lactococcus lactis.

（３）抗菌活性試験
QU 1005菌株により抗菌物質が液体培地中に生産されているか検討するため、MRS液体培地にて18時間培養後、遠心分離を行って得た培養液上清を回収した。1M NaOHを用いてpHを６に調整した後、濾過滅菌したものを試験サンプルとした。試験サンプルを２倍段階希釈し、抗菌活性試験に用いた。指標菌を混釈した軟寒天培地上に試験サンプルの段階希釈液を10μl滴下した。抗菌活性は輪郭の明瞭な増殖阻止円が観察された最大希釈倍率をXとし、X×1000/10（A.U./ml）として算出した。この結果、QU 1005菌株の培養液上清は表２に示される抗菌スペクトルを示した。QU 1005菌株によって生産される抗菌物質（抗菌性ペプチド）をここではラクティシンＱと称する。(3) Antibacterial activity test
In order to examine whether an antibacterial substance was produced in the liquid medium by the QU 1005 strain, the culture supernatant obtained by centrifuging was collected after culturing in the MRS liquid medium for 18 hours. A test sample was prepared by adjusting the pH to 6 using 1M NaOH and then sterilizing by filtration. The test sample was diluted 2-fold and used for the antibacterial activity test. 10 μl of a serial dilution of the test sample was dropped onto a soft agar medium containing the indicator bacteria. The antibacterial activity was calculated as X × 1000/10 (AU / ml), where X was the maximum dilution factor at which a well-defined growth inhibition circle was observed. As a result, the culture supernatant of the QU 1005 strain showed the antibacterial spectrum shown in Table 2. The antibacterial substance (antibacterial peptide) produced by the QU 1005 strain is referred to herein as lactisin Q.

（４）抗菌物質の生産および精製方法
分離株QU 1005菌株をMRS培地にて前培養し、前培養液8mlを250mlのMRS培地に植菌した。30℃で12時間静置培養を行い、6000rpmで遠心分離後、上清を回収した。培養液上清（200ml）の指標菌Bacillus coagulans JCM 2257^Tに対する活性は、2.56×10⁶（A.U./ml）であった。培養液上清に対して３倍量（600ml）の冷却アセトンを添加し、１時間−30℃で冷却した後、6000rpmで遠心分離し、抗菌物質を沈殿回収した。回収した沈殿物を20mMのリン酸ナトリウムバッファー（pH 5.7）100mlに再溶解した。SP-セファロース陽イオン交換樹脂（ファルマシア社製）を16mlをカラムに充填し、再溶解したサンプル100mlを添加し、リン酸ナトリウムバッファーでカラムを平衡化した。流速2ml/分で0.25、0.5、0.75、1.0M NaCl含有リン酸ナトリウムバッファー（各40ml）を用いて段階的に分画溶出した。
それぞれの溶出画分の抗菌活性を測定した結果、最も活性の強かった0.25M NaCl溶出画分の活性は2.05×10⁶（A.U./ml）であった。0.25M NaCl溶出液（40ml）を逆相HPLC（カラム：ファルマシア社製RESOURCE RPC 3ml）に供した。移動相には、0.1%トリフルオロ酢酸含有MilliQ水を用い、アセトニトリルの直線的濃度勾配（グラジエント20〜80%）、流速1ml/分、１画分あたり1mlで30分画した。検出器には紫外可視分光光度計（波長220、280nm）を使用した。30の分画サンプルの抗菌活性を測定し、活性の強かった画分を取得した。
このようにして得られた精製後の抗菌物質は表３に示される抗菌スペクトルを示した。既知のバクテリオシンであるナイシンＡと比較すると、ラクティシンQはEnteroocccus属に対して高い抗菌活性（小さいMIC（最小生育阻止濃度）値）が認められた。(4) Production and purification method of antibacterial substance Isolate QU 1005 strain was precultured in MRS medium, and 8 ml of the preculture was inoculated into 250 ml of MRS medium. After stationary culture at 30 ° C. for 12 hours, the supernatant was collected after centrifugation at 6000 rpm. The activity of the culture supernatant (200 ml) against the indicator bacterium Bacillus coagulans JCM 2257 ^T was 2.56 × 10 ⁶ (AU / ml). Three times (600 ml) of chilled acetone was added to the culture supernatant and cooled at −30 ° C. for 1 hour, and then centrifuged at 6000 rpm to precipitate and collect antibacterial substances. The collected precipitate was redissolved in 100 ml of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 5.7). 16 ml of SP-Sepharose cation exchange resin (Pharmacia) was packed in the column, 100 ml of redissolved sample was added, and the column was equilibrated with sodium phosphate buffer. Fractional fraction elution was carried out using sodium phosphate buffer (40 ml each) containing 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 M NaCl at a flow rate of 2 ml / min.
As a result of measuring the antibacterial activity of each elution fraction, the activity of the 0.25M NaCl elution fraction having the strongest activity was 2.05 × 10 ⁶ (AU / ml). The 0.25M NaCl eluate (40 ml) was subjected to reverse phase HPLC (column: RESOURCE RPC 3 ml manufactured by Pharmacia). As the mobile phase, MilliQ water containing 0.1% trifluoroacetic acid was used, and a linear concentration gradient of acetonitrile (gradient 20 to 80%), a flow rate of 1 ml / min, and fractionation at 1 ml per fraction for 30 minutes. An ultraviolet-visible spectrophotometer (wavelength 220, 280 nm) was used as the detector. The antibacterial activity of 30 fraction samples was measured, and the fraction with strong activity was obtained.
The purified antibacterial substance thus obtained exhibited the antibacterial spectrum shown in Table 3. Compared with nisin A, a known bacteriocin, lactisin Q showed higher antibacterial activity (small MIC (minimum growth inhibitory concentration) value) against Enteroocccus genus.

（５）ESI-TOF MS分析
上記のようにして精製した抗菌物質について、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析計（ESI-TOF MS、日本電子社製）を用いて質量分析を行った。その結果、ラクティシンＱは質量5926の物質であることが明らかとなった。(5) ESI-TOF MS analysis The antimicrobial substance purified as described above was subjected to mass spectrometry using an electrospray time-of-flight mass spectrometer (ESI-TOF MS, manufactured by JEOL Ltd.). As a result, it was revealed that lactisin Q is a substance having a mass of 5926.

（６）Ｎ末端アミノ酸配列解析
上記のようにして精製した抗菌物質について、エドマン分解法を利用したアミノ酸シーケンサーを用い、Ｎ末端のアミノ酸分析を行った。結果として、エドマン分解は進行せず、アミノ酸の配列を得ることは出来なかった。(6) N-terminal amino acid sequence analysis antimicrobial material purified as described above, using the amino acid sequencer using the Edman degradation method were amino acid analysis of the N-terminus. As a result, Edman degradation did not proceed and the amino acid sequence could not be obtained.

（７）抗菌性ペプチドの臭化シアン処理
上記（６）にてエドマン分解が進行しなかったため、抗菌性ペプチドのＮ末端のメチオニン残基を切断する目的で、臭化シアン処理を行い、逆相HPLCにより再度精製を行った。精製したペプチドの質量分析を行った結果、5767の実測値が得られた。臭化シアン処理前後での質量の差である159はホルミルメチオニンの質量と一致していた。この結果より抗菌性ペプチドのＮ末端はホルミルメチオニンによりブロックされており、そのためエドマン分解が進行しなかったことが示された。
また、臭化シアン処理で得られたペプチドのＮ末端アミノ酸分析を上記と同様の方法で行った。結果として配列番号２に示す、ペプチドのＮ末端より50のアミノ酸残基が明らかとなった。得られたアミノ酸配列から推定される抗菌性ペプチドの質量を算出した結果、上記（５）の質量と一致しなかったことから、得られたアミノ酸配列が不十分であることが示唆された。(7) Cyanogen bromide treatment of antibacterial peptide Since Edman degradation did not proceed in (6) above, cyanogen bromide treatment was performed for the purpose of cleaving the N-terminal methionine residue of the antibacterial peptide, and reversed phase Purification was performed again by HPLC. As a result of mass spectrometry of the purified peptide, an actual measurement value of 5767 was obtained. 159, which is the difference in mass before and after cyanogen bromide treatment, was consistent with the mass of formylmethionine. From this result, it was shown that the N-terminus of the antibacterial peptide was blocked by formylmethionine, so that Edman degradation did not proceed.
Further, the N-terminal amino acid analysis of the peptide obtained by cyanogen bromide treatment was performed in the same manner as described above. As a result, 50 amino acid residues were revealed from the N-terminal of the peptide shown in SEQ ID NO: 2. As a result of calculating the mass of the antibacterial peptide deduced from the obtained amino acid sequence, it did not coincide with the mass of (5) above, suggesting that the obtained amino acid sequence was insufficient.

（８）抗菌性ペプチドの構造遺伝子の決定
上記のようにして得られた抗菌性ペプチドのアミノ酸配列の一部より、ディジェネレートプライマーを構築し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により抗菌ペプチドの構造遺伝子の取得を行った。QU 1005菌株から全ゲノムDNAをCTAB法により抽出し、これを鋳型としてＰＣＲに用いた。ネスティッドPCR法により単一な増幅断片を得た。
その後、増幅断片をpGEM-T cloning vector（プロメガ社製）にライゲーションし、このライゲーション産物を用いて、ヒートショック法によりE. coli JM109を形質転換した。形質転換体をLB培地で8時間培養後、MagExtractor-Plasmid（TOYOBO社製）を用い、プラスミドを抽出した。このプラスミドをシーケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応にはThermo Sequence fluorescent labeled primer cycle
sequencing kit（ファルマシア社製）を使用した。
結果として、配列番号３の塩基配列（ヌクレオチド配列）が得られた。得られた塩基配列を転換して得られるアミノ酸配列は、配列番号２の10〜39残基目の配列と一致していた。(8) Determination of structural gene of antibacterial peptide A degenerate primer is constructed from a part of the amino acid sequence of the antibacterial peptide obtained as described above, and the structural gene of the antibacterial peptide is obtained by polymerase chain reaction (PCR). Was acquired. Total genomic DNA was extracted from the QU 1005 strain by the CTAB method and used as a template for PCR. A single amplified fragment was obtained by nested PCR.
Thereafter, the amplified fragment was ligated into pGEM-T cloning vector (Promega), and E. coli JM109 was transformed by the heat shock method using this ligation product. The transformant was cultured in LB medium for 8 hours, and then the plasmid was extracted using MagExtractor-Plasmid (manufactured by TOYOBO). This plasmid was used as a template for the sequence reaction. For sequence reactions, Thermo Sequence fluorescent labeled primer cycle
A sequencing kit (Pharmacia) was used.
As a result, the base sequence (nucleotide sequence) of SEQ ID NO: 3 was obtained. The amino acid sequence obtained by converting the obtained base sequence was consistent with the sequence of residues 10 to 39 in SEQ ID NO: 2.

さらに、ここで得られた塩基配列をもとに新たなプライマーを構築し、抗菌性ペプチドのＣ末端部分をコードする塩基配列の取得をアンカーPCR法により行った。すなわち、QU 1005菌株の全ゲノムDNAを制限酵素で消化し、同様にMCS（マルチクローニングサイト）を制限酵素処理したpUC18 cloning vectorにランダムにライゲーションした。このようにして得られたライゲーション産物を用いてネスティッドPCR法により単一の増幅断片を得た。得られたPCR増幅断片を上記と同様の方法で、E. coli JM109に形質転換し、シーケンス解析を行った。
結果として、配列番号４の塩基配列が得られた。得られた塩基配列を転換して得られるアミノ酸配列は、配列番号２の36〜50残基目の配列と一致していた。また、配列番号２の50番目のグリシン残基の後にイソロイシンとリジン残基の存在が確認され、その後にストップコドンが確認された。Furthermore, a new primer was constructed based on the base sequence obtained here, and the base sequence encoding the C-terminal portion of the antibacterial peptide was obtained by anchor PCR. That is, the whole genomic DNA of the QU 1005 strain was digested with a restriction enzyme and similarly ligated at random to a pUC18 cloning vector in which MCS (multicloning site) was treated with a restriction enzyme. A single amplified fragment was obtained by the nested PCR method using the ligation product thus obtained. The obtained PCR amplified fragment was transformed into E. coli JM109 by the same method as described above, and sequence analysis was performed.
As a result, the base sequence of SEQ ID NO: 4 was obtained. The amino acid sequence obtained by converting the obtained base sequence was consistent with the sequence of residues 36 to 50 of SEQ ID NO: 2. In addition, the presence of isoleucine and lysine residue was confirmed after the 50th glycine residue of SEQ ID NO: 2, and then the stop codon was confirmed.

このようにして得られたアミノ酸塩基配列から推定される抗菌物質の分子量の理論値を算出（配列番号１の１残基目のメチオニンをホルミルメチオニンとして算出）したところ、5926となり、この理論値が（５）で得られた実測値と一致したことから、この抗菌物質が配列番号１で示される５３アミノ酸残基からなるペプチドであることが明らかとなった。 The theoretical value of the molecular weight of the antibacterial substance deduced from the amino acid base sequence obtained in this way was calculated (calculated from the first methionine of SEQ ID NO: 1 as formylmethionine). Since this coincided with the actual measurement value obtained in (5), it was revealed that this antibacterial substance was a peptide consisting of 53 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 1.

（９）抗菌性ペプチドの諸性質の解明
（抗菌物質の生産および試験用サンプルの調製方法）
分離株QU 1005菌株および、ナイシンＺ生産菌株をグルコース、酵母エキス、炭酸カルシウムを含む基本培地にて培養した。培養液を遠心分離後、得られた培養液上清より、合成吸着剤を用いて、ラクティシンＱおよびナイシンＺを粗精製した。得られた粗精製サンプルを用いて以下の試験を行った。なお、HPLC分析において、ナイシン１ユニット（精製ナイシン25ng）と同じピークエリアを示す量を各バクテリオシンの１ユニットとした。(9) Elucidation of various properties of antibacterial peptides (production of antibacterial substances and preparation of test samples)
The isolate QU 1005 strain and nisin Z producing strain were cultured in a basic medium containing glucose, yeast extract and calcium carbonate. After centrifuging the culture solution, lactisin Q and nisin Z were roughly purified from the obtained culture solution supernatant using a synthetic adsorbent. The following tests were performed using the obtained crude purified sample. In HPLC analysis, the amount showing the same peak area as 1 unit of nisin (25 ng of purified nisin) was defined as 1 unit of each bacteriocin.

ｐＨ安定性試験
粗精製したラクティシンＱとナイシンＺを、それぞれ4200ユニット/mlとなるように滅菌蒸留水を用いて調製した。N/5の塩酸、N/10の水酸化ナトリウムを用いてpHを3〜9に調整したサンプルを45℃で保存し、経時的に残存するラクティシンＱおよびナイシンＺの量をHPLCにて分析した。
結果を図１に示す。図１中、残存率は、残存率（％）＝（ｎ日経過後のバクテリオシン量／実験開始日（0日目）のバクテリオシン量）×100として求めたものである。結果として、pH7、pH9において、ナイシンＺは実験開始後５日目までにほぼ全てが分解されていたのに対し、ラクティシンＱは、そのような中性およびアルカリ性領域において47日経過後でも５〜８割程度が分解されずに残存していた。 pH Stability Test Crude purified lactisin Q and nisin Z were prepared using sterile distilled water so as to be 4200 units / ml, respectively. Samples adjusted to pH 3-9 using N / 5 hydrochloric acid and N / 10 sodium hydroxide were stored at 45 ° C., and the amounts of lactisin Q and nisin Z remaining over time were analyzed by HPLC. .
The results are shown in FIG. In FIG. 1, the residual rate is obtained as residual rate (%) = (bacteriocin amount after elapse of n days / bacteriocin amount on the start day of experiment (day 0)) × 100. As a result, at pH 7 and pH 9, nisin Z was almost completely degraded by 5 days after the start of the experiment, whereas lactisin Q was 5-8 after 47 days in such neutral and alkaline regions. About 30% remained without being decomposed.

熱安定性試験
粗精製したラクティシンＱとナイシンＺを、それぞれ4200ユニット/mlとなるように滅菌蒸留水を用いて調製し、N/5の塩酸、N/10の水酸化ナトリウムを用いてpHを3〜9に調整した。サンプルを90℃ 30分間、あるいは110℃ 10分間で加熱処理し、加熱処理後に残存するラクティシンＱおよびナイシンＺの量をHPLCにて分析した。
結果を図２に示す。図２中、残存率は、残存率（％）＝（加熱処理後のバクテリオシン量／加熱処理前のバクテリオシン量）×100として求めたものである。結果として、pH7、pH9の中性〜アルカリ性域においてナイシンＺよりも高い熱安定性を示した。 Thermal stability test Crude purified lactisin Q and nisin Z were prepared using sterilized distilled water to 4200 units / ml each, and the pH was adjusted using N / 5 hydrochloric acid and N / 10 sodium hydroxide. Adjusted to 3-9. The sample was heat-treated at 90 ° C. for 30 minutes or 110 ° C. for 10 minutes, and the amount of lactisin Q and nisin Z remaining after the heat treatment was analyzed by HPLC.
The results are shown in FIG. In FIG. 2, the residual rate is obtained as residual rate (%) = (bacteriocin amount after heat treatment / bacteriocin amount before heat treatment) × 100. As a result, it showed higher thermal stability than nisin Z in the neutral to alkaline range of pH 7 and pH 9.

エタノール安定性試験
ラクティシンＱおよびナイシンＺの粗精製物を40%、50%、60％のエタノール溶液にそれぞれ4200ユニット/mlとなるように添加した。N/10の水酸化ナトリウムを用いてpH5に調整した各サンプルを45℃で保存し、経時的に残存するラクティシンＱおよびナイシンＺの量をHPLCにて分析した。
結果を図３に示す。図３中、残存率は、残存率（％）＝（ｎ日経過後のバクテリオシン量／実験開始日（0日目）のバクテリオシン量）×100として求めたものである。結果として、ナイシンＺは保存開始30日後に、すべてのサンプルで残存するナイシンＺ量が10%程度となっているのに対して、ラクティシンＱは50、60%エタノール中で50％程度、40％のエタノール中では70%が残存していた。この結果より、ラクティシンＱはナイシンＺに比べ、エタノール中での安定性に優れていることが示された。 Ethanol stability test Crucified product of lactisin Q and nisin Z was added to 40%, 50% and 60% ethanol solutions to 4200 units / ml, respectively. Each sample adjusted to pH 5 with N / 10 sodium hydroxide was stored at 45 ° C., and the amounts of lactisin Q and nisin Z remaining over time were analyzed by HPLC.
The results are shown in FIG. In FIG. 3, the residual rate is obtained as residual rate (%) = (bacteriocin amount after elapse of n days / bacteriocin amount on the start day of experiment (day 0)) × 100. As a result, nisin Z is about 10% of nisin Z remaining in all samples 30 days after the start of storage, whereas lactisin Q is about 50% and 40% in 50 and 60% ethanol. 70% remained in the ethanol. From this result, it was shown that lactisin Q is superior to nisin Z in stability in ethanol.

海外で実際に食品保存料として使用されているナイシンは、酸性では安定であるが、中性、アルカリ性域では不安定で、分解されやすいという性質を持つ。本発明の抗菌性ペプチド（ラクティシンＱ）は中性、アルカリ性域の安定性に優れているため、そのような食材の静菌効果が期待できる。また、ラクティシンＱはエタノールでの安定性にも優れているため、エタノールベースの抗菌剤の素材としても利用が可能である。そこで、以下に実施例を上げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 Nisin, which is actually used overseas as a food preservative, is stable in acidity, but unstable in neutral and alkaline regions and has the property of being easily decomposed. Since the antibacterial peptide (Lacticin Q) of the present invention is excellent in neutral and alkaline stability, the bacteriostatic effect of such foods can be expected. Lacticin Q is also excellent in ethanol stability and can be used as a material for ethanol-based antibacterial agents. Then, although an Example is raised and demonstrated further in detail below, this invention is not limited by these Examples.

食品保存性試験（卵焼きの保存性試験）
弱アルカリ性食材である卵焼きに対するラクティシンＱの静菌効果について、ナイシンＺとの比較検討を行った。
ラクティシンＱとナイシンＺの粗精製物（4200ユニット/mlとなるように滅菌蒸留水で調製）を使用し、表４の割合で材料を混合し、卵焼きを作成した。卵焼きを作成後、25℃で24時間保存し、保存後の一般生菌数を調べた。（バクテリオシン溶液の添加量は対卵1.5%とした。） Food storability test (preservation test for fried eggs)
The bacteriostatic effect of lactisin Q on fried egg, which is a weak alkaline food, was compared with nisin Z.
A crude product of lactisin Q and nisin Z (prepared with sterilized distilled water to 4200 units / ml) was used, and the ingredients were mixed at the ratios shown in Table 4 to prepare fried eggs. After preparing the fried egg, it was stored at 25 ° C. for 24 hours, and the number of viable bacteria after storage was examined. (The amount of bacteriocin solution added was 1.5% for eggs.)

結果を表５に示す。結果としてラクティシンＱを弱アルカリ性食材である卵焼きに添加した場合、ナイシンＺを添加した場合よりも一般生菌数を１オーダー程度低く抑えることができた。

The results are shown in Table 5. As a result, when lactisin Q was added to the fried egg, which is a weak alkaline food, the number of viable bacteria could be suppressed by about one order lower than when nisin Z was added.

エタノールベースラクティシンＱの抗菌活性試験
ラクティシンＱの粗精製サンプルを、終濃度が200μg/mlとなるように30%のエタノールに添加した。N/5の塩酸を用いてpHを3.5に調整した。30%のエタノール溶液、200μg/mlラクティシンＱ水溶液をコントロールとして、バイオアッセイにて抗菌活性を評価した。調製したサンプル200μlに指標菌の培養液（107CFU/ml）を20μl添加し、１分間接触させた。その後、指標菌と混合したサンプル100μlをSCDLP培地（栄研器材株式会社製）100μlと混合し、各指標菌の至適温度にて培養を行った。24、48、72時間後に指標菌の増殖の有無を目視で確認した。指標菌には大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、リステリア菌（Listeria
innocua）を用いた。
結果を表６に示す。結果として、ラクティシンＱのみを含む水溶液では、指標菌に対して静菌効果を示さなかったが、ラクティシンＱを30%エタノールと組み合わせることにより、ブドウ球菌やリステリア菌、さらにはグラム陰性細菌である大腸菌に対しても、72時間以上の静菌効果を示した。また、この効果は30％エタノール単独使用よりも優れていた。
ラクティシンＱはEnterococcus属細菌に対する抗菌効果に優れているため、VREやMRSAといった院内感染の原因菌に対しても、抗菌効果を示すと考えられ、優れた抗菌剤の素材として期待できる。 Antibacterial activity test of ethanol-based lactisin Q A crudely purified sample of lactisin Q was added to 30% ethanol to a final concentration of 200 μg / ml. The pH was adjusted to 3.5 using N / 5 hydrochloric acid. Antibacterial activity was evaluated by bioassay using 30% ethanol solution and 200 μg / ml lactisin Q aqueous solution as controls. 20 μl of indicator medium culture solution (107 CFU / ml) was added to 200 μl of the prepared sample and contacted for 1 minute. Thereafter, 100 μl of the sample mixed with indicator bacteria was mixed with 100 μl of SCDLP medium (Eiken Equipment Co., Ltd.), and cultured at the optimum temperature for each indicator bacteria. After 24, 48 and 72 hours, the presence or absence of growth of the indicator bacteria was visually confirmed. The indicator bacteria include Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Listeria
innocua).
The results are shown in Table 6. As a result, the aqueous solution containing only lactisin Q did not show a bacteriostatic effect on the indicator bacteria, but by combining lactisin Q with 30% ethanol, staphylococci, listeria, and gram-negative bacteria, E. coli Also showed a bacteriostatic effect of 72 hours or more. This effect was superior to the use of 30% ethanol alone.
Lacticin Q has an excellent antibacterial effect against Enterococcus bacteria, and is therefore expected to show antibacterial effects against nosocomial pathogenic bacteria such as VRE and MRSA, and can be expected as an excellent antibacterial material.

本発明の新菌株およびそれにより生産される抗菌性ペプチドは、食品の保存や殺菌・消毒等の目的の抗菌剤の素材として多くの分野において利用することができ、特に、中性やアルカリ性領域において使用されても有効である。 The new strain of the present invention and the antibacterial peptide produced thereby can be used in many fields as a material for antibacterial agents for the purpose of food preservation, sterilization and disinfection, particularly in the neutral and alkaline regions. It is effective even if it is used.

Claims

The following amino acid sequence:
Met-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys-Val-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Lys-Tyr-Gly-Ser-Lys-Ala-Val-Gln-Trp-Ala-Trp-Ala-Asn- Lys-Gly-Lys-Ile-Leu-Asp-Trp-Leu-Asn-Ala-Gly-Gln-Ala-Ile-Asp-Trp-Val-Val-Ser-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Leu- Gly-Ile-Lys
An antibacterial peptide having a primary structure consisting of

A DNA encoding the peptide of claim 1.

Lactococcus lactis QU 1005 strain (NITE BP-23) which produces the antimicrobial peptide of claim 1.

An antibacterial agent comprising the antibacterial peptide of claim 1 as an active ingredient.