JPWO2003104804A1 - 抗糖尿病作用を有する物質の探索方法 - Google Patents
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Abstract
本発明によれば、［１］被験物質の存在下、膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と膵臓β細胞とを接触させたときの該細胞の細胞応答を測定する工程、［２］被験物質の非存在下、該細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と該細胞とを接触させたときの該細胞の細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法、および［１］高グルコース濃度下において、被検物質とスルフオニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞とを接触させたときの該細胞の細胞応答を測定する工程、［２］高グルコース濃度下における該細胞の該細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、被験物質より該細胞応答を変化させる物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法が提供される。
Description
技術分野
本発明は、抗糖尿病作用を有する物質の探索方法に関する。
背景技術
スルフォニルウレア構造を有する化合物（以下、スルフォニルウレア化合物と略す）は、膵臓β細胞からのインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる２型糖尿病の治療薬として用いられており、血糖降下作用の強弱や作用持続時間などの異なる多くの種類のスルフォニルウレア化合物が知られている［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。
ナテグリニドは、スルフォニルウレア構造を有さない化合物であるが、スルフォニルウレア化合物と同様に、カリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害してインスリン分泌を促進する化合物として知られている［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．，２９３，４４４（２０００）］。
スルフォニルウレア化合物には、共通の副作用や合併症、およびスルフォニルウレア化合物に対する無効症があることが認められている［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。スルフォニルウレア化合物の使用に際する主たる合併症としては、低血糖症があげられる［Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．Ｅｄ．，２９６，９４９（１９８８）、Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）、Ａｃｔａ．Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．，６０５，７（１９７７）］。
また、２型糖尿病と診断された患者の約２０％に対してスルフォニルウレア化合物は無効である（一次無効）ことも知られている［Ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｒｅ ｓｔｕｄｙ，２４，４０４（１９８３）、Ｂｅｒｈｈａｒｄ，Ｈ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１４，５９（１９６５）、Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。
さらに、治療初期には、スルフォニルウレア化合物により血糖のコントロールが良好であった患者でも、治療の継続に伴い血糖をコントロールに必要なスルフォニルウレア化合物の用量が上昇すること［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］、および該患者の３〜５％において、スルフォニルウレア化合物が無効になる（二次無効）ことが知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，９，１２９（１９８６）、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１５，９５７（１９６６）、Ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ，５２（１９８９）］。
スルフォニルウレア化合物による治療により血糖コントロールを続けることで、治療を中断しても正常に近い血糖コントロールが得られるような寛解がもたらされる症例もあるが、その数はごく少数である［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２２，４５９（１９８２）、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６９，１７６（１９９０）］ことから、大半の２型糖尿病患者は、糖尿病と診断されてから一生の間、何らかの治療を受ける必要がある。
従って、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となった患者にも有効な糖尿病治療剤の開発が望まれている。
スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となった患者では、スルフォニルウレア化合物の投与だけでなく、糖負荷に対するインスリン分泌促進が得られなくなっていることが知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３５，１３１４（１９８６）］。
一方、このような二次無効となった患者でも、グルカゴンには反応してインスリン分泌が促進される例が知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３５，１３１４（１９８６）］ことから、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効になった膵臓でも、β細胞中にはインスリンが存在し、スルフォニルウレア化合物とは異なる機構によってインスリン分泌を促す作用を有する化合物に反応してインスリンを分泌することが知られている。
同様の現象は、ｅｘ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの実験によっても観察することができる。すなわち、スルフォニルウレア化合物を長期間投与したラットから調製した膵臓ランゲルハンス氏島、あるいは、スルフォニルウレア化合物を含む培地中にて長期間前培養した膵臓ランゲルハンス氏島は、高濃度のグルコース、あるいは、スルフォニルウレア化合物に対するインスリン分泌能は低下するのに対して、グルカゴンやテオフィリンなどのスルフォニルウレア化合物とは異なる機構によってインスリン分泌を促す作用を有する化合物に反応してインスリンを分泌することが知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９，６０３（１９７０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１３，１９７２（１９８３）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１０，２７（１９７４）、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２６，９（１９７７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３１，１８１５（１９９２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，７４，７９０（１９９２）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１４，２８７（１９９１）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，２８１（１９８９）］。
このような現象は、長期のスルフォニルウレア化合物を用いた治療による膵臓β細胞のスルフォニルウレア化合物に対する脱感作として知られており、この脱感作が、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となる原因の少なくとも一つであると考えられている［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。
従って、スルフォニルウレア化合物に対して脱感作した膵臓β細胞であっても、該細胞に作用し、インスリン分泌を促進する作用を有する化合物を効率よく探索する方法が求められている。
スルフォニルウレア化合物に対して脱感作した膵臓β細胞を用いて低グルコース濃度下、該細胞のインスリン分泌を促進する作用を有する物質を選択することを特徴とするインスリン分泌促進作用を有する物質の探索方法は知られている［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６１，５２７（２００１）］。しかしながら、該探索方法で得られる物質は低濃度のグルコース存在下においてもインスリン分泌を促進することから、低血糖症を引き起こす可能性が考えられる。
スルフォニルウレア化合物に対して無効である患者に有効であり、かつスルフォニルウレア化合物の副作用の一つである低血糖症を引き起こさない抗糖尿病作用を有する物質を、効率よく探索する方法は知られていない。
発明の開示
本発明は、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となった患者にも有効な抗糖尿病作用を有する物質の探索方法を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
（１） ［１］被験物質の存在下、膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と膵臓β細胞とを接触させたときの該細胞の細胞応答を測定する工程、［２］被験物質の非存在下、該細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と該細胞とを接触させたときの該細胞の該細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、該細胞の該細胞応答を変化させる被験物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
（２） ［１］被験物質の存在下、スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞の高グルコース濃度下における細胞応答を測定する工程、［２］被験物質の非存在下、該細胞の該高グルコース濃度下における該細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
（３） 膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質が、スルフォニルウレア構造を有する化合物またはナテグリニドである上記（１）の探索方法。
（４） 抗糖尿病作用を有する物質が、インスリン分泌促進活性を有する物質である上記（１）〜（３）のいずれか１つの探索方法。
（５） 細胞応答が、膵臓β細胞からのインスリン分泌であって、細胞応答の変化が膵臓β細胞からのインスリンの分泌促進である上記（１）〜（４）のいずれか１つの探索方法。
（６） 細胞応答が、膵臓β細胞のインスリン分泌の促進に関わる細胞応答であって、細胞応答の変化が、膵臓β細胞のインスリン分泌の促進に関わる細胞応答の増加である上記（１）〜（４）のいずれか１つの探索方法。
（７） 細胞応答が、膵臓β細胞のインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答であって、細胞応答の変化が、膵臓β細胞のインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答の減少である上記（１）〜（４）のいずれか１つの探索方法。
（８） インスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、細胞膜容量、細胞内カルシウムイオン濃度、細胞膜電位、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度、またはカルシウムイオンチャンネル活性である上記（６）の探索方法。
（９） インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、細胞内カリウムイオン濃度、またはカリウムイオンチャンネル活性である上記（７）の探索方法。
（１０） スルフォニルウレア構造を有する化合物が、グリベンクラミドまたはトルブタミドである上記（２）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
（１１） スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞が、高濃度のグルコース存在下におけるインスリン分泌能力、またはインスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞に比べ、減少している細胞である上記（２）および（４）〜（９）から選ばれるいずれか１つに記載の探索方法。
（１２） スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞が、高濃度のグルコース存在下におけるインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞に比べ、増大している細胞である上記（２）および（４）〜（９）から選ばれるいずれか１つに記載の探索方法。
（１３） 膵臓β細胞がＭＩＮ６細胞である上記（１）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
（１４） 膵臓β細胞がＭＩＮ６細胞であり、スルフォニルウレア構造を有する化合物がグリベンクラミドまたはトルブタミドである上記（１）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
上記（１）に係る発明で用いられる膵臓β細胞としては、スルフォニルウレア構造を有する化合物（以下、スルフォニルウレア化合物と称す）またはナテグリニドに反応して細胞応答する細胞であれば、いずれも用いることができ、例えば、膵臓から調製される膵臓β細胞、または膵臓β細胞由来の膵臓β細胞株をあげることができる。膵臓β細胞株としては、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３１，５２１（１９８２）］、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，１１３２（１９９６）］、ＩＮＳ−１細胞［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１６７（１９９２）］、βＴＣ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５，９０３７（１９８８）］、およびＭＩＮ６細胞［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６（１９９０）］等をあげることができる。
上記（２）に係る発明で用いられるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞としては、スルフォニルウレア化合物と接触させたとき、同濃度の該化合物により誘導される▲１▼インスリン分泌活性が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞より低下している細胞、▲２▼インスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞より減少している細胞、または▲３▼インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞より増加している細胞、などをあげることができ、好ましくは、脱感作状態における形質が、膵臓から調製されるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞と同等である細胞をあげることができる。
膵臓から調製されるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の形質としては、例えば、低濃度および高濃度のグルコース存在下のいずれの場合においても、インスリン分泌活性が脱感作前より低下している形質などをあげることができる。
上記の高濃度のグルコースの濃度としては、例えば、５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは８〜１８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは９〜１６ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１４．５ｍｍｏｌ／Ｌをあげることができ、低濃度のグルコースの濃度としては、５ｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満の濃度をあげることができる。
上記の親株とは、以下に記載するスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の作製に供した元の膵臓β細胞のことをいい、該元株としては、例えば、膵臓から調製される膵臓β細胞、膵臓β細胞由来の膵臓β細胞株であるＲＩＮｍ５Ｆ細胞、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞、ＩＮＳ−１細胞、βＴＣ細胞、およびＭＩＮ６細胞等をあげることができ、好ましくはＭＩＮ６細胞をあげることができる。
スルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞は、スルフォニルウレア化合物存在下で、膵臓β細胞を培養して得ることができる。
該培養に用いられる膵臓β細胞としては、上記した膵臓から調製される膵臓β細胞、膵臓β細胞株であるＲＩＮｍ５Ｆ細胞、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞、ＩＮＳ−１細胞、βＴＣ細胞、およびＭＩＮ６細胞等をあげることができ、好ましくはＭＩＮ６細胞をあげることができる。
スルフォニルウレア化合物存在下で膵臓β細胞を培養して得られる細胞が、該化合物に脱感作したことは、該化合物存在下で培養した膵臓β細胞の培養細胞を該化合物で刺激したときに、該化合物非存在下で培養した親株である膵臓β細胞の培養細胞を該化合物で刺激した場合に比べ、▲１▼インスリン分泌量が少ない、▲２▼インスリン分泌の促進に関わる細胞応答が小さい、または▲３▼インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が大きい、等のことにより確認することができる。
本発明で用いられるスルフォニルウレア化合物としては、抗糖尿病作用を有するスルフォニルウレア化合物であればいずれの化合物でもよく、例えば、グリベンクラミド、トルブタミドなどをあげることができる。
本発明で用いられるナテグリニドには、ナテグリニドの誘導体であって、かつ膵臓β細胞のインスリン分泌を促進する活性有する化合物も含まれる。
上記（１）に係る発明の方法において用いられるスルフォニルウレア化合物、およびナテグリニドの濃度としては、用いられるスルフォニルウレア化合物またはナテグリニドがその濃度において、本発明の方法で用いられる膵臓β細胞に細胞応答を生じさせ、かつ該細胞に対して毒性を示さない濃度であれば、いずれの濃度であってもよい。
該濃度としては、例えば、スルフォニルウレア化合物としてグリベンクラミドを用いる場合、０．１〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。また、スルフォニルウレア化合物としてトルブラミドの場合、該濃度としては、５０〜５００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１００〜２００μｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。ナテグリニドを用いる場合、該濃度としては、１〜１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。
また、スルフォニルウレア化合物を用いて膵臓β細胞を脱感作させる際のスルフォニルウレア化合物の濃度は、用いられるスルフォニルウレア化合物がその濃度において、用いられる膵臓β細胞を脱感作し、かつ該細胞に対して毒性を表さない濃度であれば、いずれの濃度であってもよい。
該濃度としては、例えば、スルフォニルウレア化合物としてグリベンクラミドを用いる場合、０．１〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。また、スルフォニルウレア化合物としてトルブラミドを用いる場合、５０〜５００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１００〜２００μｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。
上記（１）に係る本発明の探索方法に用いられる膵臓β細胞は、該細胞の生育に適した培地で培養することにより調製することができる。
上記（２）に係る本発明の探索方法に用いられる膵臓β細胞を培養する培地および培養条件としては、該細胞の生育に適した培地であり、かつスルフォニルウレア化合物を該培地に添加して培養した際に該細胞が該化合物に対して脱感作する培養条件であれば、いずれの培地、培養条件であってもよい。
該培地としては、例えば、ウシ胎児血清等の血清成分を添加したＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）をあげることができる。また、培養条件としては、４〜６％、好ましくは５％の炭酸ガスの存在下、３６〜３８℃、好ましくは３７℃で、６〜７２時間、好ましくは１８時間培養する条件をあげることができる。
被検物質の存在下、上記により調製した膵臓β細胞、および膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質を適当な培地または緩衝液中で接触させた場合、および被験物質の非存在下、該膵臓β細胞と該膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質とを該培地または該緩衝液中で接触させた場合における、該細胞の細胞応答を測定、比較し、該被験物質より該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択することにより、抗糖尿病作用を有する物質を取得することができる。
上記の細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液は、該細胞応答を測定できる培地、または緩衝液であれば、どのような組成の培地、または緩衝液であってもよいが、例えば、培地としてはＤＭＥＭ培地など、緩衝液としては生理的な塩を含むＨＥＰＥＳ緩衝液などをあげることができる。
細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液中には、被検物質の有無により、その細胞応答の違いが測定できる濃度であればグルコースが含まれていてもよく、グルコースが含有される場合の好ましい濃度は、１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは２〜４ｍｍｏｌ／Ｌである。
また、被験物質の存在下、高濃度のグルコースを含有する適当な培地または緩衝液中におけるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の細胞応答と、被験物質の非存在下、該培地または該緩衝液中における該細胞の該細胞応答を、測定、比較し、該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択することにより、抗糖尿病作用を有する物質を取得することができる。
上記の細胞応答の測定は、高濃度のグルコース存在下、スルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の細胞応答を測定することが可能な方法であればいずれの方法であってもよく、例えば、該細胞を、被検物質を添加した高濃度のグルコースを含有する培地中で一定時間培養した後、または高濃度のグルコースを含有する緩衝液中で該培養細胞と被検物質とを一定時間接触させた後、該細胞応答を測定する方法をあげることができる。
細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液は、該細胞応答を測定できる培地、または緩衝液であれば、どのような組成の培地、または緩衝液であってもよく、例えば、培地としてはＤＭＥＭ培地など、緩衝液としては生理的な塩を含むＨＥＰＥＳ緩衝液などをあげることができる。
細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液中の高濃度のグルコースとは、その濃度のグルコース存在下においても被検物質とスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞を接触させた際に惹起される該細胞のインスリン分泌または細胞応答を検出することができる程度に高いグルコース濃度のことであり、該グルコース濃度としては、例えば、５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは８〜１８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは９〜１６ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１４．５ｍｍｏｌ／Ｌをあげることができる。
本発明の探索方法で測定対象とする細胞応答は、糖尿病の病態の抑制に関わる細胞応答であればいずれの細胞応答であってもよく、糖尿病の病態の抑制に関わる細胞応答としては、例えば、インスリンの分泌、およびインスリン分泌に関わる細胞応答をあげることができる。
インスリン分泌に関わる細胞応答としては、インスリン分泌の促進に関わる細胞応答の増加、およびインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答の減少をあげることができる。
インスリン分泌の促進に関わる細胞応答の増加としては、例えば、細胞膜容量［Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７２，６６５（１９９３）］の上昇、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇、細胞膜電位の上昇、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の上昇、カルシウムイオンチャンネル活性の活性化、細胞内カリウムイオン濃度の上昇［いずれもＪｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）に記載］などをあげることができる。
インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答の減少としては、例えば、カリウムイオン濃度の減少、およびカリウムイオンチャンネルの活性低下［いずれもＪｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）に記載］などをあげることができる。
インスリン分泌は、培養液または緩衝液中に分泌されるインスリンを検出、定量することにより確認することができる。インスリンの検出、および定量方法は、公知の方法であればいずれの方法も用いることができ、例えば、放射標識した抗インスリン抗体を用いたラジオイムノアッセイ法をあげることができる。
本発明の方法により選択された物質が、低濃度グルコース存在下において膵臓β細胞およびスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞のインスリン分泌を促進しない物質であることは、低濃度グルコース存在下、膵臓β細胞またはスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞と該物質とを適当な培地または緩衝液中で接触させたときのインスリン分泌、インスリン分泌の促進に関わる細胞応答、またはインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答を測定することにより確認することができる。
低濃度グルコースとしては、５ｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満の濃度をあげることができる。上記測定に用いられる膵臓β細胞、培地、緩衝液等は、上記した本発明の探索方法に用いられるものであればいずれも用いることができる。インスリン分泌、インスリン分泌の促進に関わる細胞応答またはインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答は、上記した方法により測定することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ ＭＩＮ６細胞を用いたインスリン分泌促進作用を有する物質の探索法（１）
ＭＩＮ６細胞を、細胞培養用マルチウェルプレート（２４ウェルプレート、コーニング社製）中にて、３７℃、５％炭酸ガスの存在下、１５％ウシ胎児血清と５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、日水製薬株式会社製）を用いて集密的になる直前まで培養した後、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液（１１９ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４．７４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．５４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１．１９ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム、１．１９ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．３）を用いて洗浄し、さらに２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液中にて、３７℃で４５分間インキュベートした。その後、緩衝液を、１ｍＬの１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドおよび２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液、該緩衝液に１μｍｏｌ／Ｌの下式（Ｉ）
で表される化合物１（ＷＯ００／０１３８８）を添加した溶液、および該緩衝液に１０μｍｏｌ／Ｌグリベンクラミドを添加した溶液にそれぞれ交換し、該細胞を３７℃で４５分間インキュベートした後、サンプリングした。該上清は、０．１％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で適当に希釈し、インスリン濃度の測定に供した。
希釈した上清のインスリン濃度は、３−［１２５Ｉ］ｉｏｄｏｔｙｒｏｓｙｌＡ１４インスリン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、抗ラットインスリン抗体（コスモバイオ社製）を用いたラジオイムノアッセイ法に基づいて、ラットインスリン（コスモバイオ社製）をスタンダードとして測定した。測定結果を第１図に示す。
第１図より、化合物１は、スルフォニルウレア化合物であるグリベンクラミド存在下においてもインスリン分泌促進活性を有することが確認された。
実施例２ ＭＩＮ６細胞を用いたインスリン分泌促進作用を有する物質の探索法（２）
ＭＩＮ６細胞を、細胞培養用マルチウェルプレート（２４ウェルプレート、コーニング社製）中にて、３７℃、５％炭酸ガスの存在下で、１５％のウシ胎児血清と５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；日水製薬株式会社製）を用いて集密的になる直前まで培養した後、１０ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミド（シグマ社製）を含む培地に交換して、さらに、１８時間培養した。
このようにグリベンクラミドを含む培地中にて前培養したＭＩＮ６細胞を、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液を用いて洗浄した後、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液中にて、３７℃で４５分間インキュベートした。
その後、以下の方法によりインスリン分泌試験を行った。
まず、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液を、１０μｍｏｌ／Ｌの下式（Ｉ）
で表される化合物１（ＷＯ００／０１３８８）および２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液に交換し、該細胞を３７℃で１５分間処理した。ここへ、１２７ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液を上記交換溶液の９分の１容量加えることにより、グルコースの終濃度を１４．５ｍｍｏｌ／Ｌとした。その後、該細胞を３７℃で４５分間インキュベートし、分泌されたインスリンを含む上清をサンプリングした。また、このインスリン分泌試験終了後の細胞に３ｍｏｌ／Ｌの酢酸を添加することにより細胞内に残されているインスリンを抽出し、上清をサンプリングした。該上清は、それぞれ０．１％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で適当に希釈し、インスリン量の測定に供した。インスリン量は、３−［１２５Ｉ］ｉｏｄｏｔｙｒｏｓｙｌＡ１４インスリン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、抗ラットインスリン抗体（コスモバイオ社製）を用いたラジオイムノアッセイ法に基づいて、ラットインスリン（コスモバイオ社製）をスタンダードとして測定した。分泌されたインスリン量に分泌後に細胞内に残ったインスリン量を加算することにより、分泌試験前に細胞内に含有されていたインスリン量を求めた。
また、分泌試験前に細胞内に含有されていたインスリン量に対するインスリン分泌量の割合を百分率にて表した値を、インスリン分泌％とした。
第２図は、本発明の探索方法により、スルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞のインスリン分泌を促進させる物質が、選択可能であることを示している（第２図Ｂの右カラム群）。また、本発明の方法により選択された化合物１は、スルフォニルウレア化合物に脱感作していない膵臓β細胞に対して、スルフォニルウレア化合物と同等のインスリン分泌促進作用を有することも確認された（第２図Ｂの左カラム群）。
さらに化合物１は、低濃度グルコース存在下において膵臓β細胞のインスリン分泌を促進しないことも確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質の存在下における膵臓β細胞の細胞応答の変化、およびスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の細胞応答の変化を指標にして、スルフォニルウレア化合物に無効である患者にも有効な抗糖尿病作用を有する物質を効率よく探索することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、化合物１が有する、グリベンクラミド存在下におけるＭＩＮ６細胞からのインスリン分泌促進効果を示す図である。白抜きカラムは１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドのみを添加、黒色カラムは１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドと１μｍｏｌ／Ｌの化合物１を添加、斜線カラムは１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドにさらに１０μｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドを添加した試験区を表し、縦軸は上清中のインスリン濃度を表す。エラーバーは、３連で行った実験における標準誤差を示す。
第２図は、グリベンクラミドに脱感作した細胞に対する、化合物１のインスリン分泌促進効果を示す図である。Ａは２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース存在下でのインスリン分泌量、Ｂは１４．５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース存在下でのインスリン分泌量の測定結果である。エラーバーは、３連で行った実験の標準誤差を示す。カラムは、白抜きは被検物質無添加区、散点は化合物１添加区、斜線はグリベンクラミド添加区を表し、縦軸は、分泌されたインスリン量に分泌後に細胞内に残ったインスリン量を加算すること算出した分泌試験前に細胞内に含有されていたインスリン量に対するインスリン分泌量の割合を百分率にて表した値（インスリン分泌％）を表す。
また、図中各カラムを結ぶ線は、それぞれのカラム間の有意差を示し、Ｎ．Ｓ．は有意差なし、★はｐ＜０．０５、★★はｐ＜０．０１、★★★はｐ＜０．００１を表す。
本発明は、抗糖尿病作用を有する物質の探索方法に関する。
背景技術
スルフォニルウレア構造を有する化合物（以下、スルフォニルウレア化合物と略す）は、膵臓β細胞からのインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる２型糖尿病の治療薬として用いられており、血糖降下作用の強弱や作用持続時間などの異なる多くの種類のスルフォニルウレア化合物が知られている［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。
ナテグリニドは、スルフォニルウレア構造を有さない化合物であるが、スルフォニルウレア化合物と同様に、カリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害してインスリン分泌を促進する化合物として知られている［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．，２９３，４４４（２０００）］。
スルフォニルウレア化合物には、共通の副作用や合併症、およびスルフォニルウレア化合物に対する無効症があることが認められている［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。スルフォニルウレア化合物の使用に際する主たる合併症としては、低血糖症があげられる［Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．Ｅｄ．，２９６，９４９（１９８８）、Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）、Ａｃｔａ．Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．，６０５，７（１９７７）］。
また、２型糖尿病と診断された患者の約２０％に対してスルフォニルウレア化合物は無効である（一次無効）ことも知られている［Ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｒｅ ｓｔｕｄｙ，２４，４０４（１９８３）、Ｂｅｒｈｈａｒｄ，Ｈ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１４，５９（１９６５）、Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。
さらに、治療初期には、スルフォニルウレア化合物により血糖のコントロールが良好であった患者でも、治療の継続に伴い血糖をコントロールに必要なスルフォニルウレア化合物の用量が上昇すること［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］、および該患者の３〜５％において、スルフォニルウレア化合物が無効になる（二次無効）ことが知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，９，１２９（１９８６）、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１５，９５７（１９６６）、Ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ，５２（１９８９）］。
スルフォニルウレア化合物による治療により血糖コントロールを続けることで、治療を中断しても正常に近い血糖コントロールが得られるような寛解がもたらされる症例もあるが、その数はごく少数である［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２２，４５９（１９８２）、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６９，１７６（１９９０）］ことから、大半の２型糖尿病患者は、糖尿病と診断されてから一生の間、何らかの治療を受ける必要がある。
従って、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となった患者にも有効な糖尿病治療剤の開発が望まれている。
スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となった患者では、スルフォニルウレア化合物の投与だけでなく、糖負荷に対するインスリン分泌促進が得られなくなっていることが知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３５，１３１４（１９８６）］。
一方、このような二次無効となった患者でも、グルカゴンには反応してインスリン分泌が促進される例が知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３５，１３１４（１９８６）］ことから、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効になった膵臓でも、β細胞中にはインスリンが存在し、スルフォニルウレア化合物とは異なる機構によってインスリン分泌を促す作用を有する化合物に反応してインスリンを分泌することが知られている。
同様の現象は、ｅｘ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの実験によっても観察することができる。すなわち、スルフォニルウレア化合物を長期間投与したラットから調製した膵臓ランゲルハンス氏島、あるいは、スルフォニルウレア化合物を含む培地中にて長期間前培養した膵臓ランゲルハンス氏島は、高濃度のグルコース、あるいは、スルフォニルウレア化合物に対するインスリン分泌能は低下するのに対して、グルカゴンやテオフィリンなどのスルフォニルウレア化合物とは異なる機構によってインスリン分泌を促す作用を有する化合物に反応してインスリンを分泌することが知られている［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９，６０３（１９７０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１３，１９７２（１９８３）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１０，２７（１９７４）、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２６，９（１９７７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３１，１８１５（１９９２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，７４，７９０（１９９２）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１４，２８７（１９９１）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，２８１（１９８９）］。
このような現象は、長期のスルフォニルウレア化合物を用いた治療による膵臓β細胞のスルフォニルウレア化合物に対する脱感作として知られており、この脱感作が、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となる原因の少なくとも一つであると考えられている［Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）］。
従って、スルフォニルウレア化合物に対して脱感作した膵臓β細胞であっても、該細胞に作用し、インスリン分泌を促進する作用を有する化合物を効率よく探索する方法が求められている。
スルフォニルウレア化合物に対して脱感作した膵臓β細胞を用いて低グルコース濃度下、該細胞のインスリン分泌を促進する作用を有する物質を選択することを特徴とするインスリン分泌促進作用を有する物質の探索方法は知られている［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６１，５２７（２００１）］。しかしながら、該探索方法で得られる物質は低濃度のグルコース存在下においてもインスリン分泌を促進することから、低血糖症を引き起こす可能性が考えられる。
スルフォニルウレア化合物に対して無効である患者に有効であり、かつスルフォニルウレア化合物の副作用の一つである低血糖症を引き起こさない抗糖尿病作用を有する物質を、効率よく探索する方法は知られていない。
発明の開示
本発明は、スルフォニルウレア化合物に対して二次無効となった患者にも有効な抗糖尿病作用を有する物質の探索方法を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
（１） ［１］被験物質の存在下、膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と膵臓β細胞とを接触させたときの該細胞の細胞応答を測定する工程、［２］被験物質の非存在下、該細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と該細胞とを接触させたときの該細胞の該細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、該細胞の該細胞応答を変化させる被験物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
（２） ［１］被験物質の存在下、スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞の高グルコース濃度下における細胞応答を測定する工程、［２］被験物質の非存在下、該細胞の該高グルコース濃度下における該細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
（３） 膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質が、スルフォニルウレア構造を有する化合物またはナテグリニドである上記（１）の探索方法。
（４） 抗糖尿病作用を有する物質が、インスリン分泌促進活性を有する物質である上記（１）〜（３）のいずれか１つの探索方法。
（５） 細胞応答が、膵臓β細胞からのインスリン分泌であって、細胞応答の変化が膵臓β細胞からのインスリンの分泌促進である上記（１）〜（４）のいずれか１つの探索方法。
（６） 細胞応答が、膵臓β細胞のインスリン分泌の促進に関わる細胞応答であって、細胞応答の変化が、膵臓β細胞のインスリン分泌の促進に関わる細胞応答の増加である上記（１）〜（４）のいずれか１つの探索方法。
（７） 細胞応答が、膵臓β細胞のインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答であって、細胞応答の変化が、膵臓β細胞のインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答の減少である上記（１）〜（４）のいずれか１つの探索方法。
（８） インスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、細胞膜容量、細胞内カルシウムイオン濃度、細胞膜電位、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度、またはカルシウムイオンチャンネル活性である上記（６）の探索方法。
（９） インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、細胞内カリウムイオン濃度、またはカリウムイオンチャンネル活性である上記（７）の探索方法。
（１０） スルフォニルウレア構造を有する化合物が、グリベンクラミドまたはトルブタミドである上記（２）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
（１１） スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞が、高濃度のグルコース存在下におけるインスリン分泌能力、またはインスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞に比べ、減少している細胞である上記（２）および（４）〜（９）から選ばれるいずれか１つに記載の探索方法。
（１２） スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞が、高濃度のグルコース存在下におけるインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞に比べ、増大している細胞である上記（２）および（４）〜（９）から選ばれるいずれか１つに記載の探索方法。
（１３） 膵臓β細胞がＭＩＮ６細胞である上記（１）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
（１４） 膵臓β細胞がＭＩＮ６細胞であり、スルフォニルウレア構造を有する化合物がグリベンクラミドまたはトルブタミドである上記（１）〜（９）のいずれか１つの探索方法。
上記（１）に係る発明で用いられる膵臓β細胞としては、スルフォニルウレア構造を有する化合物（以下、スルフォニルウレア化合物と称す）またはナテグリニドに反応して細胞応答する細胞であれば、いずれも用いることができ、例えば、膵臓から調製される膵臓β細胞、または膵臓β細胞由来の膵臓β細胞株をあげることができる。膵臓β細胞株としては、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３１，５２１（１９８２）］、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞［Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５，１１３２（１９９６）］、ＩＮＳ−１細胞［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３０，１６７（１９９２）］、βＴＣ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５，９０３７（１９８８）］、およびＭＩＮ６細胞［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２７，１２６（１９９０）］等をあげることができる。
上記（２）に係る発明で用いられるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞としては、スルフォニルウレア化合物と接触させたとき、同濃度の該化合物により誘導される▲１▼インスリン分泌活性が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞より低下している細胞、▲２▼インスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞より減少している細胞、または▲３▼インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞より増加している細胞、などをあげることができ、好ましくは、脱感作状態における形質が、膵臓から調製されるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞と同等である細胞をあげることができる。
膵臓から調製されるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の形質としては、例えば、低濃度および高濃度のグルコース存在下のいずれの場合においても、インスリン分泌活性が脱感作前より低下している形質などをあげることができる。
上記の高濃度のグルコースの濃度としては、例えば、５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは８〜１８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは９〜１６ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１４．５ｍｍｏｌ／Ｌをあげることができ、低濃度のグルコースの濃度としては、５ｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満の濃度をあげることができる。
上記の親株とは、以下に記載するスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の作製に供した元の膵臓β細胞のことをいい、該元株としては、例えば、膵臓から調製される膵臓β細胞、膵臓β細胞由来の膵臓β細胞株であるＲＩＮｍ５Ｆ細胞、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞、ＩＮＳ−１細胞、βＴＣ細胞、およびＭＩＮ６細胞等をあげることができ、好ましくはＭＩＮ６細胞をあげることができる。
スルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞は、スルフォニルウレア化合物存在下で、膵臓β細胞を培養して得ることができる。
該培養に用いられる膵臓β細胞としては、上記した膵臓から調製される膵臓β細胞、膵臓β細胞株であるＲＩＮｍ５Ｆ細胞、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞、ＩＮＳ−１細胞、βＴＣ細胞、およびＭＩＮ６細胞等をあげることができ、好ましくはＭＩＮ６細胞をあげることができる。
スルフォニルウレア化合物存在下で膵臓β細胞を培養して得られる細胞が、該化合物に脱感作したことは、該化合物存在下で培養した膵臓β細胞の培養細胞を該化合物で刺激したときに、該化合物非存在下で培養した親株である膵臓β細胞の培養細胞を該化合物で刺激した場合に比べ、▲１▼インスリン分泌量が少ない、▲２▼インスリン分泌の促進に関わる細胞応答が小さい、または▲３▼インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が大きい、等のことにより確認することができる。
本発明で用いられるスルフォニルウレア化合物としては、抗糖尿病作用を有するスルフォニルウレア化合物であればいずれの化合物でもよく、例えば、グリベンクラミド、トルブタミドなどをあげることができる。
本発明で用いられるナテグリニドには、ナテグリニドの誘導体であって、かつ膵臓β細胞のインスリン分泌を促進する活性有する化合物も含まれる。
上記（１）に係る発明の方法において用いられるスルフォニルウレア化合物、およびナテグリニドの濃度としては、用いられるスルフォニルウレア化合物またはナテグリニドがその濃度において、本発明の方法で用いられる膵臓β細胞に細胞応答を生じさせ、かつ該細胞に対して毒性を示さない濃度であれば、いずれの濃度であってもよい。
該濃度としては、例えば、スルフォニルウレア化合物としてグリベンクラミドを用いる場合、０．１〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。また、スルフォニルウレア化合物としてトルブラミドの場合、該濃度としては、５０〜５００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１００〜２００μｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。ナテグリニドを用いる場合、該濃度としては、１〜１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５〜２０μｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。
また、スルフォニルウレア化合物を用いて膵臓β細胞を脱感作させる際のスルフォニルウレア化合物の濃度は、用いられるスルフォニルウレア化合物がその濃度において、用いられる膵臓β細胞を脱感作し、かつ該細胞に対して毒性を表さない濃度であれば、いずれの濃度であってもよい。
該濃度としては、例えば、スルフォニルウレア化合物としてグリベンクラミドを用いる場合、０．１〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。また、スルフォニルウレア化合物としてトルブラミドを用いる場合、５０〜５００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１００〜２００μｍｏｌ／Ｌの濃度をあげることができる。
上記（１）に係る本発明の探索方法に用いられる膵臓β細胞は、該細胞の生育に適した培地で培養することにより調製することができる。
上記（２）に係る本発明の探索方法に用いられる膵臓β細胞を培養する培地および培養条件としては、該細胞の生育に適した培地であり、かつスルフォニルウレア化合物を該培地に添加して培養した際に該細胞が該化合物に対して脱感作する培養条件であれば、いずれの培地、培養条件であってもよい。
該培地としては、例えば、ウシ胎児血清等の血清成分を添加したＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）をあげることができる。また、培養条件としては、４〜６％、好ましくは５％の炭酸ガスの存在下、３６〜３８℃、好ましくは３７℃で、６〜７２時間、好ましくは１８時間培養する条件をあげることができる。
被検物質の存在下、上記により調製した膵臓β細胞、および膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質を適当な培地または緩衝液中で接触させた場合、および被験物質の非存在下、該膵臓β細胞と該膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質とを該培地または該緩衝液中で接触させた場合における、該細胞の細胞応答を測定、比較し、該被験物質より該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択することにより、抗糖尿病作用を有する物質を取得することができる。
上記の細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液は、該細胞応答を測定できる培地、または緩衝液であれば、どのような組成の培地、または緩衝液であってもよいが、例えば、培地としてはＤＭＥＭ培地など、緩衝液としては生理的な塩を含むＨＥＰＥＳ緩衝液などをあげることができる。
細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液中には、被検物質の有無により、その細胞応答の違いが測定できる濃度であればグルコースが含まれていてもよく、グルコースが含有される場合の好ましい濃度は、１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは２〜４ｍｍｏｌ／Ｌである。
また、被験物質の存在下、高濃度のグルコースを含有する適当な培地または緩衝液中におけるスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の細胞応答と、被験物質の非存在下、該培地または該緩衝液中における該細胞の該細胞応答を、測定、比較し、該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択することにより、抗糖尿病作用を有する物質を取得することができる。
上記の細胞応答の測定は、高濃度のグルコース存在下、スルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の細胞応答を測定することが可能な方法であればいずれの方法であってもよく、例えば、該細胞を、被検物質を添加した高濃度のグルコースを含有する培地中で一定時間培養した後、または高濃度のグルコースを含有する緩衝液中で該培養細胞と被検物質とを一定時間接触させた後、該細胞応答を測定する方法をあげることができる。
細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液は、該細胞応答を測定できる培地、または緩衝液であれば、どのような組成の培地、または緩衝液であってもよく、例えば、培地としてはＤＭＥＭ培地など、緩衝液としては生理的な塩を含むＨＥＰＥＳ緩衝液などをあげることができる。
細胞応答を測定する際の培地、または緩衝液中の高濃度のグルコースとは、その濃度のグルコース存在下においても被検物質とスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞を接触させた際に惹起される該細胞のインスリン分泌または細胞応答を検出することができる程度に高いグルコース濃度のことであり、該グルコース濃度としては、例えば、５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは８〜１８ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは９〜１６ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは１４．５ｍｍｏｌ／Ｌをあげることができる。
本発明の探索方法で測定対象とする細胞応答は、糖尿病の病態の抑制に関わる細胞応答であればいずれの細胞応答であってもよく、糖尿病の病態の抑制に関わる細胞応答としては、例えば、インスリンの分泌、およびインスリン分泌に関わる細胞応答をあげることができる。
インスリン分泌に関わる細胞応答としては、インスリン分泌の促進に関わる細胞応答の増加、およびインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答の減少をあげることができる。
インスリン分泌の促進に関わる細胞応答の増加としては、例えば、細胞膜容量［Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７２，６６５（１９９３）］の上昇、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇、細胞膜電位の上昇、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度の上昇、カルシウムイオンチャンネル活性の活性化、細胞内カリウムイオン濃度の上昇［いずれもＪｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）に記載］などをあげることができる。
インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答の減少としては、例えば、カリウムイオン濃度の減少、およびカリウムイオンチャンネルの活性低下［いずれもＪｏｓｌｉｎ’ｓ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ Ｌｔｄ．（１９９４）に記載］などをあげることができる。
インスリン分泌は、培養液または緩衝液中に分泌されるインスリンを検出、定量することにより確認することができる。インスリンの検出、および定量方法は、公知の方法であればいずれの方法も用いることができ、例えば、放射標識した抗インスリン抗体を用いたラジオイムノアッセイ法をあげることができる。
本発明の方法により選択された物質が、低濃度グルコース存在下において膵臓β細胞およびスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞のインスリン分泌を促進しない物質であることは、低濃度グルコース存在下、膵臓β細胞またはスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞と該物質とを適当な培地または緩衝液中で接触させたときのインスリン分泌、インスリン分泌の促進に関わる細胞応答、またはインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答を測定することにより確認することができる。
低濃度グルコースとしては、５ｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上〜５ｍｍｏｌ／Ｌ未満の濃度をあげることができる。上記測定に用いられる膵臓β細胞、培地、緩衝液等は、上記した本発明の探索方法に用いられるものであればいずれも用いることができる。インスリン分泌、インスリン分泌の促進に関わる細胞応答またはインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答は、上記した方法により測定することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ ＭＩＮ６細胞を用いたインスリン分泌促進作用を有する物質の探索法（１）
ＭＩＮ６細胞を、細胞培養用マルチウェルプレート（２４ウェルプレート、コーニング社製）中にて、３７℃、５％炭酸ガスの存在下、１５％ウシ胎児血清と５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、日水製薬株式会社製）を用いて集密的になる直前まで培養した後、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液（１１９ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４．７４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．５４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１．１９ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム、１．１９ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．３）を用いて洗浄し、さらに２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液中にて、３７℃で４５分間インキュベートした。その後、緩衝液を、１ｍＬの１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドおよび２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液、該緩衝液に１μｍｏｌ／Ｌの下式（Ｉ）
希釈した上清のインスリン濃度は、３−［１２５Ｉ］ｉｏｄｏｔｙｒｏｓｙｌＡ１４インスリン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、抗ラットインスリン抗体（コスモバイオ社製）を用いたラジオイムノアッセイ法に基づいて、ラットインスリン（コスモバイオ社製）をスタンダードとして測定した。測定結果を第１図に示す。
第１図より、化合物１は、スルフォニルウレア化合物であるグリベンクラミド存在下においてもインスリン分泌促進活性を有することが確認された。
実施例２ ＭＩＮ６細胞を用いたインスリン分泌促進作用を有する物質の探索法（２）
ＭＩＮ６細胞を、細胞培養用マルチウェルプレート（２４ウェルプレート、コーニング社製）中にて、３７℃、５％炭酸ガスの存在下で、１５％のウシ胎児血清と５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；日水製薬株式会社製）を用いて集密的になる直前まで培養した後、１０ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミド（シグマ社製）を含む培地に交換して、さらに、１８時間培養した。
このようにグリベンクラミドを含む培地中にて前培養したＭＩＮ６細胞を、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液を用いて洗浄した後、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液中にて、３７℃で４５分間インキュベートした。
その後、以下の方法によりインスリン分泌試験を行った。
まず、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含むＨＢＫＲＰＢ緩衝液を、１０μｍｏｌ／Ｌの下式（Ｉ）
また、分泌試験前に細胞内に含有されていたインスリン量に対するインスリン分泌量の割合を百分率にて表した値を、インスリン分泌％とした。
第２図は、本発明の探索方法により、スルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞のインスリン分泌を促進させる物質が、選択可能であることを示している（第２図Ｂの右カラム群）。また、本発明の方法により選択された化合物１は、スルフォニルウレア化合物に脱感作していない膵臓β細胞に対して、スルフォニルウレア化合物と同等のインスリン分泌促進作用を有することも確認された（第２図Ｂの左カラム群）。
さらに化合物１は、低濃度グルコース存在下において膵臓β細胞のインスリン分泌を促進しないことも確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質の存在下における膵臓β細胞の細胞応答の変化、およびスルフォニルウレア化合物に脱感作した膵臓β細胞の細胞応答の変化を指標にして、スルフォニルウレア化合物に無効である患者にも有効な抗糖尿病作用を有する物質を効率よく探索することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、化合物１が有する、グリベンクラミド存在下におけるＭＩＮ６細胞からのインスリン分泌促進効果を示す図である。白抜きカラムは１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドのみを添加、黒色カラムは１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドと１μｍｏｌ／Ｌの化合物１を添加、斜線カラムは１００ｎｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドにさらに１０μｍｏｌ／Ｌのグリベンクラミドを添加した試験区を表し、縦軸は上清中のインスリン濃度を表す。エラーバーは、３連で行った実験における標準誤差を示す。
第２図は、グリベンクラミドに脱感作した細胞に対する、化合物１のインスリン分泌促進効果を示す図である。Ａは２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース存在下でのインスリン分泌量、Ｂは１４．５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース存在下でのインスリン分泌量の測定結果である。エラーバーは、３連で行った実験の標準誤差を示す。カラムは、白抜きは被検物質無添加区、散点は化合物１添加区、斜線はグリベンクラミド添加区を表し、縦軸は、分泌されたインスリン量に分泌後に細胞内に残ったインスリン量を加算すること算出した分泌試験前に細胞内に含有されていたインスリン量に対するインスリン分泌量の割合を百分率にて表した値（インスリン分泌％）を表す。
また、図中各カラムを結ぶ線は、それぞれのカラム間の有意差を示し、Ｎ．Ｓ．は有意差なし、★はｐ＜０．０５、★★はｐ＜０．０１、★★★はｐ＜０．００１を表す。
Claims (14)
- ［１］被験物質の存在下、膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と膵臓β細胞とを接触させたときの該細胞の細胞応答を測定する工程、［２］被験物質の非存在下、該細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質と該細胞とを接触させたときの該細胞の該細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、該細胞の該細胞応答を変化させる被験物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
- ［１］被験物質の存在下、スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞の高グルコース濃度下における細胞応答を測定する工程、［２］被験物質の非存在下、該細胞の該高グルコース濃度下における該細胞応答を測定する工程、［３］該測定値を比較し、該細胞の細胞応答を変化させる被験物質を選択する工程、を含む抗糖尿病作用を有する物質の探索方法。
- 膵臓β細胞のカリウム−ＡＴＰチャンネルの活性を阻害する物質が、スルフォニルウレア構造を有する化合物またはナテグリニドである請求項１記載の探索方法。
- 抗糖尿病作用を有する物質が、インスリン分泌促進活性を有する物質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の探索方法。
- 細胞応答が、膵臓β細胞からのインスリン分泌であって、細胞応答の変化が膵臓β細胞からのインスリンの分泌促進である請求項１〜４のいずれか１項に記載の探索方法。
- 細胞応答が、膵臓β細胞のインスリン分泌の促進に関わる細胞応答であって、細胞応答の変化が、膵臓β細胞のインスリン分泌の促進に関わる細胞応答の増加である請求項１〜４のいずれか１つに記載の探索方法。
- 細胞応答が、膵臓β細胞のインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答であって、細胞応答の変化が、膵臓β細胞のインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答の減少である請求項１〜４のいずれか１項に記載の探索方法。
- インスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、細胞膜容量、細胞内カルシウムイオン濃度、細胞膜電位、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度、またはカルシウムイオンチャンネル活性である請求項６記載の探索方法。
- インスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、細胞内カリウムイオン濃度、またはカリウムイオンチャンネル活性である請求項７記載の探索方法。
- スルフォニルウレア構造を有する化合物が、グリベンクラミドまたはトルブタミドである請求項２〜９のいずれか１項に記載の探索方法。
- スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞が、高濃度のグルコース存在下におけるインスリン分泌能力、またはインスリン分泌の促進に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞に比べ、減少している細胞である請求項２、および４〜９から選ばれるいずれか１項に記載の探索方法。
- スルフォニルウレア構造を有する化合物に脱感作した膵臓β細胞が、高濃度のグルコース存在下におけるインスリン分泌の抑制に関わる細胞応答が、親株である該化合物に脱感作していない膵臓β細胞に比べ、増大している細胞である請求項２、および４〜９から選ばれるいずれか１項に記載の探索方法。
- 膵臓β細胞がＭＩＮ６細胞である請求項１〜９のいずれか１項に記載の探索方法。
- 膵臓β細胞がＭＩＮ６細胞であり、スルフォニルウレア構造を有する化合物がグリベンクラミドまたはトルブタミドである請求項１〜９のいずれか１項に記載の探索方法。
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