JPWO2005001090A1

JPWO2005001090A1 - Methods and compositions for improving nucleic acid introduction efficiency of cells

Info

Publication number: JPWO2005001090A1
Application number: JP2005511153A
Authority: JP
Inventors: 三宅　正人; 正人三宅; 英一郎内村; 智啓吉川; 三宅　淳; 淳三宅
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2006-07-27
Also published as: WO2005001090A1

Abstract

本発明は、支持体上に固定された状態では、核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することが難しい細胞に、そのような物質を導入する（特に、トランスフェクションする）際に、その導入を可能とするかまたは導入効率を改善することができる方法を開発することを課題とする。上記課題は、細胞接着分子（例えば、コラーゲンＩＶ型）と、遺伝子導入試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）とを組み合わせて細胞に適用することによって解決され、予測されていたよりも高い核酸導入効率が達成された。また、核酸導入後の細胞は、分化誘導される能力を有していることが明らかになった。The present invention enables introduction of such a substance into a cell in which it is difficult to introduce a nucleic acid (for example, DNA) when it is fixed on a support (especially, transfection). Or to develop a method capable of improving the introduction efficiency. The above problem has been solved by applying a cell adhesion molecule (for example, collagen type IV) and a gene transfer reagent (for example, Lipofectamine) to cells, and higher nucleic acid transfer efficiency than expected has been achieved. . It was also revealed that the cells after introduction of nucleic acid have the ability to induce differentiation.

Description

本発明は、ＤＮＡのような核酸を導入する技術および細胞の分化誘導に関する。より詳細には、細胞に核酸を導入する効率を上昇させる技術および核酸を導入した後細胞を分化誘導させる技術に関する。 The present invention relates to a technique for introducing a nucleic acid such as DNA and cell differentiation induction. More specifically, the present invention relates to a technique for increasing the efficiency of introducing a nucleic acid into a cell and a technique for inducing differentiation of a cell after introducing the nucleic acid.

タンパク質の細胞への導入、トランスフェクション、形質転換、形質導入などの遺伝子導入技術を含む標的物質の細胞への導入は、細胞生物学、遺伝子工学、分子生物学など広い分野において広く使用されている。
トランスフェクションは、動物細胞などの細胞において一過的に遺伝子を発現させ、その影響を観察するためなどに利用される技術であり、ポストゲノム時代を迎えた現在、そのゲノムがコードする遺伝子の機能を解明するために頻繁に利用される技術となっている。
トランスフェクションを達成するために種々の技術が開発されており、そのために利用される薬剤が種々開発されている。そのような技術として、カチオオン性の物質であるカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などを利用する技術があり、広く使用されている。
しかし、従来の薬剤を使用するのみでは、トランスフェクション効率が十分ではないことが頻繁に起こっており、特に、初代培養細胞、神経細胞などは従来のトランスフェクション方法では、充分に導入が起こらず、充分な研究がなされていないのが現状である。従って、そのような薬剤またはシステムに対する需要は多大に存在する。また、マイクロタイタープレート、アレイなどの固相上での標的物質の導入（例えば、トランスフェクション）を効率的に行うための技術の開発に対する需要はますます高まるばかりである。特に、支持体へ細胞を固定した上で物質（例えば、核酸）を導入する技術への需要は多い。
細胞を固相上に固定する技術もまた、かなり以前から開発されており、現在では、かなりの細胞が、固相上に固定されることができるようになっている。しかし、固相上に細胞を固定した上で、核酸などの外来物質をその細胞へと導入する試みはほとんどなされておらず、その導入効率の改善についてはまったく取り組まれていない。
このように、当該分野において、すべての系および細胞において適用可能な、トランスフェクション系の開発が望まれている。そのようなトランスフェクション系の開発は、例えば、マイクロタイタープレート、アレイなどを用いた大規模ハイスループットアッセイにおいて、種々の細胞および実験系に適用することへの応用が期待されることから、その需要は年々高まるばかりである。
細胞外マトリクス（ＥＣＭともいう）に細胞を接着することが、正常な細胞機能（増殖、分化および生存）の維持に重要な役割を果たしていることが広く認知されている（ＣｉａｎｃｏｔｔｉＦＧ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５，１０２８−１０３２，１９９９）。細胞外マトリクスタンパク質への限局的かつ繊維性の接着が培養細胞において観察されているが、細胞培養の研究は、インビボでの細胞外マトリクスの架橋相互作用の働きを完全に解明するにはいたっていない。
接着性の哺乳動物細胞は、細胞外マトリクスタンパク質において細胞表面上のインテグリンレセプターを介して特定の配列を認識し、細胞株に依存した様式でレセプターに連結したシグナル伝達経路を介して応答することが知られる。細胞培養の場合、これらの応答は、細胞形態の変化（例えば、アクチン線維の伸長および細胞プレーン化）を引き起こすだけなく、接着に関与するこれら以外の変化をも引き起こすようである。ケラチノサイトを用いた研究（ＪｏｎｅｓＪＭｅｔａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２８０、２４４−２５４、２００２）では、創傷治癒に関与する細胞移動において細胞外マトリクスが影響を与えることが報告されている。ここでは、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶがプラスミノゲンアクチベーター系（例えば、セリンプロテアーゼおよび関連分子）の活性化を引き起こし、他方で、コラーゲンＩ型、ＩＩＩ型などは活性化を抑制することが報告されている。ＤｉＭｉｌｌａｅｔａｌ．（ＤｉＭｉｌｌａｅｔａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２２，７２９−７３７，１９９３）は、平滑筋細胞では、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶの表面密度に依存して細胞移動速度が決定されることを見出している。接着アッセイ（ＴｏｍａｓｅｌｌｉＫＪ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５，２３４７−２３５８，１９８７）では、ＰＣ１２細胞がラミニンおよびコラーゲンＩＶ型を用いた場合に広がることが見出されているが、フィブロネクチンでは広がることは観察されなかった。
しかし、これら細胞接着分子の外来物質の取り込みに対する効果についてはこれまで試験されておらず、その働きは未知のままである。
また、ＰＣ１２細胞を含む神経系の細胞のような固相上で核酸を導入することが困難な細胞が存在する。これまでは、このような細胞に核酸を導入することは困難であり、そのような細胞を形質転換するために核酸を導入する必要性が当該分野において存在する。
さらに、細胞に核酸を導入した（例えば、固相上で）後、分化誘導をさせることが必要な状況がしばしば存在する。しかし、そのような状況において、核酸を導入した後に分化誘導することができる技術は存在しない。そのような細胞の分化誘導技術に対する必要性が当該分野において存在する。
以上にかんがみて、本発明は、支持体上に固定された状態では、ＤＮＡのような核酸を導入することが難しい細胞に、そのような物質を導入する（特に、トランスフェクション）際に、その導入を可能とするかまたは導入効率を改善することができる方法を開発することを課題とする。本発明はまた、上記のような細胞に核酸を導入した後に、さらに、分化誘導をかけることができる技術を開発することを課題とする。
発明の要旨
上記課題は、細胞接着分子と、遺伝子導入試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）とを組み合わせて細胞に適用することによって、予測されていたよりも高い核酸導入効率が達成されたという予想外の効果を発見したことによって解決された。
本発明では、本発明者らは、細胞接着分子（細胞外マトリクスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニンなど）を含む）がトランスフェクション効率を含む核酸導入効率に対して予想外に効果があったことを見出した。これらの核酸導入効率の上昇は、予想外に固相上においても見出された。特に、局所トランスフェクション細胞アレイを用いた系において、神経細胞、初代培養細胞を含む任意の細胞において効果があることを見出した。本発明者らは、これにより、細胞接着分子（例えば、コラーゲンＩＶ型など）に基づいて効率よく核酸を導入する技術が達成されることを予想外に発見した。特に、神経細胞での核酸導入が可能になったことにより、神経細胞の種々の解析が可能になり、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、神経再生、神経幹細胞分化、神経発達などの解析も可能となった。また、初代培養細胞の遺伝子操作も容易になったことによって、より生体に近い環境における遺伝子操作の影響も分析できるようになった。
本発明はさらに、細胞接着分子と、遺伝子導入試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）とを組み合わせて（例えば、固相上で）細胞に適用することによって、その細胞が適切な刺激（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）のような細胞増殖因子の付加）により分化誘導することができることを見出したことによって上記課題を解決した。
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）細胞への核酸の導入効率を改善するための組成物であって、
Ａ）細胞接着分子；および
Ｂ）遺伝子導入試薬、
を含む、組成物。
（２）上記細胞接着分子は、細胞外マトリクスを含む、項目１に記載の組成物。
（３）上記細胞接着分子は、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスを含む、項目１に記載の組成物。
（４）上記細胞接着分子は、繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを含む、項目１に記載の組成物。
（５）上記細胞接着分子は、繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを含む、項目１に記載の組成物。
（６）上記細胞接着分子は、コラーゲンＩ型またはＩＶ型を含む、項目１に記載の組成物。
（７）上記細胞接着分子は、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を含む、項目１に記載の組成物。
（８）上記遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１つの試薬を含む、項目１に記載の組成物。
（９）さらに、導入が企図される核酸を含む、項目１に記載の組成物。
（１０）上記核酸はＤＮＡである、項目１に記載の組成物。
（１１）上記核酸は、遺伝子をコードする配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（１２）上記組成物は固体である、項目１に記載の組成物。
（１３）上記組成物は液体である、項目１に記載の組成物。
（１４）上記細胞接着分子は多量体形態である、項目１に記載の組成物。
（１５）上記細胞接着分子は、三次元構造をとる、項目１に記載の組成物。
（１６）上記細胞は、固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、項目１に記載の組成物。
（１７）上記細胞は、神経系の細胞である、項目１に記載の組成物。
（１８）上記細胞は、神経系の細胞であり、上記細胞接着分子はコラーゲンを含む、項目１に記載の組成物。
（１９）上記核酸の導入は、上記細胞が固相上に配置された状態で行われる、項目１に記載の組成物。
（２０）上記細胞は、初代培養細胞を包含する、項目１に記載の組成物。
（２１）上記細胞接着分子は、５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（２２）上記細胞は、さらに、分化誘導される、項目１に記載の組成物。
（２３）上記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、項目１に記載の組成物。
ここで、分化誘導因子は、上記組成物とは別個に含まれていてもよい。分化誘導因子が液性因子である場合は、特に、別個に含まれることが好ましい。
（２４）細胞の核酸導入効率を改善するためのデバイスであって、
Ａ）細胞接着分子；および
Ｂ）遺伝子導入試薬、
を含む、組成物が支持体に固定される、デバイス。
（２５）上記細胞接着分子は、細胞外マトリクスを含む、項目２４に記載のデバイス。
（２６）上記細胞接着分子は、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスを含む、項目２４に記載のデバイス。
（２７）上記細胞接着分子は、繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを含む、項目２４に記載のデバイス。
（２８）上記細胞接着分子は、繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを含む、項目２４に記載のデバイス。
（２９）上記細胞接着分子は、コラーゲンＩ型またはＩＶ型を含む、項目２４に記載のデバイス。
（３０）上記細胞接着分子は、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を含む、項目２４に記載のデバイス。
（３１）上記遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１つの試薬を含む、項目２４に記載のデバイス。
（３２）さらに、導入が意図される核酸を含む、項目２４に記載のデバイス。
（３３）上記核酸はＤＮＡである、項目２４に記載のデバイス。
（３４）上記核酸は遺伝子をコードする配列を含む、項目３３に記載のデバイス。
（３５）上記支持体は固体である、項目２４に記載のデバイス。
（３６）上記支持体は液体である、項目２４に記載のデバイス。
（３７）上記細胞接着分子は多量体形態である、項目２４に記載のデバイス。
（３８）上記細胞接着分子は、三次元構造をとる、項目２４に記載のデバイス。
（３９）上記細胞は、固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、項目２４に記載のデバイス。
（４０）上記細胞は、神経系の細胞である、項目２４に記載のデバイス。
（４１）上記細胞は、神経系の細胞であり、上記細胞接着分子はコラーゲンを含む、項目２４に記載のデバイス。
（４２）上記核酸の導入は、上記細胞が固相上に配置された状態で行われる、項目２４に記載のデバイス。
（４３）上記細胞は、初代培養細胞を包含する、項目２４に記載のデバイス。
（４４）上記細胞接着分子は、５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目２４に記載のデバイス。
（４５）上記細胞接着分子は、上記支持体にコーティングされる、項目２４に記載のデバイス。
（４６）上記細胞接着分子は、多層で上記支持体にコーティングされる、項目２４に記載のデバイス。
（４７）上記核酸は、アレイ状で上記支持体に配置される、項目３２に記載のデバイス。
（４８）上記細胞は、さらに、分化誘導される、項目２４に記載のデバイス。
（４９）上記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、項目２４に記載のデバイス。
（５０）細胞の核酸導入効率を上昇させる方法であって、
Ａ）細胞の核酸導入効率を改善するための組成物であって、
ａ）細胞接着分子；および
ｂ）遺伝子導入試薬、
を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程；ならびに
Ｂ）核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程、
を包含する、方法。
（５１）上記細胞接着分子は、細胞外マトリクスを含む、項目５０に記載の方法。
（５２）上記細胞接着分子は、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスを含む、項目５０に記載の方法。
（５３）上記細胞接着分子は、繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを含む、項目５０に記載の方法。
（５４）上記細胞接着分子は、繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを含む、項目５０に記載の方法。
（５５）上記細胞接着分子は、コラーゲンＩ型またはＩＶ型を含む、項目５０に記載の方法。
（５６）上記細胞接着分子は、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を含む、項目５０に記載の方法。
（５７）上記遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１つの試薬を含む、項目５０に記載の方法。
（５８）上記組成物は固体である、項目５０に記載の方法。
（５９）上記組成物は液体である、項目５０に記載の方法。
（６０）上記細胞接着分子は多量体形態である、項目５０に記載の方法。
（６１）上記細胞接着分子は、三次元構造をとる、項目５０に記載の方法。
（６２）上記細胞は、固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、項目５０に記載の方法。
（６３）上記細胞は、神経系の細胞である、項目５０に記載の方法。
（６４）上記細胞は、神経系の細胞であり、上記細胞接着分子はコラーゲンを含む、項目５０に記載の方法。
（６５）上記核酸の導入は、上記細胞が固相上に配置された状態で行われる、項目５０に記載の方法。
（６６）上記細胞は、初代培養細胞を包含する、項目５０に記載の方法。
（６７）上記核酸はＤＮＡを含む、項目５０に記載の方法。
（６８）上記核酸は、遺伝子をコードする配列を含む、項目５０に記載の方法。
（６９）上記組成物および上記核酸は、支持体に固定される、項目５０に記載の方法。
（７０）上記支持体は、固体である、項目６９に記載の方法。
（７１）上記支持体は、液体である、項目６９に記載の方法。
（７２）上記組成物および上記核酸を上記支持体に固定する工程をさらに包含する、項目６９に記載の方法。
（７３）上記固定は、インクジェット方式でされる、項目６９に記載の方法。
（７４）上記細胞接着分子は、上記支持体にコーティングされる、項目６９に記載の方法。
（７５）上記細胞接着分子は、多層で上記支持体にコーティングされる、項目６９に記載の方法。
（７６）上記核酸は、アレイ状で上記支持体に配置される、項目６９に記載の方法。
（７７）上記細胞を分化誘導する工程をさらに包含する、項目５０に記載の方法。
（７８）上記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、項目５０に記載の方法。
（７９）細胞に核酸を導入するためのキットであって、
Ａ）
ａ）細胞接着分子；および
ｂ）遺伝子導入試薬、
を含む、組成物；ならびに
Ｂ）上記組成物と、核酸とともに使用する方法を記載した指示書、
とを備える、キット。
（８０）分化誘導因子をさらに備える、項目７９に記載のキット。
（８１）ａ）細胞接着分子；およびｂ）遺伝子導入試薬、を含む、組成物の、細胞に遺伝子導入するための使用。
（８２）上記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、項目８１に記載の使用。
（８３）固相上で細胞に核酸を導入するための組成物であって、上記細胞は、核酸導入後も分化誘導する能力が保持される、組成物であって、
Ａ）細胞接着分子；および
Ｂ）遺伝子導入試薬、
を含む、組成物。
（８４）上記組成物は、分化誘導因子を含む、項目８３に記載の組成物。
（８５）上記分化誘導因子は、細胞増殖因子を含む、項目８４に記載の組成物。
（８６）上記細胞は神経であり、そして上記分化誘導因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む、項目８４に記載の組成物。
（８７）固相上で細胞に核酸を導入するための方法であって、
Ａ）
ａ）細胞接着分子；および
ｂ）遺伝子導入試薬、
を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程；ならびに
Ｂ）核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程、
を包含し、
上記細胞は、上記核酸導入後も分化誘導する能力が保持される、
方法。
（８８）上記組成物は、分化誘導因子を含む、項目８７に記載の方法。
（８９）上記分化誘導因子は、細胞増殖因子を含む、項目８８に記載の方法。
（９０）上記細胞は神経であり、そして上記分化誘導因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む、項目８８に記載の方法。
（９１）上記細胞を分化誘導させる工程をさらに包含する、項目８７に記載の方法。
（９２）固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、上記細胞を分化誘導させるための組成物であって、
Ａ）細胞接着分子；
Ｂ）遺伝子導入試薬；および
Ｃ）分化誘導因子
を含む、組成物。
（９３）固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、上記細胞を分化誘導させるためのキットであって、
Ａ）
ａ）細胞接着分子；および
ｂ）遺伝子導入試薬を含む、組成物；ならびに
Ｂ）分化誘導因子
を備える、キット。
（９４）固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、上記細胞を分化誘導させる方法であって、
Ａ）
ａ）細胞接着分子；および
ｂ）遺伝子導入試薬を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程；ならびに
Ｂ）核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程；および
Ｃ）上記細胞を分化誘導する工程、
を包含する、方法。
本発明の上述の目的，その他の目的，特徴および利点は、図面を参照して行う以下の発明の実施の形態の詳細な説明から一層明らかとなる。
本発明により、固相でも液相でも実施することができる、トランスフェクションの効率上昇が達成された。このようなトランスフェクション効率上昇試薬は、特に固相で細胞を固定しつつトランスフェクション効率を上昇させるために有用である。
本発明はまた、核酸を導入した後に、分化誘導を可能にする技術を提供する。本発明により、任意の核酸を導入し、任意の分化誘導を行うといった自在な試験設定を可能にする。この技術は、固相上で可能なことから、細胞アレイで必要なかなりの条件を任意に設定することができるという効果を奏する。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。Introduction of proteins into cells, including introduction of proteins into cells, transfection, transformation, and transduction, is widely used in a wide range of fields such as cell biology, genetic engineering, and molecular biology. .
Transfection is a technique used to transiently express a gene in a cell such as an animal cell and observe its effect. Currently, in the post-genome era, the function of the gene encoded by the genome It has become a frequently used technique for elucidating
Various techniques have been developed to achieve transfection, and various drugs used for this purpose have been developed. As such a technique, there is a technique using a cationic polymer, a cationic lipid, or the like, which is a cationic substance, and it is widely used.
However, transfection efficiency is often not sufficient only by using conventional drugs, and in particular, primary culture cells, nerve cells, etc. are not sufficiently introduced by conventional transfection methods, At present, there is not enough research. Therefore, there is a great demand for such drugs or systems. In addition, there is an increasing demand for the development of a technique for efficiently introducing a target substance (for example, transfection) on a solid phase such as a microtiter plate or an array. In particular, there is a great demand for a technique for introducing a substance (for example, a nucleic acid) after fixing cells to a support.
Techniques for immobilizing cells on a solid phase have also been developed for quite some time, and now a significant number of cells can be immobilized on the solid phase. However, few attempts have been made to introduce foreign substances such as nucleic acids into the cells after fixing the cells on the solid phase, and no attempt has been made to improve the introduction efficiency.
Thus, there is a need in the art for the development of transfection systems that can be applied in all systems and cells. The development of such transfection systems is expected to be applied to various cells and experimental systems in large-scale high-throughput assays using, for example, microtiter plates and arrays. Is growing year by year.
It is widely recognized that cell attachment to an extracellular matrix (also referred to as ECM) plays an important role in maintaining normal cell function (proliferation, differentiation and survival) (Ciancotti FG, et al. Science 285, 1028-1032, 1999). Although localized and fibrous adhesion to extracellular matrix proteins has been observed in cultured cells, cell culture studies have not fully elucidated the role of extracellular matrix cross-linking interactions in vivo. .
Adherent mammalian cells recognize specific sequences via integrin receptors on the cell surface in extracellular matrix proteins and can respond via signal transduction pathways linked to the receptors in a cell line dependent manner. known. In the case of cell culture, these responses appear not only to cause changes in cell morphology (eg, actin fiber elongation and cell plaining), but also to other changes involved in adhesion. Studies using keratinocytes (Jones JM et al. Exp. Cell. Res. 280, 244-254, 2002) have reported that the extracellular matrix affects cell migration involved in wound healing. Here, it is reported that fibronectin and collagen IV cause activation of the plasminogen activator system (for example, serine protease and related molecules), while collagen type I, type III and the like suppress activation. DiMilla et al. (DiMilla et al. J. Cell. Biol. 122, 729-737, 1993) have found that in smooth muscle cells, the cell migration rate is determined depending on the surface density of fibronectin and collagen IV. Adhesion assays (Tomaselli KJ., J. Cell. Biol. 105, 2347-2358, 1987) have found that PC12 cells spread when using laminin and collagen type IV, but spread with fibronectin. Was not observed.
However, the effects of these cell adhesion molecules on the uptake of foreign substances have not been tested so far, and their function remains unknown.
In addition, there are cells that are difficult to introduce nucleic acids on a solid phase, such as cells of the nervous system including PC12 cells. Until now, it has been difficult to introduce nucleic acids into such cells, and there is a need in the art to introduce nucleic acids to transform such cells.
Furthermore, there are often situations where it is necessary to induce differentiation after introducing a nucleic acid into a cell (eg, on a solid phase). However, in such a situation, there is no technique that can induce differentiation after introducing a nucleic acid. There is a need in the art for such cell differentiation induction techniques.
In view of the above, when the present invention introduces such a substance into a cell in which it is difficult to introduce a nucleic acid such as DNA in a state of being fixed on a support (particularly, transfection), It is an object to develop a method capable of introducing or improving introduction efficiency. Another object of the present invention is to develop a technique capable of further inducing differentiation after introducing a nucleic acid into the above-described cells.
SUMMARY OF THE INVENTION The above problem is that an unexpected effect that nucleic acid introduction efficiency higher than expected was achieved by combining a cell adhesion molecule and a gene introduction reagent (for example, Lipofectamine) to a cell. It was solved by discovering.
In the present invention, the inventors anticipate that cell adhesion molecules (including extracellular matrix proteins (eg, fibronectin, collagen type I, collagen type IV, laminin, etc.) are expected for nucleic acid transfer efficiency including transfection efficiency. I found out there was an effect. These increases in nucleic acid introduction efficiency were also unexpectedly found on the solid phase. In particular, the present invention has been found to be effective in any cells including nerve cells and primary cultured cells in a system using a locally transfected cell array. The present inventors have unexpectedly discovered that a technique for efficiently introducing a nucleic acid based on a cell adhesion molecule (for example, collagen type IV) can be achieved. In particular, the introduction of nucleic acid into nerve cells enables various analysis of nerve cells, and allows analysis of Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, nerve regeneration, neural stem cell differentiation, nerve development, etc. became. In addition, since the genetic manipulation of primary cultured cells has become easier, the influence of genetic manipulation in an environment closer to the living body can be analyzed.
The present invention further provides that a cell adhesion molecule and a gene transfer reagent (eg, Lipofectamine) are applied to the cell in combination (eg, on a solid phase) to cause the cell to undergo appropriate stimulation (eg, nerve growth factor ( The above problem has been solved by finding that differentiation can be induced by addition of a cell growth factor such as NGF).
Accordingly, the present invention provides the following.
(1) A composition for improving the efficiency of introducing a nucleic acid into a cell,
A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent,
A composition comprising:
(2) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix.
(3) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin.
(4) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises fiber-forming collagen or basement membrane collagen.
(5) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises fiber-forming collagen and basement membrane collagen.
(6) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or type IV.
(7) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV.
(8) The composition according to item 1, wherein the gene introduction reagent contains at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent, and calcium phosphate.
(9) The composition according to item 1, further comprising a nucleic acid to be introduced.
(10) The composition according to item 1, wherein the nucleic acid is DNA.
(11) The composition according to item 10, wherein the nucleic acid comprises a sequence encoding a gene.
(12) The composition according to item 1, wherein the composition is solid.
(13) The composition according to item 1, wherein the composition is a liquid.
(14) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form.
(15) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.
(16) The composition according to item 1, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.
(17) The composition according to item 1, wherein the cell is a nervous system cell.
(18) The composition according to item 1, wherein the cell is a nervous system cell and the cell adhesion molecule comprises collagen.
(19) The composition according to item 1, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase.
(20) The composition according to item 1, wherein the cells include primary cultured cells.
(21) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 μg / ml to 100 μg / ml.
(22) The composition according to item 1, wherein the cell is further induced to differentiate.
(23) The composition according to item 1, wherein the composition further comprises a differentiation-inducing factor.
Here, the differentiation-inducing factor may be contained separately from the composition. In particular, when the differentiation-inducing factor is a humoral factor, it is preferably included separately.
(24) A device for improving nucleic acid introduction efficiency of a cell,
A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent,
A device wherein the composition is secured to a support.
(25) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix.
(26) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin.
(27) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule comprises fiber-forming collagen or basement membrane collagen.
(28) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule comprises fiber-forming collagen and basement membrane collagen.
(29) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or type IV.
(30) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV.
(31) The device according to item 24, wherein the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent, and calcium phosphate.
(32) The device according to item 24, further comprising a nucleic acid intended to be introduced.
(33) A device according to item 24, wherein the nucleic acid is DNA.
(34) A device according to item 33, wherein the nucleic acid comprises a gene-encoding sequence.
(35) A device according to item 24, wherein the support is a solid.
(36) A device according to item 24, wherein the support is a liquid.
(37) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form.
(38) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.
(39) A device according to item 24, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.
(40) A device according to item 24, wherein the cell is a nervous system cell.
(41) A device according to item 24, wherein the cell is a nervous system cell and the cell adhesion molecule contains collagen.
(42) A device according to item 24, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase.
(43) A device according to item 24, wherein the cell includes a primary cultured cell.
(44) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 μg / ml to 100 μg / ml.
(45) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support.
(46) A device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers.
(47) A device according to item 32, wherein the nucleic acids are arranged in an array on the support.
(48) A device according to item 24, wherein the cell is further induced to differentiate.
(49) A device according to item 24, wherein the composition further comprises a differentiation-inducing factor.
(50) A method for increasing nucleic acid introduction efficiency of a cell,
A) A composition for improving nucleic acid introduction efficiency of a cell,
a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent,
Providing the cell with a nucleic acid intended to be introduced; and B) subjecting the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced;
Including the method.
(51) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix.
(52) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin.
(53) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule comprises fiber-forming collagen or basement membrane collagen.
(54) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule comprises fiber-forming collagen and basement membrane collagen.
(55) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or type IV.
(56) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV.
(57) A method according to item 50, wherein the gene introduction reagent comprises at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent, and calcium phosphate.
(58) A method according to item 50, wherein the composition is solid.
(59) A method according to item 50, wherein the composition is a liquid.
(60) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form.
(61) A method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.
(62) A method according to item 50, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.
(63) A method according to item 50, wherein the cell is a nervous system cell.
(64) A method according to item 50, wherein the cell is a nervous system cell and the cell adhesion molecule contains collagen.
(65) A method according to item 50, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase.
(66) A method according to item 50, wherein the cell includes a primary cultured cell.
(67) A method according to item 50, wherein the nucleic acid comprises DNA.
(68) A method according to item 50, wherein the nucleic acid comprises a sequence encoding a gene.
(69) A method according to item 50, wherein the composition and the nucleic acid are immobilized on a support.
(70) A method according to item 69, wherein the support is a solid.
(71) A method according to item 69, wherein the support is a liquid.
(72) A method according to item 69, further comprising fixing the composition and the nucleic acid to the support.
(73) A method according to item 69, wherein the fixing is performed by an inkjet method.
(74) A method according to item 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support.
(75) A method according to item 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers.
(76) A method according to item 69, wherein the nucleic acids are arranged on the support in an array.
(77) A method according to item 50, further comprising a step of inducing differentiation of the cell.
(78) A method according to item 50, wherein the composition further comprises a differentiation-inducing factor.
(79) A kit for introducing a nucleic acid into a cell,
A)
a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent,
A composition comprising: and B) instructions describing the composition and method for use with nucleic acids,
A kit comprising:
(80) A kit according to item 79, further comprising a differentiation-inducing factor.
(81) Use of a composition for introducing a gene into a cell, comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene introduction reagent.
(82) The use according to item 81, wherein the composition further comprises a differentiation-inducing factor.
(83) A composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid,
A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent,
A composition comprising:
(84) A composition according to item 83, wherein the composition contains a differentiation-inducing factor.
(85) A composition according to item 84, wherein the differentiation-inducing factor comprises a cell growth factor.
(86) A composition according to item 84, wherein the cell is a nerve, and the differentiation-inducing factor comprises nerve growth factor (NGF).
(87) A method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase,
A)
a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent,
Providing the cell with a nucleic acid intended to be introduced; and B) subjecting the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced;
Including
The cells retain the ability to induce differentiation even after introduction of the nucleic acid,
Method.
(88) A method according to item 87, wherein the composition contains a differentiation-inducing factor.
(89) A method according to item 88, wherein the differentiation-inducing factor comprises a cell growth factor.
(90) A method according to item 88, wherein the cell is a nerve, and the differentiation-inducing factor comprises nerve growth factor (NGF).
(91) A method according to item 87, further comprising a step of inducing differentiation of the cell.
(92) A composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell,
A) cell adhesion molecules;
A composition comprising B) a gene transfer reagent; and C) a differentiation-inducing factor.
(93) A kit for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and for inducing differentiation of the cell,
A)
A kit comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a composition comprising a gene transfer reagent; and B) a differentiation inducer.
(94) A method of introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell,
A)
providing a composition with a nucleic acid intended to be introduced to the cell; and b) subjecting the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced; And C) inducing differentiation of the cell,
Including the method.
The above object, other objects, features and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of embodiments of the present invention with reference to the drawings.
By the present invention, an increase in the efficiency of transfection that can be carried out in solid phase or liquid phase has been achieved. Such a transfection efficiency increasing reagent is particularly useful for increasing the transfection efficiency while fixing the cells on a solid phase.
The present invention also provides a technique that enables differentiation induction after introduction of a nucleic acid. According to the present invention, it is possible to freely set a test in which an arbitrary nucleic acid is introduced and an arbitrary differentiation induction is performed. Since this technique is possible on a solid phase, it has an effect that a considerable condition necessary for a cell array can be arbitrarily set.
Preferred embodiments of the present invention will be shown below, but those skilled in the art can appropriately implement the embodiments and the like from the description of the present invention and well-known and common techniques in the field, and the effects and effects of the present invention can be easily achieved. It should be recognized to understand.

図１は、実施例における位相顕微鏡（図１Ａ〜Ｄ）および共焦点顕微鏡（図１Ｅ〜Ｆ）を用いて観察されたＰＣ１２細胞の形態変化。
図１Ａは、フィブロネクチンの効果を示す。
図１Ｂは、Ｉ型コラーゲンの効果を示す。
図１Ｃは、ＩＶ型コラーゲンを示す。
図１Ｄは、ラミニンの効果を示す。
図１Ｅは、フィブロネクチンの効果を示す。
図１Ｆ１は、ＩＶ型コラーゲンを示す。
図１Ｆ２は、ＩＶ型コラーゲンを用いた場合と、ＰＬＬを用いた場合とを、経時的に（１時間、２時間、３時間、６時間）観察した結果を示す。徐々に核が拡張し、核酸が導入されやすい形態となっていることが示される。
図１Ｆ３は、コラーゲンＩＶ型およびフィブロネクチンを用いた場合の位相顕微鏡による観察結果（１時間および２時間＝（ａ））、ならびに、コラーゲンＩＶ型、フィブロネクチン、コラーゲンＩ型およびラミニンについて観察した結果（３時間＝（ｂ））を示す。これをもとに、核の相対面積をグラフ化したものを図１Ｆ３（ｃ）に示す。
図１Ｇは、トランスフェクションチップ（スライドガラス、ＰＬＬコート）上に３ｍｍ×３ｍｍに３０００−６０００個の細胞を播種したときの細胞接着形態を示す。図１Ｇは、ＰＣ１２細胞の細胞接着形態を示す。
図１Ｈは、コラーゲンＩＶ型（０．００５ｍｇ／ｍｌ）をコーティングしたＰＬＬコートスライドにおけるＮｅｕｒｏ２ａ細胞を示す。
図２は、実施例において示される例示的なＩＶ型コラーゲンの効果（ＰＣ１２細胞）を示す。
図２Ａは、ＰＣ１２細胞における各種細胞外マトリックス上での接着特性を示す。
図２Ｂは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における各種細胞外マトリクスの効果を示す。
図２Ｃは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における各種細胞外マトリクスのトランスフェクション効率を示す。
図３は、実施例におけるＰＣ１２細胞に対するＰＬＬコーティングの有無の効果を示す。図３Ａは、各種コート条件および細胞外マトリックスとの組み合わせにおける位相顕微鏡を示す。
図３Ｂは、各種ＥＣＭのトランスフェクション効率を示す写真である。
図３Ｃは、それぞれプレーンおよびＰＬＬコーティングスライドにおける隔離効果を示す。
図３Ｄは、各種ＥＣＭと各種コーティングとの組み合わせを試験した結果を示す。
図３Ｅには、その強度を数値化したグラフを示す。
図３Ｆは、図３Ｄのものの実際の細胞固定の様子を示す。
図３Ｇは、スライド表面処理の種類による各種ＥＣＭの効果の経時変化を示す。
図３Ｈは、スライド表面処理の種類による各種ＥＣＭの効果の経時変化を示す。
図４は、Ｆｕｒａ２技術を用いて観察されたカルシウムイオン放出の挙動を示す。
図５は、種々の細胞接着因子の核酸導入効率への効果をまとめたグラフを示す。
図６は、本発明のアレイ技術への応用例を示す。
図６Ａは、ＰＣ１２細胞を示す。
図６Ｂは、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を示す。
図６ＣはＨｅｐＧ２を示す。
図６Ｄは、ｈＭＳＣを示す。
図６Ｅは、図６ＡにおけるＰＣ１２細胞の様子を示した写真である。
図７は、固相系トランスフェクションの概略を示す。
図８は、核酸導入効率は遺伝子導入試薬の種類に依存しないことを示す。ａは、各種ＳＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびラミニン）における、核酸導入の様子を示す。緑色に染まるものが、導入された遺伝子の産物になる。ｂは、各種ＥＣＭタンパク質の効果が、遺伝子導入試薬の種類に依存しないことを示す。ｚ軸は、トランスフェクション効率であり、ｘ軸には各種メーカーの遺伝子導入試薬を示し、ｙ軸には各種ＥＣＭタンパク質またはその非存在下である条件を示す。メーカーの試薬を用いてもＰＣ１２細胞のトランスフェクション効率の傾向は変化しないことが明らかになった。
図９は、固相トランスフェクション（ＰＣ１２）をコラーゲンＩＶコーティング上で行った場合のｓｉＲＮＡの効果を示す。図９Ａは、ＥＧＦＰベクターおよび抗ＥＧＦＰｓｉＲＮＡを共トランスフェクションしたＰＣ１２細胞を示す。示されるように、ＨｃＲｅｄのみが発色し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１に由来する緑色信号が抑制されていたことが判明した。他方、図９Ｂは、スクランブルｓｉＲＮＡを用いた例を示す。示されるように、緑色の蛍光が観察され、図９Ａにおける効果は、ＲＮＡｉの効果であることが確認された。図９Ａおよび図９Ｂにおける蛍光の強度を相対的に示した図を図９Ｃに示す。ｙ軸は相対輝度により示す。ＥＧＦＰによる効果は、ほぼ完全に抑えられていることが分かる。
図１０は、ＮＧＦによりＰＣ１２細胞がアレイ上においても分化誘導することを示す。図１０Ａは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、およびラミニンをコーティングしたアレイ上での固相トランスフェクションを示す。図１０Ａは、ガラススライドのスキャン画像を示す。
図１０Ｂは、トランスフェクションアレイにおける分化の様子をスキャン造影したものを示す（左）。図１０Ｂの真ん中は、ＰＣ１２細胞のトランスフェクション後３日目の顕微鏡写真を示す。図１０Ｂの右は、ＮＧＦ誘導後１日後の写真を示す。
配列表の説明
配列番号１：マウスのＦＶＢ／Ｎコラーゲンｐｒｏ−α−１型Ｉ鎖の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｕ０８０２０）。
配列番号２：配列番号１の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号３：マウスのプロコラーゲンＩ型α２（Ｃｏｌ１ａ２）（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＮＭ＿００７７４３）の核酸配列。
配列番号４：配列番号３の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号５：マウスのα１型−ＩＶコラーゲンの核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｍ１４０４２）の核酸配列。
配列番号６：配列番号５の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号７：マウスのコラーゲンα−２（ＩＶ）鎖（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｘ０４６４７）の核酸配列。
配列番号８：配列番号７の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号９：マウスのプロコラーゲンＩＶ型α３（Ｃｏｌ４ａ３）（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＮＭ＿００７７３４）。
配列番号１０：配列番号９の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号１１：マウスのコラーゲンＩＶ型α４鎖の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｚ３５１６７）。
配列番号１２：配列番号１１の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号１３：マウスのコラーゲンＩＶ型α５鎖の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：Ｚ３５１６８）。
配列番号１４：配列番号１３の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号１５：マウスのプロコラーゲンＩＶ型α６（Ｃｏｌ４ａ６）の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号：ＮＭ＿０５３１８５）。
配列番号１６：配列番号１５の核酸にコードされるタンパク質の配列。
配列番号１７：ラミニンの核酸配列（マウスα鎖）
配列番号１８：ラミニンのアミノ酸配列（マウスα鎖）
配列番号１９：ラミニンの核酸配列（マウスβ鎖）
配列番号２０：ラミニンのアミノ酸配列（マウスβ鎖）
配列番号２１：ラミニンの核酸配列（マウスγ鎖）
配列番号２２：ラミニンのアミノ酸配列（マウスγ鎖）
配列番号２３：フィブロネクチンの核酸配列（ヒト）
配列番号２４：フィブロネクチンのアミノ酸配列（ヒト）
配列番号２５：実施例９で使用したｓｉＲＮＡの配列。
配列番号２６：実施例９で使用したスクランブルＲＮＡの配列。FIG. 1 shows morphological changes of PC12 cells observed using a phase microscope (FIGS. 1A to D) and a confocal microscope (FIGS. 1E to F) in Examples.
FIG. 1A shows the effect of fibronectin.
FIG. 1B shows the effect of type I collagen.
FIG. 1C shows type IV collagen.
FIG. 1D shows the effect of laminin.
FIG. 1E shows the effect of fibronectin.
FIG. 1F1 shows type IV collagen.
FIG. 1F2 shows the results of observing over time (1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours) when using type IV collagen and when using PLL. It is shown that the nucleus gradually expands and the nucleic acid is easily introduced.
FIG. 1F3 shows the results of observation with a phase microscope when collagen type IV and fibronectin were used (1 hour and 2 hours = (a)), and the results of observation on collagen type IV, fibronectin, collagen type I and laminin (3 Time = (b)). Based on this, a graph of the relative area of the nucleus is shown in FIG. 1F3 (c).
FIG. 1G shows a cell adhesion form when 3000-6000 cells are seeded at 3 mm × 3 mm on a transfection chip (slide glass, PLL coat). FIG. 1G shows the cell adhesion morphology of PC12 cells.
FIG. 1H shows Neuro2a cells in PLL-coated slides coated with collagen type IV (0.005 mg / ml).
FIG. 2 shows the effect of exemplary type IV collagen (PC12 cells) shown in the examples.
FIG. 2A shows the adhesion properties on various extracellular matrices in PC12 cells.
FIG. 2B shows the effect of various extracellular matrices on Neuro2a cells.
FIG. 2C shows the transfection efficiency of various extracellular matrices in Neuro2a cells.
FIG. 3 shows the effect of the presence or absence of PLL coating on PC12 cells in the examples. FIG. 3A shows a phase microscope in combination with various coating conditions and extracellular matrix.
FIG. 3B is a photograph showing the transfection efficiency of various ECMs.
FIG. 3C shows the isolation effect on the plain and PLL coated slides, respectively.
FIG. 3D shows the results of testing combinations of various ECMs and various coatings.
FIG. 3E shows a graph in which the intensity is digitized.
FIG. 3F shows the actual cell fixation of that of FIG. 3D.
FIG. 3G shows changes over time in the effects of various ECMs depending on the type of slide surface treatment.
FIG. 3H shows changes over time in the effects of various ECMs depending on the type of slide surface treatment.
FIG. 4 shows the behavior of calcium ion release observed using the Fura2 technique.
FIG. 5 shows a graph summarizing the effects of various cell adhesion factors on nucleic acid introduction efficiency.
FIG. 6 shows an application example of the present invention to the array technology.
FIG. 6A shows PC12 cells.
FIG. 6B shows Neuro2a cells.
FIG. 6C shows HepG2.
FIG. 6D shows hMSC.
FIG. 6E is a photograph showing the appearance of PC12 cells in FIG. 6A.
FIG. 7 shows an outline of solid phase transfection.
FIG. 8 shows that the nucleic acid introduction efficiency does not depend on the type of gene introduction reagent. a shows the state of nucleic acid introduction in various SECM proteins (fibronectin, collagen I, collagen IV and laminin). What is dyed green is the product of the introduced gene. b shows that the effect of various ECM proteins does not depend on the type of gene transfer reagent. The z axis represents transfection efficiency, the x axis represents gene introduction reagents from various manufacturers, and the y axis represents various ECM proteins or conditions in the absence thereof. It became clear that the trend of transfection efficiency of PC12 cells did not change even using the manufacturer's reagent.
FIG. 9 shows the effect of siRNA when solid phase transfection (PC12) was performed on a collagen IV coating. FIG. 9A shows PC12 cells co-transfected with EGFP vector and anti-EGFP siRNA. As shown, it was found that only HcRed developed color and the green signal derived from pEGFP-N1 was suppressed. On the other hand, FIG. 9B shows an example using scrambled siRNA. As shown, green fluorescence was observed, confirming that the effect in FIG. 9A is that of RNAi. FIG. 9C shows the relative intensity of the fluorescence in FIGS. 9A and 9B. The y axis is indicated by relative luminance. It can be seen that the effect of EGFP is almost completely suppressed.
FIG. 10 shows that NGF induces differentiation of PC12 cells also on the array. FIG. 10A shows solid phase transfection on an array coated with fibronectin, collagen type I, collagen type IV, and laminin. FIG. 10A shows a scanned image of a glass slide.
FIG. 10B shows a scanning image of the state of differentiation in the transfection array (left). The middle of FIG. 10B shows a photomicrograph on the third day after transfection of PC12 cells. The right side of FIG. 10B shows a photograph one day after NGF induction.
Description of Sequence Listing SEQ ID NO: 1: Nucleic acid sequence of mouse FVB / N collagen pro-α-1 type I chain (GENBANK accession number: U08020).
SEQ ID NO: 2: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3: Nucleic acid sequence of mouse procollagen type I α2 (Col1a2) (GENBANK accession number: NM — 007743).
SEQ ID NO: 4: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5: Nucleic acid sequence of mouse α1-type IV collagen nucleic acid sequence (GENBANK accession number: M14042).
SEQ ID NO: 6: protein sequence encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 7: Nucleic acid sequence of mouse collagen α-2 (IV) chain (GENBANK accession number: X04647).
SEQ ID NO: 8: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 7.
SEQ ID NO: 9: Mouse procollagen type IV α3 (Col4a3) (GENBANK registration number: NM_007734).
SEQ ID NO: 10: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 9.
SEQ ID NO: 11: Nucleic acid sequence of mouse collagen type IV α4 chain (GENBANK accession number: Z35167).
SEQ ID NO: 12: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 11.
SEQ ID NO: 13: Nucleic acid sequence of mouse collagen type IV α5 chain (GENBANK accession number: Z35168).
SEQ ID NO: 14: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 13.
SEQ ID NO: 15: Nucleic acid sequence of mouse procollagen type IV α6 (Col4a6) (GENBANK accession number: NM — 053185).
SEQ ID NO: 16: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 15.
SEQ ID NO: 17: Laminin nucleic acid sequence (mouse α chain)
SEQ ID NO: 18: amino acid sequence of laminin (mouse α chain)
SEQ ID NO: 19: Laminin nucleic acid sequence (mouse β chain)
SEQ ID NO: 20: amino acid sequence of laminin (mouse β chain)
SEQ ID NO: 21: Laminin nucleic acid sequence (mouse γ chain)
SEQ ID NO: 22: amino acid sequence of laminin (mouse γ chain)
SEQ ID NO: 23: Fibronectin nucleic acid sequence (human)
SEQ ID NO: 24: Amino acid sequence of fibronectin (human)
SEQ ID NO: 25: The sequence of siRNA used in Example 9.
SEQ ID NO: 26: Scrambled RNA sequence used in Example 9.

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．ｅｔａｌ．（１９８９）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒおよびその３ｒｄＥｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９９５）．ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄａｎｎｕａｌｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９９）．ＰＣＲＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉｃｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、別冊実験医学「外来物質導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔａｌ．（１９９４）．ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９６）．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（一般生化学）
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。フィブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８（１９９４））。フィブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質などの遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。また、トランスフェクションの対象となる分子もこのポリヌクレオチドである。
用語「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの有用な細胞外マトリクスタンパク質には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。また、最近のゲノム配列解読により、構造遺伝子でも調節遺伝子でもない部分が注目されており生命において役割を果たしていることが示唆されている。したがって、遺伝子とは、生命体に存在する核酸およびその核酸によって規定される遺伝形質を決定する因子を包含することが理解される。したがって、コラーゲン遺伝子というときは、通常、コラーゲンの構造遺伝子およびコラーゲンのプロモーターの両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡにおいてデフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよく、目的とする機能を発揮することができる限りヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド改変体をも包含する。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号１文字記号意味
ＡｌａＡアラニン
ＣｙｓＣシステイン
ＡｓｐＤアスパラギン酸
ＧｌｕＥグルタミン酸
ＰｈｅＦフェニルアラニン
ＧｌｙＧグリシン
ＨｉｓＨヒスチジン
ＩｌｅＩイソロイシン
ＬｙｓＫリジン
ＬｅｕＬロイシン
ＭｅｔＭメチオニン
ＡｓｎＮアスパラギン
ＰｒｏＰプロリン
ＧｌｎＱグルタミン
ＡｒｇＲアルギニン
ＳｅｒＳセリン
ＴｈｒＴトレオニン
ＶａｌＶバリン
ＴｒｐＷトリプトファン
ＴｙｒＹチロシン
Ａｓｘアスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘグルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ不明または他のアミノ酸。
塩基
記号意味
ａアデニン
ｇグアニン
ｃシトシン
ｔチミン
ｕウラシル
ｒグアニンまたはアデニンプリン
ｙチミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍアデニンまたはシトシンアミノ基
ｋグアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓグアニンまたはシトシン
ｗアデニンまたはチミン／ウラシル
ｂグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄアデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈアデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖアデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチド分子またはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸または核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位（例えば、コラーゲンの接着部位など）中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸またはそれをコードする核酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。このような対応するアミノ酸または核酸は、当該分野において公知のアラインメント技術を用いて同定することができる。そのようなアラインメント技術としては、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，ＳＢａｎｄＷｕｎｓｃｈ，ＣＤ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３，１９７０に記載される技術が挙げられるがそれに限定されない。
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスコラーゲン遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスコラーゲンなど）の配列（例えば、配列番号１〜２４）をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本発明では、フラグメントは、ある一定の大きさ（例えば、５ｋＤａ）以上の大きさを有することが好ましい。理論に束縛されないが、細胞接着分子として機能するためにはある程度の大きさが必要であるようであるからである。
本明細書において使用される用語「領域」によって、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の連続した部分によって定義される。用語「ドメイン」は、本明細書中で、生体分子の既知の機能または推測されている機能に寄与する、その生体分子の構造部分をいうものとして定義される。ドメインは、領域またはその部分と同じ広がりを有し得；ドメインはまた、その領域の全てまたは一部に加えて、特定の領域と区別される生体分子の一部を組み込み得る。本発明の細胞接着分子のドメインの例としては、シグナルペプチド、細胞外（すなわち、Ｎ末端）ドメイン、ロイシンリッチ反復ドメイン、ＲＧＤ部分、他の保存領域が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明において使用されるポリヌクレオチド（例えば、コラーゲンＩをコードするもの）の中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１〜３８、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ１：ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａＰｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ_４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ^＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙＵｓｉｎｇＰｕｒｉｆｉｅｄＧｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
本発明において使用されるタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３などに示される核酸配列の一部を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましい本発明の核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１ｍＭＥＤＴＡ；４２℃の温度で７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭＮａＣｌ；６０ｍＭクエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭＮａＣｌ；３０ｍＭクエン酸ナトリウム）；１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ；１５ｍＭクエン酸ナトリウム）；０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３などに示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ法（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７；１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ法（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、Ｆｎ１には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書において物質の細胞への「導入」とは、その物質が、細胞膜の内部へ進入することをいう。内部に導入されたかどうかは、例えば、その物質そのものを標識（例えば、蛍光標識、化学発光標識、燐光、放射能などを利用する）しその標識を検出することによるか、あるいは、その物質に起因する細胞内の変化（例えば、遺伝子発現、シグナル伝達、細胞内レセプターへの結合による事象、代謝変化など）を物理学的（例えば、目視）、化学的（分泌物の測定）、生化学的、生物学的に測定することによって判定することができる。従って、そのような「導入」には、単なるタンパク質、核酸などの物質の細胞内への移入の他、通常遺伝子操作とも呼ばれる、トランスフェクション、形質転換、形質導入などの操作も包含される。
本明細書において「外来物質」とは、細胞内への導入が企図される物質をいう。本発明が企図する外来物質は、通常の条件下では、細胞内に導入されない物質をいう。従って、拡散または疎水性相互作用によって通常の条件下で細胞に導入されることができるような物質は、本発明の重要な局面では対象外となる。通常の条件下で細胞内に導入されない標的物質としては、例えば、タンパク質（ポリペプチド）、ＲＮＡ、ＤＮＡ、糖（特に多糖）、およびそれら同士の複合分子（例えば、糖タンパク質、ＰＮＡなど）またはそれらと別の分子との複合分子（例えば、糖脂質）、ウィルスベクター、他の化合物が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物体について言及するとき、その２つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などの生体内で生じる通常の相互作用であり得る。
本明細書において「接触」とは、２つの物質（例えば、組成物および細胞）が互いに相互作用するに十分に至近距離に存在することをいう。
（遺伝子の改変）
本発明において使用される細胞接着分子は遺伝子産物の形態をとることが多いが、そのような遺伝子産物は、上述のようにその改変体であってもよいことが理解される。従って、本発明は、以下のような遺伝子改変の技術で生産された物質も使用することができる。
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；ＭａｒｋＺｏｌｌｅｒａｎｄＭｉｃｈａｅｌＳｍｉｔｈ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
本明細書において「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
（遺伝子操作）
本明細書において遺伝子操作について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
原核細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴ^ＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
動物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（ＭｕｒｉｎｅＳｔｅｍＣｅｌｌＶｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
植物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ、ｐＣＧＮ１５４８、ｐＣＧＮ１５４９、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ターミネーター」とは、通常遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列をいう。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「サイレンサー」とは、遺伝子発現を抑制し静止する機能を有する配列をいう。本発明では、サイレンサーとしてはその機能を有する限り、どのようなものを用いてもよく、サイレンサーを用いなくてもよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ａ．ら編（１９８８）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋＪら（１９８７）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．およびその第三版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法が挙げられる。
本明細書において「外来物質導入試薬」とは、外来物質の導入効率を促進するために使用されている物質をいう。そのような試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。このような試薬は、通常、核酸の導入効率を上昇させることから、「遺伝子導入試薬」を包含する。
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、核酸（通常遺伝子をコードするが、それに限定されない）の導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔ^ＴＭＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），Ｔｆｘ^ＴＭ−２０Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ５００（Ｒ０５１１，ＦｅｒｍｅｎｔａｓＩｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
外来物質導入効率または遺伝子導入効率は、単位面積（例えば、１ｍｍ^２など）あたりの導入外来物質（導入遺伝子）（例えば、蛍光タンパク質ＧＦＰなど）の導入（発現）細胞数、または総信号（蛍光タンパク質の場合は、蛍光）量を測定することによって算定することができる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部（組織など）をいう。形質転換体としては、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫などの細胞などの生命体の全部または一部（組織など）が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ２−Ｂｌｕｅ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ１が例示される。あるいは、本発明では、天然物から分離した細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。あるいは、本発明では、初代培養細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る植物細胞としては、カルスまたはその一部および懸濁培養細胞、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科などの植物の細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、ＮａｔＧｅｎｅｔ．２００２Ｄｅｃ；３２Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「増加」とは、細胞内に遺伝子発現に関連する因子（例えば、発現されるべき遺伝子またはそれを調節する因子）を導入したときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、コラーゲンがそのリガンドと相互作用する場合、その生物学的活性は、結合体の形成または他の生物学的変化を包含する。別の好ましい実施形態では、そのような生物学的活性は、細胞接着活性、ヘパリン結合活性、コラーゲン結合活性などであり得る。細胞接着活性は、細胞播種後に細胞の固相への接着速度を測定し、接着活性として取り扱うことによって測定することができる。ヘパリン結合活性は、ヘパリン固定化カラム等のアフィニティークロマトグラフィーを行い、これに結合するものとして確認できるものによって測定することができる。コラーゲン結合活性は、コラーゲン固定化カラム等のアフィニティークロマトグラフィーを行い、これに結合するものとして確認できるものによって測定することができる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（本明細書において引用）などを参照）。
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。
（ポリペプチドの製造方法）
本発明において使用されるポリペプチドは、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、このポリペプチドを生成蓄積させ、その培養物よりその本発明のポリペプチドを採取することにより、製造することができる。
形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源（例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類など）、窒素源（例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等など）、無機塩類（例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等など）等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等）のいずれを用いてもよい。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましいがそれに限定されない。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明において使用されるポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、そのポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常のポリペプチド（例えば、酵素）の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマドグラフィー法、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明において使用されるポリペプチドが形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
本発明において使用されるポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法［例えば、Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明において使用されるポリペプチドが他のタンパク質との融合タンパク質として生産しても使用され得る場合、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。あるいは、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、そのようなポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明において使用されるポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
（細胞の分化誘導）
本明細書において「分化」とは、一般的には、１つの系が２つ以上の質的に異なる系に分離することをいい、細胞、組織または臓器について用いられるとき、機能および／または形態が特殊化することをいう。分化に伴い、通常、多能性は減少または消失する。分化によって、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などの形態学的に別の細胞に分化するか、あるいは、神経細胞のように樹状突起などが伸展または増殖してもよい。本発明において用いられる場合、分化誘導された分化細胞は、集団または組織の形態を採り得る。
本明細書において「分化誘導」および「分化促進」は、交換可能に用いられ、細胞について言及される場合、分化を誘導または促進することをいう。従って、分化誘導は、分化の速度が上昇することおよび分化がとまっていたり脱分化の方向にある細胞を分化の方向に向けることも含まれる。
本明細書において「分化因子」、「分化誘導因子」または「分化促進因子」は、交換可能に用いられ、分化細胞への分化を促進または誘導させる因子（例えば、化学物質、温度など）であれば、どのような因子であってもよい。そのような因子としては、例えば、種々の環境要因を挙げることができ、そのような因子としては、例えば、温度、湿度、ｐＨ、塩濃度、栄養、金属、ガス、有機溶媒、圧力、化学物質（例えば、ステロイド、抗生物質など）などまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。代表的な分化因子としては、細胞生理活性物質が挙げられるがそれらに限定されない。そのような因子のうち代表的なものとしては、ＤＮＡ脱メチル化剤（５−アザシチジンなど）、ヒストン脱アセチル化剤（トリコスタチンなど）、核内レセプターリガンド（例えば、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ビタミンＤ_３、Ｔ３など）、細胞増殖因子（アクチビン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）２／４など）、サイトカイン（ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６など）、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルｃＡＭＰ、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
具体的な分化因子としては、以下が挙げられる。これらの分化因子は、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
Ａ）角膜：上皮増殖因子（ＥＧＦ）；
Ｂ）皮膚（ケラチノサイト）：ＴＧＦ−β、ＦＧＦ−７（ＫＧＦ：ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ
Ｃ）血管内皮：ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）
Ｄ）腎臓：ＬＩＦ、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ
Ｅ）心臓：ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ
Ｆ）肝臓：ＨＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ
Ｇ）臍帯内皮：ＶＥＧＦ
Ｈ）腸管上皮：ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１１
Ｉ）神経：神経成長因子（ＮＧＦ）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ
Ｊ）グリア細胞：ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＥＧＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６
Ｋ）末梢神経細胞：ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、
Ｌ）肺（肺胞上皮）：ＴＧＦ−β、ＩＬ−１３、ＩＬ−１β、ＫＧＦ、ＨＧＦ
Ｍ）胎盤：成長ホルモン（ＧＨ）、ＩＧＦ、プロラクチン、ＬＩＦ、ＩＬ−１、アクチビンＡ、ＥＧＦ
Ｎ）膵臓上皮：成長ホルモン、プロラクチン
Ｏ）膵臓ランゲルハンス氏島細胞：ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＲＨ（ｔｈｙｒｏｒｏｐｉｎ）
Ｐ）関節滑膜上皮：ＦＧＦ、ＴＧＦ−β
Ｑ）骨芽細胞：ＢＭＰ、ＦＧＦ
Ｒ）軟骨芽細胞：ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、ＴＮＦ−α
Ｓ）網膜細胞：ＦＧＦ、ＣＮＴＦ（絨毛神経栄養因子＝ｃｉｌｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）
Ｔ）脂肪細胞：インスリン、ＩＧＦ、ＬＩＦ
Ｕ）筋肉細胞：ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ。
本発明の細胞は、細胞の維持または所望の分化細胞へ分化する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ、Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）およびそれらの混合物などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦなどの増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウム、コレラトキシンなどを１つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。
（デバイス）
本明細書において「デバイス」とは、装置の一部または全部を構成することができる部分をいい、支持体（好ましくは固相支持体）およびその支持体に担持されるべき標的物質などから構成される。そのようなデバイスとしては、チップ、アレイ、マイクロタイタープレート、細胞培養プレート、シャーレ、フィルム、ビーズなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において使用される「支持体」は、生体分子のような物質を固定することができる材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子のような物質に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書において、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビーズ、金属（表面）などの形態をとり得る。支持体はコーティングされていてもよく、コーティングされていなくてもよい。
本明細書において「液相」とは、当該分野において通常用いられる意味と同じ意味で用いられ、通常、溶液中での状態をいう。
本明細書において「固相」とは、当該分野において用いられる意味と同じ意味で用いられ、通常、固体の状態をいう。本明細書において液体および固体を総合して流体ということがある。
本明細書において「接触」とは、２つの物質（例えば、組成物および細胞）が互いに相互作用するに十分に至近距離に存在することをいう。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物体について言及するとき、その２つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などの生体内で生じる通常の相互作用であり得る。
（基板／プレート／チップ／アレイ）
本明細書において使用される「プレート」とは、抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明では、プレートは、プラスチック、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面にもつガラス基板を基材とすることが好ましい。
本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板はプレートの概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。トランスフェクションアレイのためには、スライドグラスが好ましい。好ましくは、そのような基材は、コーティングされ得る。
本明細書において「コーティング」とは、固相支持体または基板について用いられるとき、その固相支持体または基板の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそのような膜をいう。コーティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体および基板の品質向上（例えば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体または基板に結合されるべき物質の親和性の向上などを目的とすることが多い。本明細書において、そのようなコーティングのための物質は、「コーティング剤」と呼ばれる。そのようなコーティング剤としては、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持体および基板自体に使用される物質のほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質などの生体物質、ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ＭＡＳ（松浪硝子、岸和田、日本から入手可能）、疎水性フッ素樹脂）、シラン（ＡＰＳ（例えば、γ−アミノプロピルシラン））、金属（例えば、金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択は当業者の技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに選択することができる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、（例えば、エポキシシランまたはメルカプトシラン、ＡＰＳ（γ−アミノプロピルシラン））、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金のような金属を用いることが有利であり得る。このような物質は、細胞または細胞を含む物体（例えば、生体、臓器など）に適合する物質を用いることが好ましい。
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の標的物質を含む組成物（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、トランスフェクト混合物）が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のトランスフェクト混合物のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる抗体を少なくとも１０^２個、より好ましくは少なくとも１０^３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０^４個、さらにより好ましくは少なくとも１０^５個を含む。これらの抗体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される標的物質を含む組成物は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の標的物質を含む組成物が固定され得る。
基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質（例えば、抗体のようなタンパク質）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０^８個の生体分子まで、他の実施形態において１０^７個の生体分子まで、１０^６個の生体分子まで、１０^５個の生体分子まで、１０^４個の生体分子まで、１０^３個の生体分子まで、または１０^２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０^８個の生体分子を超える標的物質を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、抗体のようなタンパク質）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞への導入が企図される標的物質を含む組成物は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
各々のアドレスを定めるサイズは、とりわけ、その基板の大きさ（特定の基板上のアドレスの数、標的物質を含む組成物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
マイクロアレイについては、ゲノム機能研究プロトコール（実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座１）、ゲノム医科学とこれからのゲノム医療（実験医学増刊）などに広く概説されている。
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（ＥｒｍｏｌａｅｖａＯら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＭｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃＦａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．ＭｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙＦａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＳｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＳｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒＳｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｏｆＭｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１５Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（細胞接着分子）
本発明は、１つの局面では、細胞接着分子と、遺伝子導入試薬との組み合わせによる驚くべき効果（固定に加えて、導入効率が飛躍的に上昇する）ことが見出されたことに有用性がある。
本明細書において「細胞接着分子」（Ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）または「接着分子」とは、互換可能に使用され、２つ以上の細胞の互いの接近（細胞接着）または基質と細胞との間の接着を媒介する分子をいう。一般には、細胞と細胞の接着（細胞間接着）に関する分子（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）と，細胞と細胞外マトリックスとの接着（細胞−基質接着）に関与する分子（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）に分けられる。本発明の組織片では、いずれの分子も有用であり、有効に使用することができる。従って、本明細書において細胞接着分子は、細胞−基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、インテグリンなど）も包含され、タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、本明細書における細胞接着分子または細胞接着分子の概念に入る。
ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）ＰＤＲ法、ハイブリダイゼイション法などのようなアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン（配列番号１−１６）、インテグリン、フィブロネクチン（配列番号２３−２４）、ラミニン（配列番号１７−２２）、ビトロネクチン、フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１）、セレクチン、カドヘリンなどが挙げられるがそれに限定されない。このような細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達する。従って、本発明の組織片において用いられる接着因子としては、そのような細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達するものが好ましい。細胞活性化により、組織片としてある組織または臓器における損傷部位に適用された後に、そこに集合した細胞および／または組織もしくは臓器にある細胞の増殖を促すことができるからである。そのような補助シグナルを細胞内に伝達することができるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧ法、標識コラーゲン法）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）ＰＤＲ法、ハイブリダイゼイション法というアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。
本明細書において「細胞外マトリクス」（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。本発明において用いられる細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、弾性繊維、膠原繊維などが挙げられるがそれに限定されない。本発明において用いられる場合、細胞外マトリクスは、好ましくは、宿主の自己細胞を呼び寄せる活性を持っていることが有利である。
本明細書において「細胞接着性タンパク質」とは、上述のような細胞接着を媒介する機能を有するタンパク質をいう。従って、本明細書において細胞接着性タンパク質は、細胞−基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、インテグリンなど）をも包含する。例えば、基質側のタンパク質を吸着した基質（ガラスやプラスチック）の上に無血清条件下で培養細胞を播種すると，レセプターであるインテグリンが細胞接着性タンパク質を認識し、細胞はその基質に接着する。細胞接着性蛋白質の活性部位はアミノ酸レベルで解明されており、ＲＧＤ，ＹＩＧＳＲなどが知られている（これらを、総合してＲＧＤ配列とも呼ぶ）。従って、１つの好ましい実施形態において、本発明の組織片に含まれるタンパク質は、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲなどのＲＧＤ配列を含むことが有利であり得る。通常、細胞接着性タンパク質は、細胞外マトリックス、培養細胞表面、血漿・血清・各種体液に存在する。その生体内での機能としては，細胞の細胞外マトリックスへの接着だけでなく，細胞の移動・増殖・形態調節・組織構築などが知られている。細胞作用とは別に，血液凝固・補体作用の調節機能を示すタンパク質もあり、本発明では、そのような機能を有するタンパク質もまた有用であり得る。そのような細胞接着性タンパク質としては、例えば、フィブロネクチン，コラーゲン，ビトロネクチン，ラミニンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ＲＧＤ分子」とは、アミノ酸配列ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）またはその機能的に同一な配列を含むタンパク質分子をいう。ＲＧＤ分子は、細胞接着性蛋白質の細胞接着活性部位のアミノ酸配列として有用なアミノ酸配列であるＲＧＤまたは機能的に等価な別のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。ＲＧＤ配列は、フィブロネクチンの細胞接着部位として発見され、その後，Ｉ型コラーゲン、ラミニン，ビトロネクチン，フィブリノゲン，フォンヴィルブランド因子，エンタクチンなど多くの細胞接着性の活性を示す分子に見出された。化学合成したＲＧＤペプチドを固相化すると細胞接着活性を示すことから、本発明における生体分子は、化学合成したＲＧＤ分子であってもよい。そのようなＲＧＤ分子としては、上述の天然に存在する分子のほかに、例えば、ＧＲＧＤＳＰペプチドが挙げられるがそれに限定されない。ＲＧＤ配列は細胞接着分子（かつ、レセプターでもある）であるインテグリン（例えば、フィブロネクチンのレセプター）によって認識されることから、ＲＧＤの機能的に等価な分子は、そのようなインテグリンを用いて相互作用を調べることによって同定することができる。
本明細書において「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、線維形成コラーゲンであり３本のポリペプチド鎖が３重螺旋を巻いた領域の総称であり、細胞生着、増殖の足場であり、組織骨格を形成するものをいう。コラーゲンは、動物の細胞外マトリクスの主成分である。コラーゲンもまた、ＲＧＤ配列をもち、細胞接着活性を示すことが知られている。コラーゲンは、動物の全タンパク質中の約２０〜３０％も含まれ、皮膚、腱、軟骨などに多量に含まれることが知られている。コラーゲン分子としては、Ｉ型〜ＸＩＩＩ型が知られている。通常、分子一つが３本のポリペプチド鎖からなる三重らせん構造を採り、各鎖はα鎖と呼ばれることが多い。コラーゲン分子では、１分子は１種類のα鎖からなっていてもよく、別々の遺伝子にコードされた複数種のα鎖からなっていてもよい。α鎖は、通常、α１，α２，α３のようにαの後に数字をつけてよび，さらにコラーゲンの型をつけて，α１（Ｉ）などと称する。従って、本発明では、例えば、［α１（Ｉ）_２α２（Ｉ）］（Ｉ型コラーゲン）のような天然に存在するコラーゲン分子のほか、天然に存在しないような組み合わせの三量体もまた私用され得る。コラーゲンの一次構造の大部分は、［Ｇｌｙ−Ｘ−Ｐｒｏ（またはヒドロキシプロリル）］_ｎ（Ｘは任意のアミノ酸残基）のアミノ酸配列からなる特徴をもつ。この構造は、３残基周期の左巻きらせん構造をとる。コラーゲンは通常、特殊なアミノ酸としてヒドロキシリジンを含む。コラーゲンは、糖タンパク質であるが、糖はヒドロキシリジンの水酸基に結合している。
コラーゲンには、線維状で存在し集まって膠原線維をなす線維形成コラーゲンまたは間質型コラーゲンという種類がある。そのような線維形成コラーゲンには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型コラーゲンがあり、本発明の好ましい実施形態において使用される。コラーゲンとしては、このほかに、短鎖コラーゲン（ＶＩＩＩ型、Ｘ型など）、基底膜コラーゲン（ＩＶ型など）、ＦＡＣＩＴコラーゲン（ＩＸ型、ＸＩＩ型、ＸＩＶ型、ＸＶＩ型、ＸＩＸ型など）、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｓコラーゲン（ＸＶ型、ＸＶＩＩＩ型など）、ミクロフィブリルコラーゲン（ＶＩ型など）、長鎖コラーゲン（ＶＩＩ型など）、膜結合型コラーゲン（ＸＩＩＩ型，ＸＶＩＩ型など）などが挙げられ、これらはすべて本発明において使用され得る。本明細書において「基底膜コラーゲン」とは、基底膜を構成する主要なコラーゲンをいう。
本明細書において「Ｉ型コラーゲン」とは、［α１（Ｉ）_２α２（Ｉ）］という構造を有するコラーゲンであり、α１（Ｉ）鎖２本およびα２（Ｉ）鎖のポリペプチド鎖のヘテロ３本鎖からなり、生体内のあらゆる組織に存在する組織骨格およびその機能的に等価な分子をいい、そのようなポリペプチドのアミノ酸配列としては、代表的には、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号では、ｐ０２４５４、ｐ０２４６４が挙げられるがそれに限定されない（例えば、配列番号１〜４に記載のものなど）。本明細書において、Ｉ型コラーゲンの機能的に等価な分子は、例えば、酵素抗体法、ＥＩＡ法という方法により同定することができる。
本明細書において「ＩＶ型コラーゲン」とは、基底膜コラーゲンであり、その分子は、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインからなっており、Ｎ末端の７Ｓで４分子が重合し、Ｃ末端のＮＣ１で２分子が重合することにより、網目状のネットワークを形成しているコラーゲンまたはその機能的に等価な分子をいい、そのようなポリペプチドのアミノ酸配列としては、代表的には、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ｐ０２４６２、ｐ０８５７２、Ｕ０２５２０、Ｄ１７３９１、Ｐ２９４００、Ｕ０４８４５が挙げられるがそれに限定されない（例えば、配列番号５〜１６に記載のものなど）。本明細書において、ＩＶ型コラーゲンの機能的に等価な分子は、例えば、酵素抗体法、ＥＩＡ法という方法により同定することができる。
（細胞）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は胚性幹細胞であっても、組織幹細胞であってもよい。
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞が使用され得る。
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
本明細書において「初代培養細胞」とは、生体から分離した細胞、組織または器官などを植え込み、第１回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいう。したがって、それを植え継いだ「継代培養」細胞とは厳密に区別される。通常、初代培養細胞は、扱いが難しく、遺伝子操作（例えば、トランスフェクション）のような外来物質の導入などを行うことがかなり困難とされている。
本明細書において「神経細胞」とは、細胞体とそれから出る突起とをあわせた神経系の構造的および機能的単位を構成する細胞またはその改変体もしくは機能的等価物をいう。神経細胞であるかどうかは、神経伝達が起こるかどうかを確認することによって判定することができる。そのような神経細胞の機能は、例えば、パッチクランプ法などにより確認することができる。神経細胞の代表的な例として、ＰＣ１２細胞が使用され得る。ＰＣ１２細胞は、副腎髄質褐色細胞由来の細胞であるが、その形態が神経細胞に類似することから、神経系のモデルとして代表的な培養細胞として使用されている。
本明細書「指示書」とは、本発明の物質導入方法などを、ユーザー（研究者、実験補助者、または治療においては医師、患者など投与を行う人など）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の組成物などを例えば、使用する方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、医薬の場合通常いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅｉｎｓｅｒｔ）の形態をとり、または実験用試薬の形態の場合マニュアルの形態をとり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
（好ましい実施形態の説明）
１つの局面において、本発明は、細胞の核酸導入効率を改善するための組成物を提供する。ここで、組成物は、Ａ）細胞接着分子；およびＢ）遺伝子導入試薬、を含むことを特徴とする。核酸を導入するためには、遺伝子導入試薬のような遺伝子導入試薬を使用してきたが、外的因子の付加により導入効率が上昇することは予測されておらず、本発明により見出された細胞接着分子の効果は驚くべきものであるといえる。特に、細胞を固定したときにその効率が変わるとは予測されておらず、むしろ、減るとさえ考えられていた。本発明は、遺伝子導入試薬と、細胞接着分子とを組み合わせて細胞に作用させると、核酸の導入が予想外に向上することが判明したという効果を持つ。本発明によって、従来困難とされていた、初代培養細胞、神経細胞などで液相または固相でトランスフェクションを容易に行うことが可能になった。ここで、細胞接着分子と、遺伝子導入試薬とは、相互作用し得る状態で存在すればよい。これらの物質は、細胞に対して同時に作用させるように構成されていても、別々に構成されていてもよい。
別の局面において、細胞の核酸導入効率を改善するためのデバイスを提供する。このデバイスは、Ａ）細胞接着分子；およびＢ）遺伝子導入試薬、を含む、組成物が支持体に固定されている。このようなデバイスは、好ましい実施形態では、指示書を備え得る。
本発明において使用される細胞接着分子は、好ましくは、タンパク質形態で提供されるが、それに限定されない。タンパク質は、生体分子であり、遺伝子操作により製造可能であるからである。好ましい細胞接着分子には、細胞外マトリクスが含まれる。より好ましくは、細胞接着分子は、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンを含み、好ましいコラーゲンとしては、繊維形成コラーゲン、基底膜コラーゲンなどが挙げられるがそれに限定されない。これらの特定のコラーゲンは複数存在してもよく、繊維形成コラーゲンと基底膜コラーゲンとが同時に含まれていてもよい。
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞接着分子は、コラーゲンＩ型またはＩＶ型を含む。より好ましくは、細胞接着分子は、コラーゲンＩ型およびＩＶ型を含む。コラーゲンＩ型は、従来細胞接着因子としての作用のみが知られており、遺伝子導入試薬と組み合わせて使用したときに、核酸の導入効率が相乗的に上昇したことは、格別な発見である。また、コラーゲンＩＶ型が核酸導入効率を上昇させることは知られておらず、格別な効果といえる。また、これらの複数のコラーゲンを組み合わせることで核酸の導入効率はさらに上昇する。コラーゲンの種類が増加すると、核酸の導入を容易にするポイントが増大するからである。
本発明において使用される細胞接着分子は、多量体形態で存在することが好ましい。多量体形態で存在することによって、細胞の固定化が安定化されるからであり、核酸の導入効率を飛躍的に上げるようであることが判明したからである。
好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞接着分子は、三次元構造をとる。ここで、「三次元構造」とは、少なくとも２層以上から構成され、平面向きの構造以外にその平面とは垂直方向の分子の広がりを持つ構造をいう。したがって、そのような三次元構造を有することによって、細胞は、より天然の状況に近い状態で存在することになる。
１つの実施形態において、本発明において使用される遺伝子導入試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１つの試薬を含み、ある好ましい実施形態では、これらの試薬は複数用いられてもよい。
本発明の細胞の核酸導入効率および固定化を改善するための組成物は、導入しようとする外来分子を同時に含んでいてもよい。好ましくは、本発明の組成物は、導入が企図される遺伝子をコードする核酸分子を含んでいてもよい。
本発明の組成物は、固体であっても液体であってもよい。液体が好ましい。操作が容易であり、固相上への配置も容易であるからであり、液相での効果も確認されているからである。
本発明が対象とする細胞は、核酸の導入が企図される細胞であれば、どのような細胞であってもよく、通常遺伝子導入が可能な細胞であって、そのような細胞としては、例えば、ＰＣ１２，Ｎｅｕｒｏ２ａ，ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，ＮＧ１０８−１５，ＨＣＮ−１Ａなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい細胞としては、例えば、神経細胞、初代培養細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。初代培養細胞の原料はどのようなものでもかまわないが、好ましくは、哺乳動物の脳（大脳皮質、海馬、小脳）が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用される細胞接着分子は、５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で存在することが好ましいが、これ以下であっても遺伝子導入試薬の導入効率を上昇させることができ、この上限以上であっても特に問題なく導入効率が上昇することが理解される。上限の例示としては、例えば、１ｍｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌなどが挙げられるがそれらに限定されない。下限の例示としては、例えば、７５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌなどが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましい範囲としては、２０μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌが挙げられる。
１つの実施形態では、本発明は、固相上での細胞への核酸導入を可能にした点を利用する。従来固相上遺伝子導入が困難である細胞（たとえば、ＰＣ１２細胞などの神経系の細胞）の核酸導入を可能にしたという点で本発明は、特筆すべきであるといえる。特に好ましい実施形態では、、コラーゲンをコーティングした固相支持体の上で細胞を核酸導入するのに本発明の組成物は使用され得る。
別の実施形態では、本発明は、核酸を誘導した後、分化誘導されるために使用される。従って、好ましくは、本発明の組成物またはキットは、分化誘導因子（例えば、神経成長因子など）を含み得る。また、本発明の方法は、核酸を導入した後に、所望の分化を誘導する工程をさらに包含し得ることが理解される。
本発明において支持体が使用される場合、本発明の細胞接着分子は支持体にコーティングされることが好ましい。より好ましくは、細胞接着分子は、多層で前記支持体にコーティングされる。また、支持体は、ポリ−Ｌ−リジン、ＡＰＳ（γ−アミノプロピルシラン）、ＭＡＳでコーティングされることが好ましい。
本発明において支持体が使用される場合、支持体には核酸が配置されることが好ましく、さらに支持体に核酸（例えば、ＤＮＡ）がアレイ状で配置されることがより好ましい。このようなアレイ状で支持体が構成されることによって、ＤＮＡチップなどとして使用することができる。
別の局面において、本発明は、細胞へ核酸を導入する方法を提供する。この方法は、Ａ）細胞の遺伝子導入効率を改善するための組成物であって、ａ）細胞接着分子；およびｂ）遺伝子導入試薬、を含む、組成物を、導入が意図される遺伝子をコードする核酸分子とともに、該細胞に提供する工程；ならびにＢ）核酸が導入される条件に該細胞をさらす工程、を包含する。ここで、本発明の方法において使用される組成物は、本明細書において記載されている。このような組成物を細胞に提供する方法は、当該分野において周知の技術を用いて達成され得る。
本明細書において「核酸が導入される条件」は、導入が意図される核酸が導入される任意の条件を包含し、その核酸によって変動するが、当業者は、そのような条件を、核酸および細胞などの状況を考慮して決定することができる。例えば、核酸がＤＮＡである場合、そのような条件は、ｐＨ：６．０〜８．０；温度：３０〜４０℃；塩濃度：０．１〜０．２Ｍ（例えば、０．１５Ｍ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
１つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、固相または液相で行うことができる。固相の場合、細胞接着分子が細胞への固定を行うので、固相トランスフェクションなどの核酸固相導入が可能になる。特に、神経細胞、初代培養細胞などの従来トランスフェクションなどの核酸の導入が不可能であった細胞でも導入が可能になったことにより、種々の分析ができるようになった。このような分析は、従来不可能であった。また、液相の場合でも、本発明の方法は、核酸導入効率を上昇させることがわかった。液相の場合でも細胞接着分子が効果を有するということは知られておらず、その効果は驚くべきものであった。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、本発明の組成物と核酸（例えば、ＤＮＡ）とが支持体に固定されていることが好ましい。支持体は、どのような材料であってもよいが、好ましくは細胞と適合性である。そのような細胞に適合性の材料は、上述したとおりである。固定されることによって、チップを用いた種々の因子の分析を行うことが可能となった。
別の実施形態において、本発明の方法はまた、本発明の組成物および核酸（例えば、ＤＮＡ）を支持体に固定する工程をさらに包含する。
好ましい実施形態において、本発明の組成物および核酸を支持体に固定する方法としては、例えば、インクジェット方式、バブルジェット（登録商標）方式、手動方式などが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明は、核酸が導入された細胞を分化誘導させる工程を含んでいてもよい。
別の局面において、本発明は、細胞に核酸を導入するためのキットを提供する。このキットは、Ａ）ａ）細胞接着分子；およびｂ）遺伝子導入試薬、を含む、組成物；ならびにＢ）該組成物と、所望の遺伝子をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）とともに使用する方法を記載した指示書、とを備える。ここで、細胞接着分子および遺伝子導入試薬は、本明細書において上記され、実施例において例示されるようなものである。指示書は、核酸と、本発明の組成物とをどのように処理して、核酸を導入することが実現されるかを記載している。そのような指示書は、本明細書において上記されるとおり、どのような形態であってもよい。好ましい実施形態では、本発明は、分化誘導因子を含んでいてもよい。
別の局面において、ａ）細胞接着分子；およびｂ）遺伝子導入試薬、を含む、組成物の、細胞に核酸を導入するための使用に関する。そのような組成物の組成、核酸、細胞などの説明は上記されている。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、分化誘導因子を含んでいてもよい。
（細胞の分化誘導のための組成物、方法およびキット）
１つの局面において、本発明は、固相上で細胞に核酸を導入するための組成物であって、上記細胞は、核酸導入後も分化誘導する能力が保持される、組成物を提供する。ここで、本発明の組成物は、Ａ）細胞接着分子；およびＢ）遺伝子導入試薬、を含む。このような組成物を用いて核酸導入された細胞は、核酸導入後も分化誘導する能力を保持していた。このような現象はこれまでに達成されておらず、従って、本発明は、従来技術から予測できなかった効果を奏するといえる。
好ましい実施形態では、組成物自体が分化誘導因子を含んでいてもよく、別々に提供されていてもよい。分化誘導を制御する必要がある場合、好ましくは、分化誘導因子は、核酸を導入するために用いられる組成物とは別々に提供される。
分化誘導因子は、所望される分化を達成することができる限りどのような因子を用いてもよいが、例えば、細胞増殖因子を挙げることができる。細胞が神経である場合、用いられる分化誘導因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）を含み得る。
別の局面において、本発明は、固相上で細胞に核酸を導入するための方法を提供する。この方法は、Ａ）ａ）細胞接着分子；およびｂ）遺伝子導入試薬、を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程；ならびにＢ）核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程を包含する。ここで、上記細胞は、上記核酸導入後も分化誘導する能力が保持される。
１つの実施形態において、本発明の上記方法において用いられる組成物は、分化誘導因子を含んでいてもよいし、別々の組成物として提供されていてもよい。
好ましい実施形態において、使用される分化誘導因子としては、細胞増殖因子（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）など）を挙げることができるがそれらに限定されない。このような細胞増殖因子は、使用する細胞により変動することが理解される。
別の実施形態において、本発明の方法、上記細胞を分化誘導させる工程をさらに包含する。
別の局面において、本発明は、固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、上記細胞を分化誘導させるための組成物を提供する。ここで、この組成物は、Ａ）細胞接着分子；Ｂ）遺伝子導入試薬；およびＣ）分化誘導因子を含む。そのような組成物の組成、核酸、細胞などの説明は上記されており、任意に好ましい実施形態を採用することができることが理解される。
別の局面において、本発明は、固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、上記細胞を分化誘導させるためのキットを提供する。このキットは、Ａ）ａ）細胞接着分子；およびｂ）遺伝子導入試薬を含む、組成物、ならびにＢ）分化誘導因子を備える。そのような組成物の組成、核酸、細胞などの説明は上記されており、任意に好ましい実施形態を採用することができることが理解される。ここで、好ましくは、このキットにおいて、分化誘導因子は、上記組成物とは別個に配置される。
好ましい実施形態では、本発明のキットは、核酸導入、分化誘導などの手順を示した指示書を備えていてもよい。
別の局面において、本発明は、固相上で細胞に核酸を導入し、かつ、上記細胞を分化誘導させる方法を提供する。この方法は、Ａ）ａ）細胞接着分子；およびｂ）遺伝子導入試薬を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程；ならびにＢ）核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程；およびＣ）上記細胞を分化誘導する工程、を包含する。そのような組成物の組成、核酸、細胞などの説明は上記されており、任意に好ましい実施形態を採用することができることが理解される。ここで、好ましくは、この方法において、分化誘導は、核酸導入とは独立して行われる。
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、本発明において組成物が核酸を含む場合、その核酸に関連するポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、本発明の組成物が遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，ＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙ１２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ１１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
本発明が医薬として使用される場合、そのような医薬は経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、そのような医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明が化粧品、食品、農薬など別の用途で使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品などを調製することができる。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。The present invention will be described below. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.
(General technology)
Molecular biological techniques, biochemical techniques, and microbiological techniques used in this specification are well known and commonly used in the art, and are described in, for example, Sambrook J. et al. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F .; M.M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F .; M.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M .; A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F .; M.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M .; A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; J. et al. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, a separate volume of experimental medicine "Exogenous Substance Introduction & Expression Analysis Experiment Method" Yodosha, 1997, etc., and these may be related parts (may be all) ) Is incorporated by reference.
For DNA synthesis technology and nucleic acid chemistry for producing artificially synthesized genes, see, for example, Gait, M. et al. J. et al. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRLPpress; Gait, M .; J. et al. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F .; (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approac, IRL Press; Adams, R .; L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G .; M.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G .; T.A. (I996). Bioconjugate Technologies, Academic Press, etc., which are incorporated herein by reference in the relevant part.
(General biochemistry)
As used herein, the terms “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. The amino acid may be natural or non-natural and may be a modified amino acid. The term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is included. The gene product of an extracellular matrix protein such as fibronectin usually takes the form of a polypeptide.
As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide”, and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length. The term also includes “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide”. A “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide that includes a derivative of a nucleotide or that has an unusual linkage between nucleotides and is used interchangeably. Specific examples of such an oligonucleotide include, for example, 2′-O-methyl-ribonucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in an oligonucleotide. Is an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond derivative oligonucleotide, a ribose and phosphodiester bond in the oligonucleotide converted to a peptide nucleic acid bond, uracil in the oligonucleotide is C− A derivative oligonucleotide substituted with 5-propynyluracil, a derivative oligonucleotide in which uracil in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazole uracil, and cytosine in the oligonucleotide is substituted with C-5 propynylcytosine Derivative oligonucleotides, derivative oligonucleotides in which cytosine in the oligonucleotide is replaced with phenoxazine-modified cytosine, derivative oligonucleotides in which the ribose in DNA is replaced with 2′-O-propylribose, and Examples thereof include derivative oligonucleotides in which ribose in the oligonucleotide is substituted with 2′-methoxyethoxyribose. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also be conservatively modified (eg, degenerate codon substitutes) and complementary sequences, as well as those explicitly indicated. Is contemplated. Specifically, a degenerate codon substitute creates a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-). 98 (1994)). Genes such as extracellular matrix proteins such as fibronectin usually take this polynucleotide form. The molecule to be transfected is also this polynucleotide.
The term “nucleic acid molecule” is also used herein interchangeably with nucleic acids, oligonucleotides, and polynucleotides and includes cDNA, mRNA, genomic DNA, and the like. As used herein, nucleic acids and nucleic acid molecules can be included within the concept of the term “gene”. Nucleic acid molecules encoding certain gene sequences also include “splice variants”. Similarly, a particular protein encoded by a nucleic acid encompasses any protein encoded by a splice variant of that nucleic acid. As the name suggests, a “splice variant” is the product of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (another) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The production mechanism of splice variants varies, but includes exon alternative splicing. Other polypeptides derived from the same nucleic acid by read-through transcription are also encompassed by this definition. Any product of a splicing reaction (including recombinant forms of splice products) is included in this definition. Thus, herein, useful extracellular matrix proteins such as, for example, collagen, fibronectin, laminin, can also include splice variants thereof.
As used herein, “gene” refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on the chromosome. Those that define the primary structure of a protein are called structural genes, and those that influence the expression are called regulatory genes (for example, promoters). In the present specification, genes include structural genes and regulatory genes unless otherwise specified. Recent genome sequencing has attracted attention for parts that are neither structural genes nor regulatory genes, suggesting that they play a role in life. Thus, it is understood that a gene includes a nucleic acid present in a living organism and factors that determine a genetic trait defined by the nucleic acid. Therefore, the term “collagen gene” usually includes both a structural gene of collagen and a promoter of collagen. As used herein, “gene” may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein” “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”. As used herein, “gene product” also refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein” “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” expressed by a gene. Is included. A person skilled in the art can understand what a gene product is, depending on the situation.
As used herein, “homology” of sequences (eg, nucleic acid sequences, amino acid sequences, etc.) refers to the degree of identity of two or more gene sequences with each other. Therefore, the higher the homology between two genes, the higher the sequence identity or similarity. Whether two genes have homology can be examined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, hybridization methods under stringent conditions. When directly comparing two gene sequences, the DNA sequence between the gene sequences is typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% are identical, the genes are homologous. In the present specification, “similarity” of sequences (for example, nucleic acid sequences, amino acid sequences, etc.) refers to two or more gene sequences when conservative substitutions are considered positive (identical) in the above homology. The degree of identity with each other. Thus, if there is a conservative substitution, identity and similarity differ depending on the presence of the conservative substitution. When there is no conservative substitution, identity and similarity indicate the same numerical value.
In this specification, the comparison of similarity, identity and homology between amino acid sequences and base sequences is calculated using default parameters in FASTA, which is a sequence analysis tool.
In the present specification, the “amino acid” may be natural or non-natural as long as the object of the present invention is satisfied. “Amino acid derivative” or “amino acid analog” refers to an amino acid that is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such amino acid derivatives and amino acid analogs are well known in the art.
As used herein, “natural amino acid” means an L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, γ-carboxyglutamic acid, arginine, ornithine , And lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
As used herein, “unnatural amino acid” means an amino acid that is not normally found naturally in proteins. Examples of non-natural amino acids include norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, homo-arginine D-form or L-form and D-phenylalanine.
As used herein, “amino acid analog” refers to a molecule that is not an amino acid but is similar to the physical properties and / or function of an amino acid. Examples of amino acid analogs include ethionine, canavanine, 2-methylglutamine and the like. Amino acid mimetics refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.
In the present specification, the “nucleotide” may be natural or non-natural, and includes a nucleotide derivative or a nucleotide variant as long as the target function can be exhibited. “Nucleotide derivative” or “nucleotide analog” refers to a substance that is different from a naturally occurring nucleotide but has a function similar to that of the original nucleotide. Such nucleotide derivatives and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such nucleotide derivatives and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioate, phosphoramidate, methylphosphonate, chiral methylphosphonate, 2-O-methylribonucleotide, peptide-nucleic acid (PNA). .
Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by a generally recognized one letter code.
The character codes are as follows.
amino acid
3 letter symbol 1 letter symbol Meaning
Ala A Alanine
Cys C cysteine
Asp D aspartic acid
Glu E Glutamic acid
Phe F Phenylalanine
Gly G Glycine
His H histidine
Ile I Isoleucine
Lys K lysine
Leu L Leucine
Met M Methionine
Asn N Asparagine
Pro P Proline
Gln Q Glutamine
Arg R arginine
Ser S Serine
Thr T threonine
Val V Valin
Trp W Tryptophan
Tyr Y tyrosine
Asx asparagine or aspartic acid
Glx glutamine or glutamic acid
Xaa Unknown or other amino acid.
base
Symbol Meaning
a Adenine
g Guanine
c cytosine
t thymine
u Uracil
r Guanine or adenine purine
y Thymine / uracil or cytosine pyrimidine
m Adenine or cytosine amino group
k Guanine or thymine / urasilketo group
s Guanine or cytosine
w Adenine or thymine / uracil
b Guanine or cytosine or thymine / uracil
d Adenine or guanine or thymine / uracil
h Adenine or cytosine or thymine / uracil
v Adenine or guanine or cytosine
n Adenine or guanine or cytosine or thymine / uracil, unknown or other base.
As used herein, a “corresponding” amino acid or nucleic acid has the same action as a given amino acid or nucleic acid in a polypeptide molecule or polynucleotide as a reference for comparison in a polypeptide molecule or polynucleotide molecule, Or an amino acid or nucleic acid that is predicted to have an amino acid or nucleic acid that is present at the same position in an active site (for example, an adhesion site of collagen, etc.) It refers to the nucleic acid that encodes it. For example, an antisense molecule can be a similar part in an ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule. Such corresponding amino acids or nucleic acids can be identified using alignment techniques known in the art. Such alignment techniques include, for example, Needleman, SB and Wunsch, CD, J.M. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970 are mentioned, but it is not limited to it.
As used herein, a “corresponding” gene (for example, a polynucleotide or a polypeptide) has the same action as a predetermined gene (for example, a polynucleotide or a polypeptide) in a species as a reference for comparison in a certain species. Or a gene that is predicted to have, and when there are a plurality of genes having such actions, those that have the same origin in evolution. Thus, the corresponding gene of a gene can be an ortholog of that gene. Therefore, the gene corresponding to the mouse collagen gene can also be found in other animals (human, rat, pig, cow, etc.). Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art. Therefore, for example, a corresponding gene in an animal is obtained by using the sequence (for example, SEQ ID NO: 1 to 24) of a gene serving as a reference for the corresponding gene (for example, mouse collagen) as a query sequence (for example, human, It can be found by searching a sequence database of (rat).
As used herein, “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to the purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, Examples include 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids, and lengths expressed in integers not specifically listed here (eg, 11 etc.) are also suitable as lower limits. obtain. In the case of polynucleotides, examples include 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 and more nucleotides. Non-integer lengths (eg, 11 etc.) may also be appropriate as a lower limit. In the present specification, the lengths of polypeptides and polynucleotides can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above, but the above numbers are not absolute, and the upper limit is not limited as long as they have the same function. Alternatively, the above-mentioned number as an adjustment is intended to include a number above and below the number (or, for example, 10% above and below). In order to express such intention, in this specification, “about” may be added before the number. However, it should be understood herein that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of the value. In the present invention, the fragment preferably has a certain size (for example, 5 kDa) or more. Without being bound by theory, it seems that a certain size is necessary to function as a cell adhesion molecule.
By the term “region” as used herein is meant a physically contiguous portion of the primary structure of a biomolecule. In the case of a protein, a region is defined by a contiguous portion of the amino acid sequence of the protein. The term “domain” is defined herein to refer to the structural portion of a biomolecule that contributes to the known or suspected function of the biomolecule. A domain can have the same extent as a region or portion thereof; a domain can also incorporate a portion of a biomolecule that is distinct from a particular region in addition to all or a portion of the region. Examples of domains of cell adhesion molecules of the present invention include, but are not limited to, signal peptides, extracellular (ie, N-terminal) domains, leucine rich repeat domains, RGD portions, and other conserved regions.
In the present specification, “polynucleotide hybridizing under stringent conditions” refers to well-known conditions commonly used in the art. A colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method, or the like is used with a polynucleotide selected from among polynucleotides used in the present invention (for example, those encoding collagen I) as a probe. Thus, such a polynucleotide can be obtained. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then 0.1 to 2 times the concentration. Means a polynucleotide that can be identified by washing a filter under conditions of 65 ° C. using a SSC (saline-sodium citrate) solution (composition of 1-fold concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). To do. Hybridization was performed in Molecular Cloning 2nd ed. , Current Protocols in Molecular Biology, Supplements 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford Universe. Here, the sequence containing only the A sequence or only the T sequence is preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions. The “hybridizable polynucleotide” refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions. Specifically, the hybridizable polynucleotide is a polynucleotide having at least 60% homology with the base sequence of DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention, preferably 80% The polynucleotide which has the above homology, More preferably, the polynucleotide which has 95% or more of homology can be mentioned.
As used herein, “highly stringent conditions” are designed to allow hybridization of DNA strands having a high degree of complementarity in nucleic acid sequences and to exclude hybridization of DNA having significant mismatches. Say conditions. Hybridization stringency is primarily determined by temperature, ionic strength, and the conditions of denaturing agents such as formamide. Examples of “highly stringent conditions” for such hybridization and washing are 0.0015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, 65-68 ° C., or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M citric acid. Sodium, and 50% formamide, 42 ° C. For such highly stringent conditions, see Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, N, Y. 1989); and Anderson et al. Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach, IV, IRL Press Limited (Oxford, England). See Limited, Oxford, England. If necessary, more stringent conditions (eg, higher temperature, lower ionic strength, higher formamide, or other denaturing agents) may be used. Other agents can be included in the hybridization and wash buffers for the purpose of reducing non-specific hybridization and / or background hybridization. Examples of such other agents include 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinyl pyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (NaDodSO ₄ Or SDS), Ficoll, Denhardt solution, sonicated salmon sperm DNA (or another non-complementary DNA) and dextran sulfate, although other suitable agents may also be used. The concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. Hybridization experiments are usually performed at pH 6.8-7.4; however, at typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is almost pH independent. Anderson et al. , Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach, Chapter 4, IRL Press Limited (Oxford, England).
Factors that affect the stability of the DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by one of ordinary skill in the art to apply these variables and to allow different sequence related DNAs to form hybrids. The melting temperature of a perfectly matched DNA duplex can be estimated by the following equation:
Tm (° C.) = 81.5 + 16.6 (log [Na ⁺ ]) + 0.41 (% G + C) −600 / N−0.72 (% formamide)
Where N is the length of the double chain formed and [Na ⁺ ] Is the molar concentration of sodium ions in the hybridization or wash solution and% G + C is the percentage of (guanine + cytosine) bases in the hybrid. For imperfectly matched hybrids, the melting temperature decreases by about 1 ° C. for each 1% mismatch.
As used herein, “moderately stringent conditions” refers to conditions under which a DNA duplex having a higher degree of base pair mismatch than can be generated under “highly stringent conditions”. . Examples of representative “moderately stringent conditions” are 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, 50-65 ° C., or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, and 20 % Formamide, 37-50 ° C. By way of example, “moderately stringent” conditions at 50 ° C. in 0.015 M sodium ion tolerate a mismatch of about 21%.
It will be appreciated by those skilled in the art that there may not be a complete distinction between “highly” stringent conditions and “moderate” stringent conditions herein. For example, at 0.015M sodium ion (no formamide), the melting temperature of perfectly matched long DNA is about 71 ° C. In washing at 65 ° C. (same ionic strength), this allows about 6% mismatch. In order to capture more distant related sequences, one of ordinary skill in the art can simply decrease the temperature or increase the ionic strength.
For oligonucleotide probes up to about 20 nt, a reasonable estimate of the melting temperature in 1M NaCl is
Tm = (2 ° C. for one AT base) + (4 ° C. for one GC base pair)
Provided by. The sodium ion concentration in 6 × sodium citrate (SSC) is 1 M (see Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes, page 683, Brown and Fox (ed.) (1981)).
The natural nucleic acid encoding the protein used in the present invention is, for example, one of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, etc. It is easily separated from a cDNA library having PCR primers and hybridization probes containing portions. Preferred nucleic acids of the invention are essentially 1% bovine serum albumin (BSA); 500 mM sodium phosphate (NaPO ₄ ); 1 mM EDTA; hybridization buffer containing 7% SDS at a temperature of 42 ° C., and essentially 2 × SSC (600 mM NaCl; 60 mM sodium citrate); wash buffer containing 0.1% SDS at 50 ° C. 1% bovine serum albumin (BSA); preferably 50 mM sodium phosphate (NaPO4); 15% formamide; 1 mM EDTA; 7% SDS under low stringency conditions defined by Most preferably essentially under low stringent conditions as defined by a hybridization buffer containing, and wash buffer containing essentially 1 × SSC (300 mM NaCl; 30 mM sodium citrate) at 50 ° C .; 1% SDS 1% bovine serum albumin (BSA) at a temperature of 50 ° C. ; 200 mM sodium phosphate (NaPO ₄ ); 15% formamide; 1 mM EDTA; hybridization buffer containing 7% SDS, and essentially 0.5 × SSC at 65 ° C. (150 mM NaCl; 15 mM sodium citrate); wash buffer containing 0.1% SDS One or a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, etc. under low stringency conditions defined by the solution It can hybridize.
In the present specification, “search” refers to finding another nucleobase sequence having a specific function and / or property using a nucleobase sequence electronically or biologically or by other methods. Say. As an electronic search, BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-). 2448 (1988)), the Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147; 195-197 (1981)), and the Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:44). -453 (1970)) and the like. Biological searches include stringent hybridization, macroarrays with genomic DNA affixed to nylon membranes, microarrays affixed to glass plates (microarray assays), PCR, and in situ hybridization. It is not limited to. In the present specification, it is intended that Fn1 should also include a corresponding gene identified by such an electronic search or biological search.
In this specification, “introduction” of a substance into a cell means that the substance enters into the cell membrane. Whether the substance has been introduced or not is determined by, for example, labeling the substance itself (for example, using a fluorescent label, chemiluminescent label, phosphorescence, radioactivity, etc.) and detecting the label, or due to the substance Changes in cells (eg gene expression, signal transduction, events due to binding to intracellular receptors, metabolic changes, etc.) physical (eg visual inspection), chemical (measurement of secretions), biochemical, It can be determined by biological measurement. Accordingly, such “introduction” includes not only simple transfer of substances such as proteins and nucleic acids into cells, but also operations such as transfection, transformation, and transduction, which are usually called genetic manipulations.
As used herein, “foreign substance” refers to a substance that is intended to be introduced into cells. The foreign substance contemplated by the present invention refers to a substance that is not introduced into cells under normal conditions. Thus, substances that can be introduced into cells under normal conditions by diffusion or hydrophobic interactions are excluded from the important aspects of the present invention. Examples of target substances that are not introduced into cells under normal conditions include, for example, proteins (polypeptides), RNA, DNA, sugars (particularly polysaccharides), and complex molecules (for example, glycoproteins, PNAs, etc.) between them. Examples include, but are not limited to, a complex molecule (eg, glycolipid), viral vector, and other compounds.
In this specification, “interaction” means that when two objects are referred to, the two objects exert a force on each other. Examples of such interactions include, but are not limited to, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, etc. Not. Preferably, the interaction may be a normal interaction that occurs in vivo, such as a hydrogen bond, a hydrophobic interaction.
As used herein, “contact” means that two substances (eg, a composition and a cell) exist at a sufficiently close distance to interact with each other.
(Gene modification)
Although cell adhesion molecules used in the present invention often take the form of gene products, it is understood that such gene products may be variants thereof as described above. Therefore, the present invention can also use substances produced by the following genetic modification techniques.
In certain protein molecules, certain amino acids contained in the sequence can be replaced with other amino acids in the protein structure, such as, for example, the cationic region or the binding site of a substrate molecule, without an apparent reduction or loss of interaction binding capacity. . It is the protein's ability to interact and the nature that defines the biological function of a protein. Thus, specific amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence or at the level of its DNA coding sequence, resulting in proteins that still retain their original properties after substitution. Thus, various modifications can be made in the peptide disclosed herein or in the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.
In designing such modifications, the hydrophobicity index of amino acids can be considered. The importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions in proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ. Mol. Biol. 157 ( 1): 105-132, 1982). The hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the protein produced and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.). Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on their hydrophobicity and charge properties. They are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1 .8); Glycine (−0.4); Threonine (−0.7); Serine (−0.8); Tryptophan (−0.9); Tyrosine (−1.3); Proline (−1.6) ); Histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9) And arginine (-4.5)).
It is well known in the art that one amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still result in a protein having a similar biological function (eg, an equivalent protein in enzymatic activity). It is. In such amino acid substitution, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+3. 0 ± 1); glutamic acid (+ 3.0 ± 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (−0.4); proline ( Alanine (−0.5); histidine (−0.5); cysteine (−1.0); methionine (−1.3); valine (−1.5); leucine (−0.5 ± 1); -1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (-3.4). It is understood that an amino acid can be substituted with another that has a similar hydrophilicity index and can still provide a biological equivalent. In such amino acid substitution, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5.
In the present invention, “conservative substitution” refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the amino acid to be replaced with the original amino acid is similar as described above. Examples of conservative substitutions include those having a hydrophilicity index or hydrophobicity index within ± 2, preferably within ± 1, and more preferably within ± 0.5. But not limited to them. Thus, examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine, and Examples include, but are not limited to, isoleucine.
In the present specification, the “variant” refers to a substance in which a part of the original substance such as a polypeptide or polynucleotide is changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles refer to genetic variants that belong to the same locus and are distinguished from each other. Therefore, an “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship with a gene. Such allelic variants usually have the same or very similar sequence as their corresponding alleles and usually have nearly the same biological activity but rarely have different biological activities. May have. “Species homologue or homolog” means homology (preferably 60% or more, more preferably 80% or more) with a gene at the amino acid level or nucleotide level in a certain species. 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher homology). The method for obtaining such species homologues will be apparent from the description herein. An “ortholog” is also called an orthologous gene and refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, in the case of the hemoglobin gene family with multiple gene structures, the human and mouse α-hemoglobin genes are orthologs, but the human α- and β-hemoglobin genes are paralogs (genes generated by gene duplication). . Orthologs are useful for estimating molecular phylogenetic trees. Orthologs of the present invention can also be useful in the present invention, since orthologs can usually perform the same function as the original species in another species.
“Conservative (modified) variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. Conservatively modified variants with respect to a particular nucleic acid sequence refer to nucleic acids that encode the same or essentially the same amino acid sequence, and are essentially identical if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence. An array. Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be altered to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such nucleic acid variations are “silent modifications (mutations),” which are one species of conservatively modified mutations. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of that nucleic acid. In the art, each codon in a nucleic acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan), produces a functionally identical molecule. It is understood that it can be modified. Thus, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that greatly affects the conformation of the polypeptide. Such base sequence modification methods include restriction enzyme digestion, DNA polymerase, Klenow fragment, DNA ligase treatment and other ligation treatments, and site-specific base substitution using synthetic oligonucleotides (specification). Site-directed mutagenesis; Mark Zoller and Michael Smith, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983)), but other modifications may also be made by methods usually used in the field of molecular biology. it can.
As used herein, in addition to amino acid substitutions, amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides. Amino acid substitution means that the original peptide is substituted with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. The addition of amino acids means that one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added to the original peptide chain. Deletion of amino acids means deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide. Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like. The amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
As used herein, the term “peptide analog” or “peptide derivative” refers to a compound that is different from a peptide, but equivalent to at least one chemical or biological function of the peptide. Thus, peptide analogs include those in which one or more amino acid analogs or amino acid derivatives are added or substituted to the original peptide. Peptide analogs have the same function as the original peptide (for example, similar pKa values, similar functional groups, similar binding modes with other molecules, Such additions or substitutions are made so as to be substantially similar to (eg, similarity in sex). Such peptide analogs can be made using techniques well known in the art. Thus, a peptide analog can be a polymer that includes an amino acid analog.
As used herein, “polynucleotide analog” and “nucleic acid analog” are compounds different from a polynucleotide or nucleic acid, but are equivalent to at least one chemical function or biological function of a polynucleotide or nucleic acid. Say. Thus, polynucleotide analogs or nucleic acid analogs include those in which one or more nucleotide analogs or nucleotide derivatives are added or substituted to the original peptide.
As used herein, a nucleic acid molecule may have a portion of its nucleic acid sequence deleted or otherwise as long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the native polypeptide. It may be substituted with a base, or another nucleic acid sequence may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end. Alternatively, it may be a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a gene encoding a polypeptide and encodes a polypeptide having substantially the same function as the polypeptide. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.
Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. For example, a site-specific displacement induction method, a hybridization method, or the like may be combined with these methods.
As used herein, “substitution, addition or deletion” of a polypeptide or polynucleotide is a substitution of an amino acid or its substitute, or a nucleotide or its substitute for the original polypeptide or polynucleotide, respectively. , Adding or removing. Such substitution, addition, or deletion techniques are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. The number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as it is one or more, and such a number may be a function (for example, information on hormones, cytokines) in a variant having the substitution, addition or deletion. As long as the transmission function is maintained, it can be increased. For example, such a number can be one or several, and preferably can be within 20%, within 10%, or less than 100, less than 50, less than 25, etc. of the total length.
As used herein, an “isolated” biological factor (eg, a nucleic acid or protein, etc.) refers to other biological factors within the cells of the organism in which it is naturally occurring (eg, When it is a nucleic acid, it is substantially separated from a non-nucleic acid and a nucleic acid containing a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid; Or it is purified. “Isolated” nucleic acids and proteins include nucleic acids and proteins purified by standard purification methods. Thus, isolated nucleic acids and proteins include chemically synthesized nucleic acids and proteins.
As used herein, a “purified” biological agent (such as a nucleic acid or protein) refers to a product from which at least a part of the factors naturally associated with the biological agent has been removed. Thus, typically, the purity of a biological agent in a purified biological agent is higher (ie, enriched) than the state in which the biological agent is normally present.
The terms “purified” and “isolated” as used herein are preferably at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably Means that at least 98% by weight of the same type of biological agent is present.
(Gene manipulation)
In this specification, when referring to genetic manipulation, “vector” or “recombinant vector” refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell. Such vectors can be autonomously replicated in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, individual animals and individual plants, or can be integrated into chromosomes. Examples include those containing a promoter at a position suitable for nucleotide transcription. Among vectors, a vector suitable for cloning is referred to as “cloning vector”. Such cloning vectors usually contain multiple cloning sites that contain multiple restriction enzyme sites. Such restriction enzyme sites and multiple cloning sites are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select and use them according to the purpose. Such techniques are described in the literature described herein (eg, Sambrook et al., Supra).
As used herein, “expression vector” refers to a nucleic acid sequence in which various regulatory elements are operably linked in a host cell in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression. Regulatory elements can preferably include terminators, selectable markers such as drug resistance genes, and enhancers. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, animal) and the type of regulatory elements used can vary depending on the host cell.
Recombinant vectors for prokaryotic cells include pcDNA3 (+), pBluescript-SK (+/-), pGEM-T, pEF-BOS, pEGFP, pHAT, pUC18, pFT-DEST. ^TM 42 GATEWAY (Invitrogen) and the like are exemplified.
Recombinant vectors for animal cells include pcDNAI / Amp, pcDNAI, pCDM8 (all available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-229 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)], pAMo, pAMoA [J. Biol. Chem. , 268, 22782-2787 (1993)], retroviral expression vectors based on Murine Stem Cell Virus (MSCV), pEF-BOS, pEGFP and the like.
Recombinant vectors for plant cells include, but are not limited to, pPCVICEn4HPT, pCGN1548, pCGN1549, pBI221, pBI121 and the like.
In the present specification, the terminator refers to a sequence that is located downstream of a region encoding a protein of a normal gene and is involved in termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA and addition of a poly A sequence. It is known that the terminator is involved in the stability of mRNA and affects the expression level of the gene.
In the present specification, the term “promoter” refers to a region on DNA that determines the initiation site of gene transcription and directly regulates its frequency, and is usually a base sequence that initiates transcription upon binding of RNA polymerase. . Therefore, in this specification, the part which has the function of the promoter of a certain gene is called "promoter part." Since the promoter region is usually a region within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region, if the protein coding region in the genomic base sequence is predicted using DNA analysis software, The promoter region can be estimated. The putative promoter region varies for each structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is present within about 2 kbp upstream from the first exon translation start point.
As used herein, “enhancer” refers to a sequence used to increase the expression efficiency of a target gene. Such enhancers are well known in the art. A plurality of enhancers may be used, but one may be used or may not be used.
As used herein, “silencer” refers to a sequence having a function of suppressing and resting gene expression. In the present invention, any silencer may be used as long as it has the function, and the silencer may not be used.
As used herein, “operably linked” means under the control of a transcriptional translational regulatory sequence (eg, promoter, enhancer, silencer, etc.) or translational regulatory sequence that has the expression (operation) of a desired sequence. To be placed. In order for a promoter to be operably linked to a gene, the promoter is usually placed immediately upstream of the gene, but need not necessarily be adjacent.
In this specification, any technique may be used for introducing a nucleic acid molecule into a cell, and examples thereof include transformation, transduction, and transfection. Such a technique for introducing a nucleic acid molecule is well known in the art and commonly used. For example, Ausubel F. et al. A. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, a separate volume of experimental medicine “Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method” Yodosha, 1997, and the like. Gene transfer can be confirmed using the methods described herein, such as Northern blot, Western blot analysis, or other well-known conventional techniques.
Moreover, as a method for introducing a vector, any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used. For example, transfection, transduction, transformation, etc. (for example, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method, electroporation method, method using particle gun (gene gun), lipofection method, spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], lithium acetate method [J. Bacteriol. , 153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
In the present specification, the “foreign substance introduction reagent” refers to a substance used for promoting the introduction efficiency of a foreign substance. Examples of such reagents include, but are not limited to, cationic polymers, cationic lipids, polyamine reagents, polyimine reagents, calcium phosphate, and the like. Such a reagent usually includes a “gene introduction reagent” because it increases the efficiency of nucleic acid introduction.
In the present specification, the “gene introduction reagent” refers to a reagent used for promoting introduction efficiency in a method for introducing a nucleic acid (normally encoding a gene, but not limited thereto). Examples of such gene introduction reagents include, but are not limited to, cationic polymers, cationic lipids, polyamine reagents, polyimine reagents, calcium phosphate, and the like. Specific examples of reagents used in transfection include reagents commercially available from various sources, such as Effectene Transfection Reagent (cat. No. 301425, Qiagen, CA), TransFast. ^TM Transfection Reagent (E2431, Promega, WI), Tfx ^TM −20 Reagent (E2391, Promega, WI), SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA), PolyFect Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA), LipofectAMINE 2000 4) conc. (101-30, Polyplus-translation, France) and ExGen 500 (R0511, Fermentas Inc., MD) and the like.
Foreign substance introduction efficiency or gene introduction efficiency is a unit area (for example, 1 mm ² Etc.) can be calculated by measuring the number of introduced (expressed) cells or the total signal (fluorescent in the case of fluorescent protein) of the introduced foreign substance (transgene) (for example, fluorescent protein GFP). .
In the present specification, the “transformant” refers to all or a part (tissue or the like) of an organism such as a cell produced by transformation. Examples of the transformant include all or a part (tissue or the like) of living organisms such as cells of prokaryotes, yeasts, animals, plants, insects and the like. A transformant is also referred to as a transformed cell, transformed tissue, transformed host, etc., depending on the subject. The cell used in the present invention may be a transformant.
When a prokaryotic cell is used in the present invention for genetic manipulation or the like, the prokaryotic cell includes, for example, a prokaryotic cell belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc. Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1 are exemplified. Or in this invention, the cell isolate | separated from the natural product can also be used.
Examples of animal cells that can be used in genetic manipulation and the like in this specification include mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, BHK cells, African green monkey kidney cells, humans Examples include leukemia cells, HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299), and human colon cancer cell lines. Mouse myeloma cells such as ps20 and NSO, rat myeloma cells such as YB2 / 0, human fetal kidney cells such as HEK293 (ATCC: CRL-1573), human leukemia cells such as BALL-1 and Africa COS-1, COS-7 as the kidney monkey cells, HCT-15 as the human colon cancer cell line, human neuroblastoma SK-N-SH, SK-N-SH-5Y, mouse neuroblastoma Neuro2A, etc. Is exemplified. Alternatively, primary cultured cells can also be used in the present invention.
Plant cells that can be used in the present specification for genetic manipulation and the like include callus or a part thereof and suspension culture cells, solanaceae, gramineous, cruciferous, rose, legume, cucurbitaceae, perilla, lily , But not limited to, cells of plants such as red crustaceae and ceraceae.
As used herein, “detection” or “quantification” of gene expression (eg, mRNA expression, polypeptide expression) can be accomplished using suitable methods including, for example, mRNA measurement and immunoassay methods. Examples of molecular biological measurement methods include Northern blotting, dot blotting, and PCR. Examples of the immunological measurement method include an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a Western blot method, and an immunohistochemical staining method. Examples of the quantitative method include an ELISA method and an RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (eg, DNA array, protein array). The DNA array is widely outlined in (edited by Shujunsha, separate volume of cell engineering "DNA microarray and latest PCR method"). For protein arrays, see Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32. Examples of gene expression analysis methods include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, in vitro translation and the like. Such further analysis methods are described in, for example, Genome Analysis Experimental Method / Yusuke Nakamura Lab Manual, Editing / Yusuke Nakamura Yodosha (2002), etc., all of which are incorporated herein by reference. Is done.
As used herein, “expression” of a gene product such as a gene, polynucleotide, or polypeptide means that the gene or the like is subjected to a certain action in vivo to take another form. Preferably, a gene, polynucleotide or the like is transcribed and translated into a polypeptide form, but transcription to produce mRNA can also be a form of expression. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed.
“Expression level” refers to the level at which a polypeptide or mRNA is expressed in a target cell or the like. Such expression level is evaluated by any appropriate method including immunoassay methods such as ELISA method, RIA method, fluorescent antibody method, Western blot method, and immunohistochemical staining method using the antibody of the present invention. The amount of expression of the polypeptide of the present invention at the protein level, or mRNA of the polypeptide of the present invention evaluated by any suitable method including molecular biological measurement methods such as Northern blotting, dot blotting, and PCR The expression level at the level is mentioned. “Change in expression level” means an increase in the expression level at the protein level or mRNA level of the polypeptide of the present invention evaluated by any appropriate method including the above immunological measurement method or molecular biological measurement method. Or it means to decrease.
Accordingly, in the present specification, “expression” or “reduction” in “expression amount” of a gene, polynucleotide, polypeptide, etc. means that the amount of expression is greater when the factor of the present invention is applied than when it is not. Is significantly reduced. Preferably, the decrease in expression includes a decrease in the expression level of the polypeptide. As used herein, “expression” or “increase” in “expression” or “expression level” of a gene, polynucleotide, polypeptide, etc. refers to a factor related to gene expression in a cell (eg, a gene to be expressed or regulates it) When the factor is introduced, the amount of expression is significantly increased compared to when the agent is not allowed to act. Preferably, the increase in expression includes an increase in the expression level of the polypeptide. In this specification, “induction” of “expression” of a gene means that a certain factor acts on a certain cell to increase the expression level of the gene. Therefore, induction of expression means that the gene is expressed when no expression of the gene is seen, and the expression of the gene is increased when the expression of the gene is already seen. Is included.
In the present specification, the expression "specifically expresses" a gene means that the gene is expressed at a different (preferably higher) level in a specific part or time of the plant than other parts or time. . “Specific expression” may be expressed only at a certain site (specific site) or may be expressed at other sites. The expression specifically preferably means that it is expressed only at a certain site.
As used herein, “biological activity” refers to an activity that a certain factor (eg, polypeptide or protein) may have in vivo, and exhibits various functions (eg, transcription promoting activity). Activity is included. For example, when collagen interacts with its ligand, its biological activity includes the formation of conjugates or other biological changes. In another preferred embodiment, such biological activity can be cell adhesion activity, heparin binding activity, collagen binding activity, and the like. The cell adhesion activity can be measured by measuring the adhesion rate of the cell to the solid phase after cell seeding and treating it as the adhesion activity. The heparin binding activity can be measured by performing affinity chromatography such as a heparin-immobilized column and confirming that it binds thereto. Collagen binding activity can be measured by performing affinity chromatography such as a collagen-immobilized column and confirming that it binds thereto. For example, when a factor is an enzyme, the biological activity includes the enzyme activity. In another example, when an agent is a ligand, the ligand includes binding to the corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art (see Molecular Cloning, Current Protocols (cited herein), etc.).
As used herein, the term “kit” refers to a unit in which parts to be provided (eg, reagents, particles, etc.) are usually divided into two or more compartments. This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that should not be provided in a mixed form but is preferably used in a mixed state immediately prior to use. Such kits preferably include instructions that describe how to treat the provided parts (eg, reagents, particles, etc.).
(Method for producing polypeptide)
The polypeptide used in the present invention is obtained by culturing a transformant derived from a microorganism or animal cell having a recombinant vector into which a DNA encoding the polypeptide is incorporated according to a normal culture method. It can be produced by producing and accumulating a peptide and collecting the polypeptide of the present invention from the culture.
The method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host. As a medium for culturing a transformant obtained using a prokaryote such as E. coli or a eukaryote such as yeast as a host, a carbon source that can be assimilated by the organism of the present invention (for example, glucose, fructose, sucrose, and the like) Molasses, carbohydrates such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, alcohols such as ethanol and propanol), nitrogen sources (eg, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate) Ammonium salts of various inorganic acids or organic acids such as, other nitrogen-containing substances, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and Its digests, etc.), inorganic salts (eg, phosphoric acid A medium capable of efficiently cultivating a transformant, and the like, and the like, for example, bismuth, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. Natural medium, synthetic medium (for example, RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] or fetal bovine serum or the like was added to these mediums. It may be used any of the earth, etc.). The culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture, but is not limited thereto. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin or tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
In order to isolate or purify a polypeptide from a culture of a transformant transformed with a nucleic acid sequence encoding the polypeptide used in the present invention, a conventional polypeptide (known in the art). For example, an enzyme isolation or purification method can be used. For example, when the polypeptide of the present invention is secreted outside the transformant for producing the polypeptide of the present invention, the culture is treated by a method such as centrifugation to obtain a soluble fraction. Get minutes. From the soluble fraction, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent precipitation method, diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose (Pharmacia), DIAION HPA-75 (Mitsubishi Kasei), etc. Ion exchange chromatography, cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), hydrophobic chromatography using a resin such as Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose, and molecular sieve A purified preparation can be obtained by using a gel filtration method, an affinity chromatography method, a chromatofocusing method, or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.
When the polypeptide used in the present invention accumulates in a dissolved state in the transformant cells, the culture is centrifuged to collect the cells in the culture, wash the cells, and then A cell-free extract is obtained by crushing cells with a sonicator, French press, Manton Gaurin homogenizer, Dynomill or the like. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 Anion exchange chromatography using an iso-resin, cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF, hydrophobic chromatography using a resin such as Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose, and molecular sieve A purified sample can be obtained by using a gel filtration method, an affinity chromatography method, a chromatofocusing method, or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.
When the polypeptide used in the present invention is expressed by forming an insoluble substance in the cells, similarly, the cells are collected and then disrupted and centrifuged from the precipitate fraction obtained by a conventional method. After recovering the polypeptide of the present invention, an insoluble substance of the polypeptide is solubilized with a polypeptide denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a dilute solution that does not contain the polypeptide denaturing agent or the concentration of the polypeptide denaturing agent does not denature the polypeptide, and forms the polypeptide of the present invention into a normal three-dimensional structure. Then, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
In addition, conventional protein purification methods [see, for example, J. Evan. Sadler et al .: Methods in Enzymology, 83, 458]. In addition, if the polypeptide used in the present invention can be used as a fusion protein with other proteins, it can be purified using affinity chromatography using a substance having affinity for the fused protein. [Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)]. Alternatively, the method of Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227-8231 (1989), Genes Develop. , 4, 1288 (1990)], such a polypeptide can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G. In addition, the polypeptide used in the present invention can be produced as a fusion protein with a FLAG peptide and purified by affinity chromatography using an anti-FLAG antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop. , 4, 1288 (1990)].
Furthermore, it can also be purified by affinity chromatography using an antibody against the polypeptide itself of the present invention. The polypeptide of the present invention can be produced by known methods [J. Biomolecular NMR, 6,129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biol. Biochem. , 110, 166-168 (1991)], can be produced using an in vitro transcription / translation system.
Based on the amino acid information of the polypeptide obtained above, the polypeptide of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). can do. Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Pharmacia Biotech, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation.
(Induction of cell differentiation)
As used herein, “differentiation” generally refers to the separation of one system into two or more qualitatively different systems and functions and / or morphology when used with cells, tissues or organs. Means specialization. With differentiation, pluripotency usually decreases or disappears. By differentiation, for example, epidermal cells, pancreatic parenchymal cells, pancreatic duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, neurons, vascular endothelial cells, pigment cells, smooth muscle cells They may differentiate into morphologically different cells such as adipocytes, bone cells, and chondrocytes, or dendrites may extend or proliferate like nerve cells. When used in the present invention, differentiated differentiated cells may take the form of a population or tissue.
As used herein, “differentiation induction” and “promotion of differentiation” are used interchangeably, and when referring to cells, refers to inducing or promoting differentiation. Therefore, differentiation induction includes increasing the speed of differentiation and directing cells in which differentiation is stopped or in the direction of dedifferentiation to the direction of differentiation.
In the present specification, “differentiation factor”, “differentiation inducing factor” or “differentiation promoting factor” is used interchangeably and may be a factor (for example, chemical substance, temperature, etc.) that promotes or induces differentiation into differentiated cells. Any factor may be used. Examples of such factors include various environmental factors. Examples of such factors include temperature, humidity, pH, salt concentration, nutrition, metal, gas, organic solvent, pressure, and chemical substances. (For example, steroids, antibiotics, etc.) or any combination thereof, but not limited thereto. Representative differentiation factors include, but are not limited to, cell bioactive substances. Representative examples of such factors include DNA demethylating agents (such as 5-azacytidine), histone deacetylating agents (such as trichostatin), nuclear receptor ligands (eg, retinoic acid (ATRA), vitamins) D ₃ , T3, etc.), cell growth factor (activin, insulin-like growth factor (IGF) -1, fibroblast growth factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF), transforming growth factor (TGF) -β, nerve growth Factor (NGF), bone morphogenetic protein (BMP) 2/4, etc.), cytokine (LIF, IL-2, IL-6 etc.), hexamethylene bisacetamide, dimethylacetamide, dibutyl cAMP, dimethylthiol sulfoxide, iododeoxyuridine, Examples include, but are not limited to, hydroxylurea, cytosine arabinoside, mitomycin C, sodium butyrate, aphidicolin, fluorodeoxyuridine, polybrene, selenium and the like.
Specific differentiation factors include the following. These differentiation factors can be used alone or in combination.
A) cornea: epidermal growth factor (EGF);
B) Skin (keratinocytes): TGF-β, FGF-7 (KGF: keratinocyte growth factor), EGF
C) Vascular endothelium: VEGF, FGF, angiopoietin
D) Kidney: LIF, BMP, FGF, GDNF
E) Heart: HGF, LIF, VEGF
F) Liver: HGF, TGF-β, IL-6, EGF, VEGF
G) Umbilical cord endothelium: VEGF
H) Intestinal epithelium: EGF, IGF-I, HGF, KGF, TGF-β, IL-11
I) Nerve: nerve growth factor (NGF), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor), neurotrophin, IL-6, TGF-β, TNF
J) Glial cells: TGF-β, TNF-α, EGF, LIF, IL-6
K) Peripheral nerve cells: bFGF, LIF, TGF-β, IL-6, VEGF,
L) Lung (alveolar epithelium): TGF-β, IL-13, IL-1β, KGF, HGF
M) Placenta: growth hormone (GH), IGF, prolactin, LIF, IL-1, activin A, EGF
N) Pancreatic epithelium: growth hormone, prolactin
O) Pancreatic islets of Langerhans: TGF-β, IGF, PDGF, EGF, TGF-β, TRH (thyropin)
P) Synovial epithelium: FGF, TGF-β
Q) Osteoblast: BMP, FGF
R) Chondroblast: FGF, TGF-β, BMP, TNF-α
S) Retinal cells: FGF, CNTF (Ciliary neurotrophic factor)
T) Adipocytes: insulin, IGF, LIF
U) Muscle cells: LIF, TNF-α, FGF.
Any culture solution can be used for the cells of the present invention as long as the cells are maintained or differentiated into desired differentiated cells. Examples of such a culture solution include, but are not limited to, DMEM, P199, MEM, HBSS, Ham's F12, BME, RPMI 1640, MCDB104, MCDB153 (KGM), and mixtures thereof. Such cultures include corticosteroids such as dexamethasone, insulin, glucose, indomethacin, isobutyl-methylxanthine (IBMX), ascorbate-2-phosphate, ascorbic acid and its derivatives, glycerophosphate, estrogen and its derivatives, Progesterone and its derivatives, Androgen and its derivatives, aFGF, bFGF, EGF, IGF, TGFβ, ECGF, BMP, PDGF and other growth factors, pituitary extract, pineal extract, retinoic acid, vitamin D, thyroid hormone, fetal bovine Serum, horse serum, human serum, heparin, sodium bicarbonate, HEPES, albumin, transferrin, selenate (such as sodium selenite), linolenic acid, 3-isobutyl-1-methyl chloride Demethylating agents such as Nthin, 5-Azancytidine, histone deacetylating agents such as trichostatin, cytokines such as activin, LIF, IL-2, IL-6, hexamethylenebisacetamide (HMBA), dimethylacetamide (DMA) , Dibutyl cAMP (dbcAMP), dimethyl sulfoxide (DMSO), iododeoxyuridine (IdU), hydroxyurea (HU), cytosine arabinoside (AraC), mitomycin C (MMC), sodium butyrate (NaBu), polybrene, selenium, Cholera toxin and the like may be included as one or a combination thereof.
(device)
In this specification, “device” refers to a part that can constitute part or all of the apparatus, and is composed of a support (preferably a solid support) and a target substance to be supported on the support. Is done. Such devices include, but are not limited to, chips, arrays, microtiter plates, cell culture plates, petri dishes, films, beads, and the like.
As used herein, “support” refers to a material that can immobilize a substance such as a biomolecule. Support materials can be either covalently bonded or non-covalently bonded to a substance such as a biomolecule used in the present invention or derivatized to have such characteristics. Any solid material to be obtained is mentioned.
As such a material for use as a support, any material capable of forming a solid surface can be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (including alloys) ), Natural and synthetic polymers such as, but not limited to, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon. The support may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, an inorganic insulating material such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide, or silicon nitride can be used. Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate Organic materials such as polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used. In the present invention, a membrane used for blotting, such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane, can also be used. When the material constituting the support is a solid phase, it is particularly referred to herein as “solid support”. In the present specification, it may take the form of a plate, microwell plate, chip, slide glass, film, bead, metal (surface) and the like. The support may be coated or uncoated.
In the present specification, the “liquid phase” is used in the same meaning as commonly used in the art, and usually refers to a state in a solution.
In the present specification, the “solid phase” is used in the same meaning as used in the art, and usually refers to a solid state. In this specification, liquid and solid may be collectively referred to as fluid.
As used herein, “contact” means that two substances (eg, a composition and a cell) exist at a sufficiently close distance to interact with each other.
In this specification, “interaction” means that when two objects are referred to, the two objects exert a force on each other. Examples of such interactions include, but are not limited to, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, etc. Not. Preferably, the interaction may be a normal interaction that occurs in vivo, such as a hydrogen bond, a hydrophobic interaction.
(Substrate / plate / chip / array)
As used herein, “plate” refers to a planar support on which molecules such as antibodies can be immobilized. In the present invention, the plate is preferably based on a glass substrate having a metal thin film containing plastic, gold, silver or aluminum on one side.
As used herein, “substrate” refers to the material (preferably solid) on which the chips or arrays of the invention are constructed. Therefore, the substrate is included in the concept of a plate. The material of the substrate can be any solid, either covalently or noncovalently, that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention or that can be derivatized to have such properties. Materials.
Such materials for use as plates and substrates can be any material that can form a solid surface, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastics, metals (including alloys) Natural and synthetic polymers such as, but not limited to, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon. The substrate may be formed from a plurality of layers of different materials. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used. Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin Organic materials such as polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used. A preferable material for the substrate varies depending on various parameters such as a measuring instrument, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate material from the various materials described above. Glass slides are preferred for transfection arrays. Preferably, such a substrate can be coated.
As used herein, “coating”, when used on a solid support or substrate, refers to the formation of a film of material on the surface of the solid support or substrate and such a film. The coating is performed for various purposes, for example, improving the quality of the solid support and the substrate (for example, improving the lifetime, improving the environmental resistance such as acid resistance), the substance to be bonded to the solid support or the substrate. In many cases, the purpose is to improve the affinity. Herein, the material for such a coating is referred to as a “coating agent”. As such a coating agent, various substances can be used. In addition to the substances used for the solid phase support and the substrate itself, biological substances such as DNA, RNA, protein, and lipid, polymers (for example, poly -L-lysine, MAS (available from Matsunami Glass, Kishiwada, Japan), hydrophobic fluororesin), silane (APS (eg, γ-aminopropylsilane)), metal (eg, gold, etc.) may be used. It is not limited to them. The selection of such materials is within the skill of the artisan and can be selected on a case-by-case basis using techniques well known in the art. In one preferred embodiment, such coatings are poly-L-lysine, silane (eg, epoxy silane or mercapto silane, APS (γ-aminopropyl silane)), MAS, hydrophobic fluororesin, gold and the like. It may be advantageous to use a simple metal. As such a substance, it is preferable to use a substance that is compatible with a cell or an object including the cell (for example, a living body, an organ, etc.).
In this specification, “chip” or “microchip” is used interchangeably and refers to a micro integrated circuit that has various functions and is a part of a system. Examples of the chip include, but are not limited to, a DNA chip and a protein chip.
As used herein, the term “array” refers to a substrate having a pattern or pattern in which compositions (eg, DNA, protein, transfection mixture) including one or more (eg, 1000 or more) target substances are arranged and arranged. For example, the chip itself. Among the arrays, those patterned on a small substrate (eg, 10 × 10 mm) are referred to as microarrays. In this specification, microarrays and arrays are used interchangeably. Accordingly, even a pattern that is larger than the above-described substrate may be called a microarray. For example, an array is composed of a set of desired transfection mixtures that are themselves immobilized on a solid surface or membrane. The array preferably contains at least 10 identical or different antibodies ² , More preferably at least 10 ³ And more preferably at least 10 ⁴ , Even more preferably at least 10 ⁵ Including These antibodies are preferably arranged on a surface of 125 × 80 mm, more preferably 10 × 10 mm. As the format, a microtiter plate of a size such as a 96-well microtiter plate or a 384-well microtiter plate or a size of a slide glass is contemplated. The composition containing the target substance to be immobilized may be one kind or plural kinds. The number of such types can be any number from 1 to the number of spots. For example, a composition containing about 10 types, about 100 types, about 500 types, and about 1000 types of target substances can be immobilized.
Any number of target substances (eg, proteins such as antibodies) can be placed on a solid surface or membrane such as a substrate as described above, but typically 10 per substrate. ⁸ Up to one biomolecule, in other embodiments 10 ⁷ Up to 10 biomolecules ⁶ Up to 10 biomolecules ⁵ Up to 10 biomolecules ⁴ Up to 10 biomolecules ³ Up to 1 biomolecule or 10 ² Up to 10 biomolecules can be placed, but 10 ⁸ A composition containing a target substance exceeding one biomolecule may be arranged. In these cases, the size of the substrate is preferably smaller. In particular, the spot size of a composition comprising a target substance (eg, a protein such as an antibody) can be as small as the size of a single biomolecule (this can be on the order of 1-2 nm). The minimum substrate area is determined in some cases by the number of biomolecules on the substrate. In the present invention, a composition containing a target substance intended to be introduced into a cell is usually arrayed and fixed in a spot shape of 0.01 mm to 10 mm by covalent bonding or physical interaction.
A “spot” of biomolecules can be placed on the array. As used herein, “spot” refers to a certain set of compositions containing a target substance. As used herein, “spotting” refers to producing a spot of a composition containing a target substance on a substrate or plate. Spotting can be done by any method, for example, it can be accomplished by pipetting or the like, or it can be done by automated equipment, such methods are well known in the art.
As used herein, the term “address” refers to a unique location on a substrate and may be distinguishable from other unique locations. The address is suitable for associating with a spot with that address, and can take any shape, with entities at all each address being distinguishable from entities at other addresses (eg, optical). The shape defining the address can be, for example, a circle, an ellipse, a square, a rectangle, or an irregular shape. Therefore, “address” indicates an abstract concept, and “spot” can be used to indicate a specific concept, but in the present specification, if it is not necessary to distinguish between the two, “Spot” may be used interchangeably.
The size defining each address is, among other things, the size of the substrate (the number of addresses on a particular substrate, the amount of composition containing the target substance and / or available reagents, the size of the microparticles and the array thereof are used. Depending on the degree of resolution required for any method, the size can range, for example, from 1-2 nm to several centimeters, but can be any size consistent with the application of the array .
The spatial arrangement and shape defining the address is designed to suit the particular application in which the microarray is used. The addresses can be densely distributed, widely distributed, or subgrouped into a desired pattern appropriate for a particular type of analyte.
Microarrays are widely reviewed in the genome function research protocol (experimental medicine separate volume, experimental lecture 1 in the post-genomic era), genomic medicine science and future genomic medicine (experimental medicine extra number).
Since the data obtained from the microarray is enormous, data analysis software for managing the correspondence between clones and spots, data analysis, etc. is important. As such software, software attached to various detection systems can be used (Ermolaeva O et al. (1998) Nat. Genet. 20: 19-23). The database format includes, for example, a format called GATC (Genetic Analysis Technology Consortium) proposed by Affymetrix.
For microfabrication, see, for example, Campbell, S .; A. (1996). The Science and Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Press; Zaut, P. et al. V. (1996). Micromicroarray Fabrication: a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services; Madou, M .; J. et al. (1997). Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press; Rai-Chudhury, P .; (1997). Handbook of Microlithography, Micromachining, & Microfabrication: Microlithography, etc., which are incorporated by reference in the relevant portions herein.
(Cell adhesion molecule)
In one aspect, the present invention is useful because it has been found that a surprising effect (in addition to immobilization, the introduction efficiency increases dramatically) by the combination of a cell adhesion molecule and a gene introduction reagent. is there.
As used herein, “cell adhesion molecule” or “adhesion molecule” is used interchangeably and refers to the proximity of two or more cells (cell adhesion) or adhesion between a substrate and a cell. A molecule that mediates Generally, a molecule (cell-cell adhesion molecule) relating to cell-cell adhesion (cell-cell adhesion) and a molecule (cell-substrate adhesion molecule) involved in adhesion between cells and extracellular matrix (cell-substrate adhesion). Divided. In the tissue piece of the present invention, any molecule is useful and can be used effectively. Therefore, in the present specification, the cell adhesion molecule includes a protein on the substrate side during cell-substrate adhesion, but in this specification, a protein on the cell side (for example, integrin etc.) is also included. Even so, as long as it mediates cell adhesion, it falls within the concept of cell adhesion molecules or cell adhesion molecules herein.
Whether a certain molecule is a cell adhesion molecule is determined by biochemical quantification (SDS-PAG method, labeled collagen method), immunological quantification (enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunohistological examination), PDR method, hybrid It can be determined by determining that it is positive in an assay such as a hybridization method. Such cell adhesion molecules include collagen (SEQ ID NO: 1-16), integrin, fibronectin (SEQ ID NO: 23-24), laminin (SEQ ID NO: 17-22), vitronectin, fibrinogen, immunoglobulin superfamily (eg, CD2 , CD4, CD8, ICM1, ICAM2, VCAM1), selectin, cadherin and the like. Many of such cell adhesion molecules transmit an auxiliary signal of cell activation by cell-cell interaction into the cell simultaneously with adhesion to the cell. Therefore, the adhesion factor used in the tissue piece of the present invention is preferably one that transmits such an auxiliary signal for cell activation into the cell. This is because the cell activation can promote the proliferation of cells gathered therein and / or cells in the tissue or organ after being applied to a damaged site in a tissue or organ as a tissue piece. Whether such auxiliary signals can be transmitted into cells is determined by biochemical quantification (SDS-PAG method, labeled collagen method), immunological quantification (enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunohistochemistry). Examination) It can be determined by determining that it is positive in an assay called PDR method or hybridization method.
In the present specification, “extracellular matrix” (ECM) is also called “extracellular matrix” and refers to a substance existing between somatic cells regardless of whether they are epithelial cells or non-epithelial cells. The extracellular matrix is responsible not only for tissue support, but also for the construction of the internal environment necessary for the survival of all somatic cells. The extracellular matrix is generally produced from connective tissue cells, but some are also secreted from the cells themselves that possess a basement membrane, such as epithelial cells and endothelial cells. The fiber component is roughly classified into a fiber component and a matrix filling the space, and the fiber component includes collagen fiber and elastic fiber. The basic component of the substrate is glycosaminoglycan (acid mucopolysaccharide), most of which binds to non-collagenous protein to form a polymer of proteoglycan (acid mucopolysaccharide-protein complex). In addition, laminin of the basement membrane, microfibril around the elastic fiber, fiber, and glycoprotein such as fibronectin on the cell surface are included in the substrate. The basic structure is the same in specially differentiated tissues, for example, hyaline cartilage produces chondrocytes that contain a large amount of proteoglycan, characteristically by chondroblasts, and bone produces bone matrix that causes calcification by osteoblasts. . Examples of the extracellular matrix used in the present invention include, but are not limited to, collagen, elastin, proteoglycan, glycosaminoglycan, fibronectin, laminin, elastic fiber, collagen fiber and the like. When used in the present invention, the extracellular matrix preferably has the activity of attracting host autologous cells.
As used herein, “cell adhesion protein” refers to a protein having a function of mediating cell adhesion as described above. Therefore, in the present specification, the cell adhesion protein includes a protein on the substrate side during cell-substrate adhesion, but also includes a protein on the cell side (for example, integrin, etc.). For example, when cultured cells are seeded under serum-free conditions on a substrate (glass or plastic) that adsorbs the protein on the substrate side, the integrin, which is a receptor, recognizes the cell adhesion protein, and the cells adhere to the substrate. The active site of the cell adhesion protein has been elucidated at the amino acid level, and RGD, YIGSR and the like are known (these are collectively referred to as RGD sequences). Therefore, in one preferred embodiment, it may be advantageous that the protein contained in the tissue piece of the present invention comprises an RGD sequence such as RGD, YIGSR. Usually, cell adhesion protein is present in extracellular matrix, cultured cell surface, plasma / serum / various body fluids. Known in vivo functions include not only cell adhesion to the extracellular matrix but also cell migration, proliferation, morphological regulation, and tissue construction. Apart from cellular effects, there are also proteins that exhibit blood coagulation / complement function regulating functions, and proteins having such functions may also be useful in the present invention. Examples of such cell adhesion protein include, but are not limited to, fibronectin, collagen, vitronectin, laminin and the like.
As used herein, “RGD molecule” refers to a protein molecule comprising the amino acid sequence RGD (Arg-Gly-Asp) or a functionally identical sequence thereof. The RGD molecule is characterized by comprising RGD which is an amino acid sequence useful as an amino acid sequence of a cell adhesion active site of a cell adhesion protein or another functionally equivalent amino acid sequence. The RGD sequence was discovered as a cell adhesion site of fibronectin, and was subsequently found in many molecules exhibiting cell adhesion activity such as type I collagen, laminin, vitronectin, fibrinogen, von Willebrand factor, entactin and the like. Since the cell adhesion activity is exhibited when a chemically synthesized RGD peptide is immobilized, the biomolecule in the present invention may be a chemically synthesized RGD molecule. Examples of such RGD molecules include, but are not limited to, the GRGDSP peptide in addition to the above-mentioned naturally occurring molecules. Since RGD sequences are recognized by integrins (eg, fibronectin receptors), which are cell adhesion molecules (and receptors), functionally equivalent molecules of RGD can interact with such integrins. It can be identified by examining.
In this specification, “collagen” is a kind of protein, which is a fiber-forming collagen and is a general term for a region in which three polypeptide chains are wound in a triple helix, and is a scaffold for cell engraftment and proliferation. The one that forms the skeleton. Collagen is the main component of the extracellular matrix of animals. Collagen is also known to have an RGD sequence and exhibit cell adhesion activity. Collagen is known to be contained in about 20-30% of the total protein of animals, and contained in large amounts in skin, tendon, cartilage and the like. As collagen molecules, types I to XIII are known. Usually, one molecule has a triple helical structure consisting of three polypeptide chains, and each chain is often called an α chain. In a collagen molecule, one molecule may consist of one type of α chain, or may consist of a plurality of types of α chains encoded by different genes. The α chain is usually referred to as α1 (I) or the like by adding a number after α, such as α1, α2, α3, and a collagen type. Therefore, in the present invention, for example, [α1 (I) ₂ In addition to naturally occurring collagen molecules such as α2 (I)] (type I collagen), non-naturally occurring combinations of trimers can also be used privately. Most of the primary structure of collagen is [Gly-X-Pro (or hydroxyprolyl)] _n (X is an arbitrary amino acid residue). This structure takes a left-handed helical structure with a 3-residue period. Collagen usually contains hydroxylysine as a special amino acid. Collagen is a glycoprotein, but the sugar is bound to the hydroxyl group of hydroxylysine.
There are two types of collagen: fibrillar collagen or interstitial collagen, which exist in a fibrous form and gather to form collagen fibers. Such fibrogenic collagens include type I, type II, type III, type V, and type XI collagen, which are used in preferred embodiments of the present invention. Other collagens include short chain collagen (VIII type, X type, etc.), basement membrane collagen (IV type, etc.), FACIT collagen (IX type, XII type, XIV type, XVI type, XIX type, etc.), multiplexins. Collagen (XV type, XVIII type, etc.), microfibrillar collagen (type VI, etc.), long chain collagen (type VII, etc.), membrane-bound collagen (XIII type, XVII type, etc.) and the like are all included in the present invention. Can be used. As used herein, “basement membrane collagen” refers to main collagen constituting the basement membrane.
As used herein, “type I collagen” refers to [α1 (I) ₂ α2 (I)], a collagen having a structure of two α1 (I) chains and a heterotriplex of α2 (I) chain polypeptide chains, and a tissue skeleton present in any tissue in the living body, and A functionally equivalent molecule refers to an amino acid sequence of such a polypeptide. Typically, Genbank accession numbers include, but are not limited to, p02454 and p02464 (for example, SEQ ID NOs: 1-4) Etc.). In the present specification, a functionally equivalent molecule of type I collagen can be identified by, for example, an enzyme antibody method or an EIA method.
In this specification, “type IV collagen” is basement membrane collagen, and its molecule is composed of four domains of 7S, NC2, TH2, and NC1, and four molecules are polymerized by N-terminal 7S, and C Collagen that forms a network by polymerization of two molecules at the terminal NC1 or a functionally equivalent molecule thereof, and the amino acid sequence of such a polypeptide is typically Genbank. Accession numbers p02462, p08572, U02520, D17391, P29400, U04845, but are not limited thereto (for example, those described in SEQ ID NOs: 5 to 16). In the present specification, a functionally equivalent molecule of type IV collagen can be identified by, for example, an enzyme antibody method or an EIA method.
(cell)
A “cell” as used herein is defined in the same way as the broadest meaning used in the art, and is a structural unit of a tissue of a multicellular organism, surrounded by a membrane structure that isolates the outside world, Refers to a living organism having self-regenerative ability and having genetic information and its expression mechanism. The cells used herein may be naturally occurring cells or artificially modified cells (eg, fusion cells, genetically modified cells). The source of cells can be, for example, a single cell culture, or such as cells from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or a normally grown cell line Examples include but are not limited to cell mixtures.
The cells used in the present invention can be cells from any organism (eg, any type of unicellular organism (eg, bacteria, yeast) or multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), plants ( For example, monocotyledonous plants, dicotyledonous plants and the like))) may be used. For example, cells derived from vertebrates (eg, larvae, lampreys, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.) are used, and more particularly mammals (eg, single pores, Marsupial, rodent, winged, winged, carnivorous, carnivorous, long-nosed, odd-hoofed, cloven-hoofed, rodent, scale, sea cattle, cetacean, primate , Rodents, rabbit eyes, etc.). In one embodiment, cells derived from primates (eg, chimpanzees, Japanese monkeys, humans), particularly cells derived from humans, are used, but are not limited thereto.
As used herein, “stem cell” refers to a cell having a self-renewal ability and having pluripotency (ie, “pluripotency”). Stem cells are usually able to regenerate the tissue when the tissue is damaged. As used herein, stem cells can be embryonic stem (ES) cells or tissue stem cells (also referred to as tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), but are not limited thereto. In addition, as long as it has the above-mentioned ability, an artificially produced cell (for example, a fusion cell described herein, a reprogrammed cell, etc.) can also be a stem cell. Embryonic stem cells refer to pluripotent stem cells derived from early embryos. Embryonic stem cells were first established in 1981, and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine. Unlike embryonic stem cells, tissue stem cells are cells in which the direction of differentiation is limited, are present at specific positions in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Therefore, tissue stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells have a high nucleus / cytoplasm ratio and poor intracellular organelles. Tissue stem cells generally have pluripotency, have a slow cell cycle, and maintain proliferative ability over the life of the individual. As used herein, a stem cell may be an embryonic stem cell or a tissue stem cell.
When classified according to the site of origin, tissue stem cells are classified into, for example, the skin system, digestive system, myeloid system, and nervous system. Examples of skin tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells. Examples of digestive tissue stem cells include pancreatic (common) stem cells and liver stem cells. Examples of myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. Examples of nervous system tissue stem cells include neural stem cells and retinal stem cells.
In the present specification, “somatic cells” refers to all cells that are cells other than germ cells such as eggs and sperm, and that do not deliver the DNA directly to the next generation. Somatic cells usually have limited or disappeared pluripotency. The somatic cells used in the present specification may be naturally occurring or genetically modified.
Cells can be classified into stem cells derived from ectoderm, mesoderm and endoderm by origin. Cells derived from ectoderm are mainly present in the brain and include neural stem cells. Cells derived from mesoderm are mainly present in bone marrow, and include vascular stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and the like. Endoderm-derived cells are mainly present in organs, and include liver stem cells, pancreatic stem cells, and the like. As used herein, somatic cells may be derived from any germ layer. Preferably, somatic cells may be lymphocytes, spleen cells or testicular cells.
As used herein, “isolated” refers to a substance that is at least reduced, preferably substantially free of naturally associated substances in a normal environment. Thus, an isolated cell refers to a cell that is substantially free of other substances (eg, other cells, proteins, nucleic acids, etc.) that accompany it in its natural environment. When referring to a nucleic acid or polypeptide, “isolated” means, for example, substantially free of cellular material or culture medium when made by recombinant DNA technology, and precursor when chemically synthesized. Refers to a nucleic acid or polypeptide that is substantially free of somatic or other chemicals. An isolated nucleic acid preferably includes sequences that are naturally flanking in the organism from which the nucleic acid is derived (ie, sequences located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid). Absent.
As used herein, “established” or “established” cells maintain certain properties (eg, pluripotency) and the cells continue to grow stably under culture conditions. State. Thus, established stem cells maintain pluripotency.
As used herein, “differentiated cells” refers to cells with specialized functions and morphology (eg, muscle cells, nerve cells, etc.), and unlike stem cells, there is no or almost no pluripotency. . Examples of differentiated cells include epidermal cells, pancreatic parenchymal cells, pancreatic duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, neurons, vascular endothelial cells, pigment cells, Examples include smooth muscle cells, fat cells, bone cells, chondrocytes.
In the present specification, the “primary culture cell” refers to a cell in a state of being cultured until a cell, tissue or organ separated from a living body is implanted and the first passage is performed. Therefore, it is strictly distinguished from the “passaged” cell in which it was planted. Usually, primary cultured cells are difficult to handle, and it is considered quite difficult to introduce foreign substances such as genetic manipulation (for example, transfection).
As used herein, “neuronal cell” refers to a cell that constitutes a structural and functional unit of the nervous system, which is a combination of a cell body and a process that emerges therefrom, or a variant or functional equivalent thereof. Whether it is a nerve cell can be determined by confirming whether nerve transmission occurs. The function of such nerve cells can be confirmed by, for example, a patch clamp method. As a typical example of a neuron, PC12 cells can be used. PC12 cells are cells derived from adrenal medullary brown cells, but their morphology is similar to that of nerve cells. Therefore, PC12 cells are used as typical cultured cells as a model of the nervous system.
The “instruction” of the present specification describes the substance introduction method of the present invention to a user (researcher, experimental assistant, or a person who performs administration such as a doctor or a patient in treatment). . This instruction describes a word indicating a method of using, for example, the composition of the present invention. This instruction is prepared according to the format prescribed by the national supervisory authority in which the present invention is to be implemented, and it is clearly stated that it has been approved by the supervisory authority. The instructions are usually in the form of so-called package inserts in the case of medicines or in the form of manuals in the case of laboratory reagents and are usually provided in paper media, but are not limited thereto, for example It can also be provided in a form such as an electronic medium (for example, a homepage or electronic mail provided on the Internet).
(Description of Preferred Embodiment)
In one aspect, the present invention provides a composition for improving cell nucleic acid introduction efficiency. Here, the composition comprises A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent. In order to introduce a nucleic acid, a gene introduction reagent such as a gene introduction reagent has been used, but the introduction efficiency is not expected to increase due to the addition of an external factor, and the cells found by the present invention are not expected. The effect of adhesion molecules can be surprising. In particular, it was not expected that the efficiency would change when cells were fixed, but rather even thought to decrease. The present invention has an effect that introduction of a nucleic acid is unexpectedly improved when a gene introduction reagent and a cell adhesion molecule are combined and allowed to act on cells. According to the present invention, it has become possible to easily perform transfection in a liquid phase or a solid phase in primary cultured cells, nerve cells, and the like, which have been conventionally difficult. Here, the cell adhesion molecule and the gene introduction reagent only need to exist in a state where they can interact with each other. These substances may be configured to act simultaneously on cells or may be configured separately.
In another aspect, a device for improving nucleic acid introduction efficiency of a cell is provided. This device comprises A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent, wherein the composition is immobilized on a support. Such a device may comprise instructions in a preferred embodiment.
The cell adhesion molecule used in the present invention is preferably provided in a protein form, but is not limited thereto. This is because proteins are biomolecules and can be produced by genetic manipulation. Preferred cell adhesion molecules include extracellular matrix. More preferably, the cell adhesion molecule comprises collagen, fibronectin or laminin, and preferred collagens include, but are not limited to, fiber-forming collagen, basement membrane collagen and the like. A plurality of these specific collagens may be present, and fiber-forming collagen and basement membrane collagen may be contained simultaneously.
In a preferred embodiment, the cell adhesion molecule used in the present invention comprises collagen type I or type IV. More preferably, the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV. Collagen type I is conventionally known only to act as a cell adhesion factor, and when used in combination with a gene introduction reagent, the introduction efficiency of nucleic acid is synergistically increased. Further, it is not known that collagen type IV increases the nucleic acid introduction efficiency, which can be said to be a special effect. In addition, nucleic acid introduction efficiency is further increased by combining these collagens. This is because as the type of collagen increases, the number of points that facilitate the introduction of nucleic acid increases.
The cell adhesion molecule used in the present invention is preferably present in a multimeric form. This is because the presence of the multimeric form stabilizes the immobilization of the cells, and it has been found that the nucleic acid introduction efficiency seems to be dramatically increased.
In a preferred embodiment, the cell adhesion molecule used in the present invention has a three-dimensional structure. Here, the “three-dimensional structure” refers to a structure composed of at least two layers and having a molecular spread in a direction perpendicular to the plane other than the structure oriented in the plane. Therefore, by having such a three-dimensional structure, the cell exists in a state closer to the natural state.
In one embodiment, the gene introduction reagent used in the present invention includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent, and calcium phosphate, and In a preferred embodiment, a plurality of these reagents may be used.
The composition for improving the nucleic acid introduction efficiency and immobilization of the cells of the present invention may contain a foreign molecule to be introduced at the same time. Preferably, the composition of the invention may comprise a nucleic acid molecule encoding a gene intended for introduction.
The composition of the present invention may be solid or liquid. Liquid is preferred. This is because the operation is easy, the arrangement on the solid phase is easy, and the effect in the liquid phase is also confirmed.
The cells targeted by the present invention may be any cells as long as they are intended for introduction of nucleic acids, and are usually cells into which genes can be introduced. Examples of such cells include: PC12, Neuro2a, SH-SY5Y, NG108-15, HCN-1A, and the like. Examples of preferable cells include, but are not limited to, nerve cells and primary cultured cells. The raw material of the primary cultured cells may be any material, but preferably includes mammalian brain (cerebral cortex, hippocampus, cerebellum), but is not limited thereto.
The cell adhesion molecule used in the present invention is preferably present in a concentration range of 5 μg / ml to 100 μg / ml, but even if it is less than this, the introduction efficiency of the gene introduction reagent can be increased, and this upper limit It is understood that the introduction efficiency can be increased without any problem even if the above is true. Examples of the upper limit include, for example, 1 mg / ml, 750 μg / ml, 500 μg / ml, 400 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml, 200 μg / ml, 150 μg / ml, 100 μg / ml, 90 μg / ml, 80 μg / ml. Examples include, but are not limited to, ml, 70 μg / ml, 60 μg / ml, 50 μg / ml, 40 μg / ml, 30 μg / ml. Examples of the lower limit include, for example, 75 μg / ml, 50 μg / ml, 40 μg / ml, 20 μg / ml, 25 μg / ml, 20 μg / ml, 15 μg / ml, 10 μg / ml, 9 μg / ml, 8 μg / ml, 7 μg / ml. ml, 6 μg / ml, 5 μg / ml, 4 μg / ml, 3 μg / ml, 2 μg / ml, 1 μg / ml and the like. A more preferable range is 20 μg / ml to 60 μg / ml.
In one embodiment, the present invention takes advantage of the fact that it allows nucleic acid introduction into cells on a solid phase. It can be said that the present invention is notable in that the nucleic acid can be introduced into cells (for example, cells of the nervous system such as PC12 cells) that have conventionally been difficult to introduce a gene on a solid phase. In particularly preferred embodiments, the compositions of the invention can be used to introduce cells into nucleic acids on a collagen-coated solid support.
In another embodiment, the present invention is used to induce differentiation after inducing nucleic acid. Accordingly, preferably, the composition or kit of the present invention may contain a differentiation-inducing factor (eg, nerve growth factor). In addition, it is understood that the method of the present invention may further include a step of inducing desired differentiation after introducing a nucleic acid.
When a support is used in the present invention, the cell adhesion molecule of the present invention is preferably coated on the support. More preferably, the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers. The support is preferably coated with poly-L-lysine, APS (γ-aminopropylsilane), and MAS.
When a support is used in the present invention, nucleic acids are preferably arranged on the support, and more preferably nucleic acids (for example, DNA) are arranged on the support in an array. By configuring the support in such an array, it can be used as a DNA chip or the like.
In another aspect, the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell. This method comprises a composition for improving the gene transfer efficiency of a cell, comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent. The composition encodes a gene intended for transfer. And providing to the cell together with a nucleic acid molecule that performs; and B) subjecting the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced. Here, the compositions used in the method of the invention are described herein. Methods for providing such compositions to cells can be accomplished using techniques well known in the art.
As used herein, “conditions for introducing a nucleic acid” include any conditions under which the nucleic acid intended to be introduced is introduced, and varies depending on the nucleic acid. It can be determined in consideration of the situation of cells and the like. For example, when the nucleic acid is DNA, such conditions are pH: 6.0 to 8.0; temperature: 30 to 40 ° C .; salt concentration: 0.1 to 0.2M (eg, 0.15M), etc. But are not limited thereto.
In one preferred embodiment, the method of the invention can be carried out in solid phase or liquid phase. In the case of a solid phase, since a cell adhesion molecule fixes to a cell, nucleic acid solid phase introduction such as solid phase transfection becomes possible. In particular, the introduction of a nucleic acid such as a nerve cell or a primary cultured cell, which could not be introduced with a nucleic acid such as a conventional transfection, enabled various analyzes. Such an analysis has been impossible in the past. It was also found that the method of the present invention increases the nucleic acid introduction efficiency even in the liquid phase. Even in the liquid phase, it was not known that cell adhesion molecules had an effect, and the effect was surprising.
In a preferred embodiment, in the method of the present invention, the composition of the present invention and a nucleic acid (for example, DNA) are preferably immobilized on a support. The support can be any material, but is preferably compatible with the cells. Such cell-compatible materials are as described above. By being fixed, it became possible to analyze various factors using the chip.
In another embodiment, the method of the invention also further comprises the step of immobilizing the composition of the invention and a nucleic acid (eg, DNA) to a support.
In a preferred embodiment, examples of the method for immobilizing the composition and nucleic acid of the present invention on a support include, but are not limited to, an inkjet method, a bubble jet (registered trademark) method, and a manual method.
In a preferred embodiment, the present invention may include a step of inducing differentiation of a cell into which a nucleic acid has been introduced.
In another aspect, the present invention provides a kit for introducing a nucleic acid into a cell. The kit comprises a composition comprising A) a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent; and B) a method for use with the composition and a nucleic acid (eg, DNA) encoding the desired gene. With written instructions. Here, the cell adhesion molecule and the gene introduction reagent are as described above in the present specification and exemplified in the Examples. The instructions describe how the nucleic acid and the composition of the invention can be treated to introduce the nucleic acid. Such instructions may be in any form as described herein above. In a preferred embodiment, the present invention may include a differentiation-inducing factor.
In another aspect, the invention relates to the use of a composition comprising a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent for introducing a nucleic acid into a cell. Descriptions of such compositions, nucleic acids, cells, etc. are given above. In a preferred embodiment, the composition of the present invention may contain a differentiation-inducing factor.
(Composition, method and kit for inducing cell differentiation)
In one aspect, the present invention provides a composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid. Here, the composition of the present invention comprises A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent. Cells into which nucleic acid was introduced using such a composition retained the ability to induce differentiation even after introduction of the nucleic acid. Such a phenomenon has not been achieved so far. Therefore, it can be said that the present invention has an effect that could not be predicted from the prior art.
In a preferred embodiment, the composition itself may contain a differentiation-inducing factor or may be provided separately. Where differentiation induction needs to be controlled, preferably the differentiation inducing factor is provided separately from the composition used to introduce the nucleic acid.
As the differentiation-inducing factor, any factor may be used as long as the desired differentiation can be achieved, and examples thereof include a cell growth factor. When the cell is a nerve, the differentiation-inducing factor used can include nerve growth factor (NGF).
In another aspect, the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase. This method comprises the steps of: A) a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent, together with a nucleic acid intended to be introduced, together with the nucleic acid intended to be introduced into the cell; and B) conditions under which the nucleic acid is introduced. The step of exposing the cell to Here, the cells retain the ability to induce differentiation even after introduction of the nucleic acid.
In one embodiment, the composition used in the above method of the present invention may contain a differentiation-inducing factor or may be provided as a separate composition.
In a preferred embodiment, the differentiation-inducing factor used can include, but is not limited to, a cell growth factor (eg, nerve growth factor (NGF)). It will be understood that such cell growth factors will vary depending on the cells used.
In another embodiment, the method further includes the step of inducing differentiation of the cell.
In another aspect, the present invention provides a composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell. Here, the composition comprises A) a cell adhesion molecule; B) a gene transfer reagent; and C) a differentiation inducing factor. Descriptions of such compositions, nucleic acids, cells, etc. have been given above, and it is understood that any preferred embodiment can be employed.
In another aspect, the present invention provides a kit for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell. The kit comprises A) a) a cell adhesion molecule; and b) a composition comprising a gene transfer reagent, and B) a differentiation inducer. Descriptions of such compositions, nucleic acids, cells, etc. have been given above, and it is understood that any preferred embodiment can be employed. Here, preferably, in this kit, the differentiation-inducing factor is arranged separately from the composition.
In a preferred embodiment, the kit of the present invention may be provided with instructions showing procedures such as nucleic acid introduction and differentiation induction.
In another aspect, the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell. The method comprises the steps of A) a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent, together with a nucleic acid intended to be introduced, to the cell; and B) conditions under which the nucleic acid is introduced. Exposing the cells; and C) inducing differentiation of the cells. Descriptions of such compositions, nucleic acids, cells, etc. have been given above, and it is understood that any preferred embodiment can be employed. Here, preferably, in this method, differentiation induction is performed independently of nucleic acid introduction.
(Gene therapy)
In certain embodiments, when the composition comprises a nucleic acid in the present invention, the present invention is used to treat, inhibit or prevent a disease or disorder associated with abnormal expression and / or activity of a polypeptide associated with the nucleic acid. Are administered for gene therapy purposes. Gene therapy refers to a therapy performed by administering to a subject a nucleic acid that is expressed or expressible. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded protein, which mediates a therapeutic effect.
Any method for gene therapy available in the art can be used according to the present invention. An exemplary method is as follows.
For a general review of methods of gene therapy, see Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11 (5): 155-215 (1993). Commonly known recombinant DNA techniques used in gene therapy are described in Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene TransferMand Transfer Expert and ExpLyA. , Stockton Press, NY (1990).
When the present invention is used as a medicament, such medicament can be administered orally or parenterally. Alternatively, such medicaments can be administered intravenously or subcutaneously. When administered systemically, the medicament used in the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable aqueous solution free of pyrogens. Such a pharmaceutically acceptable composition can be easily prepared by those skilled in the art by considering pH, isotonicity, stability and the like. In the present specification, the administration method includes oral administration, parenteral administration (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, intravaginal administration, local administration to the affected area, Skin administration, etc.). Formulations for such administration can be provided in any dosage form. Examples of such a pharmaceutical form include a liquid, an injection, and a sustained release agent.
The medicament of the present invention may be a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR, as required). Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) and a composition having the desired degree of purity can be prepared and stored in the form of a lyophilized cake or aqueous solution.
The amount of the composition used in the treatment method of the present invention takes into consideration the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, sex, medical history, cell morphology or type, etc. Can be easily determined by those skilled in the art. The frequency with which the treatment method of the present invention is applied to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, treatment course, etc. In view of this, it can be easily determined by those skilled in the art. Examples of the frequency include administration every day to once every several months (for example, once a week to once a month). It is preferable to administer once a week to once a month while observing the course.
When the present invention is used in other applications such as cosmetics, foods, and agricultural chemicals, cosmetics and the like can be prepared while complying with regulations stipulated by the authorities.
References such as scientific literature, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described.
The present invention has been described with reference to the preferred embodiments for easy understanding. In the following, the present invention will be described based on examples, but the above description and the following examples are provided only for the purpose of illustration, not for the purpose of limiting the present invention. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the embodiments or examples specifically described in the present specification, but is limited only by the scope of the claims.

以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ、和光純薬（大阪、日本）、松浪硝子（岸和田、日本）などから市販されるものを用いた。
（実験方法）
（物質および方法）
ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫細胞）（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７２１）は、３７℃、５％ＣＯ_２下で、１０％ウシ血清および抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含有するＤＭＥＭ（ＤｕｌｂｅｃｃｏｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ）（１４２４６−２５、ＮａｋａｌａｉＴｅｓｑｕｅ，ＪＰＮ）中で培養した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２下で、１０％ＦＢＳ（胎仔ウシ血清）（２９−１６７−５４、ＬｏｔＮｏ．２０２５Ｆ、ＤａｉｎｉｐｐｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣＯ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）および抗生物質を含有するＤＭＥＭ中で培養した。
（局所トランスフェクション（ＬＴ）細胞アレイのための細胞播種）
チップ（ＭａｔｓｕｎａｍｉＧｌａｓｓＩｎｄ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）の９ｍｍ^２グリッド毎に、上記細胞を含む１５μｌ滴の培養培地を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートしてこの細胞を基板に接着させ、その後、培養培地を添加してさらに４８時間インキュベートした。ＰＣ１２細胞およびＮｅｕｒｏ２ａ細胞の細胞増殖を考慮して、それぞれ、４５００個および３７５０個の細胞を各グリッドに播種した。
（局所トランスフェクションのためのプロトコル）
各細胞株に適したトランスフェクション試薬を、いくつかのトランスフェクションアッセイによって決定した。ＰＣ１２細胞については、トランスフェクション試薬として、リポフェクタミン２０００（１１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ）を含有する試薬を選択した。１．５μｌのｐＥＧＦＰを、１９μｌのＤＭＥＭで希釈した。ｐＤＮＡを穏やかに希釈した後、４．５μｌのリポフェクタミン２０００を添加し、得られた混合物を室温にて静置して脂質ＤＮＡ複合体を形成させた。Ｊｅｔ−ＰＥＩＮＰ５（１０１−３０、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）については、１．５μｌのｐＥＧＦＰを、１０．５μｌのＤＭＥＭで希釈した。３μｌの７．５ｍＭＪｅｔ−ＰＥＩポリマー（１０１−３０、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を添加し、得られた混合物を室温にて静置してポリマー／ｐＤＮＡ複合体を形成させた。１０μｌ用ピペットチップを用いて、３０ｎｌのトランスフェクション複合体を各グリッドに５回スポットし、これをクリーンベンチで乾燥させた。細胞を含む１５μｌ滴を各グリッドに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした後、培養培地を添加した。３７℃、５％ＣＯ_２下で細胞をさらに４８時間インキュベートし、その後、蛍光を観察した。
（溶液相トランスフェクションのためのプロトコル）
ＰＣ１２細胞の溶液相トランスフェクションは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのリポフェクタミン２０００トランスフェクション用プロトコルを用いて実施した。トランスフェクション溶液の表面積および量を制限するために、ガラススライド上に、シリコンガスケット（表面積１０ｃｍ^２）を置いた。次いで、トランスフェクション試薬の量を、販売元のマニュアルに基づき計算した。
（ＥＣＭタンパク質によるガラススライドのコーティング）
培養皿として、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）の薄層によって隔てられた４８個の正方形区画（９ｍｍ^２表面積）を有するプレーンなガラススライドおよびＰＬＬプレコートガラススライドを使用した。フィブロネクチンのコーティングのために、フィブロネクチン（ＦＮ）（１６０４２−４１、ＮａｋａｌａｉＴｅｓｑｕｅ、ＪＰＮ）（１ｍｇ／ｍｌ）溶液を水で希釈した（終濃度０．１μｇ／ｍｌ）。次いで、この溶液４００μｌを、８つの正方形区画の領域を覆うよう、ガラススライドに添加した。室温にて１時間インキュベートした後、この溶液を取り除き、次いで、超純水でこれらの正方形区画を１度洗浄した。Ｉ型コラーゲンのコーティングのために、コラーゲン−１（ＴｙｐｅＩ−Ｃ、新田ゼラチン株式会社生物科学研究所）（３ｍｇ／ｍｌ）を、０．１５Ｍ酢酸で希釈した（終濃度１００μｇ／ｍｌ）。次いで、８つの正方形区画を覆うよう、ガラススライド上にこの溶液４００μｌを添加した。室温にて１時間インキュベートした後、この溶液を取り除き、次いで、ＰＢＳでこれらの正方形区画を１度洗浄した。ＩＶ型コラーゲンのコーティングのために、コラーゲン−ＩＶ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、３５４２３３）（５５０μｇ／ｍｌ）を、０．１５Ｍ酢酸中に希釈した（終濃度１００μｇ／ｍｌ）。次いで、８つの正方形区画を覆うよう、ガラススライド上にこの溶液４００μｌを添加した。室温にて１時間インキュベートした後、この溶液を取り除き、次いで、ＰＢＳでこれらの正方形区画を１度洗浄した。
（蛍光イメージング）
蛍光イメージングのために、細胞培地を完全に取り除き、次いで、５％ＰＦＡを用いて細胞を固定した。この細胞を、ＰＢＳで１度洗浄し、培地成分によるバックグラウンドの蛍光を除いた。次いで、アレイスキャナ（ＧｅｎｅＴＡＣＵＣ４×４、ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓＩｎｃ．，ＭＩ）または共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０，ＣａｒｌＺｅｉｓｓＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光を観察した。さらに、プログラム（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔｖｅｒ５．２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて蛍光強度を評価した。
（実施例１：細胞形態の変化）
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質（フィブロネクチン、コラーゲンＩＶ型、コラーゲンＩ型、ラミニン）でコーティングした培養皿において２時間インキュベートした後、位相顕微鏡（図１Ａ〜Ｄ）および共焦点顕微鏡（図１Ｅ、Ｆ）を用いてＰＣ１２細胞の形態変化を観察した。観察前に、ＳＹＴＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｑｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）染色により核を可視化した。図１Ａ〜Ｄに示されるように、使用したＥＣＭコーティングによって、細胞の分布、大きさ、および形状は、顕著に異なっていた。コラーゲンＩＶ上で培養した細胞は、細胞の接着および伸展による扁平化に関して最も大きな増加を示した。核の細胞分布、大きさ、および形状もまた、使用したＥＣＭコーティングによって顕著に異なっていた（図１Ｅ、図１Ｆ１）。接着した細胞は、周囲の形態を星形状に変化させた。これは、アクチン線維の伸長および投射領域の増大に起因する。他のＥＣＭタンパク質上での細胞増殖によっては、周囲の形状はほとんど変化せず、ＩＶ型コラーゲンの場合のような投射領域の増大を示さなかった。Ｉ型コラーゲン上でのみ、同様の星形状が観察されたが、ＩＶ型コラーゲンに匹敵するほど投射領域の増加を示さなかった。図１Ｆ２は、ＩＶ型コラーゲンを用いた場合と、ＰＬＬを用いた場合とを、経時的に（１時間、２時間、３時間、６時間）観察した結果を示す。徐々に核が拡張し、核酸が導入されやすい形態となっていることが示される。
図１Ｆ３は、ＰＣ１２細胞について、コラーゲンＩＶ型およびフィブロネクチンを用いた場合の位相顕微鏡による観察結果（１時間および２時間＝（ａ））、ならびに、コラーゲンＩＶ型、フィブロネクチン、コラーゲンＩ型およびラミニンについて観察した結果（３時間＝（ｂ））を示す。これをもとに、核の相対面積をグラフ化したものを図１Ｆ３（ｃ）に示す。相対面積は、全体の面積中の核の占める面積を相対比として示した。
図１Ｆ３から明らかなように、核の相対面積が広がるほど、トランスフェクション効率が高くなることが示された。従って、他のＥＣＭタンパク質を用いる場合でも、各の相対面積が例えば、好ましくは０．１を超えるものを採用することによって、核酸の導入効率が上昇することが理解される。
また、図１Ｇとして、トランスフェクションチップ（スライドガラス、ＰＬＬコート）上に３ｍｍ×３ｍｍに３０００−６０００個の細胞を播種したときの細胞接着形態を示す。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞もまた、同様の結果を示す。図１Ｈとして、コラーゲンＩＶ型（０．００５ｍｇ／ｍｌ）をコーティングしたＰＬＬコートスライドにおけるＮｅｕｒｏ２ａ細胞を示す。示されるように、形態において顕著な変動が示される。
（実施例２：細胞接着の経時的変化）
各々のＥＣＭ上に対するＰＣ１２細胞の接着の経時変化は、位相顕微鏡により得られた知見を支持するものであった。図２に示される通り、最も早く、最も安定な接着は、ＩＶ型コラーゲンを用いた場合に観察された。細胞は、３０分後にはすでに十分に接着しており、観察した時間全体を通して強い接着を維持していたようである。Ｉ型コラーゲンに対する細胞接着は、それよりも遅かったが、ほぼ同程度の安定な接着を示した。フィブロネクチンおよびラミニンに対するＰＣ１２細胞の接着は、時間と共に接着率が増加する傾向を示したが、コラーゲン基質の場合よりも有意に低い接着率であった。
次に、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における経時的変化を見た。図２Ｂにおけるように、細胞の固定効果は通常予想されるとおりに示された。
（実施例３：細胞におけるトランスフェクション効率に対するＥＣＭタンパク質の影響）
ＣＭＶプロモーターＥＧＦＰ構築ベクターのトランスジェニック遺伝子発現を、共焦点顕微鏡を用いて蛍光細胞によって測定した。本発明者らは、プレーンなガラススライドのＥＣＭタンパク質によるコーティングの効果を、ＰＬＬでプレコーティングした場合としなかった場合とで調査した（ＰＣ１２細胞、図３；Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、図２Ｃ）。本発明者らは、ＥＣＭタンパク質およびプレコーティングに基づくトランスフェクション効果の違いを試験した。ＰＬＬプレコートスライドにおいて、ＩＶ型コラーゲンは、トランスフェクションを、ＰＬＬコーティングのみの場合と比較して約１０００倍まで増大させた。ＰＬＬコートスライド上でのラミニンは、ＩＶ型コラーゲンの場合と同程度の接着を示したが、トランスフェクション効率はそれよりも低かった（５００倍）。Ｉ型コラーゲンに対する接着は、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの場合よりも弱かったが、トランスフェクション効率の増大は、ＩＶ型コラーゲンの場合と同程度であった。フィブロネクチンに対するＰＣ１２細胞接着は弱かったので、トランスフェクションプロセス中に、トランスフェクション試薬によるダメージによって有意な剥離を引き起した。フィブロネクチン上になおも残存していた細胞は、ＰＬＬのみを用いた場合よりも高効率のトランスフェクションを示したが、それは無視できる程度であった。非コーティングガラススライド上でのＥＣＭタンパク質の効果は、ＰＬＬでプレコーティングした場合に観察される効果とわずかに異なるパターンを示した。Ｉ型コラーゲンに対する接着およびトランスフェクション効率は、ＰＬＬプレコーティングの場合と比較して増大した。フィブロネクチン、ラミニン、およびＩＶ型コラーゲンは、プレーンなスライド上でのトランスフェクション効率に対する効果が、ＰＬＬプレコーティングの場合よりも劣っていた。このような効果は、ＰＬＬプレコートスライドと比較した場合、プレーンなスライド上での、ＩＶ型コラーゲンについてはより低い接着、Ｉ型コラーゲンについてはより高い接着により説明され得る。協調的な効果もまた考えられ得る。
また、図２Ｃに示されるように、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞でも、同様に、コラーゲンＩＶ型およびＩ型のトランスフェクション効率の上昇効果が確認された。
次に、コラーゲンＩＶ型のＰＬＬコートおよびプレーンなスライドにおける隔離効果を検証した。図３Ｃに示されるように、ＰＬＬコーティングを行ったところ、トランスフェクションの隔離効果（固定による効果）が顕著であったが、プレーンなスライドでもこの効果は確認された。
次に、各種ＥＣＭを用いてコーティングのトランスフェクションに対する効果を確認した。その結果を図３Ａ、３Ｂおよび３Ｄに示す。コラーゲン（Ｉ型、ＩＶ型）およびラミニンでトランスフェクション効率が上昇したことがわかった。コラーゲンによる効果がＰＬＬおよびプレーンで高いことが示される。図３Ｅには、その強度を数値化したグラフを示す。コラーゲンの効果が顕著であることがより鮮明にわかる。図３Ｆは、図３Ｄのものの実際の細胞固定の様子を示す。フィブロネクチンは、固定効果が薄いが、コラーゲンおよびラミニンは比較的固定効果がある上に、トランスフェクション効率上昇効果があることがわかる。図３Ｇは、スライド表面処理の種類による各種ＥＣＭの効果の経時変化を示す。このように、コラーゲンの効果が顕著であるがどのＥＣＭも多かれ少なかれ接着効果を有することがわかる。
（実施例４：Ｃａ^２＋媒介遺伝子発現に対するＥＣＭタンパク質の効果）
Ｃａ^２＋の媒介する遺伝子発現に対するＥＣＭタンパク質の影響に関する情報を得るために、ＰＬＬ、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン上で増殖させたＰＣ１２細胞における核周囲空間からのＣａ^２＋放出の変化を、Ｆｕｒａ２技術を用いて観察した（図４）。培養液にて５μＭに希釈したＦｕｒａ２−ＡＭ中にて細胞を３７℃にて１５分間接触させた後、培地にて洗浄。この方法によりＦｕｒａ２−ＡＭを細胞内に導入した。予備実験からのデータは、フィブロネクチンコーティングした皿と比較して、ＩＶ型コラーゲン培養皿で増殖させた細胞において有意なＣａ^２＋濃度の増加を示した。この結果は、ＥＣＭを認識する細胞表面インテグリンレセプターにより誘導された、分子変化の可能性を示す。これは、細胞接着の効果を凌ぐものである。Ｃａ^２＋に依存する遺伝子発現は有意に変化したが、トランスフェクションの効果に対する適切な影響もまた影響を与えることが考えられ得る。
（実施例５：種々の細胞株に対するＥＣＭタンパク質の効果）
異なる種類の細胞株における細胞接着およびトランスフェクション効率に影響を及ぼすたった１つのＥＣＭタンパク質が存在するか否か、または各タイプ（またはクラス）の細胞に特異的なＥＣＭタンパク質が存在するか否かを調査するために、本発明者らは、種々の細胞株（ｈＭＳＣ、３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、ＰＣ１２、Ｎｅｕｒｏ２ａ（ｈＭＳＣ：ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ、ＰＴ−２５０１；ＮＩＨ３Ｔ３−３：ＲＩＫＥＮＣｅｌｌＢａｎｋ，ＪＰＮ、ＲＣＢ０１５０；ＨｅｐＧ２：ＲＩＫＥＮＣｅｌｌＢａｎｋ，ＪＰＮ、ＲＣＢ１６４８；ＰＣ１２：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７２１；Ｎｅｕｒｏ２ａ：ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３１）に対するフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンの効果を試験した（図５）。ｈＭＳＣ（ＰＴ−２５０１、ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）の場合、フィブロネクチンは、最も安定なＥＣＭタンパク質であることが示された。他のＥＣＭは、ＰＬＬコーティングしたスライドと比較してトランスフェクションを増大しなかった。
（実施例６：ＰＣ１２細胞のための、局所トランスフェクションアレイ）
本発明者らは、溶液相トランスフェクションにおいて得たこれまでの知見を、本発明者らのＬＴトランスフェクションアレイシステムに適用し、神経細胞株についての高密度チップに基づく遺伝子発現スクリーニングの可能性を模索した。一般的に、トランスフェクションは、トランスフェクション混合物がスポットされた領域に局在化される。異なるＥＣＭ上で増殖させたＰＣ１２細胞は、溶液相方法において観察されたものと同じ傾向を示した。Ｉ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンでコーティングしたグリッドにおいて、最大４０個のトランスフェクション体が、３０ｎｌのトランスフェクション複合体（約１ｎｌのｐＥＧＦＰを含む）をスポットした領域で観察された。溶液法と比較して、より多くの細胞が、トランスフェクションプロセスを通して接着状態を維持した。この効果は、未処理（プレーンともいう）スライドガラス基板、フィブロネクチン、ＰＬＬ、ＰＬＬ＋フィブロネクチンの場合にはっきりと確認でき、溶液法と対照的に、最大１０個のトランスフェクション体が、１つのスポット上に観察された。これらの発見は、本発明者らの局所トランスフェクション法により、トランスフェクションプロセス時の細胞への損傷が減少し、それによって細胞の生存性およびゆがみが増大することを示唆する。
（実施例７：バイオアレイへの応用）
次に、上述の本発明の効果がアレイを用いた場合でも実証されるかどうかを確認するために規模拡大して実験を行った。
（実験プロトコル）
（細胞供給源、培養培地、および培養条件）
この実施例では、５種類の異なる細胞株を使用した：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰＴ−２５０１、ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）、ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３（ＲＣＢ１６３７、ＲＩＫＥＮＣｅｌｌＢａｎｋ，ＪＰＮ）、ＮＩＨ３Ｔ３−３（ＲＣＢ０１５０、ＲＩＫＥＮＣｅｌｌＢａｎｋ，ＪＰＮ）、ＨｅＬａ（ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮＣｅｌｌＢａｎｋ，ＪＰＮ）、ＰＣ１２細胞（ＣＲＬ−１７２１、ＡＴＣＣ）およびＨｅｐＧ２（ＲＣＢ１６４８、ＲＩＫＥＮＣｅｌｌＢａｎｋ，ＪＰＮ）（例示細胞として妥当かどうかご教示ください）。ヒトＭＳＣ細胞の場合、この細胞を、市販のヒト間葉細胞基底培地（ＭＳＣＧＭＢｕｌｌｅｔＫｉｔＰＴ−３００１，ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）中で維持した。ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３−３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の場合、これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、２９−１６７−５４、ＬｏｔＮｏ．２０２５Ｆ、ＤａｉｎｉｐｐｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣＯ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを有する高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）；１４２４６−２５、ＮａｋａｌａｉＴｅｓｑｕｅ，ＪＰＮ）中で維持した。全ての細胞株を、３７℃、５％ＣＯ_２に制御されたインキュベーター中で培養した。ｈＭＳＣを含む実験において、本発明者らは、表現型の変化を回避するために、５継代未満のｈＭＳＣを使用した。
（プラスミドおよびトランスフェクション試薬）
トランスフェクションの効率を評価するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターおよびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクター（カタログ番号６０８５−１、６９７３−１、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を使用した。共に遺伝子発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下であった。トランスフェクトされた細胞は、それぞれ、連続的にＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ２を発現した。プラスミドＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（２００２４９，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＴＸ）を使用して増幅し、そしてＥｎｄｏＦｒｅｅＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＥｎｄｏＦｒｅｅＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉＫｉｔ１２３６２、ＱＩＡＧＥＮ、ＣＡ）によって精製した。全ての場合において、プラスミドＤＮＡを、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。トランスフェクション試薬は以下のようにして得た：ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（カタログ番号３０１４２５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（３０１３０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（３０１１０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、およびＥｘＧｅｎ５００（Ｒ０５１１、ＦｅｒｍｅｎｔａｓＩｎｃ．，ＭＤ）。
（固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）生成）
プロトコルの詳細は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｓｔａｆｆａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓａｂａｔｉｎｉ＿ｐｕｂｌｉｃ／ｒｅｖｅｒｓｅ＿ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍの「ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＨｏｍｅｐａｇｅ」に記載されていた。本発明者らの固相系トランスフェクション（ＳＰＴＡ方法）において、疎水性フッ素樹脂コーティングによって分離した４８平方パターン（３ｍｍ×３ｍｍ）を有する３つの型のスライドガラス（シラン処理したスライドガラス；ＡＰＳスライド、およびポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライドガラス；ＰＬＬスライド、およびＭＡＳでコーティングしたスライド；ＭａｔｓｕｎａｍｉＧｌａｓｓＩｎｄ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）を研究した。
（プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製）
ＳＰＴＡを生成するための２つの異なる方法を開発した。その主な違いは、プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製にある。
（方法Ａ）
ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔを使用する場合、プリンティング溶液は、プラスミドＤＮＡおよび細胞接着分子（４ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解したコラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニン、ウシ血漿フィブロネクチン（カタログ番号１６０４２−４１、ＮａｋａｌａｉＴｅｓｑｕｅ、ＪＰＮ）を含んだ。上記の溶液を、インクジェットプリンタ（ｓｙｎＱＵＡＤＴＭ、ＣａｒｔｅｓｉａｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いてか、または手動で０．５〜１０μＬチップを用いて、スライドの表面に適用した。このプリントしたスライドガラスを安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。トランスフェクションの前に、総Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を、ＤＮＡプリントしたスライドガラス上に静かに注ぎ、そして室温にて１５分間インキュベートした。過剰のＥｆｆｅｃｔｅｎｅ溶液を、吸引アスピレーターを用いてスライドガラスから除去し、そして安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。得られたＤＮＡプリントしたスライドガラスを、１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約２５ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０^４細胞／ｍＬ）を、このディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。
（方法Ｂ）
他のトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＴｆｘＴＭ−２０、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．またはＥｘＧｅｎ）の場合、プラスミドＤＮＡ；コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニンまたはフィブロネクチン；およびトランスフェクション試薬を、製造業業者が配布する指示書に示される比率に従って１．５ｍＬのマイクロチューブ中で均一に混合し、そしてチップ上にプリンティングする前に室温にて１５分間インキュベートした。プリンティング溶液を、インクジェットプリンターまたは０．５〜１０μＬチップを用いてスライドガラスの表面上に適用した。このプリントしたスライドガラスを、安全キャビネットの内側で室温にて１０分間かけて完全に乾燥させた。プリントしたスライドガラスを１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約３ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０^４細胞／ｍＬ）を添加し、安全キャビネットの内側で室温にて１５分間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、新鮮な培地をこのディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。インキュベーション後、本発明者らは、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７１、ＯｌｙｍｐｕｓＰＲＯＭＡＲＫＥＴＩＮＧ，ＩＮＣ．，ＪＰＮ）を用いて、増強された蛍光タンパク質（ＥＦＰ、ＥＧＦＰ、およびＤｓＲｅｄ２）の発現に基づいてトランスフェクト体を観察した。位相差画像を同じ顕微鏡を用いて撮った。両プロトコルにおいて、細胞をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定方法（ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ、処理時間は、室温にて１０分間）を用いることによって固定した。
（レーザー走査および蛍光強度定量）
トランスフェクション効率を定量するために、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＴＡＣＵＣ４×４、ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓＩｎｃ．，ＭＩ）を使用した。総蛍光強度（任意の単位）を測定した後、表面積あたりの蛍光強度を計算した。
（結果）
（局所的トランスフェクション）
トランスフェクションアレイチップは、ＰＬＬコーティングされたスライドグラス上でＤＮＡ／トランスフェクション試薬およびコラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニンなどの細胞接着因子を含む細胞培養液をマイクロプリントすることによって構築した。
種々の細胞をこの実施例において用いた。これらの細胞は、通常使用される培養条件で培養した。これらの細胞はスライドガラスに付着することから、細胞は、効率よく取り込まれ、そしてアレイ上に与えられた位置でプリントされたＤＮＡに対応する遺伝子を発現した。通常のトランスフェクション方法（例えば、カチオン性脂質またはカチオン性高分子媒介トランスフェクション）と比較すると、本発明の方法を用いた場合のトランスフェクション効率は、いずれも顕著に高かった。特に、トランスフェクトすることが困難とされていたＨｅｐＧ２、ｈＭＳＣなどのような組織幹細胞、ＰＣ１２細胞のような神経系の細胞でも、効率よくトランスフェクトされることが見出されたことは、特に重要である。ｈＭＳＣの場合には、従来方法の約４０倍以上の効率上昇が見られた。また、高密度アレイに必要な高い集積度も達成された（すなわち、アレイ上で隣接するスポット同士の間の夾雑が顕著に減っていた）。これは、ＥＧＦＰおよびＤｓ−ＲＥＤのチェック状パターンのアレイを生成することによって確認した。ヒトＭＳＣをこのアレイにおいて培養し、実質的にすべての空間解像度が示されるように対応する蛍光タンパク質を発現させた。その結果ほとんど夾雑していないことが明らかになった。プリント混合物の個々の成分の役割に関するこの研究に基づいて、種々の細胞に関して、トランスフェクション効率の最適化を行うことができる。
（コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニンなどの細胞接着因子による局所的トランスフェクションにおける効率化）
本発明者らの上述してきたデータを総合すると、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニンなどの細胞接着因子は、遺伝子導入試薬の導入効率を格段の上昇させることが明らかになった。そのような活性としては、種々の細胞によって異なるが、これらの活性は、トランスフェクション効率の上昇に関与していることがわかる。なぜなら、液相でも固相でも同様にか、むしろ液相の方がトランスフェクション効率をより上昇させたからである。
（神経細胞の固相系トランスフェクションアレイ）
ネットワークを構築する神経細胞の能力は、神経ネットワークを標的とする研究にとって特に興味深いものになっている。特に、これらの細胞の形質転換についての遺伝子解析は、ＰＣ１２細胞などの神経細胞の多能性を制御する因子を解明する上で、関心が高まっている。
これを達成するために、従来の方法は、ウイルスベクターまたはエレクトロポレーションのいずれかの技術を含む。本発明者らが開発した複合体−塩という系を用いることにより、種々の細胞株（ＰＣ１２細胞を含む）に対して高いトランスフェクション効率ならびに密集したアレイ中での空間的な局在の獲得を可能にする固相系トランスフェクションが達成された。固相系トランスフェクションの概略を、図７に示す。
固相系トランスフェクションにより、インビボ遺伝子送達のために使用され得る「トランスフェクションパッチ」の技術的な達成ならびにＰＣ１２細胞などの神経細胞における高スループットの遺伝子機能研究のための固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）が可能になることが判明した。
哺乳動物細胞をトランスフェクトするための多数の標準的な方法が存在するが、遺伝物質のＰＣ１２細胞、初代培養細胞への導入については、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａなどの細胞株を比較して不便かつ困難であることが知られている。従来使用されるウイルスベクター送達またはエレクトロポレーションのいずれも重要であるが、潜在的な毒性（ウイルス方法）、ゲノムスケールでの高スループット分析を受けにくいこと、およびインビボ研究に対して制限された適用性（エレクトロポレーションに関して）のような不便さが存在する。
固相支持体に簡便に固定することができ、かつ徐放性および細胞親和性を保持した固相支持体固定系が開発されたことにより、これらの欠点のほとんど克服することができた。
マイクロプリンティング技術を使用する本発明者らの技術を用いて、選択された遺伝物質、トランスフェクション試薬および適切な細胞接着分子、ならびに塩を含む混合物を、固体支持体上に固定化し得た。混合物を固定化した支持体の上での細胞培養は、その培養細胞に対する、混合物中の遺伝子の取り込みを可能にした。その結果、支持体−接着細胞における、空間的に分離したＤＮＡの取り込みを可能にした。したがって、これにより、ほぼ均一な条件下で細胞を培養しつつ大量に核酸を取り込ませることができる実験形態を作製することが可能となった。
本実施例の結果、いくつかの重要な効果が達成された：高いトランスフェクション効率（その結果、統計学的に有意な細胞集団が研究され得る）、異なるＤＮＡ分子を支持する領域間の低い相互夾雑（その結果、個々の遺伝子の効果が、別々に研究され得る）、トランスフェクト細胞の長期生存、高スループットの互換性のある形式および簡便な検出方法。ＳＰＴＡは、これらの基準を全て満たすことは、さらなる研究のための適切な基盤となることになる。
これらの目的の達成を明確に確立するために、上述のように本発明者らは、ＰＣ１２細胞を、本発明者らの方法論（固相系でのトランスフェクション）および従来の液相系トランスフェクションの両方を用いて一連のトランスフェクション条件下で研究した。ＳＰＴＡの場合、相互夾雑を評価するために、本発明者らは、チェック模様のパターンでガラス支持体上にプリントした赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用し、一方、従来の液相系トランスフェクションを含む実験の場合（ここで、本来、トランスフェクト細胞の自発的な空間的分離は達成され得ない）、本発明者らは、ＧＦＰを使用した。いくつかのトランスフェクション試薬を評価した：４つの液体トランスフェクション試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＴｆｘＴＭ−２０、ＬｏｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００）、２つのポリアミン（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ）、ならびに２つの型のポリイミン（ＪｅｔＰＥＩ（×４）およびＥｘＧｅｎ５００）。
トランスフェクション効率：トランスフェクション効率を、単位面積あたりの総蛍光強度として決定した。使用した細胞株に従って、最適な液相の結果を、異なるトランスフェクション試薬を用いて得た。次いで、これらの効率的なトランスフェクション試薬を、固相系プロトコルの最適化に使用した。いくつかの傾向が観察された。細胞をトランスフェクトするのが困難なＰＣ１２細胞の場合においてＳＰＴＡ方法論に最適化した条件を用いることによって、本発明者らは、細胞の特徴を維持しながら、トランスフェクション効率が数十〜数百倍まで増加したことを観察した。ＰＣ１２細胞の場合、最良条件は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬の使用を含んだ。予想したように、高いトランスフェクション効率を実現するための重要な因子は、試薬組成中の窒素原子（Ｎ）の数とプラスミドＤＮＡ内のリン酸残基（Ｐ）の数との間の電荷バランス（Ｎ／Ｐ比率）、ならびにＤＮＡ濃度である。一般的に、Ｎ／Ｐ比率および濃度における増大は、トランスフェクション効率の増大を生じる。
チップ上での高いトランスフェクション効率の達成のための重要な点は、使用されるガラスコーティングである。ＰＬＬが、トランスフェクション効率および相互夾雑の両方に関して、最良の結果を提供することを発見した（下記に考察する）。フィブロネクチンコーティングしない場合、少数のトランスフェクト体を観察した（他のすべての実験条件は一定に保った）。完全に確立したわけではないが、コラーゲンなどの細胞接着分子の役割はおそらく、細胞接着プロセスを加速し、ゆえに、表面を離れたＤＮＡ拡散が可能になる時間を制限するということである。
低い相互夾雑：ＳＰＴＡプロトコルで観察されたより高いトランスフェクション効率は別として、本技術の重要な利点は、別個に分離された細胞アレイの実現であり、その各位置では、選択した遺伝子が発現する。本発明者らは、フィブロネクチンでコーティングしたガラス表面上に、ＪｅｔＰＥＩ（製造業者が提供する「実験プロトコル」を参照のこと）およびフィブロネクチンと混合した２つの異なるレポーター遺伝子（ＲＦＰおよびＧＦＰ）をプリントした。得られたトランスフェクションチップを適切な細胞培養に提供した。最良であると見出された実験条件下において、発現されたＧＦＰおよびＲＦＰは、それぞれのｃＤＮＡがスポットされた領域に局在した。相互夾雑はほとんど観察されなかった。しかし、フィブロネクチンまたはＰＬＬの非存在下において、相互夾雑は重要であり、そしてトランスフェクション効率は、有意に低かった。このことは、接着した細胞の割合と、支持体表面から離れて拡散するプラスミドＤＮＡとの相対的な割合が、高いトランスフェクション効率および高い相互夾雑の両方に対して重要な因子であるという仮説を立証する。
相互夾雑のさらなる原因は、固体支持体上のトランスフェクション細胞の移動性であり得る。本発明者らは、数個の支持体上での細胞接着速度およびプラスミドＤＮＡの拡散速度の両方を測定した。その結果は、最適条件下においてＤＮＡ拡散はほとんど生じないが、高い相互夾雑条件下において、表面からのプラスミドＤＮＡの涸渇は、細胞接着が完了する時間までに相当な量であることを示した。
この確立された技術は、経済的な高スループットの遺伝子機能スクリーニングの状況において特に重要である。実際に、必要とされるトランスフェクション試薬およびＤＮＡの量が少量であること、ならびに全プロセス（プラスミドの単離から検出まで）を自動化が可能であることは、上記の方法の有用性を増大する。
結論として、本発明者らは、細胞接着分子と遺伝子導入試薬とを用いた系で、トランスフェクションアレイを好首尾に実現した。このことは、神経細胞の分化を制御する遺伝子機構の解明など、固相系トランスフェクションを利用した種々の研究における高スループット研究を可能にすることになる。固相系トランスフェクションの詳細な機構ならびに高スループットのリアルタイム遺伝子発現モニタリングに対するこの技術の使用に関する方法論は種々の目的に応用可能であることが明らかになった。
（議論）
細胞培養およびトランスフェクション実験は、インビトロでの培養皿のコーティングに使用したＥＣＭタンパク質が、形態、細胞分布、接着、および遺伝子発現に対して重要な効果を保持することを示した。本発明者らは、種々の細胞株ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ，ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅｐＧ２、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）のための局在化されたトランスフェクション（ＬＴ）細胞アレイを用いて報告したように、ＥＣＭ成分は、未知の遺伝子ネットワークの評価のために有用であることを試験するチップベースの細胞アレイに適した基板であるようだ。この研究は、フィブロネクチンの機能が、接着の役割を凌ぐものであることを明らかにした。インテグリンにより媒介されるフィブロネクチンマトリックス上での細胞の分散が、核のプレーン化を引き起こし、この形状変化は、核Ｃａ^２＋の一過性の上昇を伴うことが判明している。これらの調査は、Ｃａ^２＋の核周囲空間からの放出および核への侵入を担う核膜における透過チャネル由来の活性化されたＣａ^２＋の存在を示した。次いで、Ｃａ^２＋により調節された転写因子の活性は、分散した細胞において増強された。本発明者らの最近の報告において、本発明者らはまた、トランスフェクション効率がフィブロネクチンの存在により劇的に増大するという非常に関連する知見を示した。類似の細胞接着プロフィールが、フィブロネクチン（＋）およびフィブロネクチン（−）条件で観察されたが、接着細胞の形状は、顕著に異なっていた。アクチンフィラメントの方向の時間依存的な観察と合わせて、このことは、表面に堆積したフィブロネクチンなどの細胞接着分子により誘導されるアクチンフィラメントのオリエンテーションが、トランスフェクション効率の増大において重要な役割を果たすことを示唆する。表面に堆積したフィブロネクチンの存在下で、アクチンフィラメントは、迅速に再配置され、そして細胞拡大のプロセスにおいて核の下に位置する細胞質空間から見えなくなった。さらに、核の表面領域は、フィブロネクチン（＋）条件において有意に増大した。このことは、恐らく、機械的ストレスを通してＤＮＡ粒子の核通過を容易にしたからだと考えられる。さらに、遺伝子発現と核の形状との間の相関がマイクロパターンにおいて変化することを観察したＣａｒｓｏｎらの報告（ＣａｒｓｏｎＨ．Ｔｈｏｍａｓら、ＰＮＡＳ（２００２）Ｖｏｌ．９９、Ｎｏ．４、ｐ１９７２−１９７７）と緊密に相関する。この報告において、本発明者らは、神経細胞株（特に、神経細胞様ＰＣ１２細胞）の培養皿またはガラススライド上での接着およびトランスフェクションに適した基板として、ＩＶ型コラーゲンを提案する。ラミニンまたはコラーゲン基板で増殖されたＰＣ１２細胞は、その細胞骨格と共にそのα１β１インテグリンレセプターの５０％を保持することが知られている。α１β１インテグリンヘテロダイマーが、神経細胞においてラミニン／コラーゲン二重レセプターとして作用するという証拠（Ｔａｗｉｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９０）は、ＰＣ１２のそれらのＥＣＭ成分への同様の接着においてはっきりと見られた。これらの知見は、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲン上でのＰＣ１２細胞の類似の接着についての十分な説明を与えるが、それらの基板上で獲得されたトランスフェクション体が有意に異なる理由は定かではない。しかし、本発明者らの研究を含め、多くの研究から、細胞のインテグリンに基づく結合および局所的な幾何学的制御は、細胞の微小環境内での増殖および生存の調節のための基礎的なメカニズムを示すことが予想される（ＮａｔｕｒｅＶｏｌ３９２、７３０−７３３、１６Ａｐｒｉｌ１９９８；ＳｃｉｅｎｃｅＶＯＬ．２７６、３０、１４２５−１４２８ＭＡＹ１９９７；Ｋｕｂａｔｏら、ＪＢＣ１９９２）。
本発明者らの研究の１つの例示的な目的は、局所トランスフェクション細胞アレイに、神経細胞のような従来外来物質を導入することが困難とされていた細胞を適用するために、トランスフェクション効率および／または細胞接着を増大することである。本発明者らは、上記発見に対する本発明者らのアプローチについての技術的ストラテジーを基礎とし、ＩＶ型コラーゲンコーティングに基づく神経細胞株のためのチップベースのＬＴ細胞アレイの可能性を探索した（図６）。この技術は、パラレルなｃＤＮＡ遺伝子発現研究のバリデーションのための重要なハイスループットツールであることが証明された。さらに、この細胞アレイは、単一遺伝子の過剰発現により、形態変化、細胞増殖、または代替の観察のための微小スケールの過剰発現アレイとして使用され得る。
（実施例８：核酸導入効率は遺伝子導入試薬の種類に依存しない）
次に、本発明に従う核酸導入の核酸導入効率は遺伝子導入試薬の種類に依存しないことを本実施例で実証した。
以下の表に示すような量で混合した組成物を調製した。

ここで、使用した試薬は、それぞれ、以下の通りである：Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎ（１７０−３３５０；ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ，ＣＡ）；ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（ＥＭ−１０１−００１，Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）およびＴｒａｎｓＩＴ（ＭＩＲ２３０４；ＭｉｒｕｓＣｏ．，ＵＳＡ，ＷＩ）。
この試薬を用いて、実施例４および５に示されるような実験条件を用いてＰＣ１２細胞に対する各種ＥＣＭタンパク質の効果が、遺伝子導入試薬の種類に依存しないことを示した。
その結果を、図８に示す。ａは、各種ＳＥＣＭタンパク質（フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶおよびラミニン）における、核酸導入の様子を示す。緑色に染まるものが、導入された遺伝子の産物になる。ｂは、各種ＥＣＭタンパク質の効果が、遺伝子導入試薬の種類に依存しないことを示す。ｚ軸は、トランスフェクション効率であり、ｘ軸には各種メーカーの遺伝子導入試薬を示し、ｙ軸には各種ＥＣＭタンパク質またはその非存在下である条件を示す。
（実施例９：コラーゲンＩＶコートチップ上におけるＰＣ１２細胞のトランスフェクションマイクロアレイのｓｉＲＮＡを用いた応用例）
次に、ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子発現抑制実験を本実施例において行った。本実施例では、ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡが特異的にＥＧＦＰの発現を抑制できるかどうかを指標に本発明が機能するかどうかを評価した。
実施例７などに記載されるような条件を用いて、コラーゲンＩＶをコーティングしたアレイ上でＰＣ１２のトランスフェクションを行った。実施例７において使用される遺伝子に代えて、以下の条件を使用した。
０．７５ｎｇの発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）、ＨｃＲｅｄ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）をそれぞれアレイ上の１スポットにスポッティングした。この後、１６．５ｎｇのｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎより購入。標的配列：５’− ＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣ −３’（配列番号２５）＝ａ）またはスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎより購入。標的配列：５’− ｇＣｇＣｇＣＴＴＴｇＴＡｇｇＡＴＴＣｇ −３（配列番号２６）＝ｂ）をこのスポットに適用した。
結果を図９に示す。図９Ａに示されるように、ＥＧＦＰベクターおよび抗ＥＧＦＰｓｉＲＮＡを共トランスフェクションしたＰＣ１２細胞の場合、ＨｃＲｅｄのみが発色し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１に由来する緑色信号が抑制されていたことが判明した。他方、図９Ｂに示されるように、スクランブルｓｉＲＮＡの場合は、緑色の蛍光が観察され、図９Ａにおける効果は、ＲＮＡｉの効果であることが確認された。図９Ａおよび図９Ｂにおける蛍光の強度を相対的に示した図を図９Ｃに示す。ｙ軸は相対輝度により示す。ＥＧＦＰによる効果は、ほぼ完全に抑えられていることが分かる。
（実施例１０：ＮＧＦにより核酸導入されたＰＣ１２細胞はアレイ上で分化する）
次に、固相支持体の上で核酸が導入された細胞が、分化誘導因子の存在下で分化が実際に核酸導入後も誘導されるかどうかを実証した。
アレイの調製などは、実施例７に記載される条件に従った。使用したＥＣＭタンパク質としては、フィブロネクチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、およびラミニンが含まれた。図１０Ａに示されるように、これらのＥＣＭタンパク質によるコーティングによって、程度の差はあれ、核酸が導入されていたことが分かる。
次に、トランスフェクション後３日間アレイ上で細胞を培養した後、神経成長因子（ＮＧＦ）（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔ．ＵＳＡ，ＣＡ）を０．１μｇ／ｍｌ）の存在下で分化誘導させた。その結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂ（左から倍率は、５０倍、２００倍を示す。）は、トランスフェクションアレイにおける分化の様子をスキャン造影したものを示す（左）。図９Ｂの真ん中は、ＰＣ１２細胞のトランスフェクション後３日目の顕微鏡写真を示す。図１０Ｂの右は、ＮＧＦ誘導後１日後の写真を示す。示されるように、ＰＣ１２細胞が、神経様に分化している様子が明らかになった。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples. Reagents, supports and the like used in the following examples, with exceptions, are those commercially available from Sigma (St. Louis, USA, Wako Pure Chemical (Osaka, Japan), Matsunami Glass (Kishiwada, Japan), etc. It was.
(experimental method)
(Substances and methods)
PC12 cells (rat pheochromocytoma cells) (ATCC, CRL-1721) were ₂ The cells were cultured in DMEM (Dulbecos modified Eagle medium) (14246-25, Nakarai Tesque, JPN) containing 10% bovine serum and antibiotics (penicillin and streptomycin). Neuro2a cells are at 37 ° C, 5% CO ₂ The cells were cultured in DMEM containing 10% FBS (fetal bovine serum) (29-167-54, Lot No. 2025F, Dainippon Pharmaceutical CO., LTD., JPN) and antibiotics.
(Cell seeding for local transfection (LT) cell array)
9 mm of chip (Matsunami Glass Ind., LTD., JPN) ² Each grid is seeded with 15 μl drops of the culture medium containing the above cells, 37 ° C., 5% CO 2. ₂ Incubate under to allow the cells to adhere to the substrate, then add culture medium and incubate for an additional 48 hours. Considering cell growth of PC12 cells and Neuro2a cells, 4500 and 3750 cells were seeded on each grid, respectively.
(Protocol for local transfection)
The appropriate transfection reagent for each cell line was determined by several transfection assays. For PC12 cells, a reagent containing Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogen Corporation, CA) was selected as the transfection reagent. 1.5 μl of pEGFP was diluted with 19 μl of DMEM. After gently diluting the pDNA, 4.5 μl of Lipofectamine 2000 was added and the resulting mixture was allowed to stand at room temperature to form a lipid DNA complex. For Jet-PEINP5 (101-30, Polyplus-translation, France), 1.5 μl of pEGFP was diluted with 10.5 μl of DMEM. 3 μl of 7.5 mM Jet-PEI polymer (101-30, Polyplus-translation, France) was added and the resulting mixture was allowed to stand at room temperature to form a polymer / pDNA complex. Using a 10 μl pipette tip, 30 nl of the transfection complex was spotted 5 times on each grid and dried on a clean bench. A 15 μl drop containing the cells is seeded on each grid, 37 ° C., 5% CO 2. ₂ After incubating below, culture medium was added. 37 ° C, 5% CO ₂ The cells were further incubated for 48 hours, after which fluorescence was observed.
(Protocol for solution phase transfection)
Solution phase transfection of PC12 cells was performed using Invitrogen's Lipofectamine 2000 transfection protocol. In order to limit the surface area and volume of the transfection solution, a silicone gasket (surface area 10 cm) is placed on the glass slide. ² ). The amount of transfection reagent was then calculated based on the vendor's manual.
(Glass slide coating with ECM protein)
As a culture dish, 48 square sections (9 mm) separated by a thin layer of TEFLON®. ² Plain glass slides with a surface area) and PLL precoated glass slides were used. For the fibronectin coating, a solution of fibronectin (FN) (16042-41, Nakarai Tesque, JPN) (1 mg / ml) was diluted with water (final concentration 0.1 μg / ml). 400 μl of this solution was then added to the glass slide to cover the area of the eight square sections. After 1 hour incubation at room temperature, the solution was removed and the square compartments were washed once with ultrapure water. For the coating of type I collagen, collagen-1 (Type IC, Nitta Gelatin Co., Ltd., Biological Science Laboratory) (3 mg / ml) was diluted with 0.15 M acetic acid (final concentration 100 μg / ml). Then 400 μl of this solution was added on a glass slide to cover the 8 square sections. After 1 hour incubation at room temperature, the solution was removed and the square compartments were washed once with PBS. For type IV collagen coating, collagen-IV (BD Biosciences, CA, 354233) (550 μg / ml) was diluted in 0.15 M acetic acid (final concentration 100 μg / ml). Then 400 μl of this solution was added on a glass slide to cover the 8 square sections. After 1 hour incubation at room temperature, the solution was removed and the square compartments were washed once with PBS.
(Fluorescence imaging)
For fluorescence imaging, the cell culture medium was completely removed and the cells were then fixed with 5% PFA. The cells were washed once with PBS to remove background fluorescence due to media components. The fluorescence was then observed using an array scanner (GeneTAC UC4 × 4, Genomic Solutions Inc., MI) or a confocal microscope (LSM510, Carl Zeiss Co., Ltd., Germany). Furthermore, the fluorescence intensity was evaluated using a program (Image Quant ver. 5.2, Molecular Dynamics Inc., CA, USA).
(Example 1: Change in cell morphology)
After incubation for 2 hours in culture dishes coated with extracellular matrix (ECM) protein (fibronectin, collagen type IV, collagen type I, laminin), phase microscope (FIGS. 1A-D) and confocal microscope (FIGS. 1E, F) Was used to observe morphological changes in PC12 cells. Prior to observation, nuclei were visualized by staining with SYTO (Molecular Probe, Inc., Eugene, OR, USA). As shown in FIGS. 1A-D, the distribution, size and shape of the cells differed significantly depending on the ECM coating used. Cells cultured on collagen IV showed the greatest increase in flatness due to cell adhesion and spreading. Nuclear cell distribution, size, and shape were also significantly different depending on the ECM coating used (FIG. 1E, FIG. 1F1). The adhered cells changed the surrounding morphology into a star shape. This is due to the elongation of the actin fiber and the increase of the projection area. Cell growth on other ECM proteins did not change the surrounding shape and did not show an increase in projected area as in the case of type IV collagen. A similar star shape was observed only on type I collagen, but did not show an increase in projected area comparable to type IV collagen. FIG. 1F2 shows the results of observing over time (1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours) when using type IV collagen and when using PLL. It is shown that the nucleus gradually expands and the nucleic acid is easily introduced.
FIG. 1F3 shows the observation results (1 hour and 2 hours = (a)) of collagen type IV and fibronectin with respect to PC12 cells, and collagen type IV, fibronectin, collagen type I and laminin. The results (3 hours = (b)) are shown. Based on this, a graph of the relative area of the nucleus is shown in FIG. 1F3 (c). For the relative area, the area occupied by the nucleus in the total area was shown as a relative ratio.
As is clear from FIG. 1F3, it was shown that the transfection efficiency increases as the relative area of the nucleus increases. Therefore, even when other ECM proteins are used, it is understood that the introduction efficiency of the nucleic acid is increased by adopting each of the relative areas preferably exceeding 0.1, for example.
Moreover, as FIG. 1G, the cell adhesion | attachment form when 3000-6000 cells are seed | inoculated 3 mm x 3 mm on the transfection chip | tip (slide glass, PLL coat) is shown.
Neuro2a cells also show similar results. FIG. 1H shows Neuro2a cells in a PLL-coated slide coated with collagen type IV (0.005 mg / ml). As shown, there is a significant variation in morphology.
(Example 2: Change in cell adhesion over time)
The time course of PC12 cell adhesion on each ECM supported the findings obtained by phase microscopy. As shown in FIG. 2, the fastest and most stable adhesion was observed when using type IV collagen. The cells were already well attached after 30 minutes and seem to have maintained strong adhesion throughout the observed time. Although cell adhesion to type I collagen was slower than that, it showed almost the same stable adhesion. PC12 cell adhesion to fibronectin and laminin tended to increase in adhesion over time, but at a significantly lower rate than that of collagen matrix.
Next, changes over time in Neuro2a cells were observed. As in FIG. 2B, the cell fixation effect was shown as normally expected.
(Example 3: Effect of ECM protein on transfection efficiency in cells)
Transgenic gene expression of CMV promoter EGFP construction vector was measured by fluorescent cells using a confocal microscope. We investigated the effect of coating plain glass slides with ECM protein with and without pre-coating with PLL (PC12 cells, FIG. 3; Neuro2a cells, FIG. 2C). We tested the difference in transfection effects based on ECM protein and pre-coating. In PLL pre-coated slides, type IV collagen increased transfection up to about 1000-fold compared to PLL coating alone. Laminin on PLL-coated slides showed adhesion similar to that of type IV collagen, but the transfection efficiency was lower (500 times). Adhesion to type I collagen was weaker than that of type IV collagen and laminin, but the increase in transfection efficiency was comparable to that of type IV collagen. Since PC12 cell adhesion to fibronectin was weak, significant detachment was caused by transfection reagent damage during the transfection process. Cells still remaining on fibronectin showed more efficient transfection than with PLL alone, but this was negligible. The effect of ECM protein on uncoated glass slides showed a slightly different pattern from that observed when pre-coated with PLL. Adhesion and transfection efficiency for type I collagen was increased compared to the PLL pre-coating. Fibronectin, laminin, and type IV collagen were inferior in effect to transfection efficiency on plain slides compared to the PLL pre-coating. Such an effect can be explained by lower adhesion for type IV collagen and higher adhesion for type I collagen on plain slides when compared to PLL precoated slides. A cooperative effect can also be considered.
In addition, as shown in FIG. 2C, the effect of increasing collagen type IV and type I transfection efficiency was also confirmed in Neuro2a cells.
Next, the isolation effect in a collagen IV PLL coat and a plain slide was verified. As shown in FIG. 3C, when the PLL coating was performed, the transfection isolation effect (effect by immobilization) was remarkable, but this effect was confirmed even with a plain slide.
Next, various ECMs were used to confirm the effect of the coating on transfection. The results are shown in FIGS. 3A, 3B and 3D. It was found that transfection efficiency increased with collagen (type I, type IV) and laminin. It is shown that the effect by collagen is high in PLL and plain. FIG. 3E shows a graph in which the intensity is digitized. It can be clearly seen that the effect of collagen is remarkable. FIG. 3F shows the actual cell fixation of that of FIG. 3D. It can be seen that fibronectin has a small fixing effect, but collagen and laminin have a relatively fixing effect and an effect of increasing transfection efficiency. FIG. 3G shows changes over time in the effects of various ECMs depending on the type of slide surface treatment. Thus, it can be seen that although the effect of collagen is significant, any ECM has more or less an adhesive effect.
(Example 4: Ca ²⁺ Effect of ECM protein on mediated gene expression)
Ca ²⁺ In order to obtain information on the effect of ECM proteins on gene expression mediated by E. coli, Ca from perinuclear space in PC12 cells grown on PLL, fibronectin, type I collagen, type IV collagen ²⁺ The change in release was observed using Fura2 technology (FIG. 4). The cells were contacted at 37 ° C. for 15 minutes in Fura2-AM diluted to 5 μM with the culture solution, and then washed with the medium. By this method, Fura2-AM was introduced into the cells. Data from preliminary experiments show significant Ca in cells grown on type IV collagen culture dishes compared to fibronectin-coated dishes. ²⁺ An increase in concentration was shown. This result indicates the possibility of molecular changes induced by cell surface integrin receptors that recognize ECM. This surpasses the effect of cell adhesion. Ca ²⁺ Depending on the gene expression changed significantly, it can be considered that an appropriate influence on the effect of transfection also affects.
(Example 5: Effect of ECM protein on various cell lines)
Whether there is only one ECM protein that affects cell adhesion and transfection efficiency in different types of cell lines, or whether there is a specific ECM protein in each type (or class) of cells. To investigate, we investigated various cell lines (hMSC, 3T3, HepG2, PC12, Neuro2a (hMSC: Cambrex BioScience Walkersville, Inc., MD, PT-2501; NIH3T3-3: RIKEN Cell Bank, JPN). RCB0150; HepG2: RIKEN Cell Bank, JPN, RCB1648; PC12: ATCC, CRL-1721; Neuro2a: ATCC, CCL-131), fibronectin, type I collagen, The effect of laminin, type V collagen, was tested (Figure 5) In the case of hMSC (PT-2501, Cambrex BioScience Walkersville, Inc., MD), fibronectin was shown to be the most stable ECM protein. Of ECM did not increase transfection compared to PLL coated slides.
Example 6: Local transfection array for PC12 cells
The present inventors applied the previous knowledge obtained in solution phase transfection to our LT transfection array system, and demonstrated the possibility of gene expression screening based on high-density chips for neuronal cell lines. Sought. In general, transfection is localized to the area where the transfection mixture is spotted. PC12 cells grown on different ECMs showed the same trend as observed in the solution phase method. In grids coated with type I and type IV collagen, up to 40 transfections were observed in the area spotted with 30 nl of transfection complex (containing about 1 nl of pEGFP). Compared to the solution method, more cells maintained adherence throughout the transfection process. This effect can be clearly seen in the case of untreated (also called plain) glass slides, fibronectin, PLL, PLL + fibronectin, and in contrast to the solution method, up to 10 transfectants are on one spot. Observed. These findings suggest that our local transfection method reduces damage to cells during the transfection process, thereby increasing cell viability and distortion.
(Example 7: Application to bioarray)
Next, in order to confirm whether or not the above-described effect of the present invention was demonstrated even when the array was used, an experiment was conducted with the scale expanded.
(Experiment protocol)
(Cell source, culture medium, and culture conditions)
In this example, five different cell lines were used: human mesenchymal stem cells (hMSC, PT-2501, Cambrex BioScience Walkersville, Inc., MD), human embryonic kidney cells HEK293 (RCB1637, RIKEN Cell Bank, JPN), NIH3T3-3 (RCB0150, RIKEN Cell Bank, JPN), HeLa (RCB0007, RIKEN Cell Bank, JPN), PC12 cells (CRL-1721, ATCC) and HepG2 (RCB1648, RIKEN Cell Bank, JPN) (exemplary cells) Please tell us if it is appropriate). In the case of human MSC cells, the cells were maintained in commercial human mesenchymal cell basal medium (MSCGM BulletKit PT-3001, Cambrex BioScience Walkersville, Inc., MD). In the case of HEK293 cells, NIH3T3-3 cells, HeLa cells and HepG2 cells, these cells were treated with 10% fetal calf serum (FBS, 29-167-54, Lot No. 2025F, Dainippon Pharmaceutical CO., LTD., JPN). Maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, high glucose with L-glutamine and sodium pyruvate (4.5 g / L); 14246-25, Nakarai Tesque, JPN). All cell lines were washed at 37 ° C, 5% CO ₂ The cells were cultured in a controlled incubator. In experiments involving hMSCs, we used hMSCs below passage 5 to avoid phenotypic changes.
(Plasmid and transfection reagent)
To evaluate the efficiency of transfection, pEGFP-N1 and pDsRed2-N1 vectors (Catalog Nos. 6085-1, 6973-1, BD Biosciences Clontech, CA) were used. Both gene expression was under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. Transfected cells continuously expressed EGFP or DsRed2, respectively. Plasmid DNA was amplified using Escherichia coli, XL1-blue strain (200409, Stratagene, TX) and purified by EndoFree Plasmid Kit (EndoFree Plasmid Max Kit 12362, QIAGEN, CA). In all cases, plasmid DNA was dissolved in water without DNase and RNase. Transfection reagents were obtained as follows: Effectene Transfection Reagent (catalog number 301425, Qiagen, CA), TransFast ™ Transfection Reagent (E2431, Promega, WI), TfxTM-20 Reagent (E2391, PromegaS, PromegaS, PromegaS, PromegaS, Promega S Reagent (301305, Qiagen, CA), PolyFect Transfection Reagent (301105, Qiagen, CA), LipofectAMINE 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen corporation, CA), JetPEI (× 4) conc. (101-30, Polyplus-translation, France), and ExGen 500 (R0511, Fermentas Inc., MD).
(Solid-phase transfection array (SPTA) generation)
Details of the protocol can be found at http: // stuffa. wi. mit. edu / sabatini_public / reverse_transfect. It was described in “Reverse Transfection Homepage” of htm. In our solid-phase transfection (SPTA method), three types of glass slides (Silane-treated glass slides; APS slides) with 48 square patterns (3 mm x 3 mm) separated by a hydrophobic fluororesin coating; And slides coated with poly-L-lysine; PLL slides, and slides coated with MAS; Matsunami Glass Ind., LTD., JPN) were studied.
(Preparation of plasmid DNA printing solution)
Two different methods have been developed for generating SPTA. The main difference is in the preparation of plasmid DNA printing solution.
(Method A)
When the Effectene Transfection Reagent is used, the printing solution contains plasmid DNA and cell adhesion molecules (collagen type I, collagen type IV, laminin, bovine plasma fibronectin (catalog number 16042-41 The solution described above was applied to the surface of the slide using an ink jet printer (synQUADTM, Cartian Technologies, Inc., CA) or manually using a 0.5-10 μL tip. The printed glass slide was allowed to dry inside the safety cabinet for 15 minutes at room temperature, and the total Effectene reagent was added to the DNA prior to transfection. Gently pour onto a lint glass slide and incubate for 15 minutes at room temperature Excess Effectene solution is removed from the glass slide with a suction aspirator and dried for 15 minutes at room temperature inside a safety cabinet The resulting DNA-printed glass slide was placed on the bottom of a 100 mm culture dish and approximately 25 mL of cell suspension (2-4 × 10 6 ⁴ Cells / mL) was gently poured into the dish. The dish is then placed at 37 ° C., 5% CO ₂ And incubated for 2-3 days.
(Method B)
In the case of other transfection reagents (TransFastTM, TfxTM-20, SuperFect, PolyFect, LipofectAMINE 2000, JetPEI (x4) conc. Or ExGen), plasmid DNA; collagen type I, collagen type IV, laminin or fibronectin; and transfection Reagents were mixed evenly in 1.5 mL microtubes according to the ratio indicated in the manufacturer's instructions and incubated for 15 minutes at room temperature before printing on the chip. The printing solution was applied on the surface of the glass slide using an inkjet printer or a 0.5-10 μL chip. The printed glass slide was completely dried for 10 minutes at room temperature inside the safety cabinet. The printed glass slide is placed on the bottom of a 100 mm culture dish and approximately 3 mL of cell suspension (2-4 × 10 6 ⁴ Cells / mL) was added and incubated for 15 minutes at room temperature inside the safety cabinet. After incubation, fresh medium was gently poured into the dish. The dish is then placed at 37 ° C., 5% CO ₂ And incubated for 2-3 days. After incubation, we used the fluorescence microscope (IX-71, Olympus PROMARKETING, INC., JPN) to transfect the transfectants based on the expression of enhanced fluorescent proteins (EFP, EGFP, and DsRed2). Observed. Phase contrast images were taken using the same microscope. In both protocols, cells were fixed by using the paraformaldehyde (PFA) fixation method (4% PFA in PBS, treatment time 10 minutes at room temperature).
(Laser scanning and fluorescence intensity determination)
To quantify transfection efficiency, we used a DNA microarray scanner (GeneTAC UC4x4, Genomic Solutions Inc., MI). After measuring the total fluorescence intensity (arbitrary units), the fluorescence intensity per surface area was calculated.
(result)
(Local transfection)
The transfection array chip was constructed by microprinting a cell culture medium containing DNA / transfection reagent and cell adhesion factors such as collagen type I, collagen type IV, laminin on a PLL-coated slide glass.
Various cells were used in this example. These cells were cultured under commonly used culture conditions. Since these cells attached to the glass slide, the cells were efficiently taken up and expressed a gene corresponding to the DNA printed at a given location on the array. Compared to conventional transfection methods (eg, cationic lipid or cationic polymer mediated transfection), the transfection efficiency using the method of the present invention was significantly higher. In particular, it was particularly important that tissue stem cells such as HepG2 and hMSC that were considered difficult to transfect, and nervous system cells such as PC12 cells were found to be efficiently transfected. It is. In the case of hMSC, an efficiency increase of about 40 times or more of the conventional method was observed. The high degree of integration required for high density arrays was also achieved (ie, the contamination between adjacent spots on the array was significantly reduced). This was confirmed by generating an array of checked patterns of EGFP and Ds-RED. Human MSCs were cultured in this array and the corresponding fluorescent proteins were expressed so that substantially all spatial resolution was shown. As a result, it became clear that there was almost no contamination. Based on this study on the role of the individual components of the print mixture, transfection efficiency can be optimized for various cells.
(Efficiency in local transfection by cell adhesion factors such as collagen type I, collagen type IV, laminin)
When the above-mentioned data of the present inventors were combined, it became clear that cell adhesion factors such as collagen type I, collagen type IV, and laminin markedly increased the introduction efficiency of the gene introduction reagent. Although such activity varies depending on various cells, it can be seen that these activities are involved in an increase in transfection efficiency. This is because the liquid phase increases the transfection efficiency even more in the liquid phase and in the solid phase.
(Neuron cell solid-phase transfection array)
The ability of neurons to build networks has become particularly interesting for studies targeting neural networks. In particular, genetic analysis of the transformation of these cells has attracted interest in elucidating factors that control the pluripotency of nerve cells such as PC12 cells.
To achieve this, conventional methods include either viral vector or electroporation techniques. By using the complex-salt system developed by the present inventors, high transfection efficiency can be obtained for various cell lines (including PC12 cells) and spatial localization in a dense array can be obtained. An enabling solid phase transfection was achieved. An outline of solid phase transfection is shown in FIG.
Solid-phase transfection arrays for the technical achievement of “transfection patches” that can be used for in-vivo gene delivery as well as high-throughput gene function studies in neuronal cells such as PC12 cells by solid-phase transfection ( SPTA) was found to be possible.
There are many standard methods for transfecting mammalian cells, but the introduction of genetic material into PC12 cells and primary culture cells is inconvenient and difficult compared to cell lines such as HEK293 and HeLa. It is known that there is. Either previously used viral vector delivery or electroporation is important, but potential toxicity (viral methods), insensitive to high-throughput analysis at the genome scale, and limited applications for in vivo studies There are inconveniences like sex (with respect to electroporation).
The development of a solid phase support immobilization system that can be easily immobilized on a solid phase support and that retains sustained release and cell affinity has overcome most of these drawbacks.
Using our technique using microprinting techniques, a mixture containing selected genetic material, transfection reagents and appropriate cell adhesion molecules, and salts could be immobilized on a solid support. Cell culture on the support on which the mixture was immobilized allowed the uptake of genes in the mixture for the cultured cells. As a result, it was possible to incorporate spatially separated DNA in the support-adherent cells. Therefore, this has made it possible to produce an experimental form that can incorporate a large amount of nucleic acid while culturing cells under almost uniform conditions.
As a result of this example, several important effects were achieved: high transfection efficiency (so that statistically significant cell populations can be studied), low reciprocity between regions supporting different DNA molecules Contamination (so that the effects of individual genes can be studied separately), long-term survival of transfected cells, high-throughput compatible formats and convenient detection methods. For SPTA, meeting all of these criteria will provide an appropriate basis for further research.
In order to clearly establish the achievement of these objectives, as described above, we used PC12 cells as our methodology (solid phase transfection) and conventional liquid phase transfection. Both were studied under a series of transfection conditions. In the case of SPTA, in order to assess mutual contamination, we used red fluorescent protein (RFP) and green fluorescent protein (GFP) printed on a glass support in a checkered pattern, whereas traditionally In the case of experiments involving the following liquid phase transfections (where essentially no spontaneous spatial separation of the transfected cells could be achieved) we used GFP. Several transfection reagents were evaluated: four liquid transfection reagents (Effectene, TransFastTM, TfxTM-20, LopfectAMINE 2000), two polyamines (SuperFect, PolyFect), and two types of polyimines (JetPEI (x4)) And ExGen 500).
Transfection efficiency: Transfection efficiency was determined as the total fluorescence intensity per unit area. Depending on the cell line used, optimal liquid phase results were obtained with different transfection reagents. These efficient transfection reagents were then used to optimize the solid phase protocol. Several trends were observed. By using conditions optimized for SPTA methodology in the case of PC12 cells where it is difficult to transfect cells, we have achieved transfection efficiencies tens to hundreds of times while maintaining cell characteristics. Observed to increase. For PC12 cells, the best conditions included the use of Lipofectamine 2000 reagent. As expected, an important factor for achieving high transfection efficiency is the charge balance between the number of nitrogen atoms (N) in the reagent composition and the number of phosphate residues (P) in the plasmid DNA. (N / P ratio), as well as DNA concentration. In general, an increase in N / P ratio and concentration results in an increase in transfection efficiency.
The key point for achieving high transfection efficiency on the chip is the glass coating used. We have found that PLL provides the best results in terms of both transfection efficiency and reciprocal contamination (discussed below). In the absence of fibronectin coating, a few transfectants were observed (all other experimental conditions were kept constant). Although not fully established, the role of cell adhesion molecules such as collagen is probably to accelerate the cell adhesion process and thus limit the time allowed for DNA diffusion off the surface.
Low reciprocal contamination: Apart from the higher transfection efficiency observed with the SPTA protocol, an important advantage of this technology is the realization of a separately isolated cell array, at each position where the selected gene is expressed. We printed JetPEI (see “Experimental Protocol” provided by the manufacturer) and two different reporter genes (RFP and GFP) mixed with fibronectin on a glass surface coated with fibronectin. The resulting transfection chip was provided for appropriate cell culture. Under the experimental conditions found to be best, the expressed GFP and RFP were localized in the region where the respective cDNA was spotted. Almost no mutual contamination was observed. However, in the absence of fibronectin or PLL, reciprocal contamination was important and transfection efficiency was significantly lower. This hypothesizes that the percentage of adherent cells and the relative percentage of plasmid DNA that diffuses away from the support surface is an important factor for both high transfection efficiency and high mutual contamination. Prove it.
A further cause of mutual contamination may be the mobility of the transfected cells on the solid support. We measured both cell adhesion rate and plasmid DNA diffusion rate on several supports. The results showed that, under optimal conditions, little DNA diffusion occurred, but under high reciprocal conditions, depletion of plasmid DNA from the surface was substantial by the time cell attachment was complete.
This established technique is particularly important in the context of economical high-throughput gene function screening. In fact, the small amount of transfection reagent and DNA required and the ability to automate the entire process (from plasmid isolation to detection) increases the usefulness of the above method. .
In conclusion, the present inventors successfully realized a transfection array in a system using a cell adhesion molecule and a gene introduction reagent. This will enable high-throughput studies in various studies using solid-phase transfection, such as elucidating the genetic mechanisms that control neuronal differentiation. The detailed mechanism of solid-phase transfection as well as the methodology relating to the use of this technique for high-throughput real-time gene expression monitoring has been found to be applicable for various purposes.
(Discussion)
Cell culture and transfection experiments showed that the ECM protein used to coat culture dishes in vitro retained significant effects on morphology, cell distribution, adhesion, and gene expression. As reported by the inventors using various cell lines HEK293, HEK293T, HeLa, NIH3T3, CHO, HepG2, localized transfection (LT) cell arrays for human mesenchymal stem cells (hMSC) In addition, the ECM component appears to be a suitable substrate for chip-based cell arrays that are tested to be useful for the evaluation of unknown gene networks. This study revealed that the function of fibronectin outweighs the role of adhesion. Cellular dispersion on the fibronectin matrix mediated by integrins causes nuclear planarization, and this shape change is due to nuclear Ca ²⁺ It has been found to be accompanied by a transient rise. These surveys show that Ca ²⁺ Activated Ca from permeation channels in the nuclear membrane responsible for the release of perinuclear space and entry into the nucleus ²⁺ The presence of Then Ca ²⁺ The transcription factor activity regulated by was enhanced in dispersed cells. In our recent report, we also showed a very relevant finding that transfection efficiency is dramatically increased by the presence of fibronectin. Similar cell adhesion profiles were observed in fibronectin (+) and fibronectin (-) conditions, but the shape of adherent cells was significantly different. Combined with the time-dependent observation of actin filament orientation, this indicates that the orientation of actin filaments induced by cell adhesion molecules such as fibronectin deposited on the surface plays an important role in increasing transfection efficiency. To suggest. In the presence of fibronectin deposited on the surface, actin filaments were rapidly rearranged and disappeared from the cytoplasmic space located under the nucleus in the process of cell expansion. Furthermore, the surface area of the nucleus was significantly increased in fibronectin (+) conditions. This is probably because it facilitated the passage of DNA particles through mechanical stress. In addition, Carson et al. (Carson H. Thomas et al., PNAS (2002) Vol. 99, No. 4, p1972-1977) observed that the correlation between gene expression and nuclear shape changed in a micropattern. Correlate closely with. In this report, we propose type IV collagen as a substrate suitable for adhesion and transfection of neuronal cell lines (particularly neuronal-like PC12 cells) on culture dishes or glass slides. PC12 cells grown on laminin or collagen substrates are known to retain 50% of their α1β1 integrin receptor along with their cytoskeleton. Evidence that α1β1 integrin heterodimer acts as a laminin / collagen dual receptor in neurons (Tawi et al., Biochemistry 1990) was clearly seen in similar adhesion of PC12 to their ECM components. These findings provide a good explanation for similar adhesion of PC12 cells on laminin and type IV collagen, but it is not clear why the transfectants obtained on their substrates are significantly different. However, from many studies, including ours, cell integrin-based binding and local geometric control are fundamental for the regulation of proliferation and survival in the microenvironment of cells. It is expected to show a mechanism (Nature Vol 392, 730-733, 16 April 1998; Science VOL.276, 30, 1425-1428 MAY 1997; Kubato et al., JBC 1992).
One exemplary objective of our study is to apply transfection efficiency to local transfection cell arrays in order to apply cells that have traditionally been difficult to introduce foreign substances such as neurons. And / or increasing cell adhesion. We have explored the possibility of chip-based LT cell arrays for neuronal cell lines based on type IV collagen coating, based on the technical strategy of our approach to the above discovery (Figure 6). This technique has proven to be an important high-throughput tool for validation of parallel cDNA gene expression studies. Furthermore, the cell array can be used as a microscale overexpression array for morphological changes, cell growth, or alternative observations due to overexpression of a single gene.
(Example 8: Nucleic acid introduction efficiency does not depend on the type of gene introduction reagent)
Next, it was demonstrated in this example that the nucleic acid introduction efficiency of the nucleic acid introduction according to the present invention does not depend on the type of gene introduction reagent.
Compositions mixed in amounts as shown in the table below were prepared.

Here, the reagents used are as follows: Transfectin (170-3350; BIO-RAD, USA, CA); LipofectAMINE 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen corporation, CA), SureFECTOR (EM-101) -001, B-Bridge, USA, CA), JetPEI (x4) conc. (101-30, Polyplus-translation, France), SuperFect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA) and TransIT (MIR2304; Miraus Co., USA, WI).
Using this reagent, it was shown that the effects of various ECM proteins on PC12 cells did not depend on the type of gene transfer reagent using the experimental conditions as shown in Examples 4 and 5.
The result is shown in FIG. a shows the state of nucleic acid introduction in various SECM proteins (fibronectin, collagen I, collagen IV and laminin). What is dyed green is the product of the introduced gene. b shows that the effect of various ECM proteins does not depend on the type of gene transfer reagent. The z axis represents transfection efficiency, the x axis represents gene introduction reagents from various manufacturers, and the y axis represents various ECM proteins or conditions in the absence thereof.
(Example 9: Transfection of PC12 cells on collagen IV coated chip Application example using siRNA of microarray)
Next, gene expression suppression experiments using siRNA were performed in this example. In this example, whether or not the present invention functions was evaluated based on whether or not siRNA against EGFP can specifically suppress the expression of EGFP.
PC12 transfections were performed on collagen IV coated arrays using conditions such as those described in Example 7 and the like. Instead of the gene used in Example 7, the following conditions were used.
Each of 0.75 ng expression vector (pEGFP-N1) and HcRed (BD Biosciences Clontech, CA) was spotted on one spot on the array. After this, 16.5 ng siRNA (purchased from Dharmacon. Target sequence: 5′-GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC-3 ′ (SEQ ID NO: 25) = a) or scrambled siRNA (purchased from Dharmacon. Target sequence: 5 ′ -GCg CgC TTT gTA ggA TTC g-3 (SEQ ID NO: 26) = b) was applied to this spot.
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9A, in the case of PC12 cells co-transfected with an EGFP vector and an anti-EGFP siRNA, it was found that only HcRed was colored and the green signal derived from pEGFP-N1 was suppressed. On the other hand, as shown in FIG. 9B, in the case of scrambled siRNA, green fluorescence was observed, and the effect in FIG. 9A was confirmed to be the effect of RNAi. FIG. 9C shows the relative intensity of the fluorescence in FIGS. 9A and 9B. The y axis is indicated by relative luminance. It can be seen that the effect of EGFP is almost completely suppressed.
(Example 10: PC12 cells introduced with nucleic acid by NGF differentiate on the array)
Next, it was demonstrated whether cells in which a nucleic acid was introduced on a solid support were actually induced after the introduction of the nucleic acid in the presence of a differentiation-inducing factor.
The preparation of the array and the like followed the conditions described in Example 7. ECM proteins used included fibronectin, collagen type I, collagen type IV, and laminin. As shown in FIG. 10A, it can be seen that the nucleic acid was introduced to some extent by coating with these ECM proteins.
Next, after culturing the cells on the array for 3 days after transfection, differentiation was induced in the presence of nerve growth factor (NGF) (Chemicon Int. USA, CA) at 0.1 μg / ml). The result is shown in FIG. 10B. FIG. 10B (magnifications are 50 × and 200 × from the left) shows a scan-contrast image of differentiation in the transfection array (left). The middle of FIG. 9B shows a photomicrograph 3 days after transfection of PC12 cells. The right side of FIG. 10B shows a photograph one day after NGF induction. As shown, it became clear that PC12 cells were neuronally differentiated.
As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, it is understood that the scope of this invention should be construed only by the claims. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.

本発明はまた、核酸を導入した後に、分化誘導を可能にする技術を提供する。本発明により、任意の核酸を導入し、任意の分化誘導を行うといった自在な試験設定を可能にする。この技術は、固相上で可能なことから、細胞アレイで必要なかなりの条件を任意に設定することができ、細胞に関連する任意の産業（製薬業、農業など）において有用である。 The present invention also provides a technique that enables differentiation induction after introduction of a nucleic acid. According to the present invention, it is possible to freely set a test in which an arbitrary nucleic acid is introduced and an arbitrary differentiation induction is performed. Since this technique is possible on a solid phase, it is possible to arbitrarily set a considerable condition necessary for a cell array, and it is useful in any industry related to cells (pharmaceutical industry, agriculture, etc.).

【配列表】

[Sequence Listing]

Claims

A composition for improving the efficiency of introducing a nucleic acid into a cell,
A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent,
A composition comprising:

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix.

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin.

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises fiber-forming collagen or basement membrane collagen.

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises fibrogenic collagen and basement membrane collagen.

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or type IV.

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV.

The composition according to claim 1, wherein the gene introduction reagent comprises at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent, and calcium phosphate.

2. The composition of claim 1 further comprising a nucleic acid contemplated for introduction.

The composition of claim 1, wherein the nucleic acid is DNA.

The composition of claim 10, wherein the nucleic acid comprises a sequence encoding a gene.

The composition of claim 1, wherein the composition is a solid.

The composition of claim 1, wherein the composition is a liquid.

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule is in multimeric form.

The composition according to claim 1, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.

The composition according to claim 1, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.

The composition according to claim 1, wherein the cell is a cell of the nervous system.

The composition according to claim 1, wherein the cell is a cell of the nervous system, and the cell adhesion molecule comprises collagen.

The composition according to claim 1, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase.

The composition according to claim 1, wherein the cells include primary cultured cells.

The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 μg / ml to 100 μg / ml.

The composition according to claim 1, wherein the cells are further induced to differentiate.

The composition according to claim 1, further comprising a differentiation-inducing factor.

A device for improving nucleic acid introduction efficiency of a cell,
A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent,
A device wherein the composition is secured to a support.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule comprises fibrogenic collagen or basement membrane collagen.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule comprises fibrogenic collagen and basement membrane collagen.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or type IV.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV.

The device according to claim 24, wherein the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate.

25. The device of claim 24, further comprising a nucleic acid intended for introduction.

25. The device of claim 24, wherein the nucleic acid is DNA.

34. The device of claim 33, wherein the nucleic acid comprises a sequence encoding a gene.

25. The device of claim 24, wherein the support is a solid.

25. The device of claim 24, wherein the support is a liquid.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule is in multimeric form.

The device according to claim 24, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.

The device according to claim 24, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.

25. The device of claim 24, wherein the cell is a nervous system cell.

25. The device of claim 24, wherein the cell is a nervous system cell and the cell adhesion molecule comprises collagen.

The device according to claim 24, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase.

25. The device of claim 24, wherein the cells include primary cultured cells.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 [mu] g / ml to 100 [mu] g / ml.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support.

25. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers.

33. The device of claim 32, wherein the nucleic acids are arranged on the support in an array.

25. The device of claim 24, wherein the cell is further induced to differentiate.

25. The device of claim 24, wherein the composition further comprises a differentiation inducer.

A method for increasing the nucleic acid introduction efficiency of a cell,
A) A composition for improving nucleic acid introduction efficiency of a cell,
a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent,
Providing the cell with a nucleic acid intended to be introduced; and B) subjecting the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced;
Including the method.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule comprises fibrogenic collagen or basement membrane collagen.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule comprises fibrogenic collagen and basement membrane collagen.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or type IV.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV.

51. The method according to claim 50, wherein the gene introduction reagent comprises at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent, and calcium phosphate.

51. The method of claim 50, wherein the composition is a solid.

51. The method of claim 50, wherein the composition is a liquid.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule is in multimeric form.

51. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule takes a three-dimensional structure.

51. The method according to claim 50, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.

51. The method of claim 50, wherein the cell is a nervous system cell.

51. The method of claim 50, wherein the cell is a nervous system cell and the cell adhesion molecule comprises collagen.

51. The method according to claim 50, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase.

51. The method of claim 50, wherein the cells include primary cultured cells.

51. The method of claim 50, wherein the nucleic acid comprises DNA.

51. The method of claim 50, wherein the nucleic acid comprises a sequence encoding a gene.

51. The method of claim 50, wherein the composition and the nucleic acid are immobilized on a support.

70. The method of claim 69, wherein the support is a solid.

70. The method of claim 69, wherein the support is a liquid.

70. The method of claim 69, further comprising immobilizing the composition and the nucleic acid to the support.

The method according to claim 69, wherein the fixing is performed by an inkjet method.

70. The method of claim 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support.

70. The method of claim 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers.

70. The method of claim 69, wherein the nucleic acids are arranged on the support in an array.

51. The method of claim 50, further comprising inducing differentiation of the cell.

51. The method of claim 50, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor.

A kit for introducing a nucleic acid into a cell,
A)
a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent,
A composition comprising; and B) instructions describing the composition and method of use with the nucleic acid,
A kit comprising:

80. The kit of claim 79, further comprising a differentiation inducing factor.

Use of a composition for gene transfer into a cell, comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent.

The use according to claim 81, wherein the composition further comprises a differentiation-inducing factor.

A composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid,
A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent,
A composition comprising:

84. The composition of claim 83, wherein the composition comprises a differentiation inducing factor.

85. The composition of claim 84, wherein the differentiation inducing factor comprises a cell growth factor.

85. The composition of claim 84, wherein the cell is a nerve and the differentiation inducing factor comprises nerve growth factor (NGF).

A method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, comprising:
A)
a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent,
Providing the cell with a nucleic acid intended to be introduced; and B) subjecting the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced;
The cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid,
Method.

88. The method of claim 87, wherein the composition comprises a differentiation inducer.

90. The method of claim 88, wherein the differentiation inducing factor comprises a cell growth factor.

90. The method of claim 88, wherein the cell is a nerve and the differentiation inducing factor comprises nerve growth factor (NGF).

88. The method of claim 87, further comprising the step of inducing differentiation of the cell.

A composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell,
A) cell adhesion molecules;
A composition comprising B) a gene transfer reagent; and C) a differentiation-inducing factor.

A kit for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell,
A)
A kit comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a composition comprising a gene transfer reagent; and B) a differentiation inducer.

A method of introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing differentiation of the cell,
A)
providing a composition with a nucleic acid intended to be introduced to the cell; and B) subjecting the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced; And C) inducing differentiation of the cell,
Including the method.