JPWO2005010180A1 - Method for determining cancer by homeobox gene expression - Google Patents
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Abstract
（課題） 本発明の課題は、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、および癌の進行度を判定および／または診断するための有用な方法およびキットを提供することにある。 （解決手段） 癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定する方法であって、（１）被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する工程、（２）前記ＨＯＸ遺伝子の発現量を対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量と比較する工程、を含み、ここで、前記ＨＯＸ遺伝子の発現量が閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行している、と判定される方法を用いる。また、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、癌の進行度を判定するためのキットを用いる。(Problem) An object of the present invention is to provide a useful method and kit for determining and / or diagnosing the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the possibility of cancer invasion, and the progression of cancer. It is in. (Solution) A method for determining the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the possibility of cancer invasion, or the progression of cancer, comprising: (1) of at least one HOX gene in a tissue collected from a subject; A step of measuring an expression level, and (2) a step of comparing the expression level of the HOX gene with a corresponding threshold value HOX gene expression level, wherein the expression level of the HOX gene is higher than the threshold value HOX gene expression level. Alternatively, a method is used that, when low, determines that the cancer is present, that the cancer may have metastasized, that the cancer may be infiltrated, or that the cancer has progressed. In addition, a kit for determining the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the possibility of invasion of cancer, and the degree of progression of cancer provided with means for measuring the expression level of the HOX gene is used.
Description
本発明は、ホメオボックス遺伝子の発現量および発現パターンを測定することにより、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定および／または診断する方法、およびキットに関する。 The present invention relates to a method for determining and / or diagnosing the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the possibility of cancer invasion, or the progression of cancer by measuring the expression level and expression pattern of a homeobox gene. , And kits.
ホメオボックス遺伝子は、胚発生の形態形成のマスター調節遺伝子であり、転写因子をコードしている。ホメオボックス遺伝子の１ファミリーであるＨＯＸ遺伝子群は、４つの染色体に存在し、各染色体上には９から１１個の遺伝子からなるクラスターを形成している。現在、ＨＯＸファミリーに属する遺伝子は、ヒトでは３９個の遺伝子が同定されている。３９個のＨＯＸ遺伝子は、胚発生の形態形成過程では時間的、空間的に統制のとれた発現パターンを示す。ＨＯＸ遺伝子は、細胞の持つ位置情報（番地）の担い手であり、その発現パターンが発現領域における組織構築や機能の特異化を決定している。ＨＯＸ遺伝子は、胎生期だけでなく成体においても臓器、組織に特徴的な発現パターンを示し、組織構築や機能の維持に一役を担っていると考えられる。
一方、一般に癌が転移性および／または浸潤性のものであるかどうかを判定および／または診断することは容易ではなく、さらにどの部位に転移するのかを事前に判定および／または診断することは、事実上不可能である。また、癌の存在やその進行度を判定および／または診断する方法については、多くの提案がなされているが、まだ改善の余地がある。
ところで、癌とＨＯＸ遺伝子の発現との関連については、いくつかの報告がなされている（例えば、Ｃｉｌｌｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８８：１６１−１６９，２００１；Ｃｉｌｌｏ Ｃ，Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １４：３８−４９，１９９４−９５；Ｔｉｂｅｒｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５８：６０８−６１５，１９９４；Ｃａｌｖｏ Ｒ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１２７７６−１２７８１，２０００；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉｍ Ｃｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１３２：３３２−３３４，１９９２）。しかし、これらの報告には、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定し、これに基づいて癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、癌の進行度を判定および／または診断することについては記載されていない。また、複数のＨＯＸ遺伝子の発現量を用いることにより、これらの判定および／または診断の精度が向上することについても知られていない。The homeobox gene is a master regulatory gene for morphogenesis during embryogenesis and encodes a transcription factor. The HOX gene group, which is one family of homeobox genes, exists on four chromosomes, and forms a cluster of 9 to 11 genes on each chromosome. Currently, 39 genes have been identified in humans as belonging to the HOX family. The 39 HOX genes show temporally and spatially regulated expression patterns in the morphogenesis process of embryonic development. The HOX gene is a bearer of positional information (address) possessed by cells, and its expression pattern determines tissue construction and function specification in the expression region. The HOX gene shows a characteristic expression pattern in organs and tissues not only in the embryonic period but also in adults, and is considered to play a role in tissue construction and maintenance of functions.
On the other hand, it is generally not easy to determine and / or diagnose whether a cancer is metastatic and / or invasive, and it is also possible to determine and / or diagnose in advance which site it will metastasize. Virtually impossible. Many proposals have been made on methods for determining and / or diagnosing the presence of cancer and its progression, but there is still room for improvement.
By the way, some reports have been made regarding the relationship between cancer and the expression of the HOX gene (for example, Cillo C, et al, J. Cell Physiol 188: 161-169, 2001; Cillo C, Invasion Metastasis 14: 38-49, 1994-95; Tiberi C, et al, Int. J. Cancer 58: 608-615, 1994; Calvo R, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12776-12781, 2000; Taniguchi Y, et al, Bioscim Ciophys Acta 1132: 332-334, 1992). However, in these reports, the expression level of the HOX gene is measured, and based on this, the presence of cancer, the possibility of metastasis of cancer, the possibility of invasion of cancer, and the degree of progression of cancer are determined and / or diagnosed. There is no mention of that. In addition, it is not known that the accuracy of these determinations and / or diagnosis is improved by using the expression levels of a plurality of HOX genes.
本発明の課題は、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、および癌の進行度を判定および／または診断するための有用な方法およびキットを提供することにある。 An object of the present invention is to provide useful methods and kits for determining and / or diagnosing the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the possibility of cancer invasion, and the progression of cancer.
癌における組織構築の乱れや浸潤、転移といった現象は、細胞の持つ位置情報（番地）の異常が原因と捉えることができる。即ち、間違った番地には住めないから癌細胞は原発巣から出て行き、番地にあった転移巣へ移住するというのが浸潤、転移であると考えることができる。したがって、ＨＯＸ遺伝子によって位置情報が決められているのであれば、癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現パターンを解析すれば、その癌が転移しやすいのか、またどこの臓器に転移するのかわかるはずである。本発明者らは、上記の発想の下に研究を進めた結果、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定し、これをあらかじめ決定した閾値ＨＯＸ遺伝子の発現量と比較することにより、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、および癌の進行度を判定および／または診断できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定および／または診断する方法であって、
（１）被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）前記ＨＯＸ遺伝子の発現量を対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量と比較する工程、
を含み、
ここで、前記ＨＯＸ遺伝子の発現量が閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行している、と判定および／または診断される方法、に関連する。
さらに、本発明は、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、癌の進行度を判定および／または診断するためのキットに関連する。Phenomena such as disorder of tissue construction, invasion, and metastasis in cancer can be considered as the cause of abnormal cell location information (address). In other words, it is considered that invasion and metastasis is that cancer cells go out of the primary focus and migrate to the metastatic focus at the address because they cannot live at the wrong address. Therefore, if the positional information is determined by the HOX gene, the expression pattern of the HOX gene in the cancer tissue should be analyzed to determine whether the cancer is likely to metastasize and to which organ. As a result of carrying out research based on the above idea, the present inventors measured the expression level of the HOX gene, and compared this with the expression level of the threshold HOX gene determined in advance. The inventors have found that the possibility of metastasis, the possibility of cancer invasion, and the progression of cancer can be determined and / or diagnosed, and the present invention has been completed.
That is, the present invention is a method for determining and / or diagnosing the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the possibility of cancer invasion, or the progression of cancer,
(1) a step of measuring the expression level of at least one HOX gene in a tissue collected from a subject;
(2) comparing the expression level of the HOX gene with the corresponding threshold HOX gene expression level;
Including
Here, when the expression level of the HOX gene is higher or lower than the threshold HOX gene expression level, cancer is present, cancer may be metastasized, cancer may be infiltrated, or cancer may be present. It relates to a method that is determined and / or diagnosed as progressing.
Furthermore, the present invention is provided with a means for measuring the expression level of a HOX gene, for determining and / or diagnosing the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the possibility of cancer invasion, the progression of cancer. Related to the kit.
図１は、ヒトの正常臓器の各ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定した結果を示す。
図２は、甲状腺癌細胞株８株（ＩＡＡ，ＭＳＡ，Ｋ−１１９，ＲＯＡ，ＫＯＡ−２，８３０５Ｃ，８５０５Ｃ，ＴＣＯ−１）と正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を測定した結果を示す
図３は、ヒト甲状腺癌細胞の浸潤能を評価した結果を示す。
図４は、ヒト甲状腺細胞の浸潤能とＨＯＸ遺伝子の発現量との関係を示す。
図５は、ヒト胃癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図６は、リンパ節転移または肝転移のあるヒト胃癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図７は、ヒト肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図８は、浸潤によるヒト肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量および各進行度におけるヒト肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図９は、ヒト乳癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１０は、検体別のヒト乳癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１１は、ヒト大腸癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１２は、検体別のヒト大腸癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１３は、肝転移のあるヒト大腸癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。FIG. 1 shows the results of measuring the expression level of each HOX gene in normal human organs.
FIG. 2 shows the results of measuring the expression level of the HOX gene in 8 thyroid cancer cell lines (IAA, MSA, K-119, ROA, KOA-2, 8305C, 8505C, TCO-1) and normal thyroid gland. These show the results of evaluating the invasive ability of human thyroid cancer cells.
FIG. 4 shows the relationship between the invasive ability of human thyroid cells and the expression level of the HOX gene.
FIG. 5 shows the expression level of the HOX gene in human gastric cancer tissue.
FIG. 6 shows the expression level of the HOX gene in human gastric cancer tissues with lymph node metastasis or liver metastasis.
FIG. 7 shows the expression level of the HOX gene in human liver cancer tissue.
FIG. 8 shows the expression level of the HOX gene in human liver cancer tissue due to infiltration and the expression level of the HOX gene in human liver cancer tissue at each degree of progression.
FIG. 9 shows the expression level of the HOX gene in human breast cancer tissue.
FIG. 10 shows the expression level of the HOX gene in human breast cancer tissues by specimen.
FIG. 11 shows the expression level of the HOX gene in human colon cancer tissue.
FIG. 12 shows the expression level of the HOX gene in human colon cancer tissues by specimen.
FIG. 13 shows the expression level of the HOX gene in human colon cancer tissues with liver metastasis.
本発明において、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する方法または手段としては、その発現を定量することができるものであれば特に制限はないが、ＰＣＲを用いた以下の方法が好ましい。即ち、組織または細胞から全ＲＮＡを抽出し、この全ＲＮＡに対するｃＤＮＡを逆転写反応により得た後、例えば表１に示されるプライマーペアを用いて定量的ＰＣＲにより各ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定することができる。この場合、最初のＲＮＡ量に依存したサンプル間のばらつきをなくすために、例えば、β−アクチン遺伝子またはＧ３ＰＤＨ遺伝子等の細胞内で安定して発現する遺伝子を内部標準として用いることができる。そして、これら内部標準遺伝子の発現についても同様の定量を行い、ＨＯＸ遺伝子の発現量をこれら内部標準遺伝子の発現量で割って規格化した値を、ＨＯＸ遺伝子発現量として用いてもよい。また、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する他の方法または手段としては、例えば、ＤＮＡチップを用いるものや、ＨＯＸ遺伝子産物に対する抗体を用いるものなどを挙げることができる。特に、本発明のキットに用いるＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段としては、ＤＮＡチップまたは抗体を用いるものが簡便であり、好ましい。
本発明に用いられる閾値ＨＯＸ遺伝子発現量としては、本発明の判定および／または診断ができるものであれば特に制限はないが、例えば、正常な組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量、癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量、転移能および／または浸潤能を有しない癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量、転移能および／または浸潤能を有する癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量、Ｉ期ないしＩＶ期からなる群より選ばれる少なくとも１つの進行度の癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量等を挙げることができる。また、例えば、正常な組織と癌組織との間でＨＯＸ遺伝子の発現量が異なる場合、これらをあらかじめ求めておき、これらの間で任意にカットオフ値を設定し、これを閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とすることもできる。同様に、浸潤能のある組織とない組織、転移能のある組織とない組織、進行度の異なる組織間におけるＨＯＸ遺伝子発現量の違いをあらかじめ求めておき、これらの間で閾値ＨＯＸ遺伝子発現量を設定することもできる。
そして、被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子発現量が、判定および／または診断の目的に応じてあらかじめ決定した閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行していると判定および／または診断されることとなる。さらに、転移や浸潤に関しては、どの部位に転移や浸潤が起こるのかを判定および／または診断することも可能となる。
本発明において比較されるＨＯＸ遺伝子の数としては、少なくとも１つであるが、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらに好ましくは４つ以上である。比較されるＨＯＸ遺伝子の数が多いほど、判定および／または診断の精度が向上することとなる。
本発明で対象となる癌としては、細胞の増殖異常に起因する疾患であれが特に制限はないが、例えば、甲状腺癌、胃癌、肝癌、乳癌、大腸癌、脳腫瘍、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆道癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、骨肉腫等を挙げることができる。また、原発巣不明の癌（転移巣しか見いだせない癌）についても、ＨＯＸ遺伝子の発現を調べることにより、その起源を明らかにすることができるようになる。
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は例示のためのものであり、本発明を限定するものではない。In the present invention, the method or means for measuring the expression level of the HOX gene is not particularly limited as long as the expression can be quantified, but the following method using PCR is preferable. That is, after extracting total RNA from tissues or cells and obtaining cDNA for this total RNA by reverse transcription, the expression level of each HOX gene is measured by quantitative PCR using, for example, primer pairs shown in Table 1. be able to. In this case, in order to eliminate variation among samples depending on the initial RNA amount, for example, a gene that is stably expressed in cells such as β-actin gene or G3PDH gene can be used as an internal standard. The expression of these internal standard genes may be similarly quantified, and the value obtained by dividing the expression level of the HOX gene by the expression level of these internal standard genes may be used as the HOX gene expression level. Other methods or means for measuring the expression level of the HOX gene include, for example, a method using a DNA chip and a method using an antibody against the HOX gene product. In particular, as means for measuring the expression level of the HOX gene used in the kit of the present invention, those using a DNA chip or an antibody are simple and preferable.
The threshold HOX gene expression level used in the present invention is not particularly limited as long as it can be determined and / or diagnosed according to the present invention. For example, the expression level of HOX gene in normal tissues, HOX gene in cancer tissues Expression group, HOX gene expression level of cancer tissue not having metastasis ability and / or invasive ability, HOX gene expression level of cancer tissue having metastasis ability and / or invasive ability, from the group consisting of stage I to stage IV The expression level of the HOX gene in at least one selected cancer tissue can be mentioned. Also, for example, when the expression level of the HOX gene differs between normal tissue and cancer tissue, these are obtained in advance, and a cut-off value is arbitrarily set between them, and this is expressed as the threshold HOX gene expression level. It can also be. Similarly, the difference in HOX gene expression level between tissues with and without invasive ability, tissues with and without metastatic ability, and tissues with different degrees of progression is determined in advance, and the threshold HOX gene expression level is determined between these. It can also be set.
The cancer is present when the expression level of at least one HOX gene in the tissue collected from the subject is higher or lower than the threshold HOX gene expression level determined in advance according to the purpose of determination and / or diagnosis. It may be determined and / or diagnosed that there is a possibility of metastasis, a possible invasion of cancer, or that the cancer has progressed. Furthermore, with regard to metastasis and infiltration, it is possible to determine and / or diagnose at which site metastasis or invasion occurs.
The number of HOX genes to be compared in the present invention is at least one, preferably two or more, more preferably three or more, and still more preferably four or more. The greater the number of HOX genes to be compared, the better the accuracy of determination and / or diagnosis.
The cancer targeted in the present invention is not particularly limited as long as it is a disease caused by abnormal cell proliferation. For example, thyroid cancer, stomach cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, brain tumor, kidney cancer, pancreatic cancer, gallbladder -Biliary tract cancer, lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, uterine cancer, osteosarcoma, etc. can be mentioned. In addition, the origin of a cancer with an unknown primary lesion (a cancer in which only a metastatic lesion can be found) can be clarified by examining the expression of the HOX gene.
The present invention will be further described below with reference to examples, but the examples are for illustrative purposes and do not limit the present invention.
１．ＨＯＸ遺伝子の発現量の測定方法
（プライマーペアの設計）
ＨＯＸ遺伝子の塩基配列をＰｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ）に入力し、各ＨＯＸ遺伝子間でホモロジーの高い領域を排除してプライマーを設計した。得られたプライマーペアにより増幅される領域をＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ＤＮＡ Ｓｅｒｃｈ（ＳＷｓｒｃｈＰｒｏｇｒａｍｓ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｔｄｏｃｓ／ＳＷｓｒｃｈ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で解析し、他の遺伝子を増幅する可能性のないことを確認した。
さらに設計したプライマーペアを用いて得られるＰＣＲ産物が目的のＨＯＸ遺伝子であることを次のようにして確認した。まず、被験者から採取した組織から、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。そして、３μｇの全ＲＮＡを、４Ｕ／μＬのモロニーウサギ白血病ウイルス転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７．５ｍＭのジチオスレイトール、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５μＭのｄＮＴＰ、２μＭのランダムプライマーを含んだ全量５０μＬの反応液中で３７℃で２時間反応させて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。そして、１μＬのｃＤＮＡを用いて、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０５）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、４００ｎＭのプライマー、０．１Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ）を含む２５μＬの反応液中でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、９５℃、１０分の初期変性を行った後、９４℃で４０秒、６０℃で４０秒、７２℃で１分のサイクルを３５サイクル行った。ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＨＯＸプラスミドベクターを得た。内部標準としてのβ−アクチン遺伝子およびグリセロール−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子についても同様にクローニングを行い、ｐＣＲ２．１−β−アクチンプラスミドベクターおよびｐＣＲ２．１−Ｇ３ＰＤＨプラスミドベクターを得た。これらのプラスミドベクターを鋳型にして、ＤＹＥｎａｍｉｃＴＭ ＥＴ ターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｏｋｙｏ）を用いてシークエンス反応を行い、シークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ）で塩基配列を決定した。その結果、表１に示すプライマーペアは、各ＨＯＸ遺伝子を特異的に増幅できることを確認した。
（検量線の作成）
上記で得たｐＣＲ２．１−ＨＯＸプラスミドベクターの５×１０４〜５個を鋳型として、表１に示したプライマーペアとＱｕａｎｔｉＴｅｘｔＴＭＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｏｋｙｏ）を加えた全量２０μＬの反応液を、初期変成（９５℃、１５分）の後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分、を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲによる増幅を行った。これらの初期の既知量の対数値に対して、目的遺伝子のＰＣＲ反応生成物量が一定量（レポーター（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）の蛍光強度で０．３）に到達するのに必要なＰＣＲのサイクル数（Ｃｔ）をプロットし、検量線を作成した。各ＨＯＸ遺伝子の発現は、５×１０４〜１０コピーの範囲で定量可能であった。また、内部標準としてのｐＣＲ２．１−β−アクチンプラスミドベクターおよびｐＣＲ２．１−Ｇ３ＰＤＨプラスミドベクターについても、５×１０６〜１０３個を鋳型として、同様に検量線を作成した。
（ＨＯＸ遺伝子発現量の定量）
被験者から採取した組織または細胞から、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎＲＴ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μＭのｄＮＴＰ、２．５μＭのランダムヘキサマー、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１．２５Ｕ／μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅＴＭ逆転写酵素を含む１００μＬの反応液中で、２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分間反応させ、ｃＤＮＡを得た。そして、２μＬのｃＤＮＡを鋳型にして、表１に示したプライマーペアとＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｏｋｙｏ）を加えた全量２０μＬの反応液を、初期変成（９５℃、１５分）の後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、４０サイクルの増幅を行った。
そして、レポーターの蛍光強度が０．３となるのに必要なサイクル数から、検量線を用いて内挿法により初期量を求めた。そして、最初のＲＮＡ量に依存したサンプル間のばらつきをなくすために、内部標準として用いたβ−アクチン遺伝子またはＧ３ＰＤＨ遺伝子の初期量で各ＨＯＸ遺伝子の初期量を規格化した量（（ＨＯＸ遺伝子の初期量／β−アクチンまたはＧ３ＰＤＨの初期量）×１００）を、ＨＯＸ遺伝子の発現量とした。
なお、４０サイクルの反応終了後、９５℃で１５秒、６０℃で１５秒、９５℃で１５秒の反応を行い、解離曲線を描き、得られたＰＣＲ産物が単一のＴｍ値を持つことを確認した。これにより、表１に示したプライマーペアを用いて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った場合、プライマーダイマーなどの非特異的なＰＣＲ産物が生じないことを確認した。
２．ヒト正常臓器におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定例
上記の方法を用いて、ヒトの正常臓器の各ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定した結果を表２および図１に示す。図１では、最も発現量の高いものを白色、発現のないものを黒色で表している。発現しているＨＯＸ遺伝子の種類は、頭部側に位置する臓器ほど少なく、尾部側の臓器ほど多いことがわかる。また、ＨＯＸパラログの番号の大きい遺伝子（例えば、ＨＯＸ１２、ＨＯＸ１３等の、ＨＯＸクラスターのなかでも、より５’側のゲノムに位置しているもの）ほど、尾部側の臓器で発現が高いことがわかる。
３．甲状腺癌細胞株におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
甲状腺癌細胞株８株（ＩＡＡ，ＭＳＡ，Ｋ−１１９，ＲＯＡ，ＫＯＡ−２，８３０５Ｃ，８５０５Ｃ，ＴＣＯ−１）と正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図２に示す。なお、ＩＡＡ，ＭＳＡ，Ｋ−１１９，ＲＯＡ，ＫＯＡ−２は、大阪大学大学院医学研究科病態制御外科より、８３０５Ｃ，８５０５Ｃ，ＴＣＯ−１は、Ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（Ｓｅｎｎａｎ，Ｊａｐａｎ）より得た。また、正常甲状腺は、ＲＮＡをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｋ Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より得た。図２より、パラログ９から１３のＨＯＸ遺伝子の発現に特に差があることがわかった。例えば、ＨＯＸＤ９は正常甲状腺では発現しているが、癌細胞では全く発現が見られなかった。また、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２は正常甲状腺では発現していないが、癌細胞では発現しているものがみられた。したがって、正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とし、ＨＯＸＤ９の発現量が、正常甲状腺のＨＯＸＤ９の発現量より低い場合に、甲状腺癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、図２より、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、０．００１〜０．０１を設定することができる。また、正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とし、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、甲状腺癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、図２より、それぞれの閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ１０について０．００１、ＨＯＸＡ１１について０．００１、ＨＯＸＡ１３について０．００１、ＨＯＸＢ９について０．０１、ＨＯＸＢ１３について０．０１、ＨＯＸＣ１０について０．００１、ＨＯＸＣ１１について０．００１、ＨＯＸＣ１３について０．０００１、ＨＯＸＤ１１について０．０００１、ＨＯＸＤ１２について０．００１を設定することができる。
次に、８株の甲状腺癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける浸潤能を内皮下基底膜のモデルであるマトリゲルＴＭに対する浸潤アッセイにより評価した。浸潤アッセイは、８μｍの小孔の開いたフィルターで上下に仕切られたチャンバー（ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて行った。フィルターの上面には、あらかじめマトリゲルのバリアが形成されている。５００μｌの培養液に懸濁した２万個の癌細胞を上室に入れ、下室には７５０μｌのウシフィブロネクチンを含んだ培養液を注入した。２４時間ＣＯ２インキュベーターで培養後、細胞をホルマリンで固定し、ギムザ染色を施し、フィルター上面の細胞を綿棒で拭い去った。顕微鏡下でフィルター下面の細胞を観察し、２００倍の視野あたりの細胞数により浸潤能を評価した。結果を図３に示す。ＩＡＡおよびＲＯＡ細胞は、他の６株に比べ浸潤能が低いことがわかった。次に、高浸潤株と低浸潤株とを区別できるＨＯＸ遺伝子を前方選択による特徴選択アルゴリズムにより解析し、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３およびＨＯＸＤ４を選定した。いずれの発現も低浸潤株で低い傾向にある。そして、この３つの遺伝子のうちの２つ以上、好ましくは３つすべてを組み合わせることにより、浸潤能をより高い精度で判定および／または診断できるようになった（図４）。即ち、ＩＡＡまたはＲＯＡ細胞におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とし、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つの、好ましくは２つの、最も好ましくは３つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、浸潤する可能性のある甲状腺癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、ＩＡＡ細胞におけるＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４の閾値を、それぞれ０．００２、０．００００７、０．０００２と、ＲＯＡ細胞におけるＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４の閾値を、それぞれ０．００８、０．０００２、０．００００４と、設定することができる。
４．胃癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
胃癌の手術検体（癌部２１例、非癌部６例）のＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図５に示す。図５より、胃癌組織では、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１の発現量が、非癌部組織に比べて有意に高かった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。したがって、非癌部組織のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、胃癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値をＨＯＸＢ５について０．２、ＨＯＸＢ６について０．３、ＨＯＸＢ７について０．３、ＨＯＸＢ９について０．１、ＨＯＸＣ６について０．０７、ＨＯＸＣ８について０．０４、ＨＯＸＣ９について０．０５、ＨＯＸＣ１０について０．０７、ＨＯＸＣ１１について０．０７と設定することができる。
また、胃癌組織の中でも、リンパ節転移のある症例（１４例）は、これのない症例（７例）に比べ、ＨＯＸＢ６（ｐ＜０．０１）、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８およびＨＯＸＢ９（ｐ＜０．０５）の発現量が有意に高かった（図６参照）。したがって、リンパ節転移のない症例のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＤ１１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、リンパ節転移する可能性のある胃癌であると判定および／または診断されることとなる。
さらに、ＨＯＸＢ６において、（ＨＯＸ遺伝子の初期量／Ｂ−アクチンの初期量）×１００で表されるＨＯＸ遺伝子の発現量が０．２４３と０．３０１の間にカットオフ値を設定すると、各群の１例を除きリンパ節転移の有無を判定および／または診断できた。また、ＨＯＸＢ５は０．３７２以上、ＨＯＸＢ７は０．３３３以上、ＨＯＸＢ８は０．０５以上の場合、各々１例を除きリンパ節転移があると判定および／または診断できた。なお、特異値を示した症例（ｓｔ９５およびｓｔ１１０）は、複数のＨＯＸ遺伝子において同様に特異値を示すため、リンパ節に微小転移（組織学的検索では検出不可能なほど小さな転移巣の形成）を起こしている可能性も考えられる。したがって、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９の閾値ＨＯＸ遺伝子発現量を、それぞれ０．３７２、０．２４３、０．３３３、０．０５、０．０８４、として、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、リンパ節転移する可能性のある胃癌であると判定および／または診断されることとなる。
また、胃癌組織の中でも、肝転移のある症例（５例）は、これのない症例（１６例）に比べ、ＨＯＸＤ１１の発現量が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。したがって、肝転移のない症例のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＤ１１の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移する可能性のある冑癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、肝転移に関するＨＯＸＤ１１の閾値を０．０３６に設定することができる。
５．肝癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
肝癌組織（２５例）と非癌部組織（１９例）のＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図７に示す。なお、非癌部組織は、病理組織学的に硬変肝、線維肝、慢性肝炎および正常と診断された組織である。図７より、非癌部組織で発現のあったＨＯＸ遺伝子は、パラログ２からパラログ５に属するものであり、その発現レベルは、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４を除いて極めて低く、β−アクチン遺伝子発現との相対比で０．１％以下であった。一方、癌組織は、ほとんどすべてのＨＯＸ遺伝子を発現していたが、例外的にＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＤ１１を発現している癌組織はほとんどみられなかった。そして、癌組織と非癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量を比較すると、３９個のうち２８個のＨＯＸ遺伝子の発現量が癌組織において有意に高いことが明らかとなった（Ｍａｎｎ ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。具体的には、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０の発現量が有意に高く、特にＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ９において、その差が大きかった。したがって、非癌部組織のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値としては、ＨＯＸＡ３について０．１４５、ＨＯＸＡ５について０．３１０、ＨＯＸＡ６について０．２７５、ＨＯＸＡ７について０．０１７、ＨＯＸＡ９について０．１６６、ＨＯＸＡ１０について０．０６４、ＨＯＸＡ１１について０．０２１、ＨＯＸＡ１３について０．２６６、ＨＯＸＢ１について０．０２９、ＨＯＸＢ６について０．０５３、ＨＯＸＢ７について０．０６６、ＨＯＸＢ８について０．０９０、ＨＯＸＢ９について０．０３６、ＨＯＸＢ１３について０．０１９、ＨＯＸＣ５について０．２９０、ＨＯＸＣ６について０．０２３、ＨＯＸＣ８について０．０３１、ＨＯＸＣ９について０．１４７、ＨＯＸＣ１０について０．０２１、ＨＯＸＣ１１について０．０３６、ＨＯＸＣ１２について０．０２１、ＨＯＸＣ１３について０．０５０、ＨＯＸＤ１について０．０２１、ＨＯＸＤ３について０．０２８、ＨＯＸＤ４について１．４８６、ＨＯＸＤ８について０．０４４、ＨＯＸＤ９について０．０８９、ＨＯＸＤ１０について０．００７をそれぞれ設定することができる。
次に、門脈、肝動脈、肝静脈、または胆管への癌細胞浸潤のみられた組織では、これがみられなかった組織と比べ、ＨＯＸＡ５（ｐ＜０．０１）、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１（ｐ＜０．０５）の発現量の低下が認められた（図８（１）参照）。したがって、癌細胞浸潤のみられた組織のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、門脈、肝動脈、肝静脈、または胆管に浸潤する可能性がある肝癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値としては、ＨＯＸＡ２について０．０６１、ＨＯＸＡ４について０．０４５、ＨＯＸＡ５について０．０６５、ＨＯＸＡ６について０．０２７、ＨＯＸＡ７について０．０２５、ＨＯＸＡ９について０．１４２、ＨＯＸＡ１０について０．０６７、ＨＯＸＢ１について０．０２５、ＨＯＸＢ５について０．０６７、ＨＯＸＢ７について０．０５３、ＨＯＸＢ８について０．０１７、ＨＯＸＢ１３について０．０１５、ＨＯＸＣ４について０．０６８、ＨＯＸＣ５について０．０３８、ＨＯＸＣ８について０．０１７、ＨＯＸＣ９について０．１５８、ＨＯＸＣ１０について０．０２４、ＨＯＸＣ１１について０．０３２、ＨＯＸＤ１について０．０４３を設定することができる。
なお、ここで示した脈管侵襲を伴った肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子のうち、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１の１５のＨＯＸ遺伝子の発現量は、非癌部組織の発現量と同程度であるため、これら１５のＨＯＸ遺伝子の発現量は、肝癌と診断されたものについての脈管侵襲の可能性の判定および／または診断に利用することができる。そして、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９およびＨＯＸＤ１０遺伝子の発現量を、正常か肝癌かを判定および／または診断することに用いるなど、目的に応じた使い分けをすることにより、より有用な指標とすることができる。
さらに、癌の進行度をＩ、ＩＩ期とＩＩＩ、ＩＶ期に分けて比較すると、ＩＩＩ、ＩＶ期の組織のＨＯＸＢ１およびＨＯＸＡ４遺伝子の発現が、Ｉ、ＩＩ期のものより低かった（ｐ＜０．０５）（図８（２）、（３）参照）。したがって、Ｉ期またはＩＩ期におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ４および／またはＨＯＸＢ１の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、ＩＩＩ期またはＩＶ期に進行した肝癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値をＨＯＸＡ４について０．０４５、ＨＯＸＢ１について０．０５９と設定することができる。
６．乳癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
乳癌の手術検体（癌部２６例、非癌部６例）のＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図９に示す。図９に示すように、乳癌組織におけるＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０の発現量が、非癌部組織に比べて有意に低かった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。なお、これら１０のＨＯＸ遺伝子の発現量を検体別に棒グラフで図１０に示す。これより、３、４例の検体を除き、非癌部組織の発現量より、癌分組織の発現量の方が低いことが明らかである。特に、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３では、３、４例の検体を除き、非癌部組織の発現量の最低値より、癌分組織の発現量の方が低いことが明らかである。したがって、非癌部組織におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、乳癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値として、ＨＯＸＡ１について０．０５８、ＨＯＸＡ２について０．２５７、ＨＯＸＡ３について０．０９０、ＨＯＸＡ５について０．２７８、ＨＯＸＡ９について０．１３０、ＨＯＸＤ３について０．１７９、ＨＯＸＤ４について０．１７０、ＨＯＸＤ８について０．４４６、ＨＯＸＤ９について０．１７０、ＨＯＸＤ１０について０．０３３を設定することができる。
７．大腸癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
大腸癌の手術検体（癌部３０例、非癌部２０例）のＨＯＸ遺伝子発現量を図１１に示す。図１１より、大腸癌組織では、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９の発現量が、非癌部組織に比べて有意に高かった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。一方、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４の発現量は、非癌部組織に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０１）。なお、図１２に、これら８つのＨＯＸ遺伝子発現量を検体別に点グラフで示す。したがって、非癌部組織におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高いか、および／または、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、大腸癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値としては、ＨＯＸＡ９について１．２３２、ＨＯＸＢ２について０．６６０、ＨＯＸＢ３について０．７０３、ＨＯＸＢ８について０．６７８、ＨＯＸＢ９について０．６３２、ＨＯＸＤ１について０．０７５、ＨＯＸＤ３について０．０２８、ＨＯＸＤ４について０．１０３を設定することができる。
また、癌組織の中で、肝転移のある症例（１０例）とない症例（２０例）についてＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図１３に示す。肝転移症例では、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３の発現量が、肝転移のない症例に比べ有意に高いことが明らかとなった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。したがって、肝転移のない症例のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移の可能性のある大腸癌であると判定および／または診断されることとなる。
さらに、図１１より、（ＨＯＸ遺伝子の初期量／β−アクチンの初期量）×１００で表されるＨＯＸ遺伝子の発現量について、ＨＯＸＡ４は０．０６２と０．０８３の間、ＨＯＸＢ１は０．００６と０．００７の間、ＨＯＸＣ１２は０．００８と０．０１１の間、ＨＯＸＣ１３は０．０１７と０．０１８の間、にそれぞれカットオフ値を設定すると、３つ以上のＨＯＸ遺伝子においてその発現量がカットオフ値を上回っている症例は、肝転移を起こしている可能性が高い（７０％）と判定および／または診断できた。したがって、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３の閾値ＨＯＸ遺伝子発現量を、それぞれ０．０６２、０．００６、０．００８、０．０１７とし、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３からなる群より選ばれる少なくとも１つの、好ましくは２つの、より好ましくは３つの、最も好ましくは４つすべての、ＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移の可能性のある大腸癌であると判定および／または診断されることとなる。
なお、肝転移のない２０例のうちの２例において、これらのＨＯＸ遺伝子のうちの３つの発現量がカットオフ値以上であったが、これらについては、今後肝転移を起こす可能性があると考えられる。
(Primer pair design)
The base sequence of the HOX gene was input to Primer ExpressR (Applied Biosystems Japan), and primers were designed by excluding regions with high homology between each HOX gene. The region amplified by the obtained primer pair was analyzed by Smith-Waterman DNA Search (SWschPrograms: http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/SWsrch/index.html) and other genes were amplified. Confirmed that there is no possibility of doing.
Furthermore, it was confirmed as follows that the PCR product obtained using the designed primer pair was the target HOX gene. First, total RNA was extracted from tissues collected from subjects using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). 3 μg of total RNA was converted into 4 U / μL of Moloney rabbit leukemia virus transcriptase (Invitrogen), 7.5 mM dithiothreitol, 0.5 mM MgCl 2.2, Reverse transcription was performed by reaction at 37 ° C. for 2 hours in a 50 μL total reaction solution containing 0.5 μM dNTP and 2 μM random primer to obtain cDNA. Then, using 1 μL of cDNA, 15 mM Tris-HCl (pH 8.05), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2PCR reaction was performed in a 25 μL reaction solution containing 200 μM dNTP, 400 nM primer, 0.1 U / μL AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems Japan). In PCR, after initial denaturation at 95 ° C. for 10 minutes, 35 cycles of 94 ° C. for 40 seconds, 60 ° C. for 40 seconds, and 72 ° C. for 1 minute were performed. The PCR product was cloned using a TOPO-TA cloning kit (Invitrogen) to obtain a pCR2.1-HOX plasmid vector. The β-actin gene and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) gene as internal standards were similarly cloned to obtain pCR2.1-β-actin plasmid vector and pCR2.1-G3PDH plasmid vector. Using these plasmid vectors as templates, DYDynamicTM A sequencing reaction was performed using an ET terminator cycle sequencing kit (Amersham Biosciences, Tokyo), and the nucleotide sequence was determined with a sequencer ABI PRISM 377 (Applied Biosystems Japan). As a result, it was confirmed that the primer pairs shown in Table 1 can specifically amplify each HOX gene.
(Create a calibration curve)
5 × 10 of the pCR2.1-HOX plasmid vector obtained above4˜5 as templates, primer pairs shown in Table 1 and QuantiTextTMA total volume of 20 μL of reaction mixture to which SYBRGreen PCR master mix (Qiagen, Tokyo) was added was subjected to initial denaturation (95 ° C., 15 minutes), then 95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute, 1 As a cycle, amplification by PCR of 40 cycles was performed. The number of PCR cycles (Ct) required for the amount of PCR reaction product of the target gene to reach a certain amount (0.3 in terms of fluorescence intensity of reporter (SYBRGreen)) with respect to these initial known logarithmic values. Was plotted to create a calibration curve. The expression of each HOX gene is 5 × 104Quantification was possible in the range of -10 copies. In addition, for the pCR2.1-β-actin plasmid vector and the pCR2.1-G3PDH plasmid vector as internal standards, 5 × 10 56-103A calibration curve was prepared in the same manner using the individual as a template.
(Quantification of HOX gene expression level)
Total RNA was extracted from tissues or cells collected from the subjects using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). Using 1 μg of total RNA, TaqManRT buffer (Applied Biosystems Japan), 5.5 mM MgCl2, 500 μM dNTP, 2.5 μM random hexamer, 0.4 U / μL RNase inhibitor, 1.25 U / μL MultiScribeTMIn a 100 μL reaction solution containing reverse transcriptase, the reaction was carried out at 25 ° C. for 10 minutes, 48 ° C. for 30 minutes, and 95 ° C. for 5 minutes to obtain cDNA. Then, using 2 μL of cDNA as a template, the primer pairs shown in Table 1 and QuantTectTMCYBRGreen PCR master mix (Qiagen, Tokyo) added to the total volume of 20 μL of the reaction mixture after initial denaturation (95 ° C, 15 minutes), 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute As a result, 40 cycles of amplification were performed.
The initial amount was determined from the number of cycles necessary for the reporter fluorescence intensity to be 0.3 by interpolation using a calibration curve. In order to eliminate the variation between samples depending on the initial RNA amount, the initial amount of each HOX gene is normalized by the initial amount of β-actin gene or G3PDH gene used as an internal standard ((HOX gene of Initial amount / initial amount of β-actin or G3PDH) × 100) was defined as the expression level of the HOX gene.
After 40 cycles, the reaction is performed at 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 15 seconds, and 95 ° C for 15 seconds, a dissociation curve is drawn, and the obtained PCR product has a single Tm value. It was confirmed. Thereby, when quantitative real-time RT-PCR was performed using the primer pair shown in Table 1, it confirmed that nonspecific PCR products, such as a primer dimer, did not arise.
2. Example of measuring HOX gene expression in normal human organs
The results of measuring the expression level of each HOX gene in human normal organs using the above method are shown in Table 2 and FIG. In FIG. 1, the one with the highest expression level is shown in white, and the one with no expression is shown in black. It can be seen that the types of HOX genes expressed are smaller in the organ located on the head side and more in the tail side organ. In addition, it can be seen that genes with higher HOX paralog numbers (for example, those located in the 5'-side genome of HOX clusters such as HOX12 and HOX13) have higher expression in the organ on the tail side. .
3. Measurement of HOX gene expression level in thyroid cancer cell lines
FIG. 2 shows the results of measuring the HOX gene expression level in 8 thyroid cancer cell lines (IAA, MSA, K-119, ROA, KOA-2, 8305C, 8505C, TCO-1) and normal thyroid gland. In addition, IAA, MSA, K-119, ROA, and KOA-2 are obtained from Osaka University Graduate School of Medicine, Pathologic Surgery. 8305C, 8505C, and TCO-1 are obtained from The Health Science Research Resources (Sennan, Japan). It was. For normal thyroid gland, RNA was obtained from BD Biosciences Clontech Japan (Tokyo, Japan). FIG. 2 shows that there is a particular difference in the expression of the HOX genes in
Next, Matrigel, a model of subendothelial basement membrane, shows the in vitro invasive ability of eight thyroid cancer cells.TMWas evaluated by an invasion assay. The invasion assay was performed using a chamber (BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber, Becton Dickinson, Bedford, Mass.) Partitioned with an 8 μm small pore filter. A Matrigel barrier is formed in advance on the upper surface of the filter. Twenty thousand cancer cells suspended in 500 μl of the culture solution were placed in the upper chamber, and a culture solution containing 750 μl of bovine fibronectin was injected into the lower chamber. 24 hours CO2After culturing in an incubator, the cells were fixed with formalin, stained with Giemsa, and the cells on the upper surface of the filter were wiped off with a cotton swab. The cells on the lower surface of the filter were observed under a microscope, and the invasive ability was evaluated by the number of cells per 200-fold visual field. The results are shown in FIG. IAA and ROA cells were found to be less invasive than the other 6 strains. Next, HOX genes capable of distinguishing between high invasive strains and low invasive strains were analyzed by a feature selection algorithm based on forward selection, and HOXB6, HOXB13 and HOXD4 were selected. All the expressions tend to be low in the low infiltration strain. Then, by combining two or more, preferably all three of these three genes, the invasion ability can be determined and / or diagnosed with higher accuracy (FIG. 4). That is, the expression level of at least one, preferably two, and most preferably three HOX genes selected from the group consisting of HOXB6, HOXB13, and HOXD4 is defined as a threshold HOX gene expression level in IAA or ROA cells. If the expression level is higher than the corresponding threshold HOX gene expression level, it is determined and / or diagnosed as a thyroid cancer that may invade. For example, the threshold values of HOXB6, HOXB13, and HOXD4 in IAA cells are 0.002, 0.00007, and 0.0002, respectively, and the threshold values of HOXB6, HOXB13, and HOXD4 in ROA cells are 0.008, 0.0002, and 0, respectively. 0.00004 can be set.
4). Measurement of HOX gene expression in gastric cancer
FIG. 5 shows the results of measuring the HOX gene expression level of gastric cancer surgical specimens (21 cancerous parts and 6 non-cancerous parts). FIG. 5 shows that the expression levels of HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB9, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXC10, and HOXC11 were significantly higher in gastric cancer tissues than in non-cancerous tissues (Mann-Whitney U test, p <0.01). Therefore, the expression level of at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB9, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXC10, and HOXC11, with the HOX gene expression level in the non-cancerous tissue as the threshold HOX gene expression level Is higher than the corresponding threshold HOX gene expression level, it is determined and / or diagnosed that gastric cancer is present. For example, the threshold is 0.2 for HOXB5, 0.3 for HOXB6, 0.3 for HOXB7, 0.1 for HOXB9, 0.07 for HOXC6, 0.04 for HOXC8, 0.05 for HOXC9, and 0 for HOXC10. 07 and HOXC11 can be set to 0.07.
Among gastric cancer tissues, cases with lymph node metastasis (14 cases) were compared to cases without this (7 cases) with HOXB6 (p <0.01), HOXB5, HOXB7, HOXB8 and HOXB9 (p <0). .05) was significantly higher (see FIG. 6). Therefore, the expression level of at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, and HOXD11 is defined as the threshold HOX gene expression level in cases where there is no lymph node metastasis. If the gene expression level is higher, it is determined and / or diagnosed as gastric cancer that may metastasize to lymph nodes.
Further, in HOXB6, when the HOX gene expression level represented by (initial amount of HOX gene / initial amount of B-actin) × 100 is set between 0.243 and 0.301, In one case, the presence or absence of lymph node metastasis could be determined and / or diagnosed. When HOXB5 was 0.372 or more, HOXB7 was 0.333 or more, and HOXB8 was 0.05 or more, it was determined and / or diagnosed that there was lymph node metastasis except for one case each. In addition, since the case (st95 and st110) which showed a specific value shows a specific value similarly in several HOX genes, it is a micrometastasis to a lymph node (formation of a small metastatic focus which cannot be detected by histological search). It is also possible that this has been caused. Therefore, the threshold HOX gene expression levels of HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, and HOXB9 are 0.372, 0.243, 0.333, 0.05, and 0.084, respectively, and HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, When the expression level of at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXB9 is higher than the threshold HOX gene expression level, it is determined and / or diagnosed as gastric cancer that may metastasize to lymph nodes.
Moreover, among gastric cancer tissues, cases with liver metastasis (5 cases) had significantly higher expression levels of HOXD11 (p <0.05) than cases without this (16 cases). Therefore, if the expression level of HOX gene in a case without liver metastasis is the threshold HOX gene expression level and the expression level of HOXD11 is higher than the corresponding threshold level HOX gene expression level, it is a vaginal cancer that may cause liver metastasis. It will be judged and / or diagnosed. For example, the threshold value of HOXD11 regarding liver metastasis can be set to 0.036.
5. Measurement of HOX gene expression level in liver cancer
The results of measuring HOX gene expression levels in liver cancer tissues (25 cases) and non-cancerous tissues (19 cases) are shown in FIG. The non-cancerous tissue is a tissue that is diagnosed as histopathologically cirrhotic liver, fibrotic liver, chronic hepatitis, and normal. From FIG. 7, the HOX gene expressed in the non-cancerous tissue belongs to paralog 2 to
Next, HOXA5 (p <0.01), HOXA2, HOXA4, HOXA6, HOXA7 were compared with the tissue in which cancer cells infiltrated into the portal vein, hepatic artery, hepatic vein, or bile duct. , HOXA9, HOXA10, HOXB1, HOXB5, HOXB7, HOXB8, HOXB13, HOXC4, HOXC5, HOXC8, HOXC9, HOXC10, HOXC11, HOXD1 (p <0.05) was observed (p <0.05). reference). Therefore, the HOX gene expression level of the tissue in which cancer cells have been infiltrated is set as the threshold HOX gene expression level as HOXA2, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXB1, HOXB5, HOXB7, HOXB8, HOXB8, HOXB8, HOXB8, HOXB8, HOXB13 When the expression level of at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXC8, HOXC9, HOXC10, HOXC11, and HOXD1 is lower than the threshold HOX gene expression level, the portal vein, hepatic artery, hepatic vein, or bile duct can be infiltrated It will be determined and / or diagnosed as having sexual liver cancer. For example, the threshold values are 0.061 for HOXA2, 0.045 for HOXA4, 0.065 for HOXA5, 0.027 for HOXA6, 0.025 for HOXA7, 0.142 for HOXA9, 0.067 for HOXA10, and HOXB1 0.025, HOXB5 0.067, HOXB7 0.053, HOXB8 0.017, HOXB13 0.015, HOXC4 0.068, HOXC5 0.038, HOXC8 0.017,
Of the HOX genes in the liver cancer tissues accompanied by vascular invasion shown here, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXB1, HOXB7, HOXB8, HOXB13, HOXC5, HOXC8, HOXC9, HOXC9, HOXC9, HOXC9, HOXC9, HOXC9, HOXC9, HOXC9 Since the expression level of the 15 HOX genes is comparable to the expression level of the non-cancerous tissue, the expression level of these 15 HOX genes is used to determine the possibility of vascular invasion in those diagnosed with liver cancer. It can be used for diagnosis. And / or to determine and / or diagnose the expression level of HOXA3, HOXA11, HOXA13, HOXB6, HOXB9, HOXC6, HOXC12, HOXC13, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9 and HOXD10 By using properly according to, it can be a more useful index.
Furthermore, when cancer progression was divided into stages I, II, III, and IV, the expression of HOXB1 and HOXA4 genes in tissues of III and IV was lower than those in stages I and II (p <0). .05) (see FIGS. 8 (2) and (3)). Therefore, when the expression level of HOX gene in stage I or II is the threshold HOX gene expression level and the expression level of HOXA4 and / or HOXB1 is lower than the threshold level HOX gene expression level, It will be determined and / or diagnosed as being present. For example, the threshold can be set to 0.045 for HOXA4 and 0.059 for HOXB1.
6). Measurement of HOX gene expression level in breast cancer
FIG. 9 shows the results of measuring the HOX gene expression level of breast cancer surgical specimens (26 cancerous parts and 6 non-cancerous parts). As shown in FIG. 9, the expression levels of HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA5, HOXA9, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, and HOXD10 in breast cancer tissues were significantly lower than those in non-cancerous tissues (Mann-Whitney). U test, p <0.01). In addition, the expression level of these 10 HOX genes is shown in FIG. From this, it is clear that the expression level of the cancerous tissue is lower than the expression level of the non-cancerous tissue, except for 3 and 4 specimens. In particular, in HOXA1, HOXA3, HOXA9, and HOXD3, it is clear that the expression level of the cancerous tissue is lower than the minimum expression level of the non-cancerous tissue, except for three and four samples. Therefore, using the HOX gene expression level in the non-cancerous tissue as the threshold HOX gene expression level, at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA5, HOXA9, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, and HOXD10 When the expression level is lower than the threshold HOX gene expression level, it is determined and / or diagnosed that breast cancer exists. For example, the threshold values are 0.058 for HOXA1, 0.257 for HOXA2, 0.090 for HOXA3, 0.278 for HOXA5, 0.130 for HOXA9, 0.179 for HOXD3, 0.170 for HOXD4, and 0 for HOXD8. .446, 0.170 for HOXD9 and 0.033 for HOXD10.
7). Measurement of HOX gene expression in colorectal cancer
FIG. 11 shows the HOX gene expression levels of surgical specimens for colorectal cancer (30 cancerous cases and 20 noncancerous cases). From FIG. 11, the expression levels of HOXA9, HOXB2, HOXB3, HOXB8, and HOXB9 were significantly higher in the colon cancer tissues than in the non-cancerous tissues (Mann-Whitney U test, p <0.01). On the other hand, the expression levels of HOXD1, HOXD3, and HOXD4 were significantly lower than those in non-cancerous tissues (p <0.01). In addition, in FIG. 12, these eight HOX gene expression levels are shown as a point graph for each specimen. Therefore, the expression level of at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXA9, HOXB2, HOXB3, HOXB8, and HOXB9 is defined as the threshold HOX gene expression level, where the HOX gene expression level in the non-cancerous tissue is the threshold HOX gene expression level. When the expression level of at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXD1, HOXD3, and HOXD4 is higher and / or lower than the threshold HOX gene expression level, it is determined and / or diagnosed that colorectal cancer is present It will be. For example, the threshold values are 1.232 for HOXA9, 0.660 for HOXB2, 0.703 for HOXB3, 0.678 for HOXB8, 0.632 for HOXB9, 0.075 for HOXD1, 0.028 for HOXD3, and HOXD4 0.103 can be set.
FIG. 13 shows the results of measuring the HOX gene expression level in cases (10 cases) with and without liver metastasis among cancer tissues (20 cases). In liver metastasis cases, HOXA4, HOXB1, HOXC12, and HOXC13 expression levels were found to be significantly higher than those without liver metastasis (Mann-Whitney U test, p <0.01). Therefore, the expression level of at least one HOX gene selected from the group consisting of HOXA4, HOXB1, HOXC12, and HOXC13 is higher than the threshold HOX gene expression level, with the HOX gene expression level of the case without liver metastasis as the threshold HOX gene expression level In some cases, it may be determined and / or diagnosed as colorectal cancer with the possibility of liver metastasis.
Further, as shown in FIG. 11, the HOX gene expression level expressed by (initial amount of HOX gene / initial amount of β-actin) × 100, HOXA4 is between 0.062 and 0.083, and HOXB1 is 0.006. If a cutoff value is set between 0.008 and 0.011 for HOXC12 and 0.017 and 0.018 for HOXC13, the expression level in three or more HOX genes The cases in which the value exceeds the cut-off value could be determined and / or diagnosed as having a high probability of liver metastasis (70%). Therefore, the threshold HOX gene expression levels of HOXA4, HOXB1, HOXC12, and HOXC13 are 0.062, 0.006, 0.008, and 0.017, respectively, and at least one selected from the group consisting of HOXA4, HOXB1, HOXC12, and HOXC13 If the expression level of one, preferably two, more preferably three, and most preferably all four HOX genes is higher than the threshold HOX gene expression level, the colorectal cancer is likely to have liver metastasis. It will be judged and / or diagnosed.
In 2 cases out of 20 cases without liver metastasis, the expression level of 3 of these HOX genes was more than the cut-off value. Conceivable.
【配列表】
Claims (37)
（１）被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）前記ＨＯＸ遺伝子の発現量を対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量と比較する工程、
を含み、
ここで、前記ＨＯＸ遺伝子の発現量が閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行している、と判定される方法。A method of determining the presence of cancer, the possibility of cancer metastasis, the likelihood of cancer invasion, or the progression of cancer,
(1) a step of measuring the expression level of at least one HOX gene in a tissue collected from a subject;
(2) comparing the expression level of the HOX gene with the corresponding threshold HOX gene expression level;
Including
Here, when the expression level of the HOX gene is higher or lower than the threshold HOX gene expression level, cancer is present, cancer may be metastasized, cancer may be infiltrated, or cancer may be present. A method that is determined to be in progress.
配列番号１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア。The method according to any one of claims 1 to 23, wherein the expression level of the HOX gene is measured by PCR using at least one primer pair selected from the group consisting of:
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a base sequence in which one or two bases are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a base sequence in which one or two bases are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a base sequence in which one or two bases are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a base sequence in which one or two bases are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 17 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 19 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 or a base sequence in which one or two bases are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 25 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
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An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 31 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 32 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
An oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 35 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and a base sequence represented by SEQ ID NO: 36, or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
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An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 or a base sequence in which one or two bases thereof are substituted, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 40 or a base sequence in which one or two bases are substituted A primer pair consisting of an oligonucleotide having
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