JPWO2004039844A1

JPWO2004039844A1 - Prostate cancer tumor marker

Info

Publication number: JPWO2004039844A1
Application number: JP2004548109A
Authority: JP
Inventors: 達寛吉貴; 上田　正道; 正道上田
Original assignee: Ｔｓｓバイオテック株式会社
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2023-10-31
Also published as: AU2003280693A1; JP4451784B2; WO2004039844A1

Abstract

本発明は、前立腺肥大症組織の上皮組織片又は上皮細胞で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物のミエローマ細胞とを融合して得られ、前立腺分泌細胞に対して反応するが間質には反応しないモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株に関する。The present invention is obtained by fusing mammalian immune cells and mammalian myeloma cells immunized with epithelial tissue pieces or epithelial cells of benign prostatic hyperplasia tissue, and reacts with prostate secretory cells, but in the stroma The present invention relates to a hybridoma or a cell line derived therefrom that produces an unreacted monoclonal antibody.

Description

本発明は、前立腺癌の診断に有用なタンパク質、該タンパク質に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を生産するためのハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた前立腺癌の検出方法に関する。 The present invention relates to a protein useful for diagnosis of prostate cancer, a monoclonal antibody specific for the protein, a hybridoma for producing the monoclonal antibody, and a method for detecting prostate cancer using the monoclonal antibody.

前立腺癌は、６０歳代より急激な患者人口の増加が認められ、７０代では潜伏癌も含めて３０％台にのぼる高齢者の高リスク癌の一つである。現状では、老人健診や、前立腺肥大等の疑いで精査されて発見されるケースがほとんどである。前立腺癌の診断においては、血尿等通常の一次検診で発見しやすい症状を呈さないことがほとんどであるために、見落とされることが多い。根治療法としては、原発巣の外科的切除が有効であることは他の癌と同じであるが、前立腺癌はしばしば早期段階での診断が困難であり、年齢と癌の進行度合いにより手術不能例が多く、転移（骨転移）が高率に起こって、予後不良となる例が多い。従って、前立腺癌の早期診断・治療を可能にする簡便で安価な技術開発は急務であった。
一方、前立腺癌の診断と経過観察のために有用な抗原として、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（ＷａｎｇＭＣ，ｅｔａｌ．，ＩｎｖｅｓｔＵｒｏｌ１７，１５９−１６３，１９７９）が知られているが、この抗原は、多くの他の腫瘍マーカーと同様に癌特異的ではない。従って、前立腺特異抗原分子そのものの存在は、必ずしも癌細胞の検出に有用ではなく、良性前立腺疾患による偽陽性の可能性を常に念頭におく必要があり、前立腺肥大症と前立腺癌を識別可能な診断技術が望まれていた。Prostate cancer is one of the high-risk cancers of the elderly, with a rapid increase in the patient population since the 60s, and in the 70s, including latent cancer, in the 30% range. At present, most cases are discovered after scrutinizing due to suspicion such as medical examinations for the elderly and enlarged prostate. In the diagnosis of prostate cancer, it is often overlooked because it usually does not show symptoms that are easily detected by a normal primary examination such as hematuria. As a radical treatment, surgical resection of the primary lesion is the same as other cancers, but prostate cancer is often difficult to diagnose at an early stage, and inoperable cases due to age and the degree of progression of cancer In many cases, metastasis (bone metastasis) occurs at a high rate, resulting in poor prognosis. Therefore, there is an urgent need to develop a simple and inexpensive technology that enables early diagnosis and treatment of prostate cancer.
On the other hand, a prostate specific antigen (PSA) (Wang MC, et al., Invest Urol 17, 159-163, 1979) is known as an antigen useful for diagnosis and follow-up of prostate cancer. Is not as cancer specific as many other tumor markers. Therefore, the presence of the prostate-specific antigen molecule itself is not necessarily useful for detecting cancer cells, and it is always necessary to keep in mind the possibility of false positives due to benign prostate disease. Technology was desired.

本発明の課題は、前立腺肥大症と前立腺癌を識別しうる新規な前立腺癌腫瘍マーカーを見出し、前立腺癌を効果的に検出できる方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、Ｍａｃ−２結合タンパク質を腫瘍マーカーとして、これに特異的に反応する抗体を用いることにより、上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）前立腺肥大症組織の上皮組織片又は上皮細胞で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物のミエローマ細胞とを融合して得られ、前立腺分泌細胞に対して反応するが間質には反応しないモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株。
（２）（１）に記載のハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株が産生する、前立腺分泌細胞に対して反応するが間質には反応しないモノクローナル抗体。
（３）前立腺肥大症組織の上皮組織片又は上皮細胞で哺乳動物を免疫し、該哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物のミエローマ細胞とを融合させ、前立腺分泌細胞に対して反応するが間質には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株を選択し、該ハイブリドーマを培養し、該モノクローナル抗体を回収することを特徴とする、（２）に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
（４）（２）に記載のモノクローナル抗体を用いて、試料中のＭａｃ−２結合タンパク質を免疫学的に測定し、前立腺癌を検出する方法。
（５）試料中のＭａｃ−２結合タンパク質を測定することにより、前立腺癌を検出する方法。
（６）Ｍａｃ−２結合タンパク質又はその断片と特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて、試料中のＭａｃ−２結合タンパク質を免疫学的に測定し、前立腺癌を検出する方法。
（７）Ｍａｃ−２結合タンパク質又はその断片と特異的に反応するモノクローナル抗体を含む前立腺癌診断薬。
（８）Ｍａｃ−２結合タンパク質又はその断片と特異的に反応するモノクローナル抗体を含む前立腺癌診断用キット。
（９）Ｍａｃ−２結合タンパク質又はその断片と特異的に反応するモノクローナル抗体の製造方法であって、前立腺肥大症組織の上皮組織片又は上皮細胞で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物のミエローマ細胞とを融合し、得られたハイブリドーマから前立腺分泌細胞に対して反応するが間質には反応しないモノクローナル抗体を産生するものを選択し、これを培養して該モノクローナル抗体を回収することを特徴とする該方法。
抗体の作成
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト前立腺肥大症組織から分離された上皮細胞で免疫した哺乳動物の免疫細胞をもとに公知の方法によって得ることができる。免疫細胞とは、当技術分野における通常の意味を有し、例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、プラズマ細胞等が含まれるが、特に抗体産生細胞を意味する。
ヒト前立腺肥大症組織由来の上皮細胞を免疫原として用いる場合、通常、前立腺から分離した上皮組織片を生理食塩水等のバッファーに懸濁させて動物に投与する。また、全前立腺を細断して生理食塩水に懸濁させ、上皮組織片を分離することなくこの懸濁液をそのまま抗原として用いてもよい。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）によって産生されたハイブリドーマから得ることができる。また、得られたハイブリドーマを、更に無血清培地や低血清培地でも増殖可能にした該ハイブリドーマに由来する細胞株を抗体産生細胞として用いることもできる。細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
まず、前記免疫原を哺乳動物（マウス、ラット等、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）に免疫する。免疫原の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決めることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。初回免疫後、１〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に免疫原を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も免疫原はアジュバントを添加混合して追加免疫注射をすることが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、免疫原を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物（マウス、ラット等）のミエローマ細胞とを細胞融合させるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１株（ＪＣＲＢ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ００２９）などを用いることができる。
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やリポソーム等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を一次抗体として蛍光免疫染色法等で前立腺肥大症組織及び精液に含まれる前立腺分泌液を染色し、ヒト前立腺分泌細胞と特異的に反応するが間質には反応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する。抗体産生細胞のクローニングは、限界希釈法等の公知のクローニング方法を組み合わせて行うことができ、本発明のモノクローナル抗体を生産する細胞株を単離して得ることができる。染色するための前立腺肥大症組織は、例えば、無固定で液体窒素によって凍結したもの、又は緩衝ホルマリン固定後パラフィン包埋したものの切片を使用できる。前立腺分泌液は、精液に含まれているので、これを凍結保存して使用することができる。
本明細書において、前立腺分泌細胞とは、前立腺の本体となる腺管を構成し、内部に分泌顆粒を含む腺上皮細胞を意味し、間質とは、腺管と腺管の間隙を埋める、平滑筋を含む結合組織を意味する。
具体的には、ヒト前立腺分泌細胞に対する反応性を指標に、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングし、クローニングして細胞株とする。得られた細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。サブクラスは、例えば、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット等を用いて決定できる。
培地としてはＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましい。
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明のモノクローナル抗体を得ることもできる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせることにより、精製することができる。
作成された抗体の反応性評価
上記のようにして得られたモノクローナル抗体を一次抗体として蛍光免疫染色法によって前立腺癌症例のホルマリン固定パラフィン切片を染色した。その結果、前立腺癌細胞は、前立腺肥大症組織の分泌細胞と同様に良好な染色性を示し、試験した前立腺癌組織のうちの９４％が陽性を示した。高分化癌が最も高い陽性率を示した。既存の腫瘍マーカーである前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）や前立腺特異抗原（ＰＳＡ）についても、同一の前立腺癌組織試料を用いて反応性を試験した。その結果、前立腺特異抗原を用いた場合の陽性率は５８％、前立腺性酸性フォスファターゼを用いた場合の陽性率は７１％であり、それぞれ有意に本発明のモノクローナル抗体を用いた場合の陽性率の方が高いことが示された。
また、前立腺癌に罹患していなかった男性３症例と女性２症例の剖検で得られた各種臓器のホルマリン固定パラフィン切片を用いて、上記と同様に上記抗体を一次抗体として蛍光免疫測定法によって染色を行ったところ、本発明の抗体が前立腺組織に高い特異性で反応することが確認された。
さらに、上記のような蛍光免疫染色法で前立腺癌細胞を染色した場合に、その組織片に含まれる癌細胞の２／３以上が陽性を示す癌細胞陽性患者群とそうでない患者群とを比較すると、前者の患者群の方が生存率が良好であった。同様に、癌の非進展率についても、前者の患者群の方が良好であった。一般に、生存率および癌の非進展率が良好な癌は、細胞の分化度が高い、すなわち悪性度の低いものであると考えられる。上記の反応性評価においては、細胞レベルでの染色性が良好なものほど生存率及び癌非進展率が良好であったことから、上記モノクローナル抗体と反応する抗原は、分化抗原であると考えられる。
抗体が認識する抗原の同定
作成された抗体が認識する抗原を検出するために、第一段階としてヒト混合精漿を試料として電気泳動を行った。次に、ゲルからタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。この膜を、今回作成した抗体を一次抗体として免疫染色した。ウェスタンブロット解析の結果、還元条件下で本発明のモノクローナル抗体は分子量約７０ｋＤａのタンパク質を抗原として認識することが明らかとなった。
次に、作成された抗体を利用した免疫アフィニティーカラムで対応抗原の精製を行った。精製した抗体をアフィニティー精製用ゲルに結合させカラムに組んだ。このカラムに混合精漿を通して精漿中の抗原とカラムの抗体を反応させ、十分に洗浄して非特異的結合物質を除去後、抗原を抗体から解離させ回収した。回収した精製抗原を電気泳動し、染色にてタンパク質を可視化させ当該部位のバンドをゲルから切り出した。そのゲル片からタンパク質を抽出後、酵素処理にて断片化し、それぞれをエドマン法によってアミノ酸配列分析した。その結果、Ｎ末端を含めて計５１残基の配列が全て完全にＭａｃ−２結合タンパク質と同一であることを確認した。以上から、本発明のモノクローナル抗体に対する抗原はＭａｃ−２結合タンパク質であることが明らかとなった。
Ｍａｃ−２結合タンパク質とは、乳癌細胞株の培養上清から発見された５６７個のアミノ酸からなる糖タンパク質であり、Ｍａｃ−２タンパク質のリガンドと考えられている。
このタンパク質は分子量約９０ｋＤａで、２５ｋＤａと６５ｋＤａに断片化すると報告されている。このことから、上記のようにして得られた本発明の抗体に対するＭａｃ−２結合タンパク質の抗原決定基は、われわれの電気泳動では約７０ｋＤａと判断された後者の６５ｋＤａの断片上に存在すると考えられる。
従って、本発明における別の態様においては、Ｍａｃ−２結合タンパク質又はその断片と特異的に反応する抗体を用いて、前立腺癌の検出を行うことができる。すなわち、Ｍａｃ−２結合タンパク質又はその断片を免疫原として免疫した哺乳動物の免疫細胞をもとに上記と同様の方法によって得られたモノクローナル抗体を用いて前立腺癌の検出を行うことができる。ここで、Ｍａｃ−２結合タンパク質の断片とは、前立腺肥大症組織の上皮細胞で免疫した哺乳動物から上記のようにして得られた本発明の抗体と結合することができるＭａｃ−２結合タンパク質の断片を意味し、好ましくは上記の６５ｋＤａの断片を意味する。Ｍａｃ−２結合タンパク質を免疫原として用いる場合は、当該タンパク質は以下のようにして得ることができる。
免疫原としてのＭａｃ−２結合タンパク質の作成
本発明において免疫原として使用可能なＭａｃ−２結合タンパク質のアミノ酸配列及び該タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｌ１３２１０として公開されている。従って、公開されているアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより、免疫原として使用するためのＭａｃ−２結合タンパク質を合成することができる。
また、公知の遺伝子組換え手法を利用して、Ｍａｃ−２結合タンパク質をコードするｃＤＮＡの情報を用いてＭａｃ−２結合タンパク質を生産することも可能である。以下、組換え手法を用いたＭａｃ−２結合タンパク質の生産に関して説明する。
Ｍａｃ−２結合タンパク質生産用組換えベクターは、上記公開されているｃＤＮＡ配列を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体はＭａｃ−２結合タンパク質生産用組換えベクターを、Ｍａｃ−２結合タンパク質が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１ａ、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターにＭａｃ−２結合タンパク質ｃＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
その他、哺乳動物細胞において用いられるＭａｃ−２結合タンパク質生産用組換えベクターには、プロモーター、Ｍａｃ−２結合タンパク質ｃＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、Ｍａｃ−２結合タンパク質生産用組換えベクターを作成する。
形質転換に使用する宿主としては、Ｍａｃ−２結合タンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
一例として、細菌を宿主とする場合は、Ｍａｃ−２結合タンパク質生産用組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、Ｍａｃ−２結合タンパク質ＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＢＲＬなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞などを宿主とする場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って、Ｍａｃ−２結合タンパク質を生産することができる。
本発明において免疫原として使用するＭａｃ−２結合タンパク質は、上記作成した形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、Ｍａｃ−２結合タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、Ｍａｃ−２結合タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からＭａｃ−２結合タンパク質を単離精製することができる。
Ｍａｃ−２結合タンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
癌の検出方法
本発明の癌の検出方法は、上記の方法に従って、前立腺肥大症組織の上皮細胞を免疫原として得られるモノクローナル抗体又はＭａｃ−２結合タンパク質若しくはその断片を免疫原として得られるモノクローナル抗体を用いて、試料中の前立腺癌細胞に由来するＭａｃ−２結合タンパク質を免疫学的に検出又は測定することを特徴とする。
本発明の検出方法は、抗体を用いる測定法、すなわち免疫学的測定法であればいずれの方法においても、その測定法で使用される抗体として本発明の上記モノクローナル抗体を用いることができ、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウェスタンブロット法等により本発明の検出方法は実施される。
本発明の検出方法において被検対象となる試料としては、前立腺癌細胞に由来するＭａｃ−２結合タンパク質が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定されるものではない。例えば、血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水などが挙げられ、細胞又は臓器の抽出液等も使用することができる。特に、血液、血清、血漿のような試料において、本発明のモノクローナル抗体を用いて得られたＭａｃ−２結合タンパク質の測定値は、前立腺癌の指標として有用である。
本発明の検出方法を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、本発明のモノクローナル抗体を固相化するか、又は試料中の成分を固相化して、それらと免疫学的反応を行うことが好ましい。
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。固相化は、固相担体と本発明のモノクローナル抗体又は試料成分とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
本発明においては、本発明のモノクローナル抗体と、試料中の前立腺癌細胞に由来するＭａｃ−２結合タンパク質との反応を容易に検出するために、本発明のモノクローナル抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（例えばサンドイッチ法など）を利用することが好ましい。
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン−アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ４８０又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素^１２５又はヨウ素^１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ_２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測定法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。
測定の操作法は、公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年，北川常廣ら編「タンパク質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年，入江實編「ラジオイムノアッセイ」，講談社サイエンティフィク，１９７４年，入江實編「続ラジオイムノアッセイ」，講談社サイエンティフィク，１９７９年）により行うことができる。
例えば、本発明のモノクローナル抗体を直接標識する場合には、試料中の成分を固相化し、標識した本発明のモノクローナル抗体と接触させて、Ｍａｃ−２結合タンパク質−本発明のモノクローナル抗体の複合体を形成させる。そして未結合の標識モノクローナル抗体を洗浄分離して、結合標識モノクローナル抗体量又は未結合標識モノクローナル抗体量より試料中のＭａｃ−２結合タンパク質量を測定することができる。
また例えば、標識二次抗体を用いる場合には、本発明のモノクローナル抗体と試料とを反応させ（一次反応）、さらに標識二次抗体を反応させる（二次反応）。一次反応と二次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。一次反応及び二次反応により、固相化したＭａｃ−２結合タンパク質−本発明のモノクローナル抗体−標識二次抗体の複合体、又は固相化した本発明のモノクローナル抗体−Ｍａｃ−２結合タンパク質−標識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量より試料中のＭａｃ−２結合タンパク質量を測定することができる。
具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射能量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
本発明の検出方法は、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
以下に、本発明の検出法の好ましい実施態様の一例を示す。最初に、本発明のモノクローナル抗体を一次モノクローナル抗体として不溶性担体に固定する。そして好ましくは、抗原が吸着していない固相表面を、抗原とは無関係のタンパク質（仔ウシ血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなど）によりブロッキングする。続いて、固定化された一次モノクローナル抗体と被検試料とを接触させる。次いで、上記一次モノクローナル抗体と異なる部位で、Ｍａｃ−２結合タンパク質と反応する標識二次抗体とを接触させ、該標識からの信号を検出する。
ここで用いる「一次モノクローナル抗体と異なる部位で、Ｍａｃ−２結合タンパク質と反応する二次抗体」は、一次モノクローナル抗体とＭａｃ−２結合タンパク質との結合部位以外の部位を認識する抗体であれば特に制限はなく、免疫原の種類を問わず、ポリクローナル抗体、抗血清、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’等）を用いることもできる。更に、二次抗体として複数種のモノクローナル抗体を用いてもよい。
またこれとは逆に、本発明のモノクローナル抗体に標識を付して二次抗体とし、本発明のモノクローナル抗体と異なる部位で、Ｍａｃ−２結合タンパク質と反応する抗体を一次抗体として不溶性担体に固定し、この固定化された一次抗体と被検試料とを接触させ、次いで、二次抗体として標識を付した本発明のモノクローナル抗体とを接触させ、前記標識からの信号を検出してもよい。
本発明のＭａｃ−２結合タンパク質は、試料中において二量体以上で存在し、強い還元条件下でのみ単量体となる。従って、一次抗体、二次抗体とも同一のモノクローナル抗体を使用して検出することもできる。
癌の診断薬
また本発明のモノクローナル抗体は、上述したように、前立腺癌細胞に由来するＭａｃ−２結合タンパク質と特異的に反応するため、癌の診断薬として用いることができる。
本発明の診断薬は、本発明のモノクローナル抗体を含むものであり、従って、本発明の診断薬を用いて、前立腺癌への罹患が疑われる個体から採取した試料中に含まれる前立腺癌細胞に由来するＭａｃ−２結合タンパク質を検出することによって、該個体の前立腺癌の罹患を診断することができる。
また本発明の診断薬は、免疫学的測定を行うための手段であればいずれの手段においても利用することができるが、当技術分野で公知の免疫クロマト用テストストリップなどの簡便な手段と組み合わせて用いることによって、さらに簡便かつ迅速に癌を診断することができる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、本発明の診断薬を含有する試薬部、試料と診断薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を呈色する標識部、呈色された反応物が展開してくる提示部などから構成されるものであり、妊娠診断薬と同様の形態とすることができる。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において、試料中の前立腺癌細胞由来のＭａｃ−２結合タンパク質と本発明のモノクローナル抗体との反応が起こり、反応した複合体が展開部を移動して標識部に到達する。標識部においては、上記反応複合体と標識二次抗体との反応が起こって、その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展開すると呈色が認められることになる。
上記免疫クロマト用テストストリップは、使用者に対し苦痛や試薬使用による危険性を一切与えないものであるため、家庭におけるモニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査・治療（外科的切除等）し、転移・再発予防に結びつけることが可能となる。また現在、このテストストリップは、例えば特開平１０−５４８３０号公報に記載されるような製造方法により安価に大量生産できるものである。
また、本発明の診断薬と前立腺特異抗原を含む既知の前立腺癌の腫瘍マーカーに対する診断薬とを組み合わせて使用することにより、さらに信頼性の高い診断が可能になる。
診断結果
前立腺癌患者の血清中におけるＭａｃ−２結合タンパク質濃度を、Ｍａｃ−２結合タンパク質の濃度を定量するためのＭａｃ−２結合タンパク質測定キットで定量した。前立腺特異抗原濃度も同時に定量し、比較した。その結果、同一患者群での前立腺特異抗原濃度が非常に低い場合であってもＭａｃ−２結合タンパク質濃度は測定上方限界を超える症例が存在するなど、両者の相関係数は低かった。Ｍａｃ−２結合タンパク質濃度が１０．０μｇ／ｍｌを越える数値を示した症例の転帰は極めて不良で、全例が癌死した。以上の結果から、Ｍａｃ−２結合タンパク質は、確立された前立腺癌の腫瘍マーカーである前立腺特異抗原とは独立したマーカーとして使用できることが示された。
また、健常者、前立腺肥大症患者及び前立腺癌患者の血清中におけるＭａｃ−２結合タンパク質濃度を、Ｍａｃ−２結合タンパク質測定キットで定量した。その結果、Ｍａｃ−２結合タンパク質の濃度は、前立腺癌患者において統計学的に有意に高いことが明らかとなった。従って、本発明の癌検出方法により、これまで識別の困難であった前立腺肥大症と前立腺癌とを識別することが可能になることが明らかとなった。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００２−３１７３４８号の明細書及び／又は図面に記載された内容を包含する。  An object of the present invention is to find a novel prostate cancer tumor marker that can discriminate between prostatic hypertrophy and prostate cancer, and to provide a method that can effectively detect prostate cancer.
  As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the above problems can be solved by using a Mac-2 binding protein as a tumor marker and an antibody that reacts specifically with the tumor marker. It came to complete.
  That is, the present invention includes the following inventions.
(1) It is obtained by fusing a mammalian immune cell immunized with an epithelial tissue fragment or epithelial cell of a prostatic hypertrophy tissue and a myeloma cell of a mammal, and reacts with prostate secretory cells but reacts with stroma. A hybridoma or a cell line derived therefrom that produces a monoclonal antibody that does not.
(2) A monoclonal antibody that reacts with prostatic secretory cells but does not react with stroma, produced by the hybridoma according to (1) or a cell line derived therefrom.
(3) Immunize mammals with epithelial tissue pieces or epithelial cells of benign prostatic hyperplasia tissue, fuse the immune cells of the mammal with mammalian myeloma cells, and react to prostate secretory cells, but in the stroma The method for producing a monoclonal antibody according to (2), wherein a hybridoma producing a monoclonal antibody that does not react or a cell line derived therefrom is selected, the hybridoma is cultured, and the monoclonal antibody is recovered.
(4) A method for detecting prostate cancer by immunologically measuring a Mac-2 binding protein in a sample using the monoclonal antibody according to (2).
(5) A method for detecting prostate cancer by measuring Mac-2 binding protein in a sample.
(6) A method for detecting prostate cancer by immunologically measuring a Mac-2 binding protein in a sample using a monoclonal antibody that specifically reacts with the Mac-2 binding protein or a fragment thereof.
(7) A diagnostic agent for prostate cancer comprising a monoclonal antibody that specifically reacts with Mac-2 binding protein or a fragment thereof.
(8) A prostate cancer diagnostic kit comprising a monoclonal antibody that specifically reacts with a Mac-2 binding protein or a fragment thereof.
(9) A method for producing a monoclonal antibody that specifically reacts with a Mac-2 binding protein or a fragment thereof, wherein the immune cells of mammals immunized with epithelial tissue fragments or epithelial cells of benign prostatic hyperplasia tissue and mammalian myeloma Fusing cells, selecting from the resulting hybridoma a monoclonal antibody that reacts with prostate-secreting cells but does not react with the stroma, and cultivates it to recover the monoclonal antibody This method.
Antibody production
  The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by a known method on the basis of mammalian immune cells immunized with epithelial cells isolated from human prostatic hypertrophy tissue. An immune cell has a normal meaning in the art, and includes, for example, macrophages, T cells, B cells, antigen-presenting cells, plasma cells, etc., and particularly means antibody-producing cells.
  When using epithelial cells derived from human prostatic hypertrophy tissue as an immunogen, epithelial tissue fragments separated from the prostate are usually suspended in a buffer such as physiological saline and administered to animals. Alternatively, the entire prostate may be shredded and suspended in physiological saline, and this suspension may be used as an antigen as it is without separating epithelial tissue fragments.
  Monoclonal antibodies can be obtained from hybridomas produced by the cell fusion method of Keller et al. (G. Koehler et al., Nature, 256, 495-497, 1975). In addition, a cell line derived from the hybridoma obtained by allowing the obtained hybridoma to further grow in a serum-free medium or a low serum medium can also be used as an antibody-producing cell. Preparation of a monoclonal antibody by the cell fusion method can be performed by the following operation.
  First, a mammal (mouse, rat, etc., for example, BALB / c of an inbred mouse) is immunized with the immunogen. The immunization amount of the immunogen can be appropriately determined depending on the type of immunized animal, the site of immunization injection, and the like.
  Immunization may be performed at a site such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal or back. After the first immunization, booster injections of the immunogen are given at sites such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal or back at 1 to 3 week intervals. The number of booster injections is generally 2 to 6 times. In this case as well, the immunogen is preferably boosted by adding an adjuvant and mixing.
  After initial immunization, the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA, etc. When the antibody titer reaches a plateau, the immunogen is dissolved in physiological saline (0.9% sodium chloride aqueous solution). Are injected intravenously or intraperitoneally to obtain the final immunization. Three to five days after the final immunization, cells having the ability to produce antibodies such as spleen cells, lymph node cells or peripheral lymphocytes of immunized animals are obtained.
  The cell having antibody-producing ability obtained from this immunized animal is fused with myeloma cells of mammals (mouse, rat, etc.). As myeloma cells, hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase (HGPRT) or thymidine kinase is used. Cell lines lacking an enzyme such as (TK) are preferred. For example, P3-X63-Ag8 strain (ATCC TIB9), P3-X63-Ag8-U1 strains are HGPRT-deficient cell lines derived from BALB / c mice. (Cancer Research Source Bank (JCRB) 9085), P3 / NS-1 / 1 / Ag4.1 strain (JCRB 0009), P3-X63-Ag8 / 653 strain (JCRB 0028) or SP2 / O-Ag-14 strain (JCRB 0029) or the like can be used.
  Cell fusion can be performed using a fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG) of various molecular weights or liposomes, or can be performed by electrofusion. When the myeloma cells are of HGPRT-deficient strain or TK-deficient strain, a hybridoma of cells capable of producing antibodies and myeloma cells by using a selection medium (HAT medium) containing hypoxanthine / aminopterin / thymidine. Only can be selectively cultured and propagated.
  The hybridoma culture supernatant thus obtained is used as a primary antibody to stain prostate prostatic fluid contained in prostatic hypertrophy tissue and semen by fluorescent immunostaining, etc., and reacts specifically with human prostate secretory cells. Hybridomas that produce antibodies that do not react with quality are selected. Cloning of antibody-producing cells can be performed by combining known cloning methods such as limiting dilution, and can be obtained by isolating a cell line that produces the monoclonal antibody of the present invention. As the benign prostatic hyperplasia tissue for staining, for example, a section of an unfixed tissue frozen with liquid nitrogen or a paraffin-embedded tissue after buffered formalin fixation can be used. Since prostate secretion is contained in semen, it can be stored frozen.
  In the present specification, the prostatic secretory cell constitutes a gland duct serving as the main body of the prostate, and means a glandular epithelial cell containing secretory granules therein, and the stroma fills the gap between the gland duct and the gland duct. By connective tissue including smooth muscle.
  Specifically, using the reactivity to human prostate secretory cells as an indicator, cells producing the desired antibody are screened and cloned into a cell line. The obtained cell line is cultured in an appropriate medium, and the monoclonal antibody of the present invention can be obtained from the culture supernatant. The subclass can be determined using, for example, a mouse monoclonal antibody isotyping kit.
  As the medium, a medium such as DMEM medium, RPMI 1640 medium, or ASF medium 103 can be used. A serum-free medium or a low-concentration serum medium may be used, and in this case, it is preferable in that the antibody can be easily purified.
  Alternatively, a monoclonal antibody-producing cell line is injected into the abdominal cavity of a mammal that is compatible with this and previously stimulated with pristane or the like, and after a certain period of time, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained from ascites collected in the abdominal cavity. it can.
  The monoclonal antibody thus obtained can be purified by a salting-out method using ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., an ion exchange chromatography, a gel filtration method, an affinity chromatography, or a combination of these methods. Can do.
Reactivity evaluation of prepared antibodies
  Formalin-fixed paraffin sections of prostate cancer cases were stained by fluorescent immunostaining with the monoclonal antibody obtained as described above as the primary antibody. As a result, prostate cancer cells showed good staining as well as secretory cells of benign prostatic hyperplasia tissue, and 94% of the prostate cancer tissues tested were positive. Well-differentiated cancer showed the highest positive rate. The reactivity of the existing tumor markers prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate specific antigen (PSA) was also tested using the same prostate cancer tissue sample. As a result, the positive rate when using the prostate specific antigen was 58%, the positive rate when using prostatic acid phosphatase was 71%, and the positive rate when using the monoclonal antibody of the present invention was significantly higher. It was shown to be higher.
  In addition, using the formalin-fixed paraffin sections of various organs obtained by autopsy of 3 men and 2 women who did not suffer from prostate cancer, the above antibody was stained as a primary antibody by fluorescent immunoassay as described above. As a result, it was confirmed that the antibody of the present invention reacts with prostate tissue with high specificity.
  Furthermore, when prostate cancer cells are stained by the fluorescent immunostaining method as described above, a comparison is made between a cancer cell positive patient group in which 2/3 or more of cancer cells contained in the tissue piece are positive and a patient group in which other cancer cells are not. Then, the survival rate was better in the former patient group. Similarly, regarding the non-progression rate of cancer, the former patient group was better. In general, a cancer with a favorable survival rate and non-progression rate of cancer is considered to have a high degree of cell differentiation, that is, a low malignancy. In the above-described reactivity evaluation, the better the staining at the cell level, the better the survival rate and cancer non-progression rate. Therefore, the antigen that reacts with the monoclonal antibody is considered to be a differentiation antigen. .
Identification of antigen recognized by antibody
  In order to detect an antigen recognized by the prepared antibody, electrophoresis was performed using human mixed seminal plasma as a sample as a first step. Next, the protein was transferred from the gel to a nitrocellulose membrane. This membrane was immunostained using the antibody prepared this time as the primary antibody. Western blot analysis revealed that the monoclonal antibody of the present invention recognizes a protein having a molecular weight of about 70 kDa as an antigen under reducing conditions.
  Next, the corresponding antigen was purified with an immunoaffinity column using the prepared antibody. The purified antibody was bound to an affinity purification gel and assembled into a column. The antigen in the seminal plasma and the antibody in the column were reacted through this column through the mixed seminal fluid, washed thoroughly to remove non-specific binding substances, and then the antigen was dissociated from the antibody and recovered. The recovered purified antigen was electrophoresed, the protein was visualized by staining, and the band at the site was excised from the gel. Proteins were extracted from the gel pieces and then fragmented by enzyme treatment, and each was analyzed for amino acid sequence by Edman method. As a result, it was confirmed that the entire 51-residue sequence including the N-terminus was completely identical to the Mac-2 binding protein. From the above, it was revealed that the antigen against the monoclonal antibody of the present invention is a Mac-2 binding protein.
  The Mac-2 binding protein is a glycoprotein consisting of 567 amino acids discovered from the culture supernatant of a breast cancer cell line, and is considered a ligand for Mac-2 protein.
  This protein has been reported to have a molecular weight of approximately 90 kDa and to be fragmented to 25 kDa and 65 kDa. From this, it is considered that the antigenic determinant of the Mac-2 binding protein for the antibody of the present invention obtained as described above is present on the latter 65 kDa fragment, which was judged to be about 70 kDa by our electrophoresis. .
  Therefore, in another aspect of the present invention, prostate cancer can be detected using an antibody that specifically reacts with a Mac-2 binding protein or a fragment thereof. That is, prostate cancer can be detected using a monoclonal antibody obtained by a method similar to the above based on immune cells of a mammal immunized with a Mac-2 binding protein or fragment thereof as an immunogen. Here, the Mac-2 binding protein fragment refers to a Mac-2 binding protein that can bind to the antibody of the present invention obtained as described above from a mammal immunized with epithelial cells of prostatic hypertrophy tissue. It means a fragment, preferably the above 65 kDa fragment. When a Mac-2 binding protein is used as an immunogen, the protein can be obtained as follows.
Creation of Mac-2 binding protein as an immunogen
  The amino acid sequence of a Mac-2 binding protein that can be used as an immunogen in the present invention and the cDNA sequence encoding the protein are disclosed, for example, in GenBank as accession number L13210. Therefore, Mac-2 binding protein for use as an immunogen can be synthesized by publicly known methods such as solid phase peptide synthesis using the publicly available amino acid sequence information.
  It is also possible to produce a Mac-2 binding protein using information on cDNA encoding the Mac-2 binding protein using a known gene recombination technique. Hereinafter, production of Mac-2 binding protein using a recombinant technique will be described.
  The recombinant vector for producing Mac-2 binding protein can be obtained by ligating the above-described cDNA sequence to an appropriate vector, and the transformant is obtained by converting the recombinant vector for producing Mac-2 binding protein into Mac. -2 binding protein can be obtained by introducing it into a host so that it can be expressed.
  As the vector, a phage or a plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism is used. As plasmid DNA, plasmids derived from E. coli (eg, pET21a, pGEX4T, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, YCp50, etc.) ) And the like, and examples of the phage DNA include λ phage (λgt11, λZAP, etc.). Furthermore, animal viruses such as vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
  In order to insert a Mac-2 binding protein cDNA into a vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector DNA, and ligated to the vector. Etc. are adopted.
  Other recombinant vectors for producing Mac-2 binding protein used in mammalian cells include promoters, Mac-2 binding protein cDNA, cis elements such as enhancers, splicing signals, poly A addition signals, selectable markers, as desired. In addition, a ribosome binding sequence (SD sequence) or the like may be linked.
  A known DNA ligase is used to link the DNA fragment and the vector fragment. Then, the DNA fragment and the vector fragment are annealed and then ligated to prepare a recombinant vector for producing Mac-2 binding protein.
  The host used for transformation is not particularly limited as long as it can express Mac-2 binding protein. Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CHO cells, etc.) and insect cells.
  As an example, when a bacterium is used as a host, a recombinant vector for producing a Mac-2 binding protein is capable of autonomous replication in the bacterium, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, a Mac-2 binding protein DNA, a transcription termination sequence. It is preferable that it is comprised. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Examples of E. coli include Escherichia coli BRL. Examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. Examples thereof include a method using calcium ions and an electroporation method.
  Similarly, when yeast, animal cells, insect cells, and the like are used as hosts, Mac-2 binding proteins can be produced according to techniques known in the art.
  The Mac-2 binding protein used as an immunogen in the present invention can be obtained by culturing the transformant prepared above and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells. The method of culturing the transformant in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  As a medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host, the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  The culture is usually performed at 37 ° C. for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture. During the culture period, the pH is kept near neutral. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
  After the cultivation, when the Mac-2 binding protein is produced in the microbial cells or cells, the protein is extracted by disrupting the microbial cells or cells. When the Mac-2 binding protein is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination, Mac-2 binding protein can be isolated and purified from
  Whether or not Mac-2 binding protein is obtained can be confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like.
Cancer detection method
  According to the method for detecting cancer of the present invention, a monoclonal antibody obtained using epithelial cells of benign prostatic hyperplasia tissue as an immunogen or a monoclonal antibody obtained using a Mac-2 binding protein or a fragment thereof as an immunogen according to the above method, It is characterized by immunologically detecting or measuring a Mac-2 binding protein derived from prostate cancer cells in a sample.
  The detection method of the present invention can be any of the measurement methods using an antibody, that is, an immunological measurement method, and the monoclonal antibody of the present invention can be used as an antibody used in the measurement method. , Enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, immunoturbidimetric method, immunotrophic method, latex agglutination, latex turbidimetric method, erythrocyte agglutination The detection method of the present invention is carried out by reaction, particle agglutination reaction, Western blotting or the like.
  The sample to be examined in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a biological sample that may contain Mac-2 binding protein derived from prostate cancer cells. Examples thereof include blood, serum, plasma, lymphocyte culture supernatant, urine, spinal fluid, saliva, sweat, ascites, etc., and cell or organ extracts can also be used. In particular, in samples such as blood, serum, and plasma, the measured value of Mac-2 binding protein obtained using the monoclonal antibody of the present invention is useful as an indicator of prostate cancer.
  When the detection method of the present invention is performed by an immunoassay using a label such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay, the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a solid phase. It is preferable that the components in the sample are immobilized or the components in the sample are immobilized and an immunological reaction is performed with them.
  As solid phase carriers, beads made of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic materials Insoluble carriers in the form of microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used. The solid phase can be formed by binding the solid phase carrier and the monoclonal antibody or sample component of the present invention according to a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof.
  In the present invention, in order to easily detect the reaction between the monoclonal antibody of the present invention and a Mac-2 binding protein derived from prostate cancer cells in a sample, the reaction is carried out by labeling the monoclonal antibody of the present invention. Either directly detected or indirectly detected by using a labeled secondary antibody. In the detection method of the present invention, it is preferable to use the latter indirect detection (for example, a sandwich method) in terms of sensitivity.
  As the labeling substance, in the case of enzyme immunoassay, peroxidase (POD), alkaline phosphatase, β-galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase, amylase or biotin-avidin complex, etc. In the case of a measurement method, fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate, dichlorotriazine isothiocyanate, Alexa480 or AlexaFluor 488, etc., and in the case of a radioimmunoassay, tritium, iodine¹²⁵Or iodine¹³¹Etc. can be used. In addition, the luminescence immunoassay method is NADH-FMNH.₂-Luciferase system, luminol-hydrogen peroxide-POD system, acridinium ester system, dioxetane compound system, etc. can be used.
  The binding method between the labeling substance and the antibody is a known method such as glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method or periodate method in the case of enzyme immunoassay, and chloramine T in the case of radioimmunoassay. A known method such as the Bolton Hunter method can be used.
  The method of measurement is a known method (Japanese Society of Clinical Pathology “Special Issue on Clinical Pathology No. 53 Special Issue No. 53 Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications” ”, Clinical Pathology Publications, 1983, edited by Shinji Ishikawa et al. "Enzyme immunoassay", 3rd edition, School of Medicine, 1987, edited by Tsuneaki Kitagawa et al., "Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No.31 Enzyme Immunoassay", Kyoritsu Publishing, 1987, Kei Irie "Radioimmunoassay", Kodansha Scientific, 1974, edited by Kei Irie, “Continuing Radioimmunoassay”, Kodansha Scientific, 1979).
  For example, when the monoclonal antibody of the present invention is directly labeled, the component in the sample is solid-phased and brought into contact with the labeled monoclonal antibody of the present invention, and then a Mac-2 binding protein-monoclonal antibody complex of the present invention is obtained. To form. The unbound labeled monoclonal antibody can be washed and separated, and the amount of Mac-2 binding protein in the sample can be measured from the amount of bound labeled monoclonal antibody or the amount of unbound labeled monoclonal antibody.
  For example, when a labeled secondary antibody is used, the monoclonal antibody of the present invention and the sample are reacted (primary reaction), and further, the labeled secondary antibody is reacted (secondary reaction). The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times. By a primary reaction and a secondary reaction, an immobilized Mac-2 binding protein-a monoclonal antibody-labeled secondary antibody complex of the present invention, or an immobilized monoclonal antibody of the present invention-Mac-2 binding protein-label A secondary antibody complex is formed. Then, the unbound labeled secondary antibody can be washed and separated, and the amount of Mac-2 binding protein in the sample can be measured from the amount of bound labeled secondary antibody or the amount of unbound labeled secondary antibody.
  Specifically, in the case of enzyme immunoassay, the labeled enzyme is reacted with the substrate under the optimum conditions, and the amount of the reaction product is measured by an optical method or the like. In the case of fluorescence immunoassay, the fluorescence intensity by the fluorescent substance label is measured, and in the case of radioimmunoassay, the amount of radioactivity by the radioactive substance label is measured. In the case of the luminescence immunoassay, the amount of luminescence by the luminescence reaction system is measured.
  The detection method of the present invention comprises the production of immune complex aggregates such as immunoturbidimetry, latex agglutination, latex turbidimetry, erythrocyte agglutination, particle agglutination, etc. When measured or visually measured, a phosphate buffer solution, glycine buffer solution, Tris buffer solution or Good buffer solution can be used as a solvent, and a reaction accelerator such as polyethylene glycol, A non-specific reaction inhibitor may be included.
  Below, an example of the preferable embodiment of the detection method of this invention is shown. First, the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on an insoluble carrier as a primary monoclonal antibody. Preferably, the solid surface on which no antigen is adsorbed is blocked with a protein unrelated to the antigen (calf serum, bovine serum albumin, gelatin, etc.). Subsequently, the immobilized primary monoclonal antibody is brought into contact with the test sample. Next, a labeled secondary antibody that reacts with the Mac-2 binding protein is brought into contact at a site different from the primary monoclonal antibody, and a signal from the label is detected.
  The “secondary antibody that reacts with the Mac-2 binding protein at a site different from the primary monoclonal antibody” used herein is an antibody that recognizes a site other than the binding site between the primary monoclonal antibody and the Mac-2 binding protein. There is no limitation, and any of the immunogens may be a polyclonal antibody, an antiserum, or a monoclonal antibody, and fragments of these antibodies (Fab, F (ab ′))₂, Fab ′, etc.) can also be used. Furthermore, multiple types of monoclonal antibodies may be used as secondary antibodies.
  Conversely, the monoclonal antibody of the present invention is labeled to give a secondary antibody, and an antibody that reacts with a Mac-2 binding protein at a site different from the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on an insoluble carrier as a primary antibody. Then, the immobilized primary antibody may be brought into contact with the test sample, and then the monoclonal antibody of the present invention labeled as a secondary antibody may be contacted to detect the signal from the label.
  The Mac-2 binding protein of the present invention exists in a dimer or higher in a sample and becomes a monomer only under strong reducing conditions. Therefore, the primary antibody and the secondary antibody can also be detected using the same monoclonal antibody.
Cancer diagnostics
  Further, as described above, the monoclonal antibody of the present invention specifically reacts with Mac-2 binding protein derived from prostate cancer cells, and therefore can be used as a diagnostic agent for cancer.
  The diagnostic agent of the present invention contains the monoclonal antibody of the present invention. Therefore, the diagnostic agent of the present invention is used to detect prostate cancer cells contained in a sample collected from an individual suspected of having prostate cancer. By detecting the derived Mac-2 binding protein, the individual can be diagnosed with prostate cancer morbidity.
  In addition, the diagnostic agent of the present invention can be used in any means as long as it is a means for performing immunological measurement, but is combined with a simple means known in the art such as a test strip for immunochromatography. It is possible to diagnose cancer more easily and quickly. The test strip for immunochromatography has been developed, for example, a sample receiving portion made of a material that easily absorbs a sample, a reagent portion containing the diagnostic agent of the present invention, a developing portion where a reaction product of the sample and the diagnostic agent moves, It is composed of a labeling part for coloring the reaction product, a presentation part for developing the colored reaction product, and the like, and can be in the same form as the pregnancy diagnostic agent. First, when a sample is given to the sample receiving portion, the sample receiving portion absorbs the sample and causes the sample to reach the reagent portion. Subsequently, in the reagent part, a reaction between the prostate cancer cell-derived Mac-2 binding protein in the sample and the monoclonal antibody of the present invention occurs, and the reacted complex moves through the development part and reaches the labeling part. In the labeling part, the reaction between the reaction complex and the labeled secondary antibody occurs, and when the reaction product with the labeled secondary antibody develops to the presentation part, coloration is recognized.
  The above immunochromatographic test strip does not pose any pain or danger to the user due to the use of reagents, so it can be used for monitoring at home, and the results are examined and treated at the level of each medical institution ( Surgical resection, etc.), which can be linked to prevention of metastasis and recurrence. At present, this test strip can be mass-produced at low cost by a manufacturing method as described in JP-A-10-54830, for example.
  Further, by using the diagnostic agent of the present invention in combination with a diagnostic agent for a known tumor marker for prostate cancer containing a prostate-specific antigen, a more reliable diagnosis is possible.
Diagnosis
  The Mac-2 binding protein concentration in the serum of prostate cancer patients was quantified with a Mac-2 binding protein measurement kit for quantifying the concentration of Mac-2 binding protein. The prostate specific antigen concentration was also quantified and compared at the same time. As a result, even when the prostate specific antigen concentration in the same patient group was very low, there were cases where the Mac-2 binding protein concentration exceeded the upper measurement limit, and the correlation coefficient between them was low. The outcomes of cases where the Mac-2 binding protein concentration exceeded 10.0 μg / ml were very poor, and all cases died of cancer. From the above results, it was shown that Mac-2 binding protein can be used as a marker independent of prostate-specific antigen which is an established prostate cancer tumor marker.
  In addition, the Mac-2 binding protein concentration in the sera of healthy subjects, prostatic hypertrophy patients and prostate cancer patients was quantified with a Mac-2 binding protein measurement kit. As a result, it was revealed that the concentration of Mac-2 binding protein was statistically significantly higher in prostate cancer patients. Therefore, it has been clarified that the method for detecting cancer according to the present invention makes it possible to distinguish between benign prostatic hyperplasia and prostate cancer, which has been difficult to identify.
  This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2002-317348, which is the basis of the priority of the present application.

図１は、実施例４において、前立腺癌患者の血清中におけるＭａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ２ＢＰ）濃度及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）濃度を定量し、ｘ軸にＰＳＡ濃度の対数、ｙ軸にＭａｃ−２結合タンパク質濃度をとって比較したものである。 FIG. 1 shows the quantification of Mac-2 binding protein (Mac2BP) concentration and prostate specific antigen (PSA) concentration in the serum of prostate cancer patients in Example 4, with the logarithm of PSA concentration on the x-axis and Mac− on the y-axis. It is a comparison of two binding protein concentrations.

以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されるものではない。
（実施例１モノクローナル抗体の作成）
免疫原の準備
免疫原としてのヒト前立腺肥大症組織は滋賀医科大学、京都大学医学部附属病院及び両者の関連病院の泌尿器科から手術又は剖検によって得られたものを使用した。一部は無固定でただちに液体窒素で凍結処理し、−８０℃で保存した。残りは１０％緩衝ホルマリン固定後、最終的にパラフィン包埋された。
上記のヒト前立腺肥大症組織からＯｉｓｈｉＫ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ２，２８１−２８９，１９８１の方法に準じて上皮細胞を分離し、これを免疫原として用いた。すなわち、タンパク質分解酵素は使用せずに、鋏で組織を細切し、それを用手的に圧迫することによって組織片から細胞を押し出すように解離させ、組織片から出た細胞を培養液で洗浄回収した。
免疫・細胞融合
免疫動物には７週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスを使用した。上記のようにして得られた前立腺肥大症の上皮細胞を１０^７個、２週間ごとに３回腹腔内注射して免疫した。最終免疫から３日のちにマウスから脾臓を摘出し、この脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ００２８）を５０％ポリエチレングリコール１，５００（ＢＤＨＬｉｍｉｔｅｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて常法に従って細胞融合させた。得られた融合細胞を９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に０．１ｍｌずつ播き、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水社）に１５％ウシ胎児血清（Ｆｉｌｔｒｏｎ社）を添加したＨＡＴ選択培地で培養を続けた。約２週間で必要量のモノクローナル抗体が培地中に分泌される。
スクリーニング法
ヒト前立腺肥大症組織を未固定のままでＯ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉｌｅｓ社）に包埋し、液体窒素で凍結した。低温ミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ社）を用いて６〜８μ厚の凍結切片を作成し、Ｎｅｏｐｒｅｎｅを塗布したスライドガラスに添付した。９６ウェルマイクロプレート中の培養液０．１ｍｌを取り出して凍結切片に加え、約３０分後に生理食塩水で洗浄し、ＦＩＴＣでラベルしたウサギＩｇＧ抗マウスＩｇ（二次抗体；ＤＡＫＯ社）で３０分間処理した。次いで、洗浄した後、蛍光顕微鏡（ニコン社）を用いて培養液中の抗体が反応する組織部位を観察した。前立腺において前立腺分泌細胞と反応するが間質とは反応しない抗体が産生されているウェルを選択した。
選択したウェル中のハイブリドーマを限界希釈法でクローニングし、抗体サブクラスはＭｏｕｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｉｓｏｔｙｐｉｎｇｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で決定した。
その結果、クローン８−９Ｅが選択された。このクローンは、２００２年１０月２９日付け（原寄託）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−０８５０７として寄託されている（２００３年１０月１５日付で原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託への移管請求受領）。
抗体の調製及び精製
クローニングした抗体産生細胞を、あらかじめプリスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ社）処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した。これにより腹水内に大量のモノクローナル抗体が存在するようになる。得られた腹水を２０〜５０％飽和硫安で粗精製した。続いて、プロタミンセファロース（Ｓｉｇｍａ社）を利用して精製した。こうして得た抗体は９５％以上、通常９９％に精製されていた。
（実施例２８−９Ｅ抗体の前立腺癌組織との反応性の検討）
組織学的検討のために、５２例の前立腺癌患者の標本を使用した。それらは１９８２年から１９９１年の期間に滋賀医科大学付属病院で診断された患者に由来する。平均年齢は７０．３歳（５３〜８７歳）であった。３例が臨床病期Ａ、２例がＢ、１４例がＣ、３３例がＤ２であった。平均観察期間は３９．４ヶ月（２〜１１８ヶ月）であった。臨床病期Ｄ２群は、基本的に内分泌療法（両側精巣摘除、エストロゲン療法など）で加療されていた。これらの患者の前立腺癌組織を無固定でただちに液体窒素で凍結処理後−８０℃で保存した。前立腺分泌液は精液に含まれているので、これを健常ボランティアから採取し、−８０℃で凍結保存した。
モノクローナル抗体の前立腺分泌細胞に対する反応性は、融合細胞の培養上清を一次抗体として蛍光免疫染色法で検討した。上記の前立腺癌組織の凍結切片を検索に用いた。免疫染色法としてアビジン−ビオチン−コンプレックス（ＡＢＣ）法を用いた。まず、ブロックエース（大日本製薬株式会社）で切片に対する抗体の非特異的吸着を抑えた。一次抗体は上記のように作成した本発明の抗体を、二次抗体はウマ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を、ＡＢＣ法にはベクタステインＡＢＣキット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いた。最後に、０．００５％Ｈ_２Ｏ_２、０．２ｍｇ／ｍｌＤＡＢ（３，３’ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）溶液を反応させて発色させ、ヘマトキシリンで核染色した。
５２症例の前立腺癌組織のうち４９例が様々な程度の陽性所見を示した。その程度は、２／３以上の癌細胞が陽性か否かの２群に分類すると、組織学的分化度と統計学的に有意に相関した（ｐ＝０．０００１）。高分化癌が最も高い陽性率を示していた。ホルモン療法を施行された３３例の臨床病期Ｄ２群について、５年生存率と癌非進展率を検討した。経過観察期間中に１７例が前立腺癌死し、４例が循環器疾患又は他疾患で死亡した。脱落症例は２例であった。２／３以上の癌細胞が陽性を示す患者群はそうでない患者群に対して有意に生存率良好であった（ｐ＜０．０５）。同様に癌の非進展率も前者が良好であった（ｐ＝０．０２６０）。また、この抗体は前立腺分泌液にも良好に反応した。
（実施例３８−９Ｅ抗体の臓器特異性の検討）
前立腺癌に罹患していなかった男性３症例と女性２症例の剖検で得られた大脳２例、脊髄２例、肺５例、甲状腺５例、胃３例、小腸３例、結腸２例、脾臓４例、肝臓５例、膵臓５例、腎臓５例、精巣２例、子宮１例、上皮小体２例、骨髄４例、食道３例の各種臓器のホルマリン固定パラフィン切片を用いて、上記と同様の方法によって反応性を調べた。
その結果、脳、肺、甲状腺、胃、小腸、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱を含む各種臓器の９９％以上の上皮細胞が陰性と判断された。
（実施例４８−９Ｅ抗体によって認識される抗原の解析）
前立腺分泌細胞に反応し、間質には反応しない抗体がヒトから得られた材料において実際にどのような抗原に反応するのか調べるため、ウェスタンブロットを実施した。まず、前立腺肥大症患者の精漿を２％ＳＤＳ、１０％メルカプトエタノール含有バッファー（第一化学薬品）と混和し、１００℃で２分間還元後、４〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳＰＡＧＥｍｉｎｉ：テフコ株式会社）にアプライし、電気泳動した。ついでこのゲルからタンパク質を電気的にニトロセルロース膜に転写した。この膜にブロックエースを作用させたのち、今回作成したモノクローナル抗体を一次抗体としてＡＢＣ法で染色した。ウェスタンブロットの結果、還元条件下で８−９Ｅ抗体は分子量約７０ｋＤａのタンパク質を抗原として認識することが明らかになった。
次に、例えば、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ１９９５，２，２６１−２６６に記載されるように、作成された抗体を利用した免疫アフィニティーカラムで対応抗原の精製を行った。すなわち、精製した抗体をＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０（バイオラッド社）１０ｍｌに結合させた（ゲル１ｍｌあたり２ｍｇ）。この抗体結合ゲルと混合精漿とを、４℃で２時間にわたり、撹拌しながらインキュベートした。そして、０．１％のＣＨＡＰＳを含むリン酸緩衝化食塩水でゲルを十分に洗浄した後、０．１％のＣＨＡＰＳを含む５０ｍＭクエン酸で対応抗原を溶出した。還元条件下（０．２Ｍジチオスレイトール）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、精製抗原を評価した。タンパク質のバンドはクーマシーブリリアンドブルー（和光純薬工業株式会社）を用いて可視化した。バンドをゲルから切り出し、ゲル片からタンパク質を抽出後、酵素処理にて断片化し、それぞれをエドマン法によってアミノ酸配列分析した。
このタンパク質のＮ末端部分１５残基のアミノ酸配列は、既に一次構造が報告されていたＭａｃ−２結合タンパク質のそれと完全に一致した。精製抗原を酵素処理にて断片化し、３個のポリペプチドについて可及的多くの部分アミノ酸配列を解読した。その結果、Ｎ末端を含めて計５１残基の配列が全て完全にＭａｃ−２結合タンパク質と同一であることを確認した。以上から、本発明のモノクローナル抗体に対する抗原はＭａｃ−２結合タンパク質であることが明らかとなった。
（実施例５前立腺癌患者血清における８−９Ｅ抗原の測定）
実施例４の結果より８−９Ｅ抗体が特異的に認識する抗原がＭａｃ−２結合タンパク質であることが明らかになったので、Ｍａｃ−２結合タンパク質測定用キットを用いて、前立腺癌患者血清中のＭａｃ−２結合タンパク質濃度を測定した。
前立腺癌患者３８例の血清中におけるＭａｃ−２結合タンパク質濃度をＥＩＡキット（ｈｕｍａｎ９０Ｋ／Ｍａｃ−２ＢＰＥＬＩＺＡ；ＢｅｎｄｅｒＭｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって定量した。また、同一血清における前立腺特異抗原濃度も測定し、両者の測定値を比較した。
まず、固定化抗Ｍａｃ−２結合タンパク質抗体と試料を反応させる。次にＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）等によって標識した抗Ｍａｃ−２結合タンパク質抗体を反応させる。標識に対する基質を加えて発色させた後、酸にて酵素反応を停止させる。４５０ｎｍで吸光度測定し、標準曲線と比較することよって抗原濃度を算出する。結果を図１に示す。
Ｍａｃ−２結合タンパク質濃度の測定値は、最低０．９９μｇ／ｍｌから測定限界の１０．０μｇ／ｍｌまで幅広く分散した。同一検体群での前立腺特異抗原濃度が１ｎｇ／ｍｌ以下でもＭａｃ−２結合タンパク質濃度は測定上方限界値を越える症例が存在するなど、両者の相関係数は低かった（ｒ＝０．２４５、ｐ＝０．１３８）。１０．０μｇ／ｍｌを越える数値を示した３症例の転帰は極めて不良で、全例癌死した。以上からＭａｃ−２結合タンパク質は、確立された前立腺癌の腫瘍マーカーである前立腺特異抗原からは独立したマーカーであることが示された。
前立腺肥大症患者の血清に対する反応性との比較
健常者、前立腺肥大症患者及び前立腺癌患者の血清中におけるＭａｃ−２結合タンパク質濃度を、上記のＥＩＡキットで定量した。結果を以下に示す。

ｔ検定結果
１ｖｓ３ｐ＝０．０３７３
２ｖｓ３ｐ＝０．０３２９
１＋２ｖｓ３ｐ＝０．００３９
以上から、Ｍａｃ−２結合タンパク質の濃度は、前立腺癌患者において統計学的に有意に高いことが明らかとなり、本発明の方法によって、前立腺肥大症と前立腺癌患者を識別可能に診断できることが示された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
(Example 1 Preparation of monoclonal antibody)
Preparation of immunogen Human prostatic hypertrophy tissue as an immunogen was obtained by surgery or autopsy from the urological departments of Shiga Medical University, Kyoto University Hospital and related hospitals. A portion was not fixed and immediately frozen with liquid nitrogen and stored at −80 ° C. The rest was finally embedded in paraffin after 10% buffered formalin fixation.
From the human prostatic hypertrophy tissue described above, Oishi K. et al. et al. , Prostate 2, 281-289, 1981, epithelial cells were isolated and used as an immunogen. That is, without using a proteolytic enzyme, the tissue is minced with a scissors and dissociated so as to extrude the cells from the tissue piece by manually pressing it, and the cells released from the tissue piece are removed with the culture solution. It was washed and collected.
Seven weeks old BALB / c female mice were used as immunized / cell fusion immunized animals. Immunization was performed by intraperitoneally injecting 10 ⁷ prostatic hypertrophy epithelial cells obtained as described above three times every two weeks. Three days after the final immunization, the spleen was removed from the mouse, and this spleen cell and mouse myeloma cell P3-X63-Ag8.653 strain (JCRB 0028) were used with 50% polyethylene glycol 1,500 (BDH Limited, England). Cell fusion was performed according to a conventional method. The obtained fused cells were seeded in 0.1 ml each in a 96-well microplate (Corning), and the culture was continued in a HAT selection medium in which 15% fetal calf serum (Fitron) was added to RPMI 1640 medium (Nissui). In about 2 weeks, the required amount of monoclonal antibody is secreted into the medium.
Screening method: O. C. T.A. Embedded in Compound (Miles) and frozen in liquid nitrogen. Using a low-temperature microtome (Reichert), a frozen section having a thickness of 6 to 8 μm was prepared and attached to a glass slide coated with Neoprene. 0.1 ml of the culture solution in a 96-well microplate was taken out and added to the frozen section. After about 30 minutes, it was washed with physiological saline, and it was washed with FITC-labeled rabbit IgG anti-mouse Ig (secondary antibody; DAKO) for 30 minutes. Processed. Next, after washing, a tissue site where the antibody in the culture solution reacts was observed using a fluorescence microscope (Nikon). Wells were selected that produced antibodies in the prostate that react with prostate secretory cells but not the stroma.
The hybridomas in the selected wells were cloned by limiting dilution, and the antibody subclass was determined by the Mouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham).
As a result, clone 8-9E was selected. This clone is dated October 29, 2002 (original deposit) and is registered with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1st, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan). -Deposited as 08507 (received a request for transfer from the original deposit to the deposit under the Budapest Treaty on October 15, 2003).
Preparation and purification of antibody The cloned antibody-producing cells were injected intraperitoneally into BALB / c mice previously treated with pristane (Aldrich). As a result, a large amount of monoclonal antibody is present in the ascites. The obtained ascites was roughly purified with 20-50% saturated ammonium sulfate. Subsequently, purification was performed using protamine sepharose (Sigma). The antibody thus obtained was purified to 95% or more, usually 99%.
(Examination of reactivity of Example 2 8-9E antibody with prostate cancer tissue)
Samples from 52 prostate cancer patients were used for histological examination. They are derived from patients diagnosed at Shiga Medical University Hospital during the period from 1982 to 1991. The average age was 70.3 years (53-87 years). 3 cases were clinical stage A, 2 cases were B, 14 cases were C, and 33 cases were D2. The average observation period was 39.4 months (2 to 118 months). The clinical stage D2 group was basically treated with endocrine therapy (bilateral orchiectomy, estrogen therapy, etc.). The prostate cancer tissues of these patients were immediately fixed and stored at −80 ° C. after freezing with liquid nitrogen. Since prostate secretion was contained in semen, it was collected from healthy volunteers and stored frozen at -80 ° C.
The reactivity of the monoclonal antibody to prostate secretory cells was examined by fluorescent immunostaining using the culture supernatant of the fused cells as the primary antibody. The above frozen section of prostate cancer tissue was used for the search. The avidin-biotin-complex (ABC) method was used as an immunostaining method. First, non-specific adsorption of the antibody to the section was suppressed with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). The primary antibody is the antibody of the present invention prepared as described above, the secondary antibody is a horse anti-mouse immunoglobulin G antibody (Vector Laboratories, Inc), and the ABC method is a vector stain ABC kit (Vector Laboratories, Inc). It was. Finally, 0.005% H ₂ O ₂ , 0.2 mg / ml DAB (3,3 ′ diaminobenzidine tetrahydrochloride) solution was reacted to develop color, and nuclear staining with hematoxylin.
Of the 52 cases of prostate cancer tissue, 49 cases showed varying degrees of positive findings. The degree was statistically significantly correlated with the degree of histological differentiation (p = 0.0001) when classified into two groups of positive or negative 2/3 or more cancer cells. Well differentiated cancer showed the highest positive rate. The 33-year clinical stage D2 group treated with hormone therapy was examined for 5-year survival rate and cancer non-progression rate. During the follow-up period, 17 died of prostate cancer and 4 died of cardiovascular or other diseases. There were 2 dropout cases. The group of patients positive for 2/3 or more cancer cells was significantly better in survival than the other group (p <0.05). Similarly, the non-progression rate of cancer was good in the former (p = 0.0260). This antibody also reacted well with prostate secretion.
(Examination of organ specificity of Example 3 8-9E antibody)
2 cases of cerebrum, 2 cases of spinal cord, 5 cases of lung, 5 cases of thyroid gland, 3 cases of stomach, 3 cases of small intestine, 2 cases of colon, 2 cases of spleen Using formalin-fixed paraffin sections of various organs of 4 cases, liver 5 cases, pancreas 5 cases, kidney 5 cases, testis 2 cases, uterus 1 case, parathyroid body 4 cases, bone marrow 4 cases and esophagus 3 cases, The reactivity was examined by the same method.
As a result, 99% or more of epithelial cells of various organs including brain, lung, thyroid, stomach, small intestine, liver, spleen, pancreas, kidney and bladder were judged to be negative.
(Example 4 Analysis of antigen recognized by 8-9E antibody)
Western blots were performed to examine what antigens in the material obtained from humans actually react with antibodies that react with prostate secreting cells but not stroma. First, seminal plasma from a patient with benign prostatic hyperplasia is mixed with 2% SDS, 10% mercaptoethanol-containing buffer (Daiichi Kagaku), and reduced at 100 ° C. for 2 minutes, followed by 4-20% SDS polyacrylamide gel (SDS PAGE mini). : Tefco Co., Ltd.) and electrophoresis was performed. The protein was then transferred electrically from this gel to a nitrocellulose membrane. After block ace was allowed to act on the membrane, the monoclonal antibody prepared this time was stained as a primary antibody by the ABC method. Western blotting revealed that the 8-9E antibody recognizes a protein with a molecular weight of about 70 kDa as an antigen under reducing conditions.
Next, for example, Int. J. et al. As described in Urol 1995, 2, 261-266, the corresponding antigen was purified with an immunoaffinity column using the prepared antibody. That is, the purified antibody was bound to 10 ml of Affi-Gel 10 (Bio-Rad) (2 mg per ml of gel). The antibody-bound gel and mixed seminal plasma were incubated at 4 ° C. for 2 hours with agitation. The gel was thoroughly washed with phosphate buffered saline containing 0.1% CHAPS, and the corresponding antigen was eluted with 50 mM citric acid containing 0.1% CHAPS. SDS-PAGE was performed under reducing conditions (0.2 M dithiothreitol) to evaluate the purified antigen. Protein bands were visualized using Coomassie Brilliand Blue (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The band was cut out from the gel, the protein was extracted from the gel piece, fragmented by enzyme treatment, and each was analyzed for amino acid sequence by Edman method.
The amino acid sequence of the 15-residue N-terminal portion of this protein completely matched that of the Mac-2 binding protein whose primary structure had already been reported. The purified antigen was fragmented by enzymatic treatment, and as many partial amino acid sequences as possible were decoded for the three polypeptides. As a result, it was confirmed that the entire 51-residue sequence including the N-terminus was completely identical to the Mac-2 binding protein. From the above, it was revealed that the antigen against the monoclonal antibody of the present invention is a Mac-2 binding protein.
(Example 5 Measurement of 8-9E antigen in prostate cancer patient serum)
From the results of Example 4, it was revealed that the antigen specifically recognized by the 8-9E antibody was a Mac-2 binding protein. Therefore, using a Mac-2 binding protein measurement kit, The Mac-2 binding protein concentration was measured.
The Mac-2 binding protein concentration in the serum of 38 prostate cancer patients was quantified by EIA kit (human 90K / Mac-2BP ELIZA; Bender Medsystems, Austria). In addition, the prostate-specific antigen concentration in the same serum was also measured, and the measured values were compared.
First, the sample is reacted with the immobilized anti-Mac-2-binding protein antibody. Next, an anti-Mac-2 binding protein antibody labeled with HRP (horseradish peroxidase) or the like is reacted. After adding a substrate for the label to develop color, the enzyme reaction is stopped with acid. Absorbance is measured at 450 nm and the antigen concentration is calculated by comparison with a standard curve. The results are shown in FIG.
The measured Mac-2 binding protein concentration was widely dispersed from a minimum of 0.99 μg / ml to a measurement limit of 10.0 μg / ml. Even when the prostate-specific antigen concentration in the same sample group was 1 ng / ml or less, there were cases where the Mac-2 binding protein concentration exceeded the upper limit of measurement, and the correlation coefficient between them was low (r = 0.245, p = 0.138). The outcomes of the 3 cases showing numerical values exceeding 10.0 μg / ml were very poor and all cases died of cancer. From the above, it was shown that Mac-2 binding protein is a marker independent of prostate-specific antigen, which is an established tumor marker for prostate cancer.
Comparison with responsiveness to serum of patients with benign prostatic hyperplasia The concentration of Mac-2 binding protein in the sera of healthy subjects, patients with benign prostatic hypertrophy and prostate cancer patients was quantified with the above EIA kit. The results are shown below.

t test result 1 vs 3 p = 0.0373
2 vs 3 p = 0.0329
1 + 2 vs 3 p = 0.039
From the above, it has been clarified that the concentration of Mac-2 binding protein is statistically significantly higher in prostate cancer patients, and it has been shown that prostatic hypertrophy and prostate cancer patients can be diagnosed by the method of the present invention. It was.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Industrial applicability

本発明により、簡易かつ安価な方法で、前立腺癌を効果的に検出することができるため、前立腺癌の早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、前立腺肥大症と前立腺癌を識別できるため、治療方針の決定、治療効果の経過観察、予後の予測に有用である。 According to the present invention, since prostate cancer can be effectively detected by a simple and inexpensive method, early detection, diagnosis and treatment of prostate cancer are possible. Moreover, since the prostatic hypertrophy and prostate cancer can be discriminated by the method of the present invention, it is useful for determination of a treatment policy, follow-up of therapeutic effects, and prediction of prognosis.

Claims

Monoclonal antibodies obtained by fusing mammalian immune cells and mammalian myeloma cells immunized with epithelial tissue fragments or epithelial cells of benign prostatic hyperplasia tissue and reacting to prostate secretory cells but not stroma A hybridoma or a cell line derived therefrom.

A monoclonal antibody that reacts with prostate secretory cells but does not react with stroma, which is produced by the hybridoma according to claim 1 or a cell line derived therefrom.

Immunizes mammals with epithelial tissue pieces or epithelial cells of benign prostatic hyperplasia tissue, fuses the mammalian immune cells and mammalian myeloma cells, reacts to prostate secretory cells, but not stroma The method for producing a monoclonal antibody according to claim 2, wherein a hybridoma that produces the monoclonal antibody or a cell line derived therefrom is selected, the hybridoma is cultured, and the monoclonal antibody is recovered.

A method for detecting prostate cancer by immunologically measuring a Mac-2 binding protein in a sample using the monoclonal antibody according to claim 2.

A method for detecting prostate cancer by measuring Mac-2 binding protein in a sample.

A method for detecting prostate cancer by immunologically measuring a Mac-2 binding protein in a sample using a monoclonal antibody that specifically reacts with the Mac-2 binding protein or a fragment thereof.

A diagnostic agent for prostate cancer comprising a monoclonal antibody that specifically reacts with Mac-2 binding protein or a fragment thereof.

A kit for diagnosing prostate cancer comprising a monoclonal antibody that specifically reacts with Mac-2 binding protein or a fragment thereof.

A method for producing a monoclonal antibody that specifically reacts with a Mac-2 binding protein or a fragment thereof, comprising a mammalian immune cell immunized with an epithelial tissue fragment or epithelial cell of a prostatic hypertrophy tissue and a mammalian myeloma cell. The hybridoma obtained by the fusion is selected to produce a monoclonal antibody that reacts with prostate secreting cells but does not react with the stroma, and is cultured to recover the monoclonal antibody. Method.