JPWO2005004902A1

JPWO2005004902A1 - Recombinant human serum albumin preparation in plastic container

Info

Publication number: JPWO2005004902A1
Application number: JP2005511583A
Authority: JP
Inventors: 與志久濱; 正和豆田; 望月　忍; 忍望月; 松寿亀山
Original assignee: Nipro Corp; Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Nipro Corp; Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 2003-07-10
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2006-08-24
Also published as: WO2005004902A1

Abstract

組換えヒト血清アルブミンの液状製剤を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備えるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤であって、長期間保存安定性に優れている。Recombinant human serum albumin in a plastic container, comprising: a plastic container containing a liquid preparation of recombinant human serum albumin; and a gas barrier outer packaging material having at least a layer containing an ethylene-vinyl alcohol copolymer for packaging the plastic container. It is a formulation and has excellent long-term storage stability.

Description

本発明は、プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤に関する。 The present invention relates to a recombinant human serum albumin preparation in a plastic container.

アルブミン、特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は血漿中に最も多く含まれる蛋白質であり、肝臓中で作られ、血流中で正常な浸透圧を維持したり、栄養物質や代謝物質と結合してこれらを運搬するなどの機能をもっている。そのため、ＨＳＡは出血性ショック患者、熱傷患者等の外傷に関連する症状、低アルブミン血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者の治療に有効とされている。このようなＨＳＡは精製水に溶解させた液状製剤として、臨床現場においてヒト体内へ注射または点滴により投与されている。
ＨＳＡ製剤を収容する容器としては、従来からガラス製容器が使用され、例えば、脱アルカリ処理した軟質ガラス容器中で保存することが提案されている（例えば、特開平４−２１０６４８号公報を参照）。また、タイプＩＩガラスバイアル、例えば、標準表面処理を施されたケイ酸塩ガラス（アンモニウム塩または酸化イオウ処理、タイプＩＩのガラス）にＨＳＡ製剤を収容することも提案されている（例えば、特開平９−２２１４３１号公報を参照）。これらのガラス容器はいずれも、ガラス容器からのアルミニウムの遊離を回避することを目的とする。しかしながら、これらのガラス容器は、重い、壊れやすいなどの欠点を有する。また、これらのＨＳＡ製剤のガラス容器への注入に際しては、容器内のＨＳＡ製剤中に大気中の細菌、その他の夾雑物質が混入する危険があり、汎用的ではない。
近年、緊急時の医薬品の使用においてガラス容器と好適に代替し得る容器として、軽量で割れないプラスチック容器が検討されている。例えば、特開２０００−１８９４９２号公報には、プラスチック容器を使用し、かつ、ＨＳＡ製剤を大気中の夾雑物質と接触しない系で該容器内部に注入し、比較的低温度で該容器開口端を密封することによって、アルブミン加熱変性物の生成を完全に抑制したＨＳＡ製剤収容プラスチック容器を提供できることが開示されている。また特開２００３−１０２８７号公報には、温度２５℃、相対湿度６０％における水蒸気透過量が特定の範囲になるようにプラスチック材料を成型加工して低水蒸気透過性を有する容器を用いることにより、充填されたＨＳＡ製剤は長期間変性もほとんどなく、その性状を維持できることが開示されている。さらにこの特開２００３−１０２８７号公報には、同条件における酸素透過量が特定の範囲になるようにプラスチック材料を成型加工して低酸素透過性を有する外包装材を併せて使用することも開示されている。
ところで、従来、ＨＳＡは、ヒトから採取した血液を分画することによって製造されていたが、かかる製造法は不経済であり、血液の供給が困難であるという問題があった。また、血液は肝炎ウィルスのように好ましくない物質を含んでいるため、ＨＳＡに代替し得る原料の開発が望まれていた。
そこで近年、遺伝子操作によるアルブミン（組換えヒト血清アルブミン；ｒＨＳＡ）の大量生産、精製技術の研究開発が進み、遺伝子組換えによる治療薬も市販されようとしている。
しかし、ｒＨＳＡ製剤の場合、上記プラスチック容器にて製剤化（プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤）すると、５０℃で６０日間の保存により、外観変化、二量体以上のｒＨＳＡの重合体の形成、アンモニア含有量の増加というような現象が起こるということが、本発明者等の試験によって新たに判った。
これらの現象が起こる理由の詳細は不明であるが、当該試験は酸素存在下で実施されていることから酸素暴露による影響が懸念される。
上記試験は、当該製剤の長期保存時の安定性を短期間で予測するために行ったものである。この外観変化、重合体の形成、アンモニア含有量の増加という現象は、本試験結果のレベルであれば必ずしも安全性に影響を与えるものではないが、品質面からみると、製造直後の品質状態を保存期間中ほぼ一定に保つことが望ましいと考えられる。
以上のように、本発明者等は、外観変化、重合体形成ならびにアンモニア含有量増加を極力抑制でき、長期間の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤の開発が必要であることを、解決すべき新たなる課題として見出した。Albumin, especially human serum albumin (HSA), is the most abundant protein in plasma, and is produced in the liver and maintains normal osmotic pressure in the bloodstream or binds to nutrients and metabolites. It has functions such as transporting. Therefore, HSA is effective for the treatment of patients suffering from trauma-related symptoms such as hemorrhagic shock patients and burn patients, hypoalbuminemia and fetal erythroblastosis. Such HSA is administered as a liquid preparation dissolved in purified water into a human body by injection or infusion at a clinical site.
Conventionally, glass containers have been used as containers for storing HSA preparations, and for example, it has been proposed to store them in a soft glass container that has been dealkalized (see, for example, JP-A-4-210648). . It has also been proposed to contain the HSA formulation in a type II glass vial, eg, a silicate glass (ammonium salt or sulfur oxide treatment, type II glass) that has been subjected to standard surface treatment (eg, Japanese Patent Laid-Open No. Hei. 9-222131). All of these glass containers aim to avoid the liberation of aluminum from the glass container. However, these glass containers have drawbacks such as being heavy and fragile. In addition, when these HSA preparations are injected into a glass container, there is a risk that bacteria and other contaminants in the atmosphere will be mixed in the HSA preparation in the container, which is not general purpose.
In recent years, lightweight and unbreakable plastic containers have been studied as containers that can be suitably substituted for glass containers in the use of pharmaceuticals in an emergency. For example, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-189492, a plastic container is used, and an HSA preparation is injected into the container in a system that does not come into contact with contaminants in the atmosphere. It is disclosed that by sealing, an HSA preparation-containing plastic container in which the production of albumin heat-modified product is completely suppressed can be provided. JP-A-2003-10287 uses a container having low water vapor permeability by molding a plastic material so that the water vapor transmission amount at a temperature of 25 ° C. and a relative humidity of 60% is in a specific range. It is disclosed that the filled HSA preparation has little denaturation for a long time and can maintain its properties. Furthermore, this Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-10287 also discloses that an outer packaging material having low oxygen permeability is used by molding a plastic material so that the oxygen permeation amount under the same condition falls within a specific range. Has been.
Conventionally, HSA has been produced by fractionating blood collected from humans. However, such a production method is uneconomical and has a problem that it is difficult to supply blood. In addition, since blood contains undesirable substances such as hepatitis virus, it has been desired to develop a raw material that can replace HSA.
Therefore, in recent years, research and development of mass production and purification technology of albumin (recombinant human serum albumin; rHSA) by genetic manipulation has progressed, and therapeutic drugs by genetic recombination are also being marketed.
However, in the case of an rHSA preparation, when it is formulated in the above plastic container (recombinant human serum albumin preparation in a plastic container), the appearance changes and the formation of a dimer or higher rHSA polymer is achieved by storage at 50 ° C. for 60 days. It has been newly found by the inventors' tests that a phenomenon such as an increase in ammonia content occurs.
Although the details of the reason why these phenomena occur are unknown, since the test is performed in the presence of oxygen, there are concerns about the effects of oxygen exposure.
The above test was conducted in order to predict the stability of the preparation during long-term storage in a short period of time. This phenomenon of appearance change, polymer formation, and ammonia content increase does not necessarily affect safety if it is at the level of this test result. It may be desirable to keep it approximately constant during the storage period.
As described above, the present inventors need to develop a recombinant human serum albumin preparation in a plastic container that can suppress changes in appearance, polymer formation, and ammonia content as much as possible, and has excellent long-term storage stability. I found this as a new problem to be solved.

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、長期間保存安定性に優れた新規なプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を提供することである。
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備えるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤。
（２）プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤が収容されてなることを特徴とする上記（１）に記載の製剤。
（３）外包装材のエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層の厚みが５〜５０μｍである上記（１）または（２）に記載の製剤。
（４）外包装材の厚みが５〜１０００μｍである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製剤。
（５）外包装材の酸素透過量が、温度２５℃、相対湿度６０％において、５０ｃｍ^３／ｍ^２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製剤。
（６）外包装材が、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製剤。
（７）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の組換えヒト血清アルブミン濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製剤。
（８）プラスチック容器の材料が、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、またはエチレン−酢酸ビニル共重合体である、上記（１）記載の製剤。
（９）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が、プラスチック容器中に、無菌状態で密封されている、上記（１）記載の製剤。
（１０）成型金型内においてプラスチック容器が成型された後、該プラスチック容器がまだ成型金型内にある間に、該プラスチック容器内に組換えヒト血清アルブミンの液状製剤が注入され、かつ、開口部が金型によって押圧されて密封されている、上記（９）記載の製剤。
（１１）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中の二量体以上の組換えヒト血清アルブミン重合体の含有量が３．８％以下である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の製剤。
（１２）組換えヒト血清アルブミンの液状製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下である、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の製剤。The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to provide a novel plastic container-containing recombinant human serum albumin preparation having excellent long-term storage stability. .
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
(1) Recombination in a plastic container comprising a plastic container for storing a liquid preparation of recombinant human serum albumin and a gas barrier outer packaging material having at least a layer containing an ethylene-vinyl alcohol copolymer for packaging the plastic container Human serum albumin preparation.
(2) The preparation according to (1) above, wherein an oxygen scavenger is accommodated between the plastic container and the outer packaging material.
(3) The preparation according to (1) or (2) above, wherein the thickness of the layer containing the ethylene-vinyl alcohol copolymer of the outer packaging material is 5 to 50 μm.
(4) The preparation according to any one of (1) to (3), wherein the thickness of the outer packaging material is 5 to 1000 μm.
(5) The oxygen permeation amount of the outer packaging material is less than 50 cm ³ / m ² /day·1013.25 hPa at a temperature of 25 ° C. and a relative humidity of 60%, according to any one of the above (1) to (4) Formulation.
(6) The outer packaging material is a multilayer structure having an innermost layer formed of polyethylene, an intermediate layer formed of an ethylene-vinyl alcohol copolymer, and an outermost layer formed of nylon. The preparation according to any one of 1) to (5).
(7) The preparation according to any one of (1) to (6) above, wherein the recombinant human serum albumin concentration in the liquid preparation of recombinant human serum albumin is 1 to 500 mg / mL.
(8) The preparation according to (1) above, wherein the material of the plastic container is polyolefin, polyvinyl chloride, or ethylene-vinyl acetate copolymer.
(9) The preparation according to (1) above, wherein the liquid preparation of recombinant human serum albumin is sealed in a plastic container in a sterile state.
(10) After the plastic container is molded in the molding die, the liquid preparation of recombinant human serum albumin is injected into the plastic container while the plastic container is still in the molding die, and the opening is opened. The preparation according to (9) above, wherein the part is pressed and sealed with a mold.
(11) The content of the recombinant human serum albumin polymer of dimer or higher in the liquid preparation of recombinant human serum albumin is 3.8% or less, and any one of (1) to (10) above Formulation.
(12) The preparation according to any one of (1) to (11) above, wherein the ammonia content in the liquid preparation of recombinant human serum albumin is 4.60 μg / mL or less.

図１は、本発明における好ましい一例のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１を簡略化して示す図である。図中における符号は、１：プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤、２：プラスチック容器、３：ｒＨＳＡ製剤、１５：外包装材、をそれぞれに示している。
図２は、本発明におけるｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の製造方法の好ましい一例を段階的に示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a simplified example of a recombinant human serum albumin preparation 1 in a plastic container according to the present invention. Reference numerals in the figure indicate 1: a recombinant human serum albumin preparation in a plastic container, 2: a plastic container, 3: an rHSA preparation, and 15: an outer packaging material.
FIG. 2 is a diagram showing in a stepwise manner a preferred example of a method for producing a plastic container containing an rHSA preparation in the present invention.

本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤は、組換えヒト血清アルブミンの液状製剤（ｒＨＳＡ製剤）を収容するプラスチック容器と、当該プラスチック容器を包装するエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するガスバリア性外包装材とを備える。
かかる構成を備える本発明によって、組換えヒト血清アルブミンの液状製剤をプラスチック容器に収容して製剤化した構成でありながら、長期間の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を提供することができる。
ここで、「長期間の保存安定性に優れる」とは、上記プラスチック容器入りｒＨＳＡ製剤を室温（３０℃以下、具体的には１０〜３０℃）で２年間保存した場合に、外観、重合体形成、アンモニア含有量を含めた品質・性状に保存開始時と比較して大きな変化が認められないことを意味する（生物学的製剤基準に則ったＨＳＡ製剤（血漿由来）の有効期間に準拠）。
また、この長期保存安定性を予測する手段として、当該プラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤（５（ｗ／ｖ）％）を５０℃、７５％ＲＨの条件下に６０日間放置後、ｒＨＳＡ製剤の外観が淡黄色澄明であり、ｒＨＳＡ製剤中に含有される二量体以上のｒＨＳＡ重合体が３．８％以下、好ましくは２．４％以下、ｒＨＳＡ製剤中のアンモニア含有量が４．６０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは３．３５μｇ／ｍＬ以下であれば、上記長期間の保存安定性と同等の効果が得られるものと推測することができる。
なお、上記放置後のｒＨＳＡ製剤中の重合体形成は、ＨＰＬＣゲル濾過法によって二量体以上の高分子量画分をｒＨＳＡの重合体として算出することによって測定することができる。また、上記放置後のｒＨＳＡ製剤中のアンモニア含有量は、ｒＨＳＡ製剤の５倍希釈液を、限外濾過膜（分子量３万カット）にて限外濾過し、得られた濾液を試料溶液とした後、日局・一般試験法のアンモニア試験法によって、インドフェノール（λｍａｘ、６４０ｎｍ）の吸光度を測定して定量することによって、算出することができる。
以下、本発明を構成する〔１〕組換えヒト血清アルブミン製剤、〔２〕プラスチック容器、〔３〕外包装材、についてそれぞれ詳述する。
〔１〕組換えヒト血清アルブミン製剤（ｒＨＳＡ製剤）
本発明において使用される組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）は、遺伝子工学的手法によって生産された、分子量約６７，０００のヒト血清アルブミンである。ｒＨＳＡとしては、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を単離し、適当なベクターに組み込み、得られた組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得て、該形質転換体を培養し、培養後に培養抽出物を種々の精製手法により精製したｒＨＳＡなどが例示される。
本発明において、上記ｒＨＳＡを従来公知の方法にて製剤化してなる組換えヒト血清アルブミンの液状製剤（ｒＨＳＡ製剤）が、プラスチック容器内に収容される。かかるｒＨＳＡ製剤は、例えば注射用水に溶解したｒＨＳＡ濃度が１〜５００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｍＬ）の溶液である。本発明におけるｒＨＳＡ製剤には、アセチルトリプトファン塩、炭素数６〜１８の有機カルボン酸またはその塩等の安定化剤が含有されていることが好ましい。このような安定化剤、例えばアセチルトリプトファンはｒＨＳＡ製剤中に含有されるｒＨＳＡ１ｇ当り、約２０〜６０ｍｇであることが好ましい。炭素数６〜１８の有機カルボン酸としては、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸等が例示され、その塩としてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩が挙げられる。
本発明におけるｒＨＳＡは、具体的には、以下のような方法にて調製され、製剤化される。
（ｉ）遺伝子操作によるｒＨＳＡの調製
本発明において用いられる遺伝子操作により調製されるｒＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。具体的には、遺伝子操作を経てｒＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが例示される。特に、宿主として酵母、中でもサッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）〕を用いることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を用いてもよい。さらに好適には、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ａ，ｈｉｓ４，ｌｅｕ２，ｃａｎ１）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）が用いられる。
これらのｒＨＳＡ産生宿主の調製方法、該宿主を培養することによるｒＨＳＡの生産方法及び培養物からのｒＨＳＡの分離採取方法は、公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施できる。ｒＨＳＡ産生宿主の調製方法としては、例えば、通常のＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号公報、特開昭５８−９０５１５号公報、特開昭５８−１５０５１７号公報を参照）、新規なＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号公報、特開平１−９８４８６号公報を参照）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報を参照）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報を参照）、組換えプラスミドを染色体上に組み込む方法（特開平３−７２８８９号公報を参照）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報を参照）、メタノール含有培地で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ２プロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６８号公報、特開平４−２９９９８４号公報を参照）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報を参照）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号公報、特開昭６３−３９５７６号公報、特開昭６３−７４４９３号公報を参照）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報を参照）が例示される。
このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）のＡＯＸ１遺伝子領域に常法によりＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
またｒＨＳＡ産生宿主の培養方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養（半回分培養）により、高濃度のグルコース或いはメタノール等を適度に少量ずつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報を参照）、培地中に脂肪酸を添加してｒＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２９３４９５号公報を参照）等が例示される。
（ｉｉ）ｒＨＳＡの精製
培養処理により産生されたｒＨＳＡを宿主細胞に由来する成分および培養成分等から、十分な精度をもって単離・精製する方法が各種研究されている。例えば、従来行われている方法としてｒＨＳＡを含有する酵母培養液を、圧搾→限外濾過膜処理→加熱処理→限外濾過膜処理に供した後、陽イオン交換体、疎水性クロマト、陰イオン交換体のカラムクロマトグラフィー処理等の工程に供する方法が挙げられる（特開平５−３１７０７９号公報，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＢｌｏｏｄＰｒｏｔｅｉｎｓ．１９９３，Ｖｏｌ．２２７，２９３−２９８を参照）。また、上記従来法の後で、さらにキレート樹脂処理またはホウ酸・塩処理の工程に供する方法も報告されている（特開平６−５６８８３号公報、特開平６−２４５７８９号公報を参照）。また、当該酵母培養液を加熱処理後に吸着流動床技術を用いたストリームライン法等を用いることもできる（特開平８−１１６９８５号公報を参照）。すなわち、ｒＨＳＡの産生宿主を含有する培養液を加熱処理し、該加熱処理液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ、その吸着画分を回収することを特徴とするものである。
（ｉｉｉ）高度精製されたｒＨＳＡの性状
本発明におけるｒＨＳＡは、分子量約６７，０００、等電点約４．９の単一物質である。当該ｒＨＳＡは単量体および微量の二量体からなり、三量体以上の重合体、分解物を実質的に含まない。ここで、上記「実質的に含まない」とは、少なくとも製造直後のものでは、当該分野で汎用される手法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、逆相クロマトなど）により上記三量体以上の重合体、分解物が検出されないことを意味する。また本発明におけるｒＨＳＡは、産生宿主に由来する夾雑成分も実質的に含まない。具体的にはｒＨＳＡ２５（ｗ／ｖ）％溶液の場合で、宿主由来の抗原性を有する夾雑成分は１ｎｇ／ｍＬ以下が例示される。パイロジェンは同様の場合で１ＥＵ／ｍＬ以下が例示される。
着色度は２５（ｗ／ｖ）％のｒＨＳＡ製剤の場合で、Ａ_３５０／Ａ_２８０が、通常、０．０１５以下、好ましくは０．０１３以下である（具体的には、Ａ_３５０／Ａ_２８０が０．０１〜０．０１５程度が例示される。）。なお、公知の精製方法をさらに適宜組み合わせて用いることにより、さらに着色度が抑えられた、すなわちＡ_３５０／Ａ_２８０の値が低いｒＨＳＡを得ることができる。
（ｉｖ）製剤化
得られたｒＨＳＡは、公知の手法（例えば、５０〜８０℃で３０分間以上の加熱滅菌処理、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化することができる。製剤としては、具体的にはｒＨＳＡを５〜２５（ｗ／ｖ）％溶液（ｒＨＳＡ量として５〜１２．５ｇ）となるように含有し、ｐＨは６．４〜７．４程度、浸透圧比は１程度（生理食塩水に対する比として）の液状製剤が例示される。本発明におけるｒＨＳＡ製剤には、安定化剤としてカプリル酸ナトリウムおよび／またはアセチルトリプトファンが配合されることが好ましい。安定化剤の添加量としては各々ｒＨＳＡ１ｇ当たり２０〜６０ｍｇ程度が例示される。また、ナトリウム含量は３．７ｍｇ／ｍＬ以下が例示される。当該安定化剤の添加時期は、通常、加熱滅菌処理、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等の処理前である。かくして、ｒＨＳＡはその保存安定性のみならず、当該製剤化工程における安定化も図られる。
〔２〕ｒＨＳＡ製剤を収容するプラスチック容器
図１は、本発明における好ましい一例のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１を簡略化して示す断面図である。本発明において、ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２の形状は、液状物を収容し得る内部空間を有するものであれば、特には制限されるものではないが、一方にのみ開口端４を有する筒状の容器で実現される（プラスチック容器において開口端４を除く部分を「容器本体５」と呼ぶことがある。）。ここで、本発明におけるプラスチック容器２の開口端４は、ｒＨＳＡ製剤を該容器内に収容するための開口端であり、後述するように密閉されて容器頭部６を形成してもよい（用時には、開口端４が開口され、この部分よりｒＨＳＡ製剤が供される）。本発明におけるプラスチック容器２は、容器本体５が、開口端４の近辺において容器本体５の断面積が徐々に小さくなるように形成された部分（以下、「肩部７」と称する。）および上記肩部７に連なって同程度の断面積で開口端４にまで伸びる部分（以下、「首部８」と称する。）とを有するように形成されるのが好ましい。また、肩部７と首部８との間、あるいは首部８に、外方に突出するようなフランジ９が周方向にわたって形成されていてもよい。本発明におけるプラスチック容器２においては、首部８および開口端４は、容器本体と一体的に形成されていてもよい、別体的に（例えば、容器本体とは異なる樹脂材料にて）形成されていてもよい。
本発明におけるプラスチック容器２は、首部８の長さＤ（首部７の肩部側端から開口端までの距離）と容器本体の長さＬ（容器底部から肩部７の首部８側端までの距離（好ましくは、容器底部からフランジ９までの距離））の比、Ｄ／Ｌが、好ましくは０．１〜０．５、より好ましくは０．１〜０．３、特に好ましくは０．１〜０．１５である。
また、容器本体５と開口端４の水平切断面との比は、目的とするｒＨＳＡ製剤３の収容量により種々異なるが、好ましくは０．０１〜０．５、より好ましくは、０．１〜０．２、もっとも好ましくは０．１〜０．１５である。
本発明におけるプラスチック容器２の容器本体５および開口端４の水平切断面に特に制限はなく、円形状（真円形状、楕円形状）、方形状（正方形状、長方形状）などが挙げられるが、中でも円形状または方形状が好ましい。本発明におけるプラスチック容器２の大きさにも特に制限はなく、収容するｒＨＳＡ製剤３の量によって、種々選択できるが、例えば、容器本体５の水平断面形状が真円形状である場合、その直径が、１０〜１５０ｍｍであるのが好ましく、５０〜１００ｍｍであるのがより好ましく、６０〜８０ｍｍであるのが特に好ましい。また、容器本体の水平断面形状が楕円形状である場合、その長軸／短軸比が１．１以上であるのが好ましく、１．５〜５．０であるのがより好ましく、２．０〜３．０であるのが特に好ましい。また、容器本体５の水平断面形状が方形状である場合、その長辺／短辺比は、１．１以上であるのが好ましく、１．５〜５．０であるのがより好ましく、２．０〜３．０であるのが特に好ましい。
さらに容器本体５の肉厚は、通常、０．２〜２．５ｍｍ、好ましくは０．３〜１．５ｍｍ、もっとも好ましくは０．４〜０．７ｍｍであり、容器首部８の肉厚は、通常、０．３〜３．０ｍｍ、好ましくは０．８〜２．０ｍｍ、もっとも好ましくは１．０〜１．５ｍｍである。
プラスチック容器２は、単層でも多層構造でもよく、その形成材料としては特に制限されず公知の樹脂材料を適宜使用することができるが、ｒＨＳＡ製剤の加熱滅菌の温度（４０〜６０℃）に耐えるとともに、ｒＨＳＡ製剤３を収容したプラスチック容器２の開口端内面温度４０〜７０℃の温度で、後述するように頭部金型による押圧により密封しうる樹脂材料が好ましい。かかる樹脂材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体等が例示される。具体的には、融点が９０〜１４０℃であり、密度が０．８９０〜０．９４０である低密度ポリエチレンなどのポリオレフィンが挙げられる。
本発明におけるプラスチック容器２は、圧力１０１３．２５ｈＰａ下において、表面積１ｍ^２、２４時間当りの水蒸気透過量が、温度２５℃および相対湿度６０％において、１．５ｇ／ｍ^２／日・１０１３．２５ｈＰａ以下（すなわち、６．２５×１０^−３ｍｇ／ｃｍ^２／時・１０１３．２５ｈＰａ以下）であることが好ましい。水蒸気透過量がこの値を越える容器においては、長期間、例えば８００日以上の保存において、ｒＨＳＡ製剤中のｒＨＳＡ濃度が、表示量に対して１１０％以上の過剰濃度となり、好ましくない。上記水蒸気透過量の測定は、ＡＳＴＭＥ９６の規定に準拠した重量法によって行うことができる。このような水蒸気透過量を実現し得る材料としては、ポリオレフィン系（ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体などから選ばれる少なくとも１種の樹脂材料が挙げられ、中でもポリエチレンが好ましく、さらには直鎖状低密度ポリエチレンと低密度ポリエチレンとの樹脂混合物が好ましい。
さらにヒートシールによって当該プラスチック容器を密封形成する場合には、最内の層が、比較的低温度（約４０〜７０℃程度）にて熱融着できる材料、例えばポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体から形成されることが望ましい。また、ｒＨＳＡ製剤をプラスチック容器に収容した後に、これを蒸気、熱水滅菌を行うこともあり得るが、その場合ｒＨＳＡを変性させない温度（７０℃以下）であることが要求される。
プラスチック容器の製法としては、ブロー成型法とインフレーション法（押出成型法）があるが、本発明のプラスチック容器を製造するには、いずれの製造方法を採用してもよい。ｒＨＳＡ製剤のプラスチック容器の注入は、該製剤を変性させない温度下で、プラスチック容器がｒＨＳＡ製剤を収容し得る状態であるならば、プラスチック容器の製造時、製造後のいずれの段階で行ってもよいが、特開２０００−１８９４９２号公報に記載された下記の方法によって、プラスチック容器の成形とｒＨＳＡ製剤の注入とを一緒に行うのが好ましい。
図２は、特開２０００−１８９４９２号公報に記載された方法を段階的に示す図である。
まず、（１）一端が閉鎖された円筒状プラスチック成形体（パリソン）２１を溶融成形し、（２）該成形体２１を本体金型２２内部に設置し（図２（ａ），（ｂ））、（３）マンドレル２３を成形体２１の上部開口端から押し込み、該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込んで容器２４を成形し（図２（ｃ））、（４）該成形した容器２４の開口端から薬液注入用ノズル２５をマンドレル２３に挿入して、容器２４の底部にまで下降させ、ｒＨＳＡ製剤３を注入し（図２（ｄ））、次いで、（５）得られた容器２４の開口端を頭部金型２６により押圧して密封する。なお、上記圧縮ガスを吹き込んで容器を成形する工程に代えて、頭部金型２６の吸引孔２７より本体金型２２内を真空にして容器を成形することも可能である。
上述のように型開きした本体金型２２内に円筒状プラスチック成形体２１を溶融押出し、その一端を金型内で閉鎖した円筒状プラスチック成形体（パリソン）を作製し、該本体金型２２内で該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込むか、あるいは本体金型２２内部を真空にして容器２４を成形し、該容器２４が未だ本体金型２２内にある間に、ｒＨＳＡ製剤３を容器開口端から内部に注入することで、ｒＨＳＡ製剤３が大気にほぼ触れることなく、無菌状態でｒＨＳＡ製剤３をプラスチック容器に収容することが可能となる。さらに本体金型２２の冷却によって容器本体２４を急冷した後、プラスチック容器の開口端を頭部金型２６により押圧して密封し、頭部金型２６の冷却により容器頭部を冷却することで、アルブミン加熱変性物の生成を完全に抑制して、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器を形成することができる。
上記ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器を製造する方法を行うための装置としては、例えばロメラグ社のボトルパック機などのブローフィルシールシステムが例示されるが、無論これに限定されるものではない。
該容器を製造する条件としては、例えば、以下のとおりである。
（１）一端が閉鎖された円筒状プラスチック成形体２１を溶融成形するには、まず、材料であるプラスチックを溶融温度以上に加熱し、筒状のオリフィスを有する押出機から押出し、開かれた金型の間に垂下するように押し出す。
（２）該成形体２１を本体金型２２内部に設置するには、本体金型２２および頭部金型２６を有する金型の本体金型２２内に、上記溶融した円筒状プラスチック成形体２１を重力により垂下させて、設置する。このとき、本体金型２２および頭部金型２６の温度は、通常、５〜３０℃に制御されている。したがって、溶融状態で垂下した円筒状プラスチック成形体２１は約１００〜１５０℃に低下している。
（３）該成形体２１内部に圧縮ガスを吹き込んで容器２４を成形するには、上記円筒状プラスチック成形体２１の開口端から圧縮ガス、例えば、空気を吹き込み、上記成形体２１を膨張させ、本体金型２２内面に接触させて容器２４を成形する。このとき、本体金型２２の温度が通常、５〜３０℃に制御されているから、円筒状プラスチック成形体２１本体の温度は、例えば、１０〜７０℃に低下する。しかしながら、該円筒状プラスチック成形体２１の上部であって、本体金型２２に接触しない部分（開口端）は、通常、１００〜１５０℃の状態にある。または金型内部を真空にして成形するには、常法に従う。この場合においても、該円筒状プラスチック成形体２１の上部であって、本体金型２２に接触しない部分（開口端）は、通常、１００〜１５０℃の状態にある。
（４）該成形した容器２４の開口端からｒＨＳＡ製剤３を注入するには、上記円筒状プラスチック成形体から容器を成形した後、できるかぎり速やかに行う。注入するｒＨＳＡ製剤３の温度は通常、５〜２５℃に近いから、該ｒＨＳＡ製剤の注入により、成形された容器本体の温度は、１０〜６０℃である。しかし、容器開口部の内面温度は、５０〜９０℃の状態のままである。
（５）得られたプラスチック容器の開口端を頭部金型２６により押圧して密封する。これは、容器開口端の内面温度が４０〜７０℃であるときに行うことが好ましい。
本発明において、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器は、必要により加熱滅菌に供して、ｒＨＳＡ製剤中に混入する虞のある微生物等を不活性化することが必要である。滅菌条件としては、５０〜８０℃で３０分間以上の加熱を行うことが望ましい。
ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の保存条件としては、凍結や変性をさけるため、温度５℃〜５０℃、相対湿度１０％以上であることが望ましい。
本発明におけるプラスチック容器は、図１に簡略化して示す例のように、容器頭部６の上面にゴム状弾性体１０が固着されていてもよい。上記のように肩部７と首部８との間、あるいは首部８に、外方に突出するフランジ９を周方向にわたって有する場合には、かしめ部材１２を使用し、当該かしめ部材１２の底端と溶着し、ゴム状弾性体１０を容器頭部６に固着するようにしてもよい。ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２の容器頭部の上面にゴム状弾性体１０が固着されると、穿刺針がゴム状弾性体１０および容器頭部に穿刺してもゴム状弾性体１０に穿刺された針穴は閉塞する方向に復元力が作用するので、穿刺針が針穴と当接しｒＨＳＡ製剤３が外部に漏れることはないという利点がある。ゴム状弾性体１０を設ける場合、当該ゴム状弾性体１０の外面が熱収縮性保護フィルム１１にて被覆されているのが好ましい。これによりゴム状弾性体１０への大気汚染物質の付着を防止することができる。上記ゴム状弾性体１０の形成材料としては、ブチルゴム、ポリイソブチレンゴム、シリコーンゴム、エチレン−ポリプロピレンゴム等の合成ゴムまたは天然ゴム等が挙げられる。また、上記熱収縮保護フィルム１１の形成材料としては、例えばポリエチレンテレフタレート、スチレン、塩化ビニル、二軸延伸ポリプロピレンなどを用いることができ、中でもポリエチレンテレフタレートを用いることが好ましい。また、かしめ部材１２の材料としては、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド等のプラスチックが好ましいが、アルミニウム、ステンレス等の金属、セラミック等でもよい。
〔３〕外包装材
本発明において上記プラスチック容器２を包装する外包装材１５は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有するプラスチック製のものであって、ガスバリア性を有することが特徴である。かかるエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有する外包装材１５を用いることによって、上述したような長期の保存安定性に優れたプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得ることができる。ここで、本発明における外包装材１５は、圧力１０１３．２５ｈＰａ下、温度２５℃、相対湿度６０％における酸素透過量が、通常、５０ｃｍ^３／ｍ^２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満であり、好ましくは５ｃｍ^３／ｍ^２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満、さらに好ましくは１ｃｍ^３／ｍ^２／日・１０１３．２５ｈＰａ未満である。かかる酸素透過量は、ＪＩＳＫ７１２６の規定に準拠した差圧法によって測定することができる。
また、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有する外包装材１５を使用することによって、比較的小さな厚みでもガスバリア性を示すため、他のガスバリア性材料と比較しても取り扱い性（操作性）がよく、しかも安価に上述のような長期の保存安定性に優れるプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得ることができる、という利点がある。
当該外包装材１５は、上記エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を少なくとも有しているならば、このエチレン−ビニルアルコール共重合体で形成された単層であってもよいし、他の樹脂材料で形成された層をさらに有する複数層であってもよい。
外包装材１５が単層からなる場合には、エチレン−ビニルアルコール共重合体のみで調製されていてもよく、また、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、架橋エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニリデン、ポリブテン、ポリエステル、エチレン共重合体から選ばれる少なくとも１種（好ましくは、２種以上）とエチレン−ビニルアルコール共重合体との混合物から調製されていてもよい。なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体のみで形成された単層の外包装材は、その厚みにもよるが、他のガスバリア性材料で形成した場合と比較して透明性に優れるという利点もある。
また外包装材１５が複数層である場合には、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む（樹脂）層は、最外層、最内層、中間層のいずれに位置していてもよい（中間層が複数ある場合には、そのいずれの位置でもよい）。かかる場合、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層以外の層の形成材料としては、上述したエチレン−ビニルアルコール共重合体と混合されてもよい樹脂として上記例示したものを好適に使用することができる。外包装材が複数層である場合、具体的には、ポリエチレンにて形成された最内層、エチレン−ビニルアルコール共重合体にて形成された中間層、ならびにナイロンにて形成された最外層を有する多層構造の外包装材が好適なものとして例示される。
また、上記のように外包装材１５が複数層（最内層、最外層、および必要に応じ１または複数の中間層）である場合、各層の厚みは、種々選択することができるが、少なくともエチレン−ビニルアルコール共重合体で形成された層について、上述した酸素透過量を満足するようにその厚みを選択する（好ましくは５〜５０μｍ、より好ましくは１０〜３０μｍ）。
本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤１は、上記ｒＨＳＡ製剤３を収容したプラスチック容器２を、上記外包装材１５にて包装する。ここで「包装」とは、外包装材が、ｒＨＳＡ製剤を収容したプラスチック容器の少なくとも容器本体を、好適にはプラスチック容器全体を、完全にその内部に収容するように覆い、包み込んでなることを指す。外包装材１５の形状については特に制限されるものではないが、取扱い性の観点から、薄膜であることが好ましい。その厚み（多層の場合には、全ての層の厚みの総計）は、５〜１０００μｍであるのが好ましく、１０〜５００μｍであるのがより好ましい。
外包装材１５は、従来公知の適宜の製造方法、例えば、ブロー成型法、インフレーション法（押出成型法）などを用いて製造することができる。また、ｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２を外包装材１５にて包装する方法としては、従来公知の適宜の方法、例えば、プラスチック容器を収容後に外包装材の開口部をシールする方法などが挙げられる。
本発明においては、上記のようにｒＨＳＡ製剤３を収容するプラスチック容器２を外包装材１５にて包装する際に、ｒＨＳＡ製剤３に対する酸素の影響をさらに抑制すべく、プラスチック容器２と外包装材１５との間の空間部１６に脱酸素剤が収容されてなるのが好ましい。脱酸素剤としては、従来公知の適宜の市販品、たとえば、エージレス（三菱ガス化学株式会社製）、タモツ（王子タック株式会社製）などを特に制限なく使用することができる。さらに酸素による暴露を受けたかどうかを確認するために酸素検知剤（商品名：エージレスアイ（三菱ガス化学株式会社製））などを収容していてもよい。The recombinant human serum albumin preparation in a plastic container according to the present invention comprises a plastic container containing a liquid preparation of recombinant human serum albumin (rHSA preparation) and a layer containing an ethylene-vinyl alcohol copolymer for packaging the plastic container. A gas barrier outer packaging material at least.
According to the present invention having such a configuration, a recombinant human serum albumin preparation contained in a plastic container having a long-term storage stability is provided, although the liquid preparation of recombinant human serum albumin is formulated in a plastic container. can do.
Here, “excellent in long-term storage stability” means that when the above rHSA preparation in a plastic container is stored at room temperature (30 ° C. or lower, specifically 10 to 30 ° C.) for 2 years, the appearance, polymer This means that there is no significant change in the quality and properties including formation and ammonia content compared to the beginning of storage (according to the effective period of HSA preparation (derived from plasma) in accordance with biological preparation standards) .
As a means for predicting the long-term storage stability, the recombinant human serum albumin preparation (5 (w / v)%) in a plastic container is left for 60 days at 50 ° C. and 75% RH, and then the rHSA preparation. The appearance of is a light yellow clear, the dimer or higher rHSA polymer contained in the rHSA preparation is 3.8% or less, preferably 2.4% or less, and the ammonia content in the rHSA preparation is 4.60 μg. / ML or less, preferably 3.35 μg / mL or less, it can be presumed that the same effect as the long-term storage stability can be obtained.
The polymer formation in the rHSA preparation after standing can be measured by calculating a high molecular weight fraction of a dimer or more as an rHSA polymer by HPLC gel filtration. The ammonia content in the rHSA preparation after standing was ultrafiltered with a 5-fold dilution of the rHSA preparation through an ultrafiltration membrane (molecular weight 30,000 cut), and the resulting filtrate was used as a sample solution. Thereafter, it can be calculated by measuring and quantifying the absorbance of indophenol (λmax, 640 nm) by the ammonia test method of the JP / General test method.
Hereinafter, [1] recombinant human serum albumin preparation, [2] plastic container, and [3] outer packaging material constituting the present invention will be described in detail.
[1] Recombinant human serum albumin preparation (rHSA preparation)
Recombinant human serum albumin (rHSA) used in the present invention is human serum albumin having a molecular weight of about 67,000 produced by genetic engineering techniques. As rHSA, a gene encoding human serum albumin is isolated, incorporated into an appropriate vector, the obtained recombinant vector is introduced into an appropriate host to obtain a transformant, and the transformant is cultured. Examples include rHSA obtained by purifying a culture extract by various purification methods after culturing.
In the present invention, a liquid preparation of recombinant human serum albumin (rHSA preparation) obtained by formulating the above rHSA by a conventionally known method is contained in a plastic container. Such an rHSA preparation is, for example, a solution having an rHSA concentration of 1 to 500 mg / mL (preferably 10 to 100 mg / mL) dissolved in water for injection. The rHSA preparation in the present invention preferably contains a stabilizer such as an acetyltryptophan salt, an organic carboxylic acid having 6 to 18 carbon atoms or a salt thereof. Such stabilizers, such as acetyltryptophan, are preferably about 20-60 mg per gram of rHSA contained in the rHSA formulation. Examples of the organic carboxylic acid having 6 to 18 carbon atoms include caproic acid, caprylic acid, capric acid, lauric acid, palmitic acid, oleic acid and the like, and the salts thereof include alkali metal salts such as sodium and potassium, calcium and the like Alkaline earth metal salts are mentioned.
Specifically, rHSA in the present invention is prepared and formulated by the following method.
(I) Preparation of rHSA by genetic manipulation
The rHSA production host prepared by genetic manipulation used in the present invention is not particularly limited as long as it is prepared through genetic manipulation. Can be used. Specifically, bacteria (for example, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, etc.), animal cells, etc. that have been rendered rHSA-producing through genetic manipulation are exemplified. In particular, yeast, particularly Saccharomyces cerevisiae (for example, Saccharomyces cerevisiae) or Pichia (for example, Pichia pastoris) is preferably used as the host. Further, auxotrophic strains and antibiotic-sensitive strains may be used. More preferably, Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his 4, leu 2, can 1) and Pichia pastoris GTS115 strain (his 4) are used.
The method for preparing these rHSA production hosts, the method for producing rHSA by culturing the host, and the method for separating and collecting rHSA from the culture can be carried out by employing known and equivalent techniques. As a method for preparing an rHSA production host, for example, a method using a normal HSA gene (see JP-A-58-56684, JP-A-58-90515, JP-A-58-150517), novel A method using a novel HSA gene (see JP-A-62-29985 and JP-A-1-98486), a method using a synthetic signal sequence (see JP-A-1-240191), a serum albumin signal sequence A method to be used (see JP-A-2-167695), a method for incorporating a recombinant plasmid into a chromosome (see JP-A-3-72889), a method for fusing hosts together (JP-A-3-53877) Reference), a method of causing mutation in a medium containing methanol, and a method of using a mutant AOX2 promoter (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 6-90768) HSA expression by Bacillus subtilis (see JP 62-25133), HSA expression by yeast (JP 60-41487, JP 63) -39576 and JP-A-63-74493), and expression of HSA by Pichia yeast (see JP-A-2-104290).
Among these, the method of causing mutation in a methanol-containing medium is specifically performed as follows. That is, first, a plasmid having a transcription unit capable of expressing HSA under the control of the AOX1 promoter is introduced into a suitable host, preferably Pichia yeast, specifically, the AOX1 gene region of GTS115 strain (NRRL deposit number Y-15851) by a conventional method. To obtain a transformant (see JP-A-2-104290). This transformant has a weak growth ability in methanol medium. Therefore, the transformant is cultured in a methanol-containing medium to cause mutation, and only viable strains are collected. In this case, the methanol concentration is exemplified by about 0.0001 to 5%. The medium may be an artificial medium or a natural medium. Examples of culture conditions include 15 to 40 ° C. and about 1 to 1000 hours.
Further, as a method for culturing an rHSA production host, in addition to the methods described in the above-mentioned publications, high concentration glucose or methanol is supplied little by little by fed batch culture (semi-batch culture). A method for obtaining a high concentration of bacterial cells and products while avoiding high-concentration substrate inhibition on the body (refer to JP-A-3-83595), and a method for enhancing the production of rHSA by adding a fatty acid to the medium (See Japanese Patent Publication No. 4-293495).
(Ii) Purification of rHSA
Various studies have been conducted on methods for isolating and purifying rHSA produced by culture treatment from components derived from host cells, culture components, and the like with sufficient accuracy. For example, as a conventional method, a yeast culture solution containing rHSA is subjected to pressing → ultrafiltration membrane treatment → heating treatment → ultrafiltration membrane treatment, and then a cation exchanger, hydrophobic chromatography, anion Examples include a method of subjecting the exchanger to a process such as column chromatography (see JP-A-5-317079, Biotechnology of Blood Proteins. 1993, Vol. 227, 293-298). In addition, after the above conventional method, a method of subjecting to a chelate resin treatment or a boric acid / salt treatment step has also been reported (see JP-A-6-56883 and JP-A-6-245789). In addition, a streamline method using an adsorption fluidized bed technique after heat treatment of the yeast culture solution can be used (see JP-A-8-116985). That is, a culture solution containing an rHSA production host is heat-treated, the heat-treatment solution is brought into contact with adsorbent particles suspended in a fluidized bed, and the adsorbed fraction is collected.
(Iii) Properties of highly purified rHSA
The rHSA in the present invention is a single substance having a molecular weight of about 67,000 and an isoelectric point of about 4.9. The rHSA is composed of a monomer and a trace amount of a dimer, and does not substantially contain a polymer or decomposition product of a trimer or higher. Here, the term “substantially free” means that the polymer of the trimer or higher is obtained by a method (SDS-PAGE, gel filtration, reverse phase chromatography, etc.) widely used in the field at least immediately after production. , Meaning that no degradation products are detected. In addition, rHSA in the present invention is substantially free from contaminating components derived from the production host. Specifically, in the case of an rHSA25 (w / v)% solution, the host-derived antigenic contaminant component is exemplified by 1 ng / mL or less. The pyrogen is exemplified by 1 EU / mL or less in the same case.
The coloration degree is 25 (w / v)% in the case of rHSA preparation. ₃₅₀ / A ₂₈₀ Is usually 0.015 or less, preferably 0.013 or less (specifically, A ₃₅₀ / A ₂₈₀ Is about 0.01 to 0.015. ). In addition, the coloring degree was further suppressed by using a known purification method in an appropriate combination, that is, A ₃₅₀ / A ₂₈₀ RHSA having a low value of can be obtained.
(Iv) Formulation
The obtained rHSA can be formulated by a known method (for example, heat sterilization treatment at 50 to 80 ° C. for 30 minutes or more, ultrafiltration, sterilization filtration, dispensing, lyophilization, etc.). Specifically, the formulation contains rHSA in a 5 to 25 (w / v)% solution (5 to 12.5 g as the amount of rHSA), pH is about 6.4 to 7.4, and osmotic pressure ratio Is exemplified by a liquid preparation of about 1 (as a ratio to physiological saline). The rHSA preparation of the present invention preferably contains sodium caprylate and / or acetyltryptophan as a stabilizer. The amount of stabilizer added is, for example, about 20 to 60 mg per 1 g of rHSA. The sodium content is exemplified by 3.7 mg / mL or less. The stabilizing agent is usually added before heat sterilization, ultrafiltration, sterilization filtration, dispensing, freeze drying, and the like. Thus, rHSA can be stabilized not only in its storage stability but also in the formulation step.
[2] Plastic container for storing rHSA preparation
FIG. 1 is a cross-sectional view showing a simplified example of a recombinant human serum albumin preparation 1 in a plastic container according to the present invention. In the present invention, the shape of the plastic container 2 for storing the rHSA preparation 3 is not particularly limited as long as it has an internal space capable of storing a liquid material, but has an open end 4 only on one side. This is realized by a cylindrical container (a part of the plastic container excluding the opening end 4 may be referred to as a “container body 5”). Here, the open end 4 of the plastic container 2 in the present invention is an open end for accommodating the rHSA preparation in the container, and may be sealed to form the container head 6 as will be described later. Sometimes the open end 4 is opened and the rHSA preparation is provided from this part). In the plastic container 2 according to the present invention, the container body 5 is a portion (hereinafter referred to as “shoulder portion 7”) formed so that the cross-sectional area of the container body 5 gradually decreases in the vicinity of the opening end 4. It is preferably formed so as to have a portion (hereinafter, referred to as “neck portion 8”) that extends to the opening end 4 with the same cross-sectional area continuously to the shoulder portion 7. Moreover, the flange 9 which protrudes outward between the shoulder part 7 and the neck part 8, or the neck part 8 may be formed over the circumferential direction. In the plastic container 2 according to the present invention, the neck portion 8 and the open end 4 may be formed integrally with the container body, or formed separately (for example, with a resin material different from the container body). May be.
The plastic container 2 in the present invention has a length D of the neck portion 8 (distance from the shoulder side end of the neck portion 7 to the opening end) and a length L of the container body (from the container bottom portion to the neck 8 side end of the shoulder portion 7). Ratio (preferably, distance from the bottom of the container to the flange 9)), D / L is preferably 0.1 to 0.5, more preferably 0.1 to 0.3, and particularly preferably 0.1. ~ 0.15.
Further, the ratio between the container body 5 and the horizontal cut surface of the open end 4 varies depending on the amount of the target rHSA preparation 3, but is preferably 0.01 to 0.5, more preferably 0.1 to 0.1. 0.2, most preferably 0.1 to 0.15.
There are no particular limitations on the horizontal cut surfaces of the container body 5 and the open end 4 of the plastic container 2 in the present invention, and examples include a circular shape (perfect circle shape, elliptical shape), a square shape (square shape, rectangular shape), and the like. Of these, a circular shape or a rectangular shape is preferable. The size of the plastic container 2 in the present invention is not particularly limited and can be variously selected depending on the amount of the rHSA preparation 3 to be accommodated. For example, when the horizontal cross-sectional shape of the container body 5 is a perfect circle, the diameter is The thickness is preferably 10 to 150 mm, more preferably 50 to 100 mm, and particularly preferably 60 to 80 mm. Moreover, when the horizontal cross-sectional shape of a container main body is elliptical shape, it is preferable that the major axis / minor axis ratio is 1.1 or more, it is more preferable that it is 1.5-5.0, and 2.0 It is especially preferable that it is -3.0. Moreover, when the horizontal cross-sectional shape of the container main body 5 is a square shape, the long side / short side ratio is preferably 1.1 or more, more preferably 1.5 to 5.0. Particularly preferred is 0.0 to 3.0.
Furthermore, the wall thickness of the container body 5 is usually 0.2 to 2.5 mm, preferably 0.3 to 1.5 mm, most preferably 0.4 to 0.7 mm, and the wall thickness of the container neck 8 is Usually, it is 0.3 to 3.0 mm, preferably 0.8 to 2.0 mm, and most preferably 1.0 to 1.5 mm.
The plastic container 2 may be a single layer or a multilayer structure, and the material for forming the plastic container 2 is not particularly limited, and a known resin material can be used as appropriate, but it can withstand the heat sterilization temperature (40 to 60 ° C.) of the rHSA preparation. In addition, a resin material that can be sealed by pressing with a head mold as described later at a temperature of 40 to 70 ° C. at the open end inner surface of the plastic container 2 containing the rHSA preparation 3 is preferable. Examples of such resin materials include polyolefins such as polyethylene and polypropylene, polyvinyl chloride, and ethylene-vinyl acetate copolymers. Specific examples include polyolefins such as low density polyethylene having a melting point of 90 to 140 ° C. and a density of 0.890 to 0.940.
The plastic container 2 according to the present invention has a surface area of 1 m under a pressure of 101.25 hPa. ² The water vapor transmission rate per 24 hours is 1.5 g / m at a temperature of 25 ° C. and a relative humidity of 60%. ² /Day·1013.25 hPa or less (that is, 6.25 × 10 ^-3 mg / cm ² /Hour·1013.25 hPa or less). In a container having a water vapor transmission rate exceeding this value, the rHSA concentration in the rHSA preparation becomes an excessive concentration of 110% or more with respect to the indicated amount during long-term storage, for example, 800 days or more, which is not preferable. The water vapor transmission amount can be measured by a gravimetric method in accordance with ASTM E 96. Examples of the material capable of realizing such a water vapor transmission amount include at least one resin material selected from polyolefin (polyethylene, polypropylene, etc.), polyvinyl chloride, ethylene-vinyl acetate copolymer, etc. Further, a resin mixture of linear low density polyethylene and low density polyethylene is preferred.
Further, when the plastic container is hermetically formed by heat sealing, the innermost layer is made of a material that can be heat-sealed at a relatively low temperature (about 40 to 70 ° C.), for example, polyolefin such as polyethylene and polypropylene, It is desirable to be formed from vinyl chloride and an ethylene-vinyl acetate copolymer. In addition, after the rHSA preparation is stored in a plastic container, it may be sterilized with steam or hot water. In this case, the temperature is required not to denature rHSA (70 ° C. or less).
As a method for producing a plastic container, there are a blow molding method and an inflation method (extrusion molding method). Any method may be adopted to produce the plastic container of the present invention. The injection of the plastic container of the rHSA preparation may be carried out at any stage after the production of the plastic container as long as the plastic container can accommodate the rHSA preparation at a temperature that does not denature the preparation. However, it is preferable to mold the plastic container and inject the rHSA preparation together by the following method described in JP-A No. 2000-189492.
FIG. 2 is a diagram showing the method described in Japanese Patent Laid-Open No. 2000-189492 step by step.
First, (1) a cylindrical plastic molded body (parison) 21 whose one end is closed is melt-molded, and (2) the molded body 21 is installed inside the main body mold 22 (FIGS. 2A and 2B). ), (3) The mandrel 23 is pushed in from the upper opening end of the molded body 21, and a compressed gas is blown into the molded body 21 to mold the container 24 (FIG. 2C), and (4) the molded container 24. The chemical solution injection nozzle 25 is inserted into the mandrel 23 from the open end of the container, and is lowered to the bottom of the container 24 to inject the rHSA preparation 3 (FIG. 2 (d)), and then (5) the container 24 obtained. The opening end is pressed by the head mold 26 and sealed. Instead of the step of forming the container by blowing the compressed gas, it is possible to form the container by evacuating the main body mold 22 from the suction hole 27 of the head mold 26.
The cylindrical plastic molded body 21 is melt-extruded into the body mold 22 opened as described above, and a cylindrical plastic molded body (parison) whose one end is closed in the mold is manufactured. Then, compressed gas is blown into the molded body 21 or the inside of the main body mold 22 is evacuated to form the container 24, and the rHSA preparation 3 is opened while the container 24 is still in the main body mold 22. By injecting into the inside from the end, the rHSA formulation 3 can be accommodated in a plastic container in a sterile state without substantially touching the atmosphere. Further, after rapidly cooling the container body 24 by cooling the main body mold 22, the opening end of the plastic container is pressed and sealed by the head mold 26, and the container head is cooled by cooling the head mold 26. In addition, it is possible to form a plastic container containing the rHSA preparation by completely suppressing the production of the albumin heat-denatured product.
As an apparatus for performing the method for producing a plastic container containing the rHSA preparation, for example, a blow-fill seal system such as a bottle pack machine manufactured by Lomelag is exemplified, but it is not limited thereto.
The conditions for producing the container are, for example, as follows.
(1) In order to melt-mold the cylindrical plastic molded body 21 whose one end is closed, first, the plastic material is heated to a melting temperature or higher, extruded from an extruder having a cylindrical orifice, and opened gold. Extrude to hang down between molds.
(2) In order to install the molded body 21 inside the main body mold 22, the molten cylindrical plastic molded body 21 is placed in the main body mold 22 of the mold having the main body mold 22 and the head mold 26. Is suspended by gravity. At this time, the temperature of the main body mold 22 and the head mold 26 is normally controlled at 5 to 30 ° C. Therefore, the cylindrical plastic molded body 21 drooped in the molten state is lowered to about 100 to 150 ° C.
(3) To mold the container 24 by blowing compressed gas into the molded body 21, compressed gas, for example, air is blown from the opening end of the cylindrical plastic molded body 21 to expand the molded body 21. The container 24 is formed in contact with the inner surface of the main body mold 22. At this time, since the temperature of the main body mold 22 is normally controlled to 5 to 30 ° C., the temperature of the cylindrical plastic molded body 21 main body is lowered to 10 to 70 ° C., for example. However, the upper part of the cylindrical plastic molded body 21 that is not in contact with the main body mold 22 (open end) is normally in a state of 100 to 150 ° C. Or, in order to mold the inside of the mold in a vacuum, a conventional method is followed. Also in this case, the upper part of the cylindrical plastic molded body 21 that is not in contact with the main body mold 22 (open end) is normally in a state of 100 to 150 ° C.
(4) Injecting the rHSA preparation 3 from the open end of the molded container 24 is performed as soon as possible after molding the container from the cylindrical plastic molded body. Since the temperature of the rHSA preparation 3 to be injected is usually close to 5 to 25 ° C., the temperature of the container body formed by the injection of the rHSA preparation is 10 to 60 ° C. However, the inner surface temperature of the container opening remains at 50 to 90 ° C.
(5) The opening end of the obtained plastic container is pressed by the head mold 26 and sealed. This is preferably performed when the inner surface temperature of the container opening end is 40 to 70 ° C.
In the present invention, the plastic container containing the rHSA preparation needs to be subjected to heat sterilization as necessary to inactivate microorganisms or the like that may be mixed into the rHSA preparation. As sterilization conditions, it is desirable to heat at 50 to 80 ° C. for 30 minutes or more.
As the storage conditions of the plastic container containing the rHSA preparation, it is desirable that the temperature is 5 ° C. to 50 ° C. and the relative humidity is 10% or more in order to avoid freezing and denaturation.
As for the plastic container in this invention, the rubber-like elastic body 10 may adhere to the upper surface of the container head 6 like the example simplified and shown in FIG. As described above, when the flange 9 protruding outward is provided between the shoulder portion 7 and the neck portion 8 or on the neck portion 8 in the circumferential direction, the caulking member 12 is used, and the bottom end of the caulking member 12 is The rubber-like elastic body 10 may be fixed to the container head 6 by welding. When the rubber-like elastic body 10 is fixed to the upper surface of the container head of the plastic container 2 containing the rHSA preparation 3, the rubber-like elastic body 10 is formed even if the puncture needle punctures the rubber-like elastic body 10 and the container head. Since the puncture needle hole has a restoring force in the closing direction, there is an advantage that the puncture needle abuts the needle hole and the rHSA preparation 3 does not leak to the outside. When the rubber-like elastic body 10 is provided, it is preferable that the outer surface of the rubber-like elastic body 10 is covered with the heat-shrinkable protective film 11. Thereby, adhesion of air pollutants to the rubber-like elastic body 10 can be prevented. Examples of the material for forming the rubber-like elastic body 10 include synthetic rubber such as butyl rubber, polyisobutylene rubber, silicone rubber, and ethylene-polypropylene rubber, or natural rubber. Further, as a material for forming the heat shrink protective film 11, for example, polyethylene terephthalate, styrene, vinyl chloride, biaxially stretched polypropylene or the like can be used, and among these, polyethylene terephthalate is preferably used. The material of the caulking member 12 is preferably a plastic such as polyolefin, polyester or polyamide, but may be a metal such as aluminum or stainless steel, ceramic or the like.
[3] Outer packaging material
In the present invention, the outer packaging material 15 for packaging the plastic container 2 is made of plastic having at least a layer containing an ethylene-vinyl alcohol copolymer, and is characterized by having gas barrier properties. By using the outer packaging material 15 having at least a layer containing such an ethylene-vinyl alcohol copolymer, a recombinant human serum albumin preparation in a plastic container having excellent long-term storage stability as described above can be obtained. Here, the outer packaging material 15 in the present invention has an oxygen permeation amount of typically 50 cm under a pressure of 101.25 hPa, a temperature of 25 ° C., and a relative humidity of 60%. ³ / M ² / Day · less than 1013.25 hPa, preferably 5 cm ³ / M ² / Day · less than 1013.25 hPa, more preferably 1 cm ³ / M ² / Day · less than 1013.25 hPa. Such an oxygen permeation amount can be measured by a differential pressure method based on the JIS K 7126 standard.
In addition, by using the outer packaging material 15 having at least a layer containing an ethylene-vinyl alcohol copolymer, gas barrier properties are exhibited even at a relatively small thickness. This is advantageous in that a recombinant human serum albumin preparation in a plastic container having excellent long-term storage stability as described above can be obtained at low cost.
As long as the outer packaging material 15 has at least a layer containing the ethylene-vinyl alcohol copolymer, it may be a single layer formed of the ethylene-vinyl alcohol copolymer, A plurality of layers further including a layer formed of a resin material may be used.
When the outer packaging material 15 is composed of a single layer, it may be prepared only with an ethylene-vinyl alcohol copolymer, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, a crosslinked ethylene-vinyl acetate copolymer, polychlorinated. It may be prepared from a mixture of at least one (preferably two or more) selected from vinylidene, polybutene, polyester, and ethylene copolymer, and an ethylene-vinyl alcohol copolymer. In addition, the single-layer outer packaging material formed only with the ethylene-vinyl alcohol copolymer has an advantage that it is excellent in transparency as compared with the case where it is formed with other gas barrier materials, depending on the thickness. .
When the outer wrapping material 15 has a plurality of layers, the (resin) layer containing the ethylene-vinyl alcohol copolymer may be located in any of the outermost layer, the innermost layer, and the intermediate layer (the intermediate layer is When there are a plurality of positions, any position may be used). In such a case, as a material for forming a layer other than the layer containing the ethylene-vinyl alcohol copolymer, it is preferable to use those exemplified above as the resin that may be mixed with the above-described ethylene-vinyl alcohol copolymer. it can. When the outer packaging material has a plurality of layers, specifically, it has an innermost layer formed of polyethylene, an intermediate layer formed of ethylene-vinyl alcohol copolymer, and an outermost layer formed of nylon. The outer packaging material of a multilayer structure is illustrated as a suitable thing.
Moreover, when the outer packaging material 15 is a plurality of layers (the innermost layer, the outermost layer, and one or a plurality of intermediate layers as required) as described above, the thickness of each layer can be variously selected. -About the layer formed with the vinyl alcohol copolymer, the thickness is selected so that the amount of oxygen permeation mentioned above may be satisfied (preferably 5-50 micrometers, more preferably 10-30 micrometers).
In the recombinant human serum albumin preparation 1 in a plastic container of the present invention, the plastic container 2 containing the rHSA preparation 3 is packaged with the outer packaging material 15. Here, “packaging” means that the outer packaging material covers and wraps at least the container body of the plastic container containing the rHSA preparation, preferably so that the entire plastic container is completely contained therein. Point to. The shape of the outer packaging material 15 is not particularly limited, but is preferably a thin film from the viewpoint of handleability. The thickness (the sum of the thicknesses of all layers in the case of multiple layers) is preferably 5 to 1000 μm, and more preferably 10 to 500 μm.
The outer packaging material 15 can be manufactured using a conventionally known appropriate manufacturing method such as a blow molding method or an inflation method (extrusion molding method). Further, as a method of packaging the plastic container 2 containing the rHSA preparation 3 with the outer packaging material 15, a conventionally known appropriate method, for example, a method of sealing the opening of the outer packaging material after housing the plastic container, etc. Can be mentioned.
In the present invention, when the plastic container 2 containing the rHSA formulation 3 is packaged with the outer packaging material 15 as described above, the plastic container 2 and the outer packaging material are further suppressed in order to further suppress the influence of oxygen on the rHSA formulation 3. It is preferable that an oxygen scavenger is accommodated in the space 16 between the two. As the oxygen scavenger, a conventionally known appropriate commercial product, for example, AGELESS (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.), Tamotsu (manufactured by Oji Tac Co., Ltd.) or the like can be used without particular limitation. Further, an oxygen detector (trade name: Ageless Eye (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.)) or the like may be accommodated in order to confirm whether or not the exposure by oxygen has been received.

次に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ｒＨＳＡの調製
ｒＨＳＡ産生酵母菌ピキアパストリスの取得およびその培養については、特開平５−３１７０７９号公報に記載された方法に準じて行った。得られた培養液からｒＨＳＡを回収・精製するには、特開平８−１１６９８５号公報に記載された方法に準じて、培養液の加熱処理→吸着体粒子処理（ストリームラインＳＰ処理）→加熱処理→疎水性クロマト処理→陰イオン交換体処理→キレート樹脂処理→ホウ酸・塩処理を行った。
調製されたｒＨＳＡは５（ｗ／ｖ）％溶液に調整し、さらにカプリル酸ナトリウムおよびアセチルトリプトファンナトリウムを当該溶液１００ｍＬ当たり各々６６．５ｍｇおよび１０７．３ｍｇ添加した後に、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を用いて除菌濾過することにより、ｒＨＳＡを注射剤として使用することができる。その組成は、塩化ナトリウム含量３．７ｍｇ／ｍＬ以下、ｐＨ６．４〜７．４、浸透圧比約１（生理食塩水に対する比）であった。
（２）精製ｒＨＳＡ（含有組成物）の性状
〔ＨＰＬＣ分析〕
ｒＨＳＡをＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記の条件で行った。
（ａ）カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ（東ソー社製）
（ｂ）展開液：０．１ＭＫＨ_２ＰＯ_４／０．３ＭＮａＣｌ緩衝液
（ｃ）検出：波長２８０ｎｍでの吸光度
精製ｒＨＳＡ含有組成物における主ピークはｒＨＳＡのモノマーに相当するものであった。
〔酵母由来成分分析〕
ＨＳＡ非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ｒＨＳＡ含有組成物中に存在する酵母由来成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。酵母由来成分量はｒＨＳＡ２５０ｍｇ当たり１ｎｇ未満であった。
〔分子量〕
分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物中の、ｒＨＳＡの分子量は約６７０００であった。
〔等電点〕
等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Ａｌｌｅｎらの方法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１４６，ｐ１（１９７８）］に準じて測定した。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物中の、ｒＨＳＡの等電点は約４．９であった。
〔着色度〕
着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ_３５０／Ａ_２８０、Ａ_４５０／Ａ_２８０、Ａ_５００／Ａ_２８０を算出した。本発明の精製ｒＨＳＡ含有組成物の着色度はＡ_３５０／Ａ_２８０で約０．０１５、Ａ_４５０／Ａ_２８０は約０．０１、Ａ_５００／Ａ_２８０は約０．００２であった。
〔パイロジェンの測定〕
生化学工業のエンドスペシーを用いて測定したところ、パイロジェン量はｒＨＳＡ２５０ｍｇ当たり０．５ＥＵ未満であった。
（３）プラスチック容器の成形およびｒＨＳＡ製剤の注入
密度０．９０６ｇ／ｃｍ^３の低密度ポリエチレン（ＤＥＦＤ−１１３７、日本ユニカー社製）を溶融し、押出しノズルから押出温度１９０℃で円筒状に押出し、一端が閉鎖した円筒状成形体２１（パリソン）を製造した。このパリソン２１を割金型の間に下降させ（図２（ａ））、本体金型２２を型締めした（図２（ｂ））。次いで、マンドレル２３をパリソン２１の上部開口端から押し込み、圧力３ｋｇ／ｃｍ^２で加圧空気をブローし、容器本体２４を成形した。この時の本体金型２２の温度は５０℃であった（図２（ｃ））。その後、薬液注入用ノズル２５をその先端が容器本体２４の底部まで下降させ、５（ｗ／ｖ）％ｒＨＳＡ水溶液２５０ｍＬを容器本体２４に注入した（図２（ｄ））。次いで、薬液注入用ノズル２５を上昇させ、開口端内面温度４０℃において、頭部金型２６を型締めし、吸引孔２７から真空成形して容器頭部６を形成するとともに容器開口端４を密封した（図２（ｅ），図２（ｆ））。
（４）外包装材による包装
第１層（最内層）直鎖状低密度ポリエチレン５０μｍ、第２層エチレン−ビニルアルコール共重合体１５μｍ、第３層（最外層）ナイロン１５μｍ、の３層からなる外包装材（藤森工業製、外寸：約１６０ｍｍ×２６０ｍｍ（シール幅：１０ｍｍ）、内寸：約１４０ｍｍ×２４０ｍｍ）を準備した。本外包装材はガスバリア性（２５℃、６０％相対湿度（ＲＨ）における酸素透過量が約０．５ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・１０１３．２５ｈＰａ以下（ＪＩＳＫ７１２６の規定に準拠した差圧法にて測定））を有する。上記（３）で作製した、５（ｗ／ｖ）％のｒＨＳＡ製剤５０ｍＬを収容したプラスチック容器を、当該外包装材にて包装し、さらにその際、プラスチック容器と外包装材との間に脱酸素剤（エージレスＺＨ１００、三菱ガス化学株式会社製）を収容した。
その後、６０℃で３０分間の加熱滅菌を施し、本発明のプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を得た。
比較例１
外包装材でプラスチック容器を包装しなかったこと以外は、実施例１と同様にした。
〔評価試験〕
実施例１、比較例１にて作製したプラスチック容器入り組換えヒト血清アルブミン製剤を、５０℃、相対湿度７５％条件下に６０日間放置した後、以下の３項目について評価した。
・外観
目視により外観を評価した。
・ｒＨＳＡ重合体の含有量
各ｒＨＳＡ製剤について、上述のＨＰＬＣゲル濾過法により測定し、二量体以上の高分子量画分を重合体として算出した。
・アンモニア含有量
各ｒＨＳＡ製剤の５倍希釈液を限外ろ過膜（分子量３万カット、アミコン社製セントリコン−３０）で限外濾過し、得られた濾液を試料溶液とした。試験は、日局・一般試験法のアンモニア試験法により行い、インドフェノール（λｍａｘ、６４０ｎｍ）の吸光度測定により定量した。
結果を表１に示す。なお、表中のＮＤは、定量限界（１．６８μｇ／ｍＬ）以下であり、定量できなかったことを意味する。

結果、脱酸素剤とともにガスバリア性の外包装材で包装することにより外観の変化、アンモニア含有量および重合体含有量の増加を抑制することができた。すなわち、この効果は酸素暴露の影響を抑えたことによるものであると推察された。
また、ｒＨＳＡ製剤ではなく、血漿由来ＨＳＡを使用した以外は、上記実施例１、比較例１とそれぞれ同様のサンプルを作製し、これらについて同様の評価試験を行ったところ、外装材の有無は、重合体含量に影響しなかった。
産業上の利用分野
本発明によれば、外包装材として、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含む層を有するガスバリア性、特に低酸素透過性、のプラスチック製のものを使用し、さらに脱酸素剤と組み合わせることにより、遺伝子組換え技術を用いて調製した組換えヒト血清アルブミン製剤をプラスチック容器に収容して製剤化しても組換えヒト血清アルブミン製剤の重合体形成、ならびにアンモニア含有量の増加を従来よりも格段に抑制することができ、長期間安定に保存することが可能となった。したがって、より利便性に優れた組換えヒト血清アルブミン製剤を医療の場に提供することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００３−１９５１９１を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含される。EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
[Example 1]
(1) Preparation of rHSA Acquisition of rHSA-producing yeast Pichia pastoris and its cultivation were performed according to the method described in JP-A-5-317079. In order to recover and purify rHSA from the obtained culture broth, according to the method described in JP-A-8-116985, heat treatment of the culture broth → adsorbent particle treatment (stream line SP treatment) → heat treatment → Hydrophobic chromatographic treatment → Anion exchanger treatment → Chelate resin treatment → Boric acid / salt treatment.
The prepared rHSA was adjusted to a 5 (w / v)% solution, and sodium caprylate and acetyltryptophan sodium were added to each of 66.5 mg and 107.3 mg per 100 mL of the solution, respectively, and then a 0.22 μm filter (Millipore) RHSA can be used as an injection. The composition had a sodium chloride content of 3.7 mg / mL or less, a pH of 6.4 to 7.4, and an osmotic pressure ratio of about 1 (ratio to physiological saline).
(2) Properties of purified rHSA (containing composition) [HPLC analysis]
rHSA was analyzed by HPLC gel filtration. The gel filtration analysis was performed under the following conditions.
(A) Column: TSK gel G3000SW (manufactured by Tosoh Corporation)
(B) Developing solution: 0.1 M KH ₂ PO ₄ /0.3 M NaCl buffer (c) Detection: Absorbance at a wavelength of 280 nm The main peak in the purified rHSA-containing composition corresponds to the monomer of rHSA.
[Yeast-derived component analysis]
Rabbits are immunized with a crude supernatant of non-HSA-producing yeast cultured in the same manner as in this method, and the resulting antiserum is used to detect yeast-derived components present in the purified rHSA-containing composition. It was. The measurement was performed by enzyme immunoassay (EIA method). The amount of yeast-derived components was less than 1 ng per 250 mg of rHSA.
[Molecular weight]
The molecular weight was measured by the aforementioned HPLC gel filtration method. The molecular weight of rHSA in the purified rHSA-containing composition of the present invention was about 67,000.
[Isoelectric point]
For the isoelectric point, a thin-layer polyacrylamide gel was used, and the method of Allen et al. [J. Chromatog. , 146, p1 (1978)]. The isoelectric point of rHSA in the purified rHSA-containing composition of the present invention was about 4.9.
[Coloring degree]
The degree of coloring was determined by measuring the absorbance at 280 nm, 350 nm, 450 nm, and 500 nm, and calculating A ₃₅₀ / A ₂₈₀ , A ₄₅₀ / A ₂₈₀ , and A ₅₀₀ / A ₂₈₀ . The coloring degree of the purified rHSA-containing composition of the present invention was about 0.015 at A ₃₅₀ / A ₂₈₀ , about 0.01 at A ₄₅₀ / A ₂₈₀ , and about 0.002 at A ₅₀₀ / A ₂₈₀ .
[Measurement of pyrogen]
The amount of pyrogen was less than 0.5 EU per 250 mg of rHSA as measured using Seikagaku's endospecies.
(3) Molding of plastic container and injection of rHSA preparation Low density polyethylene (DEFD-1137, manufactured by Nihon Unicar Co., Ltd.) having a density of 0.906 g / cm ³ was melted and extruded into a cylindrical shape from an extrusion nozzle at an extrusion temperature of 190 ° C. A cylindrical molded body 21 (parison) with one end closed was produced. The parison 21 was lowered between the split molds (FIG. 2A), and the main body mold 22 was clamped (FIG. 2B). Next, the mandrel 23 was pushed in from the upper opening end of the parison 21, and pressurized air was blown at a pressure of 3 kg / cm ² to form a container body 24. The temperature of the main body mold 22 at this time was 50 ° C. (FIG. 2C). Thereafter, the tip 25 of the chemical solution injection nozzle 25 was lowered to the bottom of the container body 24, and 250 mL of a 5 (w / v)% rHSA aqueous solution was injected into the container body 24 (FIG. 2 (d)). Next, the chemical injection nozzle 25 is raised, the head die 26 is clamped at the opening end inner surface temperature of 40 ° C., and the container head 6 is formed by vacuum forming from the suction hole 27 and the container opening end 4 is Sealed (FIG. 2 (e), FIG. 2 (f)).
(4) Packaging with an outer packaging material The first layer (innermost layer) consists of three layers of 50 μm linear low density polyethylene, 15 μm of second layer ethylene-vinyl alcohol copolymer, and 15 μm of third layer (outermost layer) nylon. An outer packaging material (manufactured by Fujimori Kogyo Co., Ltd., outer dimension: about 160 mm × 260 mm (seal width: 10 mm), inner dimension: about 140 mm × 240 mm) was prepared. This outer packaging material has a gas barrier property (the oxygen permeation amount at 25 ° C., 60% relative humidity (RH) is about 0.5 cm ³ / m ² · 24 hr · 1013.25 hPa or less (in accordance with the differential pressure method in accordance with the provisions of JIS K 7126) Measured)). The plastic container containing 50 mL of the 5 (w / v)% rHSA preparation prepared in (3) above is packaged with the outer packaging material, and then removed between the plastic container and the outer packaging material. An oxygen agent (Ageless ZH100, manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Inc.) was accommodated.
Thereafter, heat sterilization was performed at 60 ° C. for 30 minutes to obtain a recombinant human serum albumin preparation in a plastic container of the present invention.
Comparative Example 1
Example 1 was repeated except that the plastic container was not packaged with the outer packaging material.
〔Evaluation test〕
The recombinant human serum albumin preparation in plastic containers prepared in Example 1 and Comparative Example 1 was allowed to stand for 60 days under conditions of 50 ° C. and 75% relative humidity, and then evaluated for the following three items.
-Appearance Appearance was evaluated visually.
-Content of rHSA polymer About each rHSA formulation, it measured by the above-mentioned HPLC gel filtration method, and calculated the high molecular weight fraction more than a dimer as a polymer.
-Ammonia content The 5-fold diluted solution of each rHSA preparation was subjected to ultrafiltration with an ultrafiltration membrane (molecular weight 30,000 cut, Amicon Centricon-30), and the obtained filtrate was used as a sample solution. The test was carried out by the ammonia test method of the Japanese Pharmacopoeia / general test method and quantified by measuring the absorbance of indophenol (λmax, 640 nm).
The results are shown in Table 1. In addition, ND in a table | surface is below a limit of quantification (1.68 microgram / mL), and means that it could not quantify.

As a result, by packaging with a gas barrier outer packaging material together with the oxygen scavenger, it was possible to suppress changes in appearance, ammonia content, and polymer content. In other words, this effect was presumed to be due to the suppression of oxygen exposure.
Further, except that plasma-derived HSA was used instead of the rHSA preparation, samples similar to those in Example 1 and Comparative Example 1 were prepared, and the same evaluation test was performed on these samples. It did not affect the polymer content.
INDUSTRIAL APPLICATION FIELD According to the present invention, a plastic material having gas barrier properties, particularly low oxygen permeability, having a layer containing an ethylene-vinyl alcohol copolymer is used as an outer packaging material. In combination with the recombinant human serum albumin preparation prepared using genetic recombination technology, the polymer formation of the recombinant human serum albumin preparation and the increase in the ammonia content have been achieved even if it is formulated in a plastic container. It was possible to store it stably for a long time. Therefore, it is possible to provide a recombinant human serum albumin preparation that is more convenient for medical use.
This application is based on Japanese Patent Application No. 2003-195191 filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

Claims

Recombinant human serum in a plastic container comprising a plastic container for storing a liquid preparation of recombinant human serum albumin, and a gas barrier outer packaging material having at least a layer containing an ethylene-vinyl alcohol copolymer and packaging the plastic container Albumin preparation.

The preparation according to claim 1, wherein an oxygen scavenger is accommodated between the plastic container and the outer packaging material.

The preparation according to claim 1 or 2, wherein a thickness of the outer packaging material containing the ethylene-vinyl alcohol copolymer is 5 to 50 µm.

The preparation according to any one of claims 1 to 3, wherein the outer packaging material has a thickness of 5 to 1000 µm.

The formulation according to any one of claims 1 to 4, wherein the outer wrapping material has an oxygen permeation amount of less than 50 cm ³ / m ² /day·1013.25 hPa at a temperature of 25 ° C and a relative humidity of 60%.

The outer packaging material is a multilayer structure having an innermost layer formed of polyethylene, an intermediate layer formed of an ethylene-vinyl alcohol copolymer, and an outermost layer formed of nylon. The formulation in any one of.

The preparation according to any one of claims 1 to 6, wherein the recombinant human serum albumin concentration in the liquid preparation of recombinant human serum albumin is 1 to 500 mg / mL.

The preparation according to claim 1, wherein the material of the plastic container is polyolefin, polyvinyl chloride, or ethylene-vinyl acetate copolymer.

The preparation according to claim 1, wherein the liquid preparation of recombinant human serum albumin is hermetically sealed in a plastic container.

After the plastic container is molded in the mold, the liquid preparation of recombinant human serum albumin is injected into the plastic container while the plastic container is still in the mold, and the opening is the mold. The preparation according to claim 9, which is pressed and sealed by a mold.

The preparation according to any one of claims 1 to 10, wherein the content of the dimer or higher recombinant human serum albumin polymer in the liquid preparation of recombinant human serum albumin is 3.8% or less.

The preparation according to any one of claims 1 to 11, wherein the ammonia content in the liquid preparation of recombinant human serum albumin is 4.60 µg / mL or less.