JPWO2006001472A1 - 特異的抗体を用いる小型肝細胞の分離法 - Google Patents
特異的抗体を用いる小型肝細胞の分離法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006001472A1 JPWO2006001472A1 JP2006528733A JP2006528733A JPWO2006001472A1 JP WO2006001472 A1 JPWO2006001472 A1 JP WO2006001472A1 JP 2006528733 A JP2006528733 A JP 2006528733A JP 2006528733 A JP2006528733 A JP 2006528733A JP WO2006001472 A1 JPWO2006001472 A1 JP WO2006001472A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- small hepatocytes
- immune complex
- hepatocytes
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 187
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 30
- 101000933364 Homo sapiens Brain protein I3 Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 101001056814 Homo sapiens Integral membrane protein 2C Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102100025464 Integral membrane protein 2C Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 11
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 28
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 28
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- -1 D6.1A Proteins 0.000 description 13
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000000587 Glycerolphosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 4
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 4
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 4
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 3
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 3
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- 210000000208 hepatic perisinusoidal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 3
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 3
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N Endothion Chemical compound COC1=COC(CSP(=O)(OC)OC)=CC1=O YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 231100000732 tissue residue Toxicity 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020138 yakult Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
ヒトを含む哺乳動物由来増殖性肝細胞（小型肝細胞）の効率的な分離方法が提供される。特に、下記の工程を含む、小型肝細胞を分離する方法が提供される：ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、CD44に対する抗体（抗CD44抗体）、D6.1Aに対する抗体（抗D6.1A抗体）およびBRI3に対する抗体（抗BRI3抗体）からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させる工程；ii）小型肝細胞を含む前記免疫複合体を回収する工程。
Description
本発明は、ヒトを含む哺乳動物由来増殖性肝細胞（小型肝細胞）の効率的な分離方法に関する。
（背景技術）
肝臓および肝細胞は体内における化学工場と言われるほど多様な機能を持っている。例えば、血清タンパク質の90％以上は肝細胞が産生しており、体内に取り込まれたり産生された有害物質を代謝する解毒機能を有している。そのため、肝細胞を培養し、その持っている機能を使って有害物質の検出（バイオセンサー）、ヒトに必要な物質の体外生産を可能にしようと様々な研究機関で研究がなされている。それらの研究に用いる肝細胞を供給するためには、現在のところ分化した肝細胞機能を保持している細胞株は存在していないため、実験毎に成熟肝細胞を単離しなければならない。このような場合には、得られる細胞数は個々の個体の肝細胞数に依存する。なぜなら、肝細胞の機能を維持したまま、成熟細胞を増殖させる方法が十分に確立しているわけではないからである。従って、成熟肝細胞機能の多くを有する細胞の恒常的な大量供給が望まれている。ヒトを含めて動物の肝細胞を冷凍し、長期保存し、再び使用する方法の開発は非常に重要な課題であって、世界中でなされているが、これまでに冷凍保存後、解凍した肝細胞が培養皿上に生着し、肝細胞としての機能の70〜80％程度を短期間保持できることが報告されているのみである。しかも、これらの報告においては、解凍された肝細胞はほとんど増殖能を有せず、短期間に死滅している。
肝臓および肝細胞は体内における化学工場と言われるほど多様な機能を持っている。例えば、血清タンパク質の90％以上は肝細胞が産生しており、体内に取り込まれたり産生された有害物質を代謝する解毒機能を有している。そのため、肝細胞を培養し、その持っている機能を使って有害物質の検出（バイオセンサー）、ヒトに必要な物質の体外生産を可能にしようと様々な研究機関で研究がなされている。それらの研究に用いる肝細胞を供給するためには、現在のところ分化した肝細胞機能を保持している細胞株は存在していないため、実験毎に成熟肝細胞を単離しなければならない。このような場合には、得られる細胞数は個々の個体の肝細胞数に依存する。なぜなら、肝細胞の機能を維持したまま、成熟細胞を増殖させる方法が十分に確立しているわけではないからである。従って、成熟肝細胞機能の多くを有する細胞の恒常的な大量供給が望まれている。ヒトを含めて動物の肝細胞を冷凍し、長期保存し、再び使用する方法の開発は非常に重要な課題であって、世界中でなされているが、これまでに冷凍保存後、解凍した肝細胞が培養皿上に生着し、肝細胞としての機能の70〜80％程度を短期間保持できることが報告されているのみである。しかも、これらの報告においては、解凍された肝細胞はほとんど増殖能を有せず、短期間に死滅している。
また、ヒトは種々の疾患により、例えば、肝炎、肝硬変、肝癌などにより肝機能不全状態になる。現在のところ人工肝臓は実用段階にあるとは言えないため、このような疾患の根本的な治療は肝臓移植に頼らざるを得ないのが現状である。しかも、我が国を初め世界各国において、肝臓移植を必要としている患者は多数存在するにもかかわらず、臓器を提供するドナーの数は必要数の１割を満たすのがやっとである。従って、肝臓移植に使用できるような肝組織をin vitroで形成させる方法、そのような方法に使用できる肝組織の前駆細胞コロニーおよびそのin vitro調製方法が望まれてきた。
一方、本発明者らは、肝臓組織内に、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン(CK)8、CK18などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構造的にも肝細胞としての特徴を有するが、増殖能の高い小型の細胞からなる細胞集団があることを報告し、これを「小型肝細胞」(small hepatocyte)と命名した（Mitaka T. ら、Hepatology, 16, 440-447,(1992)、Mitaka T., Sato F, Mizuguchi Tら、Hepatology 29, 111-135 (1999)）。
その他、小型肝細胞および増殖能を有する肝実質細胞に関する報告もいくつかなされている（特許第3211941号、特開2002-078481、特開平09-313172、特開平08-112092）。また、特開2002-045087にはヒトを含む異種動物由来の肝細胞からなる肝臓を有するキメラ動物と、このキメラ動物を用いた試験方法が報告されている。
さらに、本発明者らは、そのような小型肝細胞に富む画分を肝臓から得る方法を報告しており（WO 01/92481）、肝細胞の機能および増殖能を保持し得る、小型肝細胞の凍結保存方法、および、そのような方法に適した小型肝細胞の調製方法を報告してきた（WO 01/92481）。さらに、本発明者らは移植可能な肝組織を調製するために適した小型肝細胞コロニー、その調製方法、その小型肝細胞コロニーから肝組織を誘導する方法を報告し(WO 02/088332)、薬物の作用、特に正常な肝機能と関連した作用をin vitroで推定する方法も報告してきた(WO 02/088332)。しかしながら、ヒトを含む動物由来の増殖性肝細胞（小型肝細胞）に特異的なマーカータンパク質は必ずしも明らかにされておらず、そのため効率のよい分離方法にはなお改善の余地が残されていた。
その他、小型肝細胞および増殖能を有する肝実質細胞に関する報告もいくつかなされている（特許第3211941号、特開2002-078481、特開平09-313172、特開平08-112092）。また、特開2002-045087にはヒトを含む異種動物由来の肝細胞からなる肝臓を有するキメラ動物と、このキメラ動物を用いた試験方法が報告されている。
さらに、本発明者らは、そのような小型肝細胞に富む画分を肝臓から得る方法を報告しており（WO 01/92481）、肝細胞の機能および増殖能を保持し得る、小型肝細胞の凍結保存方法、および、そのような方法に適した小型肝細胞の調製方法を報告してきた（WO 01/92481）。さらに、本発明者らは移植可能な肝組織を調製するために適した小型肝細胞コロニー、その調製方法、その小型肝細胞コロニーから肝組織を誘導する方法を報告し(WO 02/088332)、薬物の作用、特に正常な肝機能と関連した作用をin vitroで推定する方法も報告してきた(WO 02/088332)。しかしながら、ヒトを含む動物由来の増殖性肝細胞（小型肝細胞）に特異的なマーカータンパク質は必ずしも明らかにされておらず、そのため効率のよい分離方法にはなお改善の余地が残されていた。
（発明の開示）
本発明の目的はヒトを含む哺乳動物由来増殖性肝細胞（小型肝細胞）の効率的な分離方法を提供することである。
本発明の目的はヒトを含む哺乳動物由来増殖性肝細胞（小型肝細胞）の効率的な分離方法を提供することである。
本発明者らは、小型肝細胞に特異的に発現している３種類の膜貫通型蛋白質を見出し、これらの特異的蛋白質に対する抗体を用いることにより効率的に小型肝細胞を分離することができることを見出した。
１）本発明により、下記の工程を含む、小型肝細胞を分離する方法が提供される：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、CD44に対する抗体（抗CD44抗体）、D6.1Aに対する抗体（抗D6.1A抗体）およびBRI3に対する抗体（抗BRI3抗体）からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させる工程；
ii）小型肝細胞を含む前記免疫複合体を回収する工程。
より具体的には、本発明は、上記方法において、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体がビオチンで標識されており、小型肝細胞を含む免疫複合体を回収する工程が、アビジンに結合した担体および／または蛍光色素で標識したアビジンと前記免疫複合体とを接触させることを含む、小型肝細胞を分離する方法でもある。
１）本発明により、下記の工程を含む、小型肝細胞を分離する方法が提供される：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、CD44に対する抗体（抗CD44抗体）、D6.1Aに対する抗体（抗D6.1A抗体）およびBRI3に対する抗体（抗BRI3抗体）からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させる工程；
ii）小型肝細胞を含む前記免疫複合体を回収する工程。
より具体的には、本発明は、上記方法において、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体がビオチンで標識されており、小型肝細胞を含む免疫複合体を回収する工程が、アビジンに結合した担体および／または蛍光色素で標識したアビジンと前記免疫複合体とを接触させることを含む、小型肝細胞を分離する方法でもある。
場合により更に下記の工程を含んでも良い：
iii)前記免疫複合体中から小型肝細胞を解離させる工程；および
iv）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
更に、
iii)前記免疫複合体中から小型肝細胞を解離させる工程；および
iv）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
更に、
２）また、本発明により、下記の工程を含む、小型肝細胞を分離する方法も提供される：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中の小型肝細胞と前記１以上の抗体との第１の免疫複合体を形成させる工程；
ｉi）i)で使用した抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体の少なくとも１つに結合する抗体の１以上と前記第１の免疫複合体とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程、
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、更に下記の工程を含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中の小型肝細胞と前記１以上の抗体との第１の免疫複合体を形成させる工程；
ｉi）i)で使用した抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体の少なくとも１つに結合する抗体の１以上と前記第１の免疫複合体とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程、
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、更に下記の工程を含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
３）本発明により、更に、下記の工程を含む小型肝細胞を分離する方法も提供される：
i）抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と前記抗体の少なくとも一つに結合する抗体の１以上とを接触させ、第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii)前記第１の免疫複合体と哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、更に下記の工程を含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
i）抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と前記抗体の少なくとも一つに結合する抗体の１以上とを接触させ、第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii)前記第１の免疫複合体と哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、更に下記の工程を含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
４）本発明により、下記の工程を含む、小型肝細胞を分離する方法も提供される：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体であって担体に結合した前記抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させる工程；
ii）小型肝細胞を含む前記免疫複合体を回収する工程。
場合により、下記の工程を更に含んでも良い：
iii)前記免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
iv）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体であって担体に結合した前記抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させる工程；
ii）小型肝細胞を含む前記免疫複合体を回収する工程。
場合により、下記の工程を更に含んでも良い：
iii)前記免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
iv）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
５）本発明により、下記の工程を含む、小型肝細胞を分離する方法も提供される：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中の小型肝細胞と前記１以上の抗体との第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii）i)で使用した抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体の少なくとも１つに結合する、担体に結合した抗体の１以上と前記第１の免疫複合体とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、更に下記の工程を含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中の小型肝細胞と前記１以上の抗体との第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii）i)で使用した抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体の少なくとも１つに結合する、担体に結合した抗体の１以上と前記第１の免疫複合体とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、更に下記の工程を含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
６）本発明により、下記の工程を含む小型肝細胞を分離する方法も提供される：
i）抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、前記抗体の少なくとも一つに結合する、担体に結合した抗体の１以上とを接触させ、第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii)前記第１の免疫複合体と哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、下記の工程を更に含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
また、細胞懸濁物が、ガラクトサミン等を投与した哺乳動物の肝臓に由来する、上記各方法も提供される。
i）抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、前記抗体の少なくとも一つに結合する、担体に結合した抗体の１以上とを接触させ、第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii)前記第１の免疫複合体と哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。
場合により、下記の工程を更に含んでも良い：
iv)前記第２の免疫複合体から小型肝細胞を解離させる工程；および
v）前記解離させた小型肝細胞を回収する工程。
また、細胞懸濁物が、ガラクトサミン等を投与した哺乳動物の肝臓に由来する、上記各方法も提供される。
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は小型肝細胞の効率的な分離方法である。本明細書において、「小型肝細胞」とは、単に肝臓に由来する小型の細胞を意味するものではなく、以下に記載する方法、あるいはこれに準じた方法を用いて肝臓から単離される細胞であって、強い増殖能を有し、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン(CK) 8、CK18などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構造的にも肝細胞としての特徴を有する、肝臓由来の特別な種類の小型の細胞を意味する。この細胞は発明者らによって見出されたものであり、より詳しくはMitaka T. ら、Hepatology, 16, 440-447,(1992)、Mitaka, T, Sato F, Mizuguchi Tら、Hepatology, 29, 111-135 (1999)に記載されている。
本発明は小型肝細胞の効率的な分離方法である。本明細書において、「小型肝細胞」とは、単に肝臓に由来する小型の細胞を意味するものではなく、以下に記載する方法、あるいはこれに準じた方法を用いて肝臓から単離される細胞であって、強い増殖能を有し、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン(CK) 8、CK18などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構造的にも肝細胞としての特徴を有する、肝臓由来の特別な種類の小型の細胞を意味する。この細胞は発明者らによって見出されたものであり、より詳しくはMitaka T. ら、Hepatology, 16, 440-447,(1992)、Mitaka, T, Sato F, Mizuguchi Tら、Hepatology, 29, 111-135 (1999)に記載されている。
小型肝細胞に富む画分は、例えば以下のように調製することができる。ヒトその他の動物から採取した肝臓組織をコラゲナーゼ等を含む溶液で処理すると肝臓由来の細胞を得ることができる。この場合、通常のコラゲナーゼ肝灌流法を利用することができる。得られた細胞懸濁液は必要に応じて適当な大きさのメッシュ等を通し、未消化の組織残渣その他の組織破砕片等を除去してもよい。この細胞懸濁液から本発明の方法によって直接小型肝細胞を分離することもできるが、実質細胞および不要な組織破砕物等を予めある程度除去してから本発明の方法を適用することが好ましい。
実質細胞の除去は、以下のように低速遠心によって行なうことができる。低速遠心とは、実質細胞および不要な組織破砕物等を多く含む画分と、非実質細胞を多く含む軽画分とを分離するために十分な条件をいい、好ましくは、実質細胞および不要な組織破砕物等を主として含む画分と、小型肝細胞および非実質細胞を多く含み実質細胞をほとんど含まない軽画分とを分離するために十分な条件をいう。このような条件で上述したような方法で得られる肝臓由来の細胞を分画すると、小型肝細胞は前述の軽画分により多く得られる。より具体的には、例えば、この細胞懸濁液を低速遠心、例えば50ｘgで１分間遠心することにより、主として実質細胞を含む重い画分と、星細胞、クッパー細胞、類洞内皮細胞等の非実質細胞を主として含む比較的軽い細胞を含む軽い上清画分とに分画することができる。小型肝細胞はこの遠心条件下で上清画分に多く得られる。
実質細胞の除去は、以下のように低速遠心によって行なうことができる。低速遠心とは、実質細胞および不要な組織破砕物等を多く含む画分と、非実質細胞を多く含む軽画分とを分離するために十分な条件をいい、好ましくは、実質細胞および不要な組織破砕物等を主として含む画分と、小型肝細胞および非実質細胞を多く含み実質細胞をほとんど含まない軽画分とを分離するために十分な条件をいう。このような条件で上述したような方法で得られる肝臓由来の細胞を分画すると、小型肝細胞は前述の軽画分により多く得られる。より具体的には、例えば、この細胞懸濁液を低速遠心、例えば50ｘgで１分間遠心することにより、主として実質細胞を含む重い画分と、星細胞、クッパー細胞、類洞内皮細胞等の非実質細胞を主として含む比較的軽い細胞を含む軽い上清画分とに分画することができる。小型肝細胞はこの遠心条件下で上清画分に多く得られる。
加速度が大きくなるほど、また、遠心時間が長くなるほど上清画分中の実質細胞の割合は減るが、沈殿する小型肝細胞の割合も増加するため、遠心は約50ｘｇにて約1分間以下とするのが好ましい。上清画分は更に遠心、沈殿、懸濁を繰り返して実質細胞および不要な組織破砕物等を除去することもできる。より具体的には、例えば、上清画分を、50ｘgで５分間遠心し、沈殿を適当な培地に懸濁し、更に50ｘgで５分間遠心する。沈殿を同様な培地に懸濁し、再び50ｘgで５分間遠心する。得られた沈殿を同様な培地に懸濁し、150ｘgで５分間遠心して、沈殿した細胞を新鮮な培地に懸濁する。細胞懸濁液中の細胞数を数え、その後の培養、あるいは処理のために必要な細胞密度となるように調製することができる。通常、１ｘ104〜５ｘ105細胞/mlの密度に調製される。
このようにして調製した、小型肝細胞を多く含む画分から本発明の方法によって、効率的に小型肝細胞を分離することができる。また、上述のように調製した小型肝細胞を多く含む画分を一定期間培養して（前培養）小型肝細胞を増殖させてから、本発明の方法によって、小型肝細胞を効率的に分離することもできる。前培養は、好ましくはヒアルロン酸付着担体および／またはヒアルロン酸を主成分とする担体の共存下で行う。
このようにして調製した、小型肝細胞を多く含む画分から本発明の方法によって、効率的に小型肝細胞を分離することができる。また、上述のように調製した小型肝細胞を多く含む画分を一定期間培養して（前培養）小型肝細胞を増殖させてから、本発明の方法によって、小型肝細胞を効率的に分離することもできる。前培養は、好ましくはヒアルロン酸付着担体および／またはヒアルロン酸を主成分とする担体の共存下で行う。
RT-PCRによって調べたところ、CD44の発現は初代培養第２〜３日目くらいから顕著であり、培養開始３〜５日後にはほぼ最大に達する傾向にあることが明らかになった。また、D6.1Aについては、初代培養第３日目くらいからみられ、培養開始18日後にはほぼ最大に達する傾向にあることが明らかになった。さらに、BRI3については、初代培養第２日目くらいから顕著であり、培養開始５〜11日後にはほぼ最大に達する傾向にあることが明らかになった。従って、本発明者らは、肝臓からの細胞画分の調製という傷害により潜在的に存在していた小型肝細胞が活性化するのに少なくとも２日〜３日ほどかかる可能性を考慮している。また、本発明者らは、ラットにおいて、ガラクトサミン等により強い肝障害を与えた場合には、投与数日後より、肝臓組織においてCD44陽性細胞が出現することを確認しており、このことは前述の考察と一致する。従って、ガラクトサミン等により予め強い肝障害を与えた個体の肝臓から細胞画分を調製した場合は前培養なしに、あるいは短期間の前培養により非常に効率的に小型肝細胞を分離することができる。
ガラクトサミンによる障害を与える場合は、成熟ラット（８〜１０週齢）にD-ガラクトサミン（アクロス）を10mg〜100mg/200μl PBS/100g体重の濃度で腹腔内注射をする。注射後３日目〜６日目にSeglenの方法（Selgen, PO., Methods Cell Biol., 1976, 13, 29-83）に準じて、肝臓より細胞を分離することができる。
ガラクトサミンによるそのような障害を与えない場合は、３日〜18日間、好ましくは３日〜５日間前培養することが好ましい。また、ヒアルロン酸付着担体、例えばヒアルロン酸付着培養皿、ヒアルロン酸付着多孔質、ヒアルロン酸からなるまたはヒアルロン酸を主成分とする担体、例えば多孔質等の共存下で培養する場合、これよりも少し長期間、例えば３日間〜２１日間前培養してもよい。ヒアルロン酸共存下で培養する場合は、小型肝細胞が選択的に増殖するので、ヒアルロン酸共存下で小型肝細胞を含むと考えられる細胞集団を培養した後、本発明の方法を適用することにより更に効率的に小型肝細胞を分離することができる。
ガラクトサミンによるそのような障害を与えない場合は、３日〜18日間、好ましくは３日〜５日間前培養することが好ましい。また、ヒアルロン酸付着担体、例えばヒアルロン酸付着培養皿、ヒアルロン酸付着多孔質、ヒアルロン酸からなるまたはヒアルロン酸を主成分とする担体、例えば多孔質等の共存下で培養する場合、これよりも少し長期間、例えば３日間〜２１日間前培養してもよい。ヒアルロン酸共存下で培養する場合は、小型肝細胞が選択的に増殖するので、ヒアルロン酸共存下で小型肝細胞を含むと考えられる細胞集団を培養した後、本発明の方法を適用することにより更に効率的に小型肝細胞を分離することができる。
ヒアルロン酸共存下で前培養を行う場合、例えば以下のようにヒアルロン酸付着担体を作製することが出来る。ヒアルロン酸を適当な濃度で、例えば調製した溶液の１ml〜５mlを担体と接触させた場合に担体の表面積に対して10μg/cm2〜1000μg/cm2、より好ましくは50μg/cm2〜500μg/cm2の量となるよう、適切な培地またはバッファー中で溶液として調製する。一般には、ヒアルロン酸溶液は10〜20mg/ml程度の濃度のストック溶液として適切な培地またはバッファー中に調製するのが便利であろう。使用するバッファーは細胞に有害でない限りどのようなバッファーも使用できるが、例えば、ハンクス液、一般的な細胞培養培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)等が利用できる。バッファーのpHはヒアルロン酸が溶解する範囲でよいが、一般には7.1〜8.5が好ましい。ヒアルロン酸を溶解するときの温度はヒアルロン酸が溶解し、かつ分解しない温度であればどのような温度でもよく、通常のインキュベーターの設定温度を考慮すれば、例えば、30℃〜40℃、特に37℃前後の温度範囲が簡便に利用できる。
なお、ヒアルロン酸は一般に分子量約１００万を境に低分子量ヒアルロン酸と高分子量ヒアルロン酸に分類されるが、ヒアルロン酸共存下で前培養を行う場合は高分子量ヒアルロン酸を使用することが好ましい。
なお、ヒアルロン酸は一般に分子量約１００万を境に低分子量ヒアルロン酸と高分子量ヒアルロン酸に分類されるが、ヒアルロン酸共存下で前培養を行う場合は高分子量ヒアルロン酸を使用することが好ましい。
このように調製したヒアルロン酸溶液を、そのまま、または場合により適切なバッファーまたは培地で希釈し、上述した担体と共存させ、担体上にヒアルロン酸をコーティングする。比較的撥水性の担体をコーティングする場合は、コーティング用のヒアルロン酸溶液の液量が少ないと担体の表面を充分に被覆できない可能性があるので、ヒアルロン酸溶液を希釈して液量を増やすことが特に有用であろう。コーティングのためには、0.5〜20mg/ml、好ましくは１〜10mg/mlのヒアルロン酸溶液を担体表面1cm2あたり、好ましくは10μg〜1000μg、より好ましくは50μg〜500μgとなるように担体表面と接触させる。例えば、60mmディッシュにヒアルロン酸をコーティングする場合、10mg/mlに調製したヒアルロン酸をPBS等で1mg/mlに希釈し、その希釈液１mlをディッシュに注ぐことによってコーティングを行うことができる。ヒアルロン酸溶液と担体との接触は、30℃〜40℃、特に37℃前後にて１時間〜24時間程度インキュベーションするのが好ましい。インキュベーションの温度と時間はヒアルロン酸が担体上にコーティングされるのに充分であればよく、コーティングのためのインキュベーション時間は24時間より長くても問題はないが、長時間インキュベーションすることの利点は乏しい。
前培養する場合は、上述したように調製した小型肝細胞を多く含む画分（細胞群）を血清、ニコチンアミド、ビタミンC、抗生物質、増殖因子、その他の細胞培養に一般的に使用される添加物を更に含む基本培地、例えば、これらを添加したダルベッコ改変イーグル培地等で37℃にて培養することができる。小型肝細胞を増殖させるあるいは維持するための培地は、ニコチンアミド、ビタミンＣ、増殖因子、DMSO等を含むことが好ましい。ビタミンＣは通常、アスコルビン酸2リン酸として添加し、その濃度は、好ましくは0.1mM〜1.0mM、より好ましくは、0.5mM〜1.0mMであり、ニコチンアミドは比較的高濃度で使用され、好ましくは１〜20mM、より好ましくは５mM〜10mMで使用する。増殖因子としては、上皮細胞増殖因子（EGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、トランスフォーミング増殖因子α（TGFα）等が利用でき、TGFαが特に好ましい。TGFαを添加する場合には、好ましくは１μg/l〜100μg/l、より好ましくは５μg/l〜50μg/lの濃度で使用する。
また、初代培養においてはDMSOは培養開始４日目から好ましくは約0.1〜約２％(v/v)、より好ましくは約0.5％〜約1.5％(v/v)の濃度で添加する。更に、前述したように、前培養はヒアルロン酸共存下、例えばヒアルロン酸付着担体、ヒアルロン酸からなる担体、またはヒアルロン酸を主成分とする担体共存下で行っても良い。
また、初代培養においてはDMSOは培養開始４日目から好ましくは約0.1〜約２％(v/v)、より好ましくは約0.5％〜約1.5％(v/v)の濃度で添加する。更に、前述したように、前培養はヒアルロン酸共存下、例えばヒアルロン酸付着担体、ヒアルロン酸からなる担体、またはヒアルロン酸を主成分とする担体共存下で行っても良い。
前培養のための培養容器としては、通常の細胞培養に使用される培養皿を使用することができる。一般には接着細胞の培養はコラーゲン被覆をした培養皿が使用され、例えば、ウシ真皮、ラットの尾部由来のコラーゲンを被覆した種々の大きさの培養皿が商業的に入手可能であり、また必要であればそのような培養皿を調製することもできるが、小型肝細胞を回収する目的ではコラーゲンを被覆しない培養皿を使用することが好ましい。なぜならば、細胞外基質が少ないほどより温和な条件で細胞が剥がれやすいからである。前培養した場合、金属キレート剤および／または酵素の存在下で個々の細胞に分離し、継代培養して再びコロニーを形成させることもできるが、この場合、細胞への損傷が大きいため、非酵素的方法によってコロニーを培養容器から剥がすのが好ましい。使用し得る金属キレート剤としては、細胞毒性の少ないものであればよく、接着細胞の剥離処理に一般的に使用されるもの、例えばEDTA、EGTA及び／またはその塩を、それぞれについて一般的な濃度で使用することができる。非酵素的細胞剥離剤としては、Ca、Mgを含まないHanksの緩衝液(pH7.3〜7.5)にEDTA、グリセロール、クエン酸ナトリム等を添加した溶液が利用でき、例えばSigma社からCell dissociation solutionの名で調製済みの非酵素的細胞剥離剤を商業的に入手することができる。培養には、通常の５％炭酸ガスインキュベーターを使用することができる。炭酸ガス濃度および培養温度は、通常の培養細胞に許容される範囲であれば本質的ではない。より具体的には、WO 01/92481に記載した方法および条件を用いて前培養した小型細胞に富む細胞懸濁物を得ることができる。
前述のようにして肝臓から調製した、またはさらに前培養して得られた小型肝細胞に富む細胞懸濁物をCD44に対する抗体（抗CD44抗体）、D6.1Aに対する抗体（抗D6.1A抗体）およびBRI3に対する抗体（抗BRI3抗体）からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させることができる。抗体は標識されていてもよく、担体に結合していてもよい。また、小型肝細胞に富む細胞懸濁物を抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体（１次抗体）とを接触させて第１の免疫複合体を形成させ、次に、使用した抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体の少なくとも１つと結合する抗体（２次抗体）の１以上と第１の免疫複合体を接触させて第２の免疫複合体を形成させることができる。この場合、初めに抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および／または抗BRI3抗体（１次抗体）とこれらの抗体の少なくとも１つと結合する抗体（２次抗体）の１以上を接触させて第１の免疫複合体を形成させ、次に、この第１の免疫複合体と小型肝細胞に富む細胞懸濁物とを接触させて第２の免疫複合体を形成させても良い。いずれの場合も、２次抗体は標識されていてもよく、担体に結合していても良い。
免疫複合体における抗体の解離は当業者によく知られた方法によって行うことができる。また、免疫複合体を形成している小型肝細胞はそのまま培養することもできる。結合した抗体は細胞の増殖に伴って希釈されるからである。抗体が担体と結合している場合は、担体−抗体結合の切断は結合様式に依存して、酵素消化その他の方法によって行なうことができる。そのような方法は当業者によく知られたものであり、後述するように市販の試薬、を利用することもできる。例えば、パパインやペプシン等の酵素を用いて抗体のFc部分を切断することができる。特に標識や担体が抗体のFc部分に結合している場合はこれらの酵素により標識や担体を細胞から切り離すことが出来る。また、小型肝細胞の分離に直接使用する抗体のF(ab)2フラグメントで免疫したヒツジから得た特定の抗体を使用すると、細胞上に結合している抗体（例えば抗CD44抗体、抗D6.1A抗体または抗BRI3抗体）の抗原決定基と抗体との結合に作用して、細胞を離脱させることができる。この方法によれば細胞上には抗体が残らず、細胞を回収することができる。そのための市販の試薬として、例えば、デタッチャビーズ（DETACHaBEAD；Dynal Biotech）を利用することが出来る。
CD44、D6.1AおよびBRI3は、いずれも細胞膜貫通タンパク質であり、細胞外ドメインを有し、かつ小型肝細胞特異的に発現しているタンパク質である。成熟肝細胞はこれらのタンパク質のいずれも発現していないか、極めて低レベルにしか発現していない。このことはRT-PCRあるいはノーザンブロット等の方法によりmRNAレベルで、または、ウェスタンブロット等の方法によりタンパク質レベルで確認することができる。
本発明の一つの実施態様においては、抗体は磁気ビーズに結合しており、これらの抗体と細胞とを接触させ、MACSによって小型肝細胞が分離される。また、本発明の別の実施態様においては、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および／または抗BRI3抗体はビオチン化され、アビジンに結合した担体、例えば磁気ビーズを用いて、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および／または抗BRI3抗体と結合した小型肝細胞が分離される。本発明の更に別の実施態様においては、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体、抗BRI3抗体の少なくとも１つ（１次抗体）に結合する抗体（２次抗体）がビオチンで標識され、アビジン結合担体、例えば、アビジン結合磁気ビーズを用いて小型肝細胞−（抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および／または抗BRI3抗体；１次抗体）−ビオチン標識抗体（２次抗体）を含む免疫複合体として小型肝細胞が分離される。
本発明の別の実施態様においては、フローサイトメトリーを用いて小型肝細胞が分離される。例えば、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および／または抗BRI3抗体は直接蛍光色素で標識されており、これらの抗体と細胞とを接触させ、FACSを用いてソーティングすることによって小型肝細胞を分離することができる。また、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および／または抗BRI3抗体をビオチン化し、蛍光色素で標識したアビジンを用いて同様にFACSを用いてソーティングすることにより小型肝細胞が分離される。更にフローサイトメトリーを用いる本発明の別の実施態様においては、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体、抗BRI3抗体の少なくとも１つ（１次抗体）に結合する抗体（２次抗体）がビオチンで標識され、蛍光色素で標識したアビジンを用いて同様にFACSソーティングすることにより小型肝細胞−（抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および／または抗BRI3抗体；１次抗体）−ビオチン標識抗体（２次抗体）を含む免疫複合体として小型肝細胞が分離される。
特に、FACSを用いたソーティングを行う場合は、上記３種類の抗体をそれぞれ別の色素でラベルすることにより、CD44、D6.1AおよびBRI3の１、２または全てを発現した細胞を個別に分離することができる。さらに、FACSを用いる場合、３種類の抗体のうち、１種の抗体についてのみビオチン化抗体と蛍光色素標識ビオチンの組み合せを用いることもできる。
特に、FACSを用いたソーティングを行う場合は、上記３種類の抗体をそれぞれ別の色素でラベルすることにより、CD44、D6.1AおよびBRI3の１、２または全てを発現した細胞を個別に分離することができる。さらに、FACSを用いる場合、３種類の抗体のうち、１種の抗体についてのみビオチン化抗体と蛍光色素標識ビオチンの組み合せを用いることもできる。
MACSを用いて小型肝細胞を分離する場合、磁気ビーズ−抗体および小型肝細胞を含む細胞群の複合体をカラムに装填し、磁石を用いて抗体に結合した細胞を固定し、１０〜２０倍体積のバッファー（たとえば0.5％ウシ血清アルブミン/2mM EDTA/PBS）で洗浄し、抗体に結合しなかった細胞を除去し、その後、カラムを磁石から外して抗体に結合した小型肝細胞を回収することができる。磁気ビーズは必要により、市販の試薬によって抗体から切り離すことができ、あるいは抗体のFc部分を酵素的に分解してもよい。
このようにして分離した小型肝細胞が肝細胞としての機能の一部を有していることは、種々のマーカーを用いて確認することができる。そのようなマーカーとしては、培地中に分泌されるアルブミンの他、トランスフェリン、尿素の産生、グリコーゲン量、アミノ酸代謝酵素、チトクロームP450等が利用できる。これらは、培地または細胞抽出液のELISA、Westernブロット解析、RT-PCR等によって、あるいは直接細胞を免疫染色することによって確認することができる。小型肝細胞は、成熟肝細胞のマーカーであるアルブミン、CK8、CK18、グリコーゲン、ペルオキシゾーム等のマーカーを有しており、一方胆管上皮細胞のマーカーであるCK7、CK19等を有していない等の点で、他の細胞と区別し得る。例えば、肝幹細胞の一種として知られるoval cellはCK7、CK19等の胆管上皮細胞のマーカーを有し、グリコーゲン、ペルオキシゾーム等の成熟肝細胞マーカーを有しない点で小型肝細胞と区別することができる。またその他の非実質細胞マーカー[ED1/2(クッパー細胞のマーカー), SE-1（類洞内皮細胞マーカー）, デスミン（desmin）（伊東細胞のマーカー）, ビメンチン（vimentin）（肝上皮様細胞マーカー）]についても陰性であることを確認することが出来る。
このようにして効率的に分離した小型肝細胞は、上述した培地および培養容器を用いて、肝臓から得た小型肝細胞を多く含む画分を培養するときと同様に培養することができる。さらに、このようにして効率的に分離および培養維持した小型肝細胞は、WO 01/92481に記載した方法に従って、凍結保存することもでき、また、WO 02/088332に記載した方法に従って、肝組織へ成熟化させることも、さらには成熟化させた肝組織を用いて薬物機能を推定するために使用することもできる。
本発明によって分離された小型肝細胞を更に、凍結保存用または薬物機能の推定用に培養する場合の培養容器としては、ヒアルロン酸付着培養皿を用いることもできるが、通常の細胞培養に使用される培養皿を使用することもできる。一般には接着細胞の培養はコラーゲン被覆をした培養皿が使用され、例えば、ウシ真皮、ラットの尾部由来のコラーゲンを被覆した種々の大きさの培養皿が商業的に入手可能であり、また必要であればそのような培養皿を調製することもできる。肝組織形成に適した小型肝細胞コロニーを調製するためにはコラーゲンを被覆しない培養皿を使用することが好ましい。なぜならば、細胞外基質が少ないほどより温和な条件で細胞が剥がれやすく、かつ、コラーゲン等で被覆しない場合には、小型肝細胞が優先的に容器から剥離する傾向があるからである。培養には、通常の５％炭酸ガスインキュベーターを使用することができる。炭酸ガス濃度および培養温度は、通常の培養細胞に許容される範囲であれば本質的ではない。
本発明によって分離された小型肝細胞を更に、凍結保存用または薬物機能の推定用に培養する場合の培養容器としては、ヒアルロン酸付着培養皿を用いることもできるが、通常の細胞培養に使用される培養皿を使用することもできる。一般には接着細胞の培養はコラーゲン被覆をした培養皿が使用され、例えば、ウシ真皮、ラットの尾部由来のコラーゲンを被覆した種々の大きさの培養皿が商業的に入手可能であり、また必要であればそのような培養皿を調製することもできる。肝組織形成に適した小型肝細胞コロニーを調製するためにはコラーゲンを被覆しない培養皿を使用することが好ましい。なぜならば、細胞外基質が少ないほどより温和な条件で細胞が剥がれやすく、かつ、コラーゲン等で被覆しない場合には、小型肝細胞が優先的に容器から剥離する傾向があるからである。培養には、通常の５％炭酸ガスインキュベーターを使用することができる。炭酸ガス濃度および培養温度は、通常の培養細胞に許容される範囲であれば本質的ではない。
（実施例）
実施例１．小型肝細胞を豊富に含む細胞分画の調製
成熟ラット（８〜１０週齢）にD-ガラクトサミン（アクロス）を75mg/200μl PBS/100g体重、の濃度で腹腔内注射をした。注射後４日目にSeglenの方法に準じて、細胞を肝臓より分離した。0.2 mM EGTAを加えたカルシウム、マグネシウムを含まないハンクス液で門脈から灌流した。40ml/分の流速で約４分流したあと、0.02％コラゲナーゼ（ヤクルト）を含むハンクス液を20ml/分の流速で１０分間流した。消化された肝臓から定法に従って肝細胞をビーカー内に振るい落とした。細胞縣濁液を２５０および７０マイクロメーターの穴のあいたフィルターでろ過し、50 x gで１分間遠心した。上清を集め、再び50 x ｇで1分間遠心を２回くり返した。その上清を集め、50 x gで５分間遠心した。沈殿した細胞を培養液（Leivobitz L-15+10% ウシ胎仔血清 + 10-7 M デキサメタゾン+0.5mg/l インスリン + 抗生物質）で洗い、再び50 x gで５分間遠心する。同様の操作を繰り返した後、今度は150 x gで５分間遠心した。同様の操作を繰り返した後、再び50 x gで５分間遠心する。沈殿した細胞を新しい培養液で縣濁したあと、生細胞数を数え、１x104〜５x105cells/mlに調製した。
実施例１．小型肝細胞を豊富に含む細胞分画の調製
成熟ラット（８〜１０週齢）にD-ガラクトサミン（アクロス）を75mg/200μl PBS/100g体重、の濃度で腹腔内注射をした。注射後４日目にSeglenの方法に準じて、細胞を肝臓より分離した。0.2 mM EGTAを加えたカルシウム、マグネシウムを含まないハンクス液で門脈から灌流した。40ml/分の流速で約４分流したあと、0.02％コラゲナーゼ（ヤクルト）を含むハンクス液を20ml/分の流速で１０分間流した。消化された肝臓から定法に従って肝細胞をビーカー内に振るい落とした。細胞縣濁液を２５０および７０マイクロメーターの穴のあいたフィルターでろ過し、50 x gで１分間遠心した。上清を集め、再び50 x ｇで1分間遠心を２回くり返した。その上清を集め、50 x gで５分間遠心した。沈殿した細胞を培養液（Leivobitz L-15+10% ウシ胎仔血清 + 10-7 M デキサメタゾン+0.5mg/l インスリン + 抗生物質）で洗い、再び50 x gで５分間遠心する。同様の操作を繰り返した後、今度は150 x gで５分間遠心した。同様の操作を繰り返した後、再び50 x gで５分間遠心する。沈殿した細胞を新しい培養液で縣濁したあと、生細胞数を数え、１x104〜５x105cells/mlに調製した。
実施例２．CD44、D6.1A、およびBRI3の小型肝細胞における発現パターンの解析
成熟肝細胞および実施例１で調製した細胞のCD44、D6.1A、およびBRI3の発現パターンを調べた。
１）CD44、D6.1A、およびBRI3の発現パターンの経時的変化
調製直後の小型型肝細胞、培養開始後の小型肝細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR法によりCD44の発現を調べた。GPDH（グリセロール3-リン酸脱水素酵素）を陽性対照として使用した。小型肝細胞の培養には以下の培地を使用した。
成熟肝細胞および実施例１で調製した細胞のCD44、D6.1A、およびBRI3の発現パターンを調べた。
１）CD44、D6.1A、およびBRI3の発現パターンの経時的変化
調製直後の小型型肝細胞、培養開始後の小型肝細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR法によりCD44の発現を調べた。GPDH（グリセロール3-リン酸脱水素酵素）を陽性対照として使用した。小型肝細胞の培養には以下の培地を使用した。
約1.0〜1.5x105個の小型肝細胞からISOGEN（株式会社ニッポンジーン）を用いて全RNAを調製した。ISOGEN（ニッポンジーン）を用いて業者の推奨するプロトコルに従って細胞を溶解し、それにクロロホルムを加えてよく混ぜた後、10000xg、15分間、４℃にて遠心した。上層を取り出し、イソプロパノールを加え、10000xg、15分間、４℃にて遠心後、得られた沈殿を70％エタノールで洗浄し、DEPC-水に溶解した。成熟肝細胞からのRNA抽出は、完了直後の細胞から同様な方法で抽出した。10ngの全RNAを用いて、RT-PCRを行った。用いたプライマーは下記の通りである
CD44用プライマー
5'-cccgaattcatggacaaggtttggtggca-3' （配列番号１）
5'-cccgaattcctacaccccaatcttcatat-3' (配列番号２)
CD44用プライマー
5'-cccgaattcatggacaaggtttggtggca-3' （配列番号１）
5'-cccgaattcctacaccccaatcttcatat-3' (配列番号２)
D6.1A用プライマー
5'-cccgaattcatggcaggtgtcagtggctg-3' （配列番号３）
5'-cccgaattctcatttgcttccaatttggc-3' （配列番号４）
5'-cccgaattcatggcaggtgtcagtggctg-3' （配列番号３）
5'-cccgaattctcatttgcttccaatttggc-3' （配列番号４）
BRI3用プライマー
5'-cccgaattcatggtgaagatcagtttcca-3' （配列番号５）
5'-cccgaattctcacaccaccccacagatga-3' （配列番号６）
5'-cccgaattcatggtgaagatcagtttcca-3' （配列番号５）
5'-cccgaattctcacaccaccccacagatga-3' （配列番号６）
またGPDH用には以下のプライマーを使用した。
5'-accacagtccatgccatcac-3' (配列番号７)
5'-tccaccaccctgttgctgta-3' （配列番号８）
PCRの条件は以下の通りである：95℃、15秒、60℃、30秒、68℃、１分、サイクル数＝25
5'-accacagtccatgccatcac-3' (配列番号７)
5'-tccaccaccctgttgctgta-3' （配列番号８）
PCRの条件は以下の通りである：95℃、15秒、60℃、30秒、68℃、１分、サイクル数＝25
その結果、初代培養開始後、約２〜３日後には顕著なCD44の発現が見られ、その後さらに発現は増大して培養開始５日後にはほぼ最大に達すること、および増殖中の小型肝細胞ではCD44の発現レベルが維持されることが明らかになった。また、D6.1Aについては、初代培養第３日目くらいからみられ、培養開始18日後にはほぼ最大に達することが明らかになった。さらに、BRI3については、初代培養第２日目くらいから顕著であり、培養開始５〜11日後にはほぼ最大に達することが明らかになった。PCR産物を電気泳動し、得られた各バンドをデンシトメータで読み取り、CD44のバンドの強度をGPDHのバンドの強度で除算し相対強度を計算した（図１A〜C）。
２）小型肝細胞および成熟肝細胞におけるCD44、D6.1A、およびBRI3の発現パターンの比較
WO 01/92481に記載した方法に従って凍結保存しておいた細胞（約1.0〜1.5x105細胞）を常法に従って溶解し、２週間培養した細胞から１）と同様な手順によりtotal RNAを抽出した。成熟肝細胞からのRNA抽出は、灌流直後の細胞から同様な方法で抽出した。
得られたtotal RNA 10ngを用いて、１）と同様にしてRT-PCRを用いてCD44、D6.1A、およびBRI3の相対発現量を調べた。ただし、PCRのサイクル数を35とした。PCR産物を電気泳動し、得られた各バンドをデンシトメータで読み取り、CD44、D6.1A、BRI3の各バンドの強度をGPDHのバンドの強度で除算し、小型肝細胞と成熟肝細胞における各抗原の発現を比較した。
その結果、成熟肝細胞では一貫してCD44、D6.1A、およびBRI3の発現は極めて低く（図２および図３）、また小型肝細胞由来の成熟化した細胞はその成熟化に伴ってこれらの抗原の発現が次第に減少することが明らかになった（図１および図４）。
WO 01/92481に記載した方法に従って凍結保存しておいた細胞（約1.0〜1.5x105細胞）を常法に従って溶解し、２週間培養した細胞から１）と同様な手順によりtotal RNAを抽出した。成熟肝細胞からのRNA抽出は、灌流直後の細胞から同様な方法で抽出した。
得られたtotal RNA 10ngを用いて、１）と同様にしてRT-PCRを用いてCD44、D6.1A、およびBRI3の相対発現量を調べた。ただし、PCRのサイクル数を35とした。PCR産物を電気泳動し、得られた各バンドをデンシトメータで読み取り、CD44、D6.1A、BRI3の各バンドの強度をGPDHのバンドの強度で除算し、小型肝細胞と成熟肝細胞における各抗原の発現を比較した。
その結果、成熟肝細胞では一貫してCD44、D6.1A、およびBRI3の発現は極めて低く（図２および図３）、また小型肝細胞由来の成熟化した細胞はその成熟化に伴ってこれらの抗原の発現が次第に減少することが明らかになった（図１および図４）。
また、同様の結果はノーザンブロットによっても得られている。この場合もハウスキーピング遺伝子としてGPDHを用いた。得られた各バンドをデンシトメータで読み取り、CD44、D6.1A、BRI3の各バンドの強度をGPDHのバンドの強度で除算し、小型肝細胞と成熟肝細胞における各抗原の発現を比較した。
上記方法で得られたRNA 20μgを電気泳動し、ノーザンブロットを行った。使用したプローブは、CD44、D6.1A、BRI3のコード領域全長である。CD44、D6.1A、BRI3のコード領域をそれぞれ配列番号９、１０および１１に示した。プローブは、Alkphos Directラベリングキット(Amersham Biosciences)を用いて標識した。
上記方法で得られたRNA 20μgを電気泳動し、ノーザンブロットを行った。使用したプローブは、CD44、D6.1A、BRI3のコード領域全長である。CD44、D6.1A、BRI3のコード領域をそれぞれ配列番号９、１０および１１に示した。プローブは、Alkphos Directラベリングキット(Amersham Biosciences)を用いて標識した。
その結果CD44およびBRI3については２本のバンドが観察され、D6.1Aについては１本のバンドが観察された。得られたバンドの強度をデンシトメータで読み取り、各バンドの強度をGPDHに対応するバンドの強度で除算し、小型肝細胞と成熟肝細胞における各抗原の発現を比較した。得られた結果は、上述のRT-PCRにより得られた結果と同等であった（図３）。
さらに、WO 02/088332に記載された方法に従って、Matrigelを培養中の小型肝細胞に添加して小型肝細胞の成熟化を誘導し、CD44発現の変化をノーザンブロットにより調べた。Matrigel添加後第２日から成熟化が開始することが分かっているが、成熟化に伴ってCD44の発現が低下することが示された（図４）。
これらの結果は、CD44、D6.1A、およびBRI3が小型肝細胞に特異的であることを示すと共に、肝臓からの細胞画分の調製という傷害により、CD44、D6.1A、およびBRI3の発現が誘導され、肝臓を構成する細胞群中に潜在的に存在していた小型肝細胞またはその前駆細胞が小型肝細胞としての本来の性質を表すようになった可能性を示唆している。
さらに、WO 02/088332に記載された方法に従って、Matrigelを培養中の小型肝細胞に添加して小型肝細胞の成熟化を誘導し、CD44発現の変化をノーザンブロットにより調べた。Matrigel添加後第２日から成熟化が開始することが分かっているが、成熟化に伴ってCD44の発現が低下することが示された（図４）。
これらの結果は、CD44、D6.1A、およびBRI3が小型肝細胞に特異的であることを示すと共に、肝臓からの細胞画分の調製という傷害により、CD44、D6.1A、およびBRI3の発現が誘導され、肝臓を構成する細胞群中に潜在的に存在していた小型肝細胞またはその前駆細胞が小型肝細胞としての本来の性質を表すようになった可能性を示唆している。
実施例３．増殖性肝細胞の抗CD44抗体による分離
上記i)小型肝細胞を豊富に含む細胞分画の調製法に記載の50 x gで１分間の遠心を３回くり返した後の上清を集め、150ｘgで５分間遠心した。沈澱した細胞を下記のバッファー（リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+ 2mM EDTA (SIGMA Chemical Co.)+ 0.5% ウシ血清アルブミン(Serologicals Proteins Inc.)）で縣濁した。
１x107細胞当たり80〜99mlのバッファーを加え縣濁後、1〜20mlのマウス抗ラットCD44抗体(PharMingen)を加えて５〜10分間、４〜８℃でインキュベートした。10-20倍容量のバッファーを加え、300ｘｇで10分間遠心した。遠心後の沈澱をバッファーに縣濁し、再び300 x ｇで10分間遠心した。この沈澱を１x107細胞当たり80mlのバッファーで縣濁し20mlのMACS抗マウスIgG磁気抗体（Miltenyi Biotec）を加え、１５分間４〜８℃でインキュベートする。10〜20倍容量のバッファーを加え、200ｘｇで10分間遠心した。遠心後の沈澱を1ｘ108細胞個当たり500ml（細胞が1ｘ108個以下の時は一律500ml）に縣濁した。MACSカラム(Miltenyi Biotec)をマルチスタンドに装着し、カラムにバッファーを500ml流した。カラムが乾かないうちに細胞縣濁液を流し、その後500mlを３回流し、カラムを洗浄した。ここまでのカラムを通した液をCD44陰性フラクションとした。カラムを磁気からはずし、カラムに１mlのバッファーを注入し、シリンジで勢いよく押し出してCD44ポジティブフラクションを得た。
上記i)小型肝細胞を豊富に含む細胞分画の調製法に記載の50 x gで１分間の遠心を３回くり返した後の上清を集め、150ｘgで５分間遠心した。沈澱した細胞を下記のバッファー（リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+ 2mM EDTA (SIGMA Chemical Co.)+ 0.5% ウシ血清アルブミン(Serologicals Proteins Inc.)）で縣濁した。
１x107細胞当たり80〜99mlのバッファーを加え縣濁後、1〜20mlのマウス抗ラットCD44抗体(PharMingen)を加えて５〜10分間、４〜８℃でインキュベートした。10-20倍容量のバッファーを加え、300ｘｇで10分間遠心した。遠心後の沈澱をバッファーに縣濁し、再び300 x ｇで10分間遠心した。この沈澱を１x107細胞当たり80mlのバッファーで縣濁し20mlのMACS抗マウスIgG磁気抗体（Miltenyi Biotec）を加え、１５分間４〜８℃でインキュベートする。10〜20倍容量のバッファーを加え、200ｘｇで10分間遠心した。遠心後の沈澱を1ｘ108細胞個当たり500ml（細胞が1ｘ108個以下の時は一律500ml）に縣濁した。MACSカラム(Miltenyi Biotec)をマルチスタンドに装着し、カラムにバッファーを500ml流した。カラムが乾かないうちに細胞縣濁液を流し、その後500mlを３回流し、カラムを洗浄した。ここまでのカラムを通した液をCD44陰性フラクションとした。カラムを磁気からはずし、カラムに１mlのバッファーを注入し、シリンジで勢いよく押し出してCD44ポジティブフラクションを得た。
得られたCD44陽性細胞は形態学的に小型肝細胞と同等であり、増殖してコロニーを形成することができた。コロニーを形成した細胞は、アルブミンを分泌しており、さらに免疫染色によって解析した結果、非実質細胞マーカー[ED1/2(クッパー細胞のマーカー)、SE-1（類洞内皮細胞マーカー）、デスミン（desmin）（伊東細胞のマーカー）、ビメンチン（vimentin）（肝上皮様細胞マーカー）]はすべて陰性であった。従って、得られた細胞は小型肝細胞であることが確認された。
実施例４．増殖性肝細胞の抗D6.1A抗体による分離
ウサギ抗ラットD6.1A抗体を用いて、実施例３と同様にしてD6.1Aポジティブ細胞を得た。得られたD6.1A陽性細胞は形態学的に小型肝細胞と同等であった。
ウサギ抗ラットD6.1A抗体は、FGAADWGKNFPDAKESC（配列番号１２）を免疫原として、免疫生物研究所（群馬県高崎市）に作製を依頼した。
ウサギ抗ラットD6.1A抗体を用いて、実施例３と同様にしてD6.1Aポジティブ細胞を得た。得られたD6.1A陽性細胞は形態学的に小型肝細胞と同等であった。
ウサギ抗ラットD6.1A抗体は、FGAADWGKNFPDAKESC（配列番号１２）を免疫原として、免疫生物研究所（群馬県高崎市）に作製を依頼した。
実施例５ ．増殖性肝細胞の抗BRI3抗体による分離
ウサギ抗ラットBRI3抗体を用いて、実施例３と同様にしてBRI3ポジティブ細胞を得た。
ウサギ抗ラットBRI3抗体は、LTPAREERPPRHRSRKGGSV（配列番号１３）を免疫原として、免疫生物研究所（群馬県高崎市）に作製を依頼した。
得られたBRI3陽性細胞は形態学的に小型肝細胞と同等であり、コロニーを形成することができた。コロニーを形成した細胞はCK8陽性細胞であった。また、これらの細胞は免疫染色によって解析した結果、非実質細胞マーカー[ED1/2(クッパー細胞のマーカー)、SE-1（類洞内皮細胞マーカー）、デスミン(desmin)（伊東細胞のマーカー）、ビメンチン（vimentin）（肝上皮様細胞マーカー）]は全て陰性であった。従って、得られた細胞は小型肝細胞であることが確認された。
ウサギ抗ラットBRI3抗体を用いて、実施例３と同様にしてBRI3ポジティブ細胞を得た。
ウサギ抗ラットBRI3抗体は、LTPAREERPPRHRSRKGGSV（配列番号１３）を免疫原として、免疫生物研究所（群馬県高崎市）に作製を依頼した。
得られたBRI3陽性細胞は形態学的に小型肝細胞と同等であり、コロニーを形成することができた。コロニーを形成した細胞はCK8陽性細胞であった。また、これらの細胞は免疫染色によって解析した結果、非実質細胞マーカー[ED1/2(クッパー細胞のマーカー)、SE-1（類洞内皮細胞マーカー）、デスミン(desmin)（伊東細胞のマーカー）、ビメンチン（vimentin）（肝上皮様細胞マーカー）]は全て陰性であった。従って、得られた細胞は小型肝細胞であることが確認された。
本発明により、ヒトを含む哺乳動物の肝臓から、効率的に小型肝細胞を分離することができる。ヒトを含む哺乳動物の肝臓から細胞混合物を得た場合には、その中に種々の型の細胞が含まれるが、本発明により、小型肝細胞を容易かつ効率的に分離することができる。
（参考文献）
１．国際公開第WO 01/92481号パンフレット
２．国際公開第WO 02/088332号パンフレット
３．日本国特許第3211941号公報
４．特開2002-078481号公報
５．特開平09-313172号公報
６．特開平08-112092号公報
７．特開2002-045087号公報
８．Mitaka T. ら、Hepatology, 16, 440-447,(1992)
９．Mitaka T., Sato F, Mizuguchi Tら、Hepatology 29, 111-135 (1999)
１．国際公開第WO 01/92481号パンフレット
２．国際公開第WO 02/088332号パンフレット
３．日本国特許第3211941号公報
４．特開2002-078481号公報
５．特開平09-313172号公報
６．特開平08-112092号公報
７．特開2002-045087号公報
８．Mitaka T. ら、Hepatology, 16, 440-447,(1992)
９．Mitaka T., Sato F, Mizuguchi Tら、Hepatology 29, 111-135 (1999)
配列番号１〜８：PCRプライマー
Claims (9)
- 下記の工程を含む、小型肝細胞を分離する方法：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、CD44に対する抗体（抗CD44抗体）、D6.1Aに対する抗体（抗D6.1A抗体）およびBRI3に対する抗体（抗BRI3抗体）からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させる工程；
ii）小型肝細胞を含む前記免疫複合体を回収する工程。 - 下記の工程を含む、請求項１記載の、小型肝細胞を分離する方法：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中の小型肝細胞と前記１以上の抗体との第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii) i）で使用した抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体の少なくとも１つに結合する抗体の１以上と前記第１の免疫複合体とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程、
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。 - 抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体がビオチンで標識されており、小型肝細胞を含む免疫複合体を回収する工程が、アビジンに結合した担体および／または蛍光色素で標識したアビジンと前記免疫複合体とを接触させることを含む、請求項１記載の方法。
- 下記の工程を含む小型肝細胞を分離する方法：
i）抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と前記抗体の少なくとも一つに結合する抗体の１以上とを接触させ、第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii)前記第１の免疫複合体と哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。 - 下記の工程を含む、請求項１記載の小型肝細胞を分離する方法：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体であって担体に結合した前記抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中に含まれる小型肝細胞と前記１以上の抗体との免疫複合体を形成させる工程；
ii）小型肝細胞を含む前記免疫複合体を回収する工程。 - 下記の工程を含む、請求項１記載の、小型肝細胞を分離する方法：
ｉ）哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物と、抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体とを接触させ、前記細胞懸濁物中の小型肝細胞と前記１以上の抗体との第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii）i)で使用した抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体の少なくとも１つに結合する、担体に結合した抗体の１以上と前記第１の免疫複合体とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。 - 下記の工程を含む小型肝細胞を分離する方法：
i）抗CD44抗体、抗D6.1A抗体および抗BRI3抗体からなる群より選ばれる１以上の抗体と、前記抗体の少なくとも一つに結合する、担体に結合した抗体の１以上とを接触させ、第１の免疫複合体を形成させる工程；
ii)前記第１の免疫複合体と哺乳動物の肝臓由来の細胞を含む細胞懸濁物とを接触させ、第２の免疫複合体を形成させる工程；
iii）小型肝細胞を含む前記第２の免疫複合体を回収する工程。 - 担体が磁気ビーズである、請求項３〜７のいずれか１項記載の、小型肝細胞を分離する方法。
- 免疫複合体を回収する工程が、フローサイトメトリーによって行われる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006528733A JP4829112B2 (ja) | 2004-06-29 | 2005-06-29 | 特異的抗体を用いる小型肝細胞の分離法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004191476 | 2004-06-29 | ||
| JP2004191476 | 2004-06-29 | ||
| PCT/JP2005/011914 WO2006001472A1 (ja) | 2004-06-29 | 2005-06-29 | 特異的抗体を用いる小型肝細胞の分離法 |
| JP2006528733A JP4829112B2 (ja) | 2004-06-29 | 2005-06-29 | 特異的抗体を用いる小型肝細胞の分離法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2006001472A1 true JPWO2006001472A1 (ja) | 2008-04-17 |
| JP4829112B2 JP4829112B2 (ja) | 2011-12-07 |
Family
ID=35781893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006528733A Expired - Fee Related JP4829112B2 (ja) | 2004-06-29 | 2005-06-29 | 特異的抗体を用いる小型肝細胞の分離法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1783489B1 (ja) |
| JP (1) | JP4829112B2 (ja) |
| CN (1) | CN101010587B (ja) |
| WO (1) | WO2006001472A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10179896B2 (en) | 2015-05-12 | 2019-01-15 | Baker Group, LLP | Method and system for a bioartificial organ |
| JP6704617B2 (ja) * | 2016-01-29 | 2020-06-03 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | 小型肝細胞の継代培養方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3014322B2 (ja) * | 1996-05-28 | 2000-02-28 | 科学技術振興事業団 | 小型肝細胞の培養方法 |
| WO2001092481A1 (fr) * | 2000-06-01 | 2001-12-06 | Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd. | Procede de preparation de petites colonies d'hepatocytes pouvant etre conserves a l'etat lyophilise et procede de conservation correspondant |
-
2005
- 2005-06-29 EP EP05765433.7A patent/EP1783489B1/en not_active Not-in-force
- 2005-06-29 JP JP2006528733A patent/JP4829112B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-06-29 WO PCT/JP2005/011914 patent/WO2006001472A1/ja active Application Filing
- 2005-06-29 CN CN2005800291684A patent/CN101010587B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6010069580, Ｔｉｓｓｕｅ ＆ Ｃｅｌｌ， ｖｏｌ．３６， ｐｐ．２９３−３０５ （２００４） * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101010587A (zh) | 2007-08-01 |
| WO2006001472A1 (ja) | 2006-01-05 |
| CN101010587B (zh) | 2011-09-07 |
| EP1783489A1 (en) | 2007-05-09 |
| JP4829112B2 (ja) | 2011-12-07 |
| EP1783489A4 (en) | 2008-05-28 |
| EP1783489B1 (en) | 2013-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4758347B2 (ja) | ヒアルロン酸を用いた小型肝細胞の選択的培養法および分離法 | |
| US20180100141A1 (en) | Multipotent progenitor cell derived from adipose tissue | |
| SG192459A1 (en) | Identification and isolation of multipotent cells from non-osteochondral mesenchymal tissue | |
| Hoppo et al. | Thy1‐positive mesenchymal cells promote the maturation of CD49f‐positive hepatic progenitor cells in the mouse fetal liver | |
| JP5254221B2 (ja) | 肝星細胞前駆細胞及びその細胞を単離する方法 | |
| US20020155598A1 (en) | Process for obtaining mammalian insulin secreting cells in vitro and their uses | |
| JP2004527257A (ja) | Ｈｌａ／ｍｈｃ遺伝子産物マーカーで免疫標識することによって幹細胞を単離するための方法 | |
| EP2019861B1 (en) | Kidney-derived stem cell population, identification and therapeutic use | |
| JP4829112B2 (ja) | 特異的抗体を用いる小型肝細胞の分離法 | |
| JPWO2002088332A1 (ja) | 小型肝細胞高含有コロニー、その調製方法、その肝組織への成熟化方法、成熟化した小型肝細胞高含有コロニーを用いた薬物機能の推定方法 | |
| JP4998969B2 (ja) | 凍結保存可能な小型肝細胞の調製方法、およびその凍結保存方法 | |
| CN112159790B (zh) | 从围产期组织中纯化多能血管祖细胞的方法 | |
| WO2002103033A1 (fr) | Procede pour detecter et isoler des cellules hepatiques indifferenciees au moyen de dlk | |
| JP6704617B2 (ja) | 小型肝細胞の継代培養方法 | |
| Sen et al. | Very late antigen-5 facilitates stromal progenitor cell differentiation into myofibroblast | |
| WO2021259814A1 (en) | Process for producing liver cells | |
| Fan et al. | Bone marrow mesenchymal stem cell from chronic hepatitis B patients differentiation into hepatocyte-like cells | |
| IL139319A (en) | Isolated hepatocyte precursors, cell cultures containing the same, and compositions containing said cell cultures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080229 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101206 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110204 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110523 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110720 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110905 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110915 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140922 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140922 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140922 Year of fee payment: 3 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |