技術分野
本発明は、ＡＳＫ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｋｉｎａｓｅ １）阻害物質を含む、免疫疾患の予防または治療剤、ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することを含む、免疫疾患の予防または治療方法、および免疫疾患の予防または治療用の製剤を製造するためのＡＳＫ１阻害物質の使用に関するものである。
背景技術
ＡＳＫ１はＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）ファミリーに属するキナーゼの一種であり、例えば、ヒトＡＳＫ１は１３７５個のアミノ酸により構成され（下記文献１参照）、マウスＡＳＫ１は１３７９個のアミノ酸から構成されており（下記文献２参照）、ヒトＡＳＫ１とマウスＡＳＫ１には９１．９％の極めて高い相同性が認められることが報告されている。同様に、ヒトＡＳＫ１のｃＤＮＡ（下記文献３参照）やマウスＡＳＫ１のｃＤＮＡ（下記文献２参照）が開示されている。ＭＡＰＫＫキナーゼは、ヒトを含む哺乳類から酵母に至るまで保存された細胞内シグナル伝達経路として知られているＭＡＰ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）キナーゼスーパーファミリーによるシグナル伝達カスケードに属するキナーゼであり、ＭＡＰＫＫキナーゼの下流には、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）およびＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）の２種類のキナーゼが存在する。（下記文献４〜６参照）
ＡＳＫ１は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、大腸、脳、肺を始め、ヒトの殆どの臓器に分布し、ＴＮＦ受容体を介してＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−αにより活性化され、活性化されたＡＳＫ１が当該シグナル伝達カスケードを介して細胞のアポトーシス誘導に関与していることが確認されている。また、ヒトＡＳＫ１の変異体であるドミナントネガティブ体をＪｕｒｋａｔ細胞に高発現させた場合、ＴＮＦ−αにより誘導されるアポトーシスが抑制されたことが報告されている。それ故、ＡＳＫ１が悪性腫瘍治療剤または悪性腫瘍遺伝子治療剤として有用であることが開示されている。（下記文献４及び５参照）更には、ＡＳＫ１が皮膚角化細胞において高発現していることが報告され、その分化促進に関与していることが示唆されている。（下記文献７参照）しかしながら、ＡＳＫ１が免疫疾患の発症や進展に関与していることは何ら報告されていない。
免疫疾患の発症原因の一つとして、サイトカインやケモカインの産生異常が関係していることは種々報告されている。例えば、ＩＬ−１は、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、移植拒絶反応、気管支喘息等の発症に関与し、ＩＬ−６は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性大腸炎、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病、メサンギウム増殖性腎炎等の免疫疾患の発症に関与し、ＩＬ−８は、慢性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、炎症性大腸炎、乾癬、気管支喘息等の発症に関与していることが報告されている。ＭＩＰ−３α〔別名：ＬＡＲＣ（ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）〕は、乾癬の病巣部に非常に高発現しており、またアトピー性皮膚炎患者の皮膚で顕著な増加が認められる。更に、ＭＩＰ−３αは、抗原提示細胞である未熟樹状細胞、組織指向性メモリーＴ細胞や皮膚の重要な抗原提示細胞であるランゲルハンス細胞の浸潤、遊走、常駐に関与しており、炎症性大腸炎、移植拒絶反応、気管支喘息等の発症にも関係している。ＭＩＰ−１αやＭＩＰ−１βは、Ｔｈ１細胞やマクロファージ等の遊走、浸潤に関与し、また慢性関節リウマチ、移植拒絶反応、移植片対宿主病、気管支喘息等の病態において発現しており、その病態形成に重要な役割を果たしてしていることが報告されている。（例えば、下記文献８〜２８参照）
慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎を始め、免疫疾患の患者数は年々増加している。現在、これらの患者に対しステロイド療法等が繁用されているが、症状の改善が認められないことが多く、また長期に使用した場合には糖尿病、高脂血症、骨粗鬆症、高血圧、易感染症などが認められることがあり、薬物療法上、未だ満足できるものとは言えない。それ故、目下免疫疾患に関して種々の研究が鋭意行われており、当該疾患の予防または治療剤の早期開発が大いに嘱望されている。
文献１：ＷＯ９７／４０１４３号公報記載の配列表配列番号１
文献２：口腔病学会雑誌，Ｎｏ．３，ｐ．４５（１９９８）図１
文献３：ＷＯ９７／４０１４３号公報記載の配列表配列番号２
文献４：Ｉｃｈｉｊｏ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．９０−９４（１９９７）
文献５：ＷＯ９７／４０１４３号公報
文献６：飛梅圭，口腔病学会雑誌，Ｎｏ．３，ｐｐ．４２−５２（１９９８）
文献７：Ｓａｙａｍａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．２，ｐｐ．９９９−１００４（２００１）
文献８：小野崎菊夫，サイトカイン，日本医学館，ｐｐ．９５−１０５
文献９：桑名正隆，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．８，ｐｐ．９００−９０７（２００１）
文献１０：武井修治，小児内科，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６，ｐｐ．８６１−８６５（２００１）
文献１１：戸倉新樹，日本皮膚アレルギー学会雑誌，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．４，ｐｐ，１１７−１２１（１９９７）
文献１２：うの原順一，臨床病理，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．６，ｐｐ．５８７−５９２（１９９８）
文献１３：田中泰史他，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１７４，Ｎｏ．１４，ｐｐ．１２１８−１２２２（１９９５）
文献１４：原田明久他，炎症と免疫，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２，ｐｐ．２１１−２２０（１９９４）
文献１５：杉本正道他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．４，ｐｐ．４１０−４１７（２００１）
文献１６：大谷明夫他，現代医療，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１５２７−１５３２（２００１）
文献１７：姉崎一弥他，医学のあゆみ，Ｖｏｌ．１７３，Ｎｏ．６，ｐｐ．５８８−５９２（１９９５）
文献１８：佐田誠他，ぜん息，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２，ｐｐ．３１−３５（１９９７）
文献１９：倉島一喜，現代医療，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１５１７−１５２１（２００１）
文献２０：松島綱治他，感染・炎症・免疫，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１，ｐｐ．９−１７（１９９４）
文献２１：向田直史，臨床病理，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．４，ｐｐ．３１７−３７９（１９９２）
文献２２：末延則子他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，ｐｐ．１４４−１５１（２００１）
文献２３：中山隆志他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，ｐｐ．１２６−１３４（２００１）
文献２４：石川昌他，実験医学，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１５，ｐｐ．１５０−１５６（２０００）
文献２５：稗島州雄，細胞工学，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．５，ｐｐ．７０８−７１６（２０００）
文献２６：義江修，臨床免疫，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１，ｐｐ．８６−９４（２００１）
文献２７：村井政子他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，ｐｐ．１６８−１７４（２００１）
文献２８：鈴木盛一，臨床免疫，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４，ｐｐ．５０４−５１１（２０００）
発明の開示
本発明は、免疫疾患の発症や進展に深く関与する各種サイトカインやケモカインの産生抑制作用を有する、免疫疾患の予防または治療剤を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、免疫疾患の予防または治療に有用な薬剤を見出すべく鋭意検討した結果、ＡＳＫ１が免疫疾患の発症や進展に関与し、ＡＳＫ１阻害物質が免疫疾患に有用であるという知見を得、本発明を成すに至った。
詳細に述べれば、第一に、本発明者らは、ＡＳＫ１の生理的機能を調べるため、活性型ＡＳＫ１を過剰発現した正常ヒト培養皮膚角化細胞を樹立し、各種サイトカインやケモカインの発現量を測定した。その結果、活性型ＡＳＫ１過剰発現細胞において、ＩＬ−１やＩＬ−６のサイトカイン、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＭＩＰ−３αのケモカインが高発現していることを確認した。これらの事実から、ＡＳＫ１が、免疫疾患の発症や進展に深く関係している、これらのサイトカインやケモカインの発現亢進に関与していることが判った。
また、本発明者らは、ＡＳＫ１ノックアウトマウスを後述した方法により作製した。作製したＡＳＫ１ノックアウトマウスより胎児線維芽細胞および脾臓細胞を採取し、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激により誘導されるＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１αの産生量を測定した。その結果、ＡＳＫ１ノックアウトマウスの胎児線維芽細胞および脾臓細胞においては野生型（正常）マウスの胎児線維芽細胞および脾臓細胞の場合と比較して有意にＩＬ−１、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１αの産生が抑制されていた。これら事実から、ＡＳＫ１の活性を低下させることにより、実際にサイトカインやケモカインの産生を抑制できることが判明した。それ故、以上の実験結果から、ＡＳＫ１阻害物質が各種免疫疾患の予防や治療に極めて有用であることが認められる。
更に、本発明者らは、敗血症モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験において、ＡＳＫ１ノックアウトマウスはその生存率が野生型マウスと比較して顕著に向上し、またＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいては血中ＴＮＦ−α濃度が殆ど上昇しないことを観察した。これらの事実から、ＡＳＫ１の活性を低下させることにより、敗血症の如く各種免疫疾患の病態が顕著に改善できることが判った。これらは、ＡＳＫ１阻害物質が各種免疫疾患の予防や治療に極めて有用であることが更に裏付けられたことに他ならない。
即ち、ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として含有させることにより、免疫疾患の予防または治療に有用な薬剤を提供することができる。また、ＡＳＫ１阻害物質を有効量使用することにより、免疫疾患の有用な予防または治療方法を提供することができる。
本明細書において、「＋／＋」は、マウスまたはマウス由来細胞において１対の相同染色体それぞれに存在する２ヶ所のＡＳＫ１遺伝子座が共に正常であること、即ち野生型であることを示し、「−／−」は、１対の相同染色体それぞれに存在する２ヶ所のＡＳＫ１遺伝子座の両方に変異が導入されており、ＡＳＫ１蛋白の発現がないホモ接合体、即ちＡＳＫ１がノックアウトされているマウスまたはマウス由来細胞であることを示す。
本発明において、免疫疾患とは、各種細胞の機能異常による免疫系の破綻により発症または進展する疾患をいい、例えば、慢性関節リウマチ、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、全身性硬化症、溶血性貧血、血小板減少症、好中球減少症、シェーグレン症候群、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、多発性筋炎、橋本病、バセドウ病、アジソン病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、硬直性脊髄炎、自己免疫性肝炎、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、抗糸球体基底膜病、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病、セリアック病、Ｇｒａｖｅｓ病等の自己免疫疾患、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、敗血症等のアレルギー性疾患、移植拒絶反応、移植片体宿主病（ＧＶＨＤ）等を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、特には慢性関節リウマチ、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、敗血症等のアレルギー性疾患に好適である。
本発明において、ＡＳＫ１阻害物質とは、それ自体ＡＳＫ１阻害作用を有しているものに限定されるものではなく、生体内または培養系においてＡＳＫ１阻害作用を有しているものを産生するものを含み、例えば、アミノ酸配列において１以上のアミノ酸を付加、挿入、置換および／または欠損（例えば、９６０番目のアラニン残基の欠損）させた誘導体を含む（例えば、下記文献２９参照）、ヒトＡＳＫ１に対するドミナントネガティブ体（例えば、Ｋ７０９Ｒ、Ｋ７０９Ｍ；以下、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体と称する）、ヒトＡＳＫ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドと称する）、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質（例えば、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｍｕ１−１等）、ネフ（Ｎｅｆ）、１４−３−３蛋白質、チオレドキシン、熱ショック蛋白質Ｈｓｐ７２、プロテインフォスファターゼ５（ＰＰ５）、Ａｋｔ（Ａｋｔ３等）、ＣＤＣ２５Ａなど）（例えば、下記文献３０〜３７参照）やそのセンスオリゴヌクレオチド（それらの薬理学的に許容される塩を含む）、並びにＡＳＫ１ドミナントネガティブ体またはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列を複製し、標的組織または宿主細胞内で当該ドミナントネガティブ体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる組換えベクター（以下、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターまたはＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する）、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを標的組織または宿主細胞内で発現することができる組換えベクター（以下、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターまたはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターと称する）、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞（以下、場合によりＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターにより形質転換された宿主細胞と称する）等を例示することができる。
本発明のＡＳＫ１阻害物質の使用方法としては、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体発現組換えベクター、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質発現組換えベクター、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターや、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を生体内の標的組織に適当な方法により導入し、所望のＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドを発現させることによる遺伝子的な予防または治療剤としての使用や、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質、またはＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質のセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする製剤を経口または非経口的に投与させることによる薬物的な予防または治療剤としての使用を挙げることができる。
ＡＳＫ１の７０９番目のリジン残基はＡＴＰ結合サイトであり、これをアルギニンまたはメチオニンに置換することによってキナーゼ触媒活性を不活化できるため、遺伝子的な予防または治療方法としては、ドミナントネガティブ（優性抑制型）体として機能する変異体ＡＳＫ１（Ｋ７０９Ｒ、Ｋ７０９Ｍ）をコードする塩基配列を発現ベクターに組み込み、そのベクターをリポフェクチン法やアデノウイルス感染法などにより細胞にトランスフェクションまたはインフェクションすることで、細胞内に過剰発現させることを例示することできる。このようにして形質転換されたＡＳＫ１の過剰発現細胞は、サイトカインやケモカインの産生を顕著に抑制することができる。
尚、本明細書において、特定の変異体であるドミナントネガティブ体を表す場合には、本来のアミノ酸残基（一文字表記）を最初に、位置番号を二番目に、置換された後のアミノ酸残基（一文字表記）を三番目に示し、「Ｋ７０９Ｒ」や「Ｋ７０９Ｍ」は７０９番目のアミノ酸残基であるＫ（Ｌｙｓ：リジン）がＲ（Ａｒｇ：アルギニン）またはＭ（Ｍｅｔ：メチオニン）で置換されていることを表す。
ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等を挙げることができる。
組換えベクターにおいては、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体やＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列の他に、これを実際に標的組織または宿主細胞に導入して所望の当該ドミナントネガティブ体やアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させるために、その発現を制御する塩基配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列）や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びにＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミンク肺上皮細胞（例えば、Ｍｖ１Ｌｕ）、リンパ球、線維芽細胞、血液系細胞および腫瘍細胞等の動物細胞を挙げることができる。
組換えベクターの標的組織または宿主細胞への導入方法としては、ＨＶＪリポソーム法（下記文献３８及び３９参照）、ＡＳＫ１阻害物質を注射等により直接投与する方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法（下記文献４０参照）、リポフェクション法によって投与する方法（下記文献４１参照）、ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等）を使う方法等を挙げることができる。
ＡＳＫ１阻害物質を有効成分とする製剤を実際に免疫疾患の予防または治療において用いる場合、用法に応じ種々の製剤形態のものが使用される。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤、注射剤、直腸投与剤、座剤等を挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
ＡＳＫ１阻害物質を含有するこれらの各種製剤は、上記ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として、通常用いられている賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合または希釈若しくは溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。
ＡＳＫ１阻害物質の免疫疾患に対する薬物的な予防または治療における投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度や疾患の種類等を考慮して適宜決定されるが、通常成人１日当たり約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜１００ｍｇ程度とするのがよく、１日一回または数回に分けて投与することができる。また、ＡＳＫ１阻害物質の免疫疾患に対する遺伝的な予防または治療における投与量もこれに準じて適宜決定することができる。
本発明によれば、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質またはそのセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列またはこれを含むベクター、またはそのベクターにより形質転換させた宿主細胞を用いて標的組織に導入することにより、免疫疾患の発症または進展を抑制することができる。また、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＳＫ１阻害作用を有する化学物質又はそのセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤を経口または非経口的に投与することにより、免疫疾患の発症または進展を抑制することができる。
文献２９：Ｗａｎｇ Ｘ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．３１６０７−３１６１１（１９９６）
文献３０：Ｓｓａｎｇ−Ｇｏｏ Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．１６，ｐｐ．１２７４９−１２７５５（２００１）
文献３１：Ｒｏｍａｓ Ｇｅｌｅｚｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４１０，ｐｐ．８３４−８３８（２００１）
文献３２：ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．４，ｐｐ．Ａ２３５（２００１）
文献３３：ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．９，ｐｐ．２５９６−２６０６（１９９８）
文献３４：Ｈｅｅ−Ｓａｅ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２２，ｐｐ．７７２１−７７３０（２００２）
文献３５：ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２１，ｐｐ．６０２８−６０３６（２００１）
文献３６：Ａｌｂｅｒｔ Ｈ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３，ｐｐ．８９３−９０１（２００１）
文献３７：Ｘｉａｎｇｈｏｎｇ Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１４，ｐｐ．４８１８−４８２８（２００１）
文献３８：金田，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２，ｐ．７８（１９９４）
文献３９：森下等，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１５，ｐ．１５８（１９９４）
文献４０：Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，ｐｐ．２８６−２９１（１９９２）
文献４１：Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４４，ｐ．１２８５（１９９０）
実施例
本発明の内容を以下の試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
試験例１
活性型ＡＳＫ１発現による正常ヒト培養皮膚角化細胞におけるサイトカインおよびケモカインの誘導実験
ＡＳＫ１分子のＮ末端側の活性抑制領域を欠損させ、恒常的に活性化させた分子である、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ；下記文献４２参照）を細胞に過剰発現させ、ＡＳＫ１の生理的機能を下記の方法により増幅させて検出した。まず、この活性型ＡＳＫ１を組み込んだアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＡＳＫ１−ΔＮ）を作製し、アデノウイルス法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に活性型ＡＳＫ１を過剰発現させた。すなわち、組換えウイルスをｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）５程度の効率で３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの正常ヒト培養皮膚角化細胞に感染させた後、細胞および培養上清５ｍＬを回収した。下記の如く、各種サイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡ発現量の増加をＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法を用いて定量し、また実際の蛋白質発現量として培養上清中に放出された蛋白質濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。コントロールとして、無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼを発現させた細胞と比較した。尚、刺激に対してｍＲＮＡ量が変化しない遺伝子であるＧＡＰＤＨをネガティブコントロールとして用いた。
１）ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法
目的とするｍＲＮＡに対する特異的なラジオアイソトープ標識プローブを用い、エンドヌクレアーゼに耐性である相補的２本鎖オリゴヌクレオチドのみをサンプル内に残存させ、ポリアクリルアミド電気泳動によって分離後、ｍＲＮＡ発現量を高感度に検出し（バンドとして検出できる）、その増加量を定量した。
２）ＥＬＩＳＡ法
目的とする蛋白質に特異的な抗体（２種類の抗体を用い、片側はビオチン標識抗体を使用した）を用いて、ビオチン・アビジン法により、蛋白質の発現量を微量定量した。
その結果を、各種サイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡの発現量については第１図に示し、各種蛋白質の発現量については、それぞれ第２図（ＩＬ−８）、第３図（ＭＩＰ−１α）、第４図（ＭＩＰ−１β）、第５図（ＭＩＰ−３α）に示した。これらの図は、ＡＳＫ１の活性化によって、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βなどのサイトカイン、およびＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３αなどのケモカインのｍＲＮＡまたは各種蛋白質の発現が誘導されることを示している。
文献４２：ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．９，ｐｐ．２５９６−２６０６（１９９８）
試験例２
ＡＳＫ１ノックアウトマウスの作製
１２９／ＳｖＪマウスの染色体（ジェノミック）ＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）から、ＡＳＫ１の第１エクソンを含む幾つかの染色体ＤＮＡ断片をクローン化した。そのうちの一つのクローンを用いて、第１エクソンより上流１０ｋｂ及び下流２ｋｂを相同組換え領域とし、第１エクソン及び隣接するイントロン領域を、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）とポジティブセレクション用のネオマイシン耐性遺伝子とに置換したターゲッティングベクターを構築した。ターゲッティングベクターには、ネガティブセレクション用のＤＴ−Ａ（ジフテリアトキシンα鎖）を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を用いた。ターゲッティングベクターは、エレクトロポーレーション法によってＪ１ ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に導入した。ネオマイシン耐性のＥＳ細胞コロニーを選択した後、更にサザンブロット法により相同組換え細胞の確認を行った。ヘテロ接合変異体ＥＳ細胞は、マイクロインジェクション法によりＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞に導入した。生まれてきたキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの戻し交配によって、Ｆ１（第１世代）ヘテロ接合体マウスが得られた。遺伝子変異が生殖細胞に導入されているか否かをサザンブロット法により確認した後、それらＦ１ヘテロ接合体マウス同士の掛け合わせから、ＡＳＫ１のホモ接合体であるＡＳＫ１ノックアウトマウスを樹立した。
試験例３
ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞での各種サイトカインおよびケモカイン発現量の低下
ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＭＥＦｓ）および脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激による、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６およびケモカインＭＩＰ−１αの発現誘導にＡＳＫ１が関与しているか否かについて検討を行った。胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）については、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した細胞に、１０μｇ／ｍＬのＬＰＳを約０．５ｍＬの培地に添加後、６、１２、２４時間での培養上清中へのＩＬ−６蛋白質の分泌量の時間的変化を測定した。同時に、２４時間後でのＬＰＳ（０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）に対する用量依存性についても測定した。また、脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）については、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した細胞に、１０μｇ／ｍＬのＬＰＳを約０．５ｍＬの培地に添加することによってＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１αの発現を誘導し、ＬＰＳ刺激後、６、１２、２４時間後の培養上清中のＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１α蛋白質の分泌量を測定した。それぞれのサイトカインおよびケモカインの発現量は、試験例１と同様に、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。
第６図及び第７図に胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）での結果を、第８図、第９図及び第１０図に脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）での結果を示した。ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）では、ＩＬ−６蛋白質の発現量が、時間的にも（第６図）、ＬＰＳの用量依存的にも（第７図）、劇的に減少していることが確認された。また、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）では、ＩＬ−１β（第８図）、ＩＬ−６（第９図）およびＭＩＰ−１α（第１０図）のそれぞれの蛋白質の発現量が、いずれも劇的に減少していることが確認された。すなわち、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞において、広範な病態に関わる重要なサイトカインである、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびケモカインであるＭＩＰ−１α等のＬＰＳ刺激による発現量が、それぞれ、劇的に減少することが判明した。これらの実験結果は、ＡＳＫ１の活性阻害が実際にサイトカインおよびケモカイン産生を抑制し、ＡＳＫ１阻害物質が各種免疫疾患に有用であることを明確に証明するものである。
試験例４
敗血症モデルに対するＡＳＫ１ノックアウトマウスの耐性
敗血症モデルに対するＡＳＫ１ノックアウトマウス及び野生型マウスそれぞれの生存率を比較した。敗血症は、ＬＰＳを１８．７ｍｇ／ｋｇ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔの用量でマウス腹腔に注射することで惹起した。敗血症においてはサイトカインの急激な上昇が観察され、それがその後のショック死の原因となることが分かっている。従って、惹起２時間後の血中ＴＮＦ−α濃度を測定し、その後、経時的に個体の生存率を観察した。尚、ノックアウトマウス及び野生型マウスはそれぞれ１０匹用いた。
第１１図に個体の生存率の経時的変化を、第１２図に惹起２時間後の血中ＴＮＦ−α濃度を、それぞれＡＳＫ１ノックアウトマウス及び野生型マウスとで比較して示した。ＡＳＫ１ノックアウトマウスにおいては、血中ＴＮＦ−α濃度の上昇は殆ど見られず（第１２図）、生存率も著しく向上していた（第１１図）。これらの結果は、ＡＳＫ１の活性阻害が、敗血症のような病態改善に顕著に有効であることを示している。
産業上の利用可能性
本発明は、ＡＳＫ１阻害物質を有効成分として使用した免疫疾患の予防または治療に関するものである。本発明により、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性大腸炎、多発性硬化症、血小板減少症、シェーグレン症候群、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、敗血症等の各種免疫疾患の予防または治療剤或いは予防または治療方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルス法により過剰発現させた場合の正常ヒト培養皮膚角化細胞における各種サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β）、各種ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−１β）及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量の増加を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法を用いて定量した図である。縦軸には、検出した遺伝子名、すなわち各種サイトカインおよびケモカインの名称、ならびにネガティブコントロールとしてのＧＡＰＤＨを示し、横軸は群名を示す。
第２図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＩＬ−８の実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−８の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第３図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＭＩＰ−１αの実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−１αの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第４図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＭＩＰ−１βの実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−１βの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第５図は、活性型ＡＳＫ１（ＡＳＫ１−ΔＮ）をアデノウイルスベクター法により正常ヒト培養皮膚角化細胞に過剰発現させた場合の、ＭＩＰ−３αの実際の蛋白質発現量を、コントロール（無処理細胞、および活性型ＡＳＫ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現させた細胞）と比較して、ＥＬＩＳＡ法により定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−３αの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第６図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞として、胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１−／−；白棒）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１＋／＋；黒棒）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−６蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第７図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来細胞として、胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６蛋白質の発現量について、ＬＰＳに対する用量依存性を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１−／−；白棒）と野生型ＭＥＦｓ細胞（ＡＳＫ１＋／＋；黒棒）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−６蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸はＬＰＳの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第８図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−１β蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１−／−；白丸）と野生型のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−１β蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第９図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１−／−；白丸）と野生型のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＩＬ−６蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第１０図は、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を用いて、ＬＰＳ刺激によるＭＩＰ−１α蛋白質の発現量について、その時間的変化を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス由来のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１−／−；白丸）と野生型のｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）につき、ＥＬＩＳＡ法により比較定量したグラフである。縦軸は培養上清中に分泌されたＭＩＰ−１α蛋白質の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。
第１１図は、敗血症モデルに対するＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ１−／−；白丸）及び野生型マウス（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）それぞれについての生存率を経時的に比較したグラフである。縦軸は生存率（％）を示し、横軸は群名を示す。
第１２図は、敗血症モデルにおけるＬＰＳ惹起２時間後の血中ＴＮＦ−α濃度を、ＡＳＫ１ノックアウトマウス（ＡＳＫ１−／−；白丸）及び野生型マウス（ＡＳＫ１＋／＋；黒丸）で比較したグラフである。縦軸は血中ＴＮＦ−α濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は群名を示す。尚、エラー・バーは標準偏差を表す。Technical field
The present invention relates to a preventive or therapeutic agent for immune diseases, comprising an ASK1 (Apoptosis Signal-regulating Kinase 1) inhibitor, a method for preventing or treating an immune disease, comprising using an effective amount of the ASK1 inhibitor, and an immune disease It relates to the use of an ASK1 inhibitor for the preparation of a prophylactic or therapeutic preparation.
Background art
ASK1 is a kind of kinase belonging to the MAPKK kinase (MAPKKKK) family. For example, human ASK1 is composed of 1375 amino acids (see Reference 1 below), and mouse ASK1 is composed of 1379 amino acids (see References below). 2), it has been reported that human ASK1 and mouse ASK1 have an extremely high homology of 91.9%. Similarly, cDNA of human ASK1 (see the following literature 3) and mouse ASK1 cDNA (see the following literature 2) are disclosed. MAPKK kinase is a kinase belonging to a signal transduction cascade by a MAP (Mitogen-activated Protein) kinase superfamily known as an intracellular signal transduction pathway conserved from mammals including humans to yeast, and downstream of MAPKK kinase. There are two types of kinases, MAPK kinase (MAPKK) and MAP kinase (MAPK). (See References 4-6 below)
ASK1 is distributed in most human organs including heart, kidney, liver, pancreas, large intestine, brain and lung, and is activated and activated by TNF (tumor necrosis factor) -α through the TNF receptor. It has been confirmed that ASK1 is involved in the induction of apoptosis of cells through the signal transduction cascade. In addition, it has been reported that when a dominant negative that is a mutant of human ASK1 is highly expressed in Jurkat cells, apoptosis induced by TNF-α is suppressed. Therefore, it is disclosed that ASK1 is useful as a malignant tumor therapeutic agent or a malignant tumor gene therapeutic agent. (Refer to References 4 and 5 below) Furthermore, it has been reported that ASK1 is highly expressed in skin keratinocytes, suggesting that it is involved in promoting its differentiation. However, it has not been reported at all that ASK1 is involved in the onset and development of immune diseases.
It has been reported variously that abnormal production of cytokines and chemokines is involved as one of the causes of immune diseases. For example, IL-1 is involved in the development of rheumatoid arthritis, type I diabetes, systemic lupus erythematosus, inflammatory colitis, atopic dermatitis, psoriasis, transplant rejection, bronchial asthma, etc., and IL-6 is chronic Involved in the development of immune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, inflammatory colitis, Castleman's disease, mesangial proliferative nephritis, IL-8 is rheumatoid arthritis, atopic dermatitis, inflammatory bowel disease, psoriasis, It has been reported to be involved in the development of bronchial asthma and the like. MIP-3α (also known as LARC (liver and activation-regulated chemokine)) is very highly expressed in the lesions of psoriasis, and a marked increase is observed in the skin of patients with atopic dermatitis. Furthermore, MIP-3α is involved in the invasion, migration, and residence of immature dendritic cells that are antigen-presenting cells, tissue-oriented memory T cells, and Langerhans cells that are important antigen-presenting cells of the skin. It is also related to the onset of inflammation, transplant rejection, bronchial asthma and the like. MIP-1α and MIP-1β are involved in migration and invasion of Th1 cells and macrophages, and are expressed in pathological conditions such as rheumatoid arthritis, transplant rejection, graft-versus-host disease, and bronchial asthma. It has been reported that it plays an important role in formation. (For example, see Documents 8 to 28 below)
The number of patients with immune diseases is increasing year by year, including rheumatoid arthritis, type I diabetes, systemic lupus erythematosus, psoriasis, inflammatory bowel disease, bronchial asthma, and atopic dermatitis. Currently, steroid therapy is frequently used for these patients, but symptoms are often not improved, and when used for a long time, diabetes, hyperlipidemia, osteoporosis, hypertension, easy infection Symptoms etc. may be recognized, and it cannot be said that the drug therapy is satisfactory yet. Therefore, various studies are currently being conducted on immune diseases, and the early development of preventive or therapeutic agents for the diseases is highly desired.
Reference 1: Sequence Listing SEQ ID NO: 1 described in WO97 / 40143
Reference 2: Journal of Stomatological Society, No. 3, p. 45 (1998) FIG.
Reference 3: Sequence Listing SEQ ID NO: 2 described in WO97 / 40143
Reference 4: Ichijo H. et al. , Science, Vol. 275, pp. 90-94 (1997)
Reference 5: WO97 / 40143
Reference 6: Tomei Ume, Journal of Stomatology Society, No. 3, pp. 42-52 (1998)
Reference 7: Sayama K.M. et al. , Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, no. 2, pp. 999-1004 (2001)
Reference 8: Kikuo Onozaki, Cytokine, Nippon Medical Museum, pp. 95-105
Reference 9: Masataka Kuwana, Molecular Medicine, Vol. 38, no. 8, pp. 900-907 (2001)
Reference 10: Shuji Takei, Pediatric Internal Medicine, Vol. 33, no. 6, pp. 861-865 (2001)
Reference 11: Shinki Tokura, Journal of Japanese Society of Dermatology, Vol. 5, no. 4, pp, 117-121 (1997)
Reference 12: Junichi Unohara, Clinical Pathology, Vol. 46, no. 6, pp. 587-592 (1998)
Reference 13: Yasushi Tanaka et al., History of Medicine, Vol. 174, no. 14, pp. 1218-1222 (1995)
Reference 14: Akihisa Harada et al., Inflammation and immunity, Vol. 2, no. 2, pp. 211-220 (1994)
Reference 15: Masamichi Sugimoto et al., Molecular Medicine, Vol. 38, no. 4, pp. 410-417 (2001)
Reference 16: Akio Otani et al., Contemporary Medicine, Vol. 33, no. 6, pp. 1527-1532 (2001)
Reference 17: Kazuya Anesaki et al., History of Medicine, Vol. 173, No. 6, pp. 588-592 (1995)
Reference 18: Makoto Sada et al., Asthma, Vol. 10, no. 2, pp. 31-35 (1997)
Reference 19: Kazuaki Kurashima, Contemporary Medicine, Vol. 33, no. 6, pp. 1517-1521 (2001)
Reference 20: Tsunaharu Matsushima et al., Infection, inflammation, immunity, Vol. 24, no. 1, pp. 9-17 (1994)
Reference 21: Naofumi Mukai, Clinical Pathology, Vol. 40, no. 4, pp. 317-379 (1992)
Reference 22: Noriko Suenono et al., Molecular Medicine, Vol. 38, no. 2, pp. 144-151 (2001)
Reference 23: Takashi Nakayama et al., Molecular Medicine, Vol. 38, no. 2, pp. 126-134 (2001)
Reference 24: Masashi Ishikawa et al., Experimental Medicine, Vol. 18, no. 15, pp. 150-156 (2000)
Reference 25: Kazuo Hatajima, Cell Engineering, Vol. 19, no. 5, pp. 708-716 (2000)
Reference 26: Osamu Yoshie, Clinical Immunity, Vol. 35, no. 1, pp. 86-94 (2001)
Reference 27: Masako Murai et al., Molecular Medicine, Vol. 38, no. 2, pp. 168-174 (2001)
Reference 28: Seiichi Suzuki, Clinical Immunity, Vol. 34, no. 4, pp. 504-511 (2000)
Disclosure of the invention
The present invention provides a preventive or therapeutic agent for immune diseases having an action of suppressing production of various cytokines and chemokines that are deeply involved in the onset and development of immune diseases.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As a result of intensive studies to find a drug useful for prevention or treatment of immune diseases, the present inventors obtained knowledge that ASK1 is involved in the onset and progression of immune diseases, and that ASK1 inhibitors are useful for immune diseases. The present invention has been achieved.
Specifically, first, in order to examine the physiological function of ASK1, the present inventors established normal human cultured skin keratinocytes overexpressing active ASK1, and determined the expression levels of various cytokines and chemokines. It was measured. As a result, it was confirmed that IL-1 and IL-6 cytokines, IL-8, MIP-1α, MIP-1β and MIP-3α chemokines were highly expressed in activated ASK1 overexpressing cells. From these facts, it was found that ASK1 is involved in the increased expression of these cytokines and chemokines, which are closely related to the onset and progress of immune diseases.
In addition, the present inventors produced ASK1 knockout mice by the method described later. Fetal fibroblasts and spleen cells were collected from the prepared ASK1 knockout mice, and the production amounts of IL-1, IL-6 and MIP-1α induced by LPS (lipopolysaccharide) stimulation were measured. As a result, in the fetal fibroblasts and spleen cells of ASK1 knockout mice, IL-1, IL-6 and MIP-1α were significantly different from those of wild-type (normal) mouse fetal fibroblasts and spleen cells. Production was suppressed. From these facts, it was found that the production of cytokines and chemokines can actually be suppressed by reducing the activity of ASK1. Therefore, from the above experimental results, it is recognized that the ASK1 inhibitor is extremely useful for the prevention and treatment of various immune diseases.
Furthermore, the present inventors have shown that in an in vivo test using a sepsis model, the survival rate of ASK1 knockout mice is significantly improved compared to wild-type mice, and the blood TNF-α concentration in ASK1 knockout mice Was observed to rise little. From these facts, it was found that the pathology of various immune diseases such as sepsis can be remarkably improved by reducing the activity of ASK1. These are none other than the fact that ASK1 inhibitors are extremely useful for the prevention and treatment of various immune diseases.
That is, by containing an ASK1 inhibitor as an active ingredient, a drug useful for prevention or treatment of immune diseases can be provided. In addition, by using an effective amount of an ASK1 inhibitor, a useful method for preventing or treating immune diseases can be provided.
In the present specification, “+ / +” indicates that the two ASK1 loci present in each of a pair of homologous chromosomes in a mouse or a mouse-derived cell are both normal, that is, wild-type. “− / −” Means a homozygote in which mutations are introduced into both of the two ASK1 loci present in each of a pair of homologous chromosomes and no ASK1 protein is expressed, ie, a mouse in which ASK1 is knocked out or It shows that it is a mouse-derived cell.
In the present invention, an immune disease refers to a disease that develops or develops due to a failure of the immune system due to abnormal functions of various cells, such as rheumatoid arthritis, type I (insulin-dependent) diabetes, systemic lupus erythematosus (SLE), Psoriasis, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, systemic sclerosis, hemolytic anemia, thrombocytopenia, neutropenia, Sjogren's syndrome, IgA nephropathy, lupus nephritis, mesangial proliferative nephritis, polymyositis, Hashimoto's disease, Graves' disease, Addison's disease, primary biliary cirrhosis (PBC), ankylosing myelitis, autoimmune hepatitis, pemphigus vulgaris, myasthenia gravis, antiglomerular basement membrane disease, Castleman's disease, celiac disease , Autoimmune diseases such as Graves' disease, bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, urticaria, anaphylaxis, sepsis, etc. Patient, and the like transplant rejection, graft versus host disease (GVHD). The pharmaceutical composition of the present invention is particularly useful for rheumatoid arthritis, type I (insulin-dependent) diabetes, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, thrombocytopenia, Sjogren's syndrome, etc. Suitable for allergic diseases such as autoimmune diseases, bronchial asthma, atopic dermatitis and sepsis.
In the present invention, the ASK1 inhibitor is not limited to those having ASK1 inhibitory activity per se, but includes those that produce substances having ASK1 inhibitory activity in vivo or in culture systems. Including, for example, a derivative in which one or more amino acids are added, inserted, substituted and / or deleted (eg, deletion of the 960th alanine residue) in the amino acid sequence (see, for example, the following document 29), a dominant against human ASK1 Negative body (for example, K709R, K709M; hereinafter referred to as ASK1 dominant negative body), antisense oligonucleotide for human ASK1 (hereinafter referred to as ASK1 antisense oligonucleotide), chemical substance having ASK1 inhibitory action (for example, glutathione S -Transferase (M u1-1 etc.), Nef (Nef), 14-3-3 protein, thioredoxin, heat shock protein Hsp72, protein phosphatase 5 (PP5), Akt (Akt3 etc.), CDC25A etc.) (for example, refer to the following documents 30 to 37) ) And its sense oligonucleotides (including pharmacologically acceptable salts thereof), and the nucleotide sequence encoding ASK1 dominant negative or ASK1 antisense oligonucleotide, and the dominant in the target tissue or host cell. Recombinant vector capable of expressing negative or antisense oligonucleotide (hereinafter referred to as ASK1 dominant negative expression recombinant vector or ASK1 antisense oligonucleotide expression recombinant vector), having ASK1 inhibitory action Recombinant vector capable of expressing chemical substance or sense oligonucleotide thereof in target tissue or host cell (hereinafter referred to as chemical substance expression recombinant vector having ASK1 inhibitory action or sense oligonucleotide expression of chemical substance having ASK1 inhibitory action) Referred to as recombinant vectors), host cells transformed with these recombinant vectors (hereinafter, host cells transformed with ASK1 dominant negative expression recombinant vectors, ASK1 antisense oligonucleotide expression recombinant vectors) Transformation with a transformed host cell, a host cell transformed with a chemical expression recombinant vector having ASK1 inhibitory action, or a sense oligonucleotide expression recombinant vector with a chemical substance having ASK1 inhibitory action It has been referred to as the host cell), or the like can be exemplified.
The method of using the ASK1 inhibitory substance of the present invention includes an ASK1 dominant negative expression recombinant vector, an ASK1 antisense oligonucleotide expression recombinant vector, a chemical substance expression recombinant vector having an ASK1 inhibitory action, or a chemistry having an ASK1 inhibitory action. Sense oligonucleotide expression recombinant vectors of substances and host cells transformed with these recombinant vectors are introduced into a target tissue in vivo by an appropriate method, and the desired ASK1 dominant negative form, ASK1 antisense nucleotide, ASK1 Use as a genetic preventive or therapeutic agent by expressing an inhibitory chemical or its sense oligonucleotide, ASK1 dominant negative, ASK1 antisense oligonucleotide, ASK Mention may be made of the use as a pharmaceutical preventive or therapeutic agent by orally or parenterally administering a chemical substance having an inhibitory action or a preparation comprising a sense oligonucleotide of a chemical substance having an ASK1 inhibitory action as an active ingredient it can.
The 709th lysine residue of ASK1 is an ATP binding site, and its kinase catalytic activity can be inactivated by substituting it with arginine or methionine. Therefore, as a genetic prevention or treatment method, dominant negative (dominant suppression type) ) Incorporating the nucleotide sequence encoding mutant ASK1 (K709R, K709M) that functions as a body into an expression vector, and transfecting or infecting the cell with the lipofectin method or adenovirus infection method, etc. The expression can be exemplified. The overexpressed cells of ASK1 thus transformed can remarkably suppress the production of cytokines and chemokines.
In addition, in this specification, when expressing the dominant negative body which is a specific variant, the original amino acid residue (single-letter code) is the first, the position number is the second, and the amino acid residue after the substitution (Single letter notation) is shown third, in which “K709R” or “K709M” is the 709th amino acid residue K (Lys: lysine) substituted with R (Arg: arginine) or M (Met: methionine) Represents that
Examples of the vector include a plasmid vector, a virus vector (for example, a retrovirus vector, an adenovirus vector, a herpes virus vector, a Sendai virus vector, a vaccinia virus vector), a liposome vector (for example, a cationic liposome vector) and the like.
In the recombinant vector, in addition to the base sequence encoding ASK1 dominant negative or ASK1 antisense oligonucleotide, this is actually introduced into the target tissue or host cell to obtain the desired dominant negative or antisense oligonucleotide. In order to express, a base sequence (for example, promoter sequence, terminator sequence, enhancer sequence) that controls the expression, or a genetic marker for selecting a microorganism, insect cell or animal cultured cell (for example, neomycin resistance gene, kanamycin resistance) Gene) and the like.
Examples of host cells include E. coli, yeast, insect cells, and animal cells such as CHO cells, COS cells, mink lung epithelial cells (eg, Mv1Lu), lymphocytes, fibroblasts, blood cells and tumor cells. be able to.
Methods for introducing a recombinant vector into a target tissue or host cell include the HVJ liposome method (see the following documents 38 and 39), a method in which an ASK1 inhibitor is directly administered by injection, the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, the electroporation method, and the like. , Method using gene gun (see reference 40 below), administration method by lipofection method (see reference 41 below), vector (eg retrovirus vector, adenovirus vector, herpes virus vector, vaccinia virus vector, etc.) The method etc. can be mentioned.
When a preparation containing an ASK1 inhibitor as an active ingredient is actually used in the prevention or treatment of immune diseases, various preparation forms are used depending on the usage. Examples of the dosage form include tablets, capsules, granules, powders, pills, fine granules, troches, injections, rectal administration, suppositories and the like, and are administered orally or parenterally. Is done.
These various preparations containing an ASK1 inhibitor include the above-mentioned ASK1 inhibitor as an active ingredient, and commonly used excipients, disintegrants, binders, lubricants, diluents, buffers, and isotonic agents. It can be produced by mixing or diluting or dissolving with pharmaceutical additives such as preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, etc., as appropriate, and dispensing according to conventional methods.
The dose of an ASK1 inhibitor in the pharmacological prevention or treatment of immune diseases is appropriately determined in consideration of the usage, patient age, sex, symptom level, disease type, etc. .1 to 500 mg, preferably about 0.5 to 100 mg, and can be administered once or several times a day. In addition, the dose of ASK1 inhibitor in genetic prevention or treatment for immune diseases can also be determined accordingly.
According to the present invention, an ASK1 dominant negative body, an ASK1 antisense oligonucleotide, a chemical substance having an ASK1 inhibitory activity or a nucleotide sequence encoding the sense oligonucleotide, a vector containing the same, or a host cell transformed with the vector Introducing into the target tissue using can suppress the onset or progression of immune diseases. In addition, the onset or progression of immune diseases can be suppressed by orally or parenterally administering an ASK1 dominant negative, ASK1 antisense oligonucleotide, a chemical substance having an ASK1 inhibitory activity or a sense oligonucleotide thereof. Can do.
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Example
The content of the present invention will be described in more detail by the following test examples, but the present invention is not limited to the content.
Test example 1
Cytokine and chemokine induction experiment in normal human cultured skin keratinocytes by active ASK1 expression
An overactive expression of active ASK1 (ASK1-ΔN; see reference 42 below), which is a molecule that has been permanently activated by deleting the NSK terminal activity suppression region of the ASK1 molecule, causes physiological functions of ASK1 Was amplified and detected by the following method. First, an adenovirus vector (Ad-ASK1-ΔN) in which this active ASK1 was incorporated was prepared, and the active ASK1 was overexpressed in normal human cultured skin keratinocytes by the adenovirus method. That is, the recombinant virus is m. o. i. (Multiplicity of effect) 3 × 10 with an efficiency of about 5 6 After infecting cells / well normal human cultured skin keratinocytes, 5 mL of cells and culture supernatant were collected. As described below, the increase in mRNA expression level of various cytokines and chemokines was quantified using the RNase protection assay, and the protein concentration released into the culture supernatant as the actual protein expression level was quantified using the ELISA method. . As a control, comparison was made with untreated cells and cells expressing β-galactosidase instead of active ASK1. GAPDH, which is a gene whose mRNA amount does not change with stimulation, was used as a negative control.
1) RNase protection assay
Using a specific radioisotope-labeled probe for the target mRNA, leave only the complementary double-stranded oligonucleotide resistant to endonuclease in the sample, and after separating by polyacrylamide electrophoresis, mRNA expression level is highly sensitive The amount of increase was quantified.
2) ELISA method
Using an antibody specific for the target protein (two types of antibodies, one side using a biotin-labeled antibody), the amount of protein expressed was quantified by the biotin-avidin method.
The results are shown in FIG. 1 for the expression levels of various cytokines and chemokine mRNAs, and the expression levels of various proteins are shown in FIGS. 2 (IL-8), 3 (MIP-1α), and 4 respectively. This is shown in FIG. (MIP-1β) and FIG. 5 (MIP-3α). In these figures, activation of ASK1 induces the expression of cytokines such as IL-1α and IL-1β and chemokine mRNAs such as IL-8, MIP-1α, MIP-1β and MIP-3α or various proteins. It is shown that.
Reference 42: EMBO Journal, Vol. 17, no. 9, pp. 2596-2606 (1998)
Test example 2
Generation of ASK1 knockout mice
Several chromosomal DNA fragments containing the first exon of ASK1 were cloned from a 129 / SvJ mouse chromosomal (genomic) DNA library (Strategene). Using one of these clones, 10 kb upstream and 2 kb downstream of the first exon are homologous recombination regions, the first exon and the adjacent intron region are GFP (green fluorescence protein) and a neomycin resistance gene for positive selection. A targeting vector substituted with was constructed. As a targeting vector, pBluescript SK (Strategene) containing DT-A (diphtheria toxin α chain) for negative selection was used. The targeting vector was introduced into J1 ES cells (embryonic stem cells) by electroporation. After selecting neomycin-resistant ES cell colonies, homologous recombination cells were further confirmed by Southern blotting. Heterozygous mutant ES cells were introduced into C57BL / 6J blastocysts by microinjection. F1 (first generation) heterozygous mice were obtained by backcrossing the born chimeric mice with C57BL / 6J mice. After confirming whether the gene mutation was introduced into germ cells by Southern blotting, ASK1 knockout mice that were homozygous for ASK1 were established from crossing these F1 heterozygous mice.
Test example 3
Decreased expression levels of various cytokines and chemokines in ASK1 knockout mouse-derived cells
ASK1 knockout mouse-derived embryonic fibroblasts (MEFs) and spleen cells (splenocytes) were used to induce the expression of inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and chemokine MIP-1α by LPS stimulation Whether or not is involved. For fetal fibroblasts (MEFs), 1 × 10 5 Time for secretion of IL-6 protein into the culture supernatant at 6, 12, and 24 hours after adding 10 μg / mL LPS to about 0.5 mL medium to cells seeded at a cell / well concentration Changes were measured. At the same time, the dose dependence on LPS (0.1, 1, 10 μg / mL) after 24 hours was also measured. In addition, for spleen cells, 1 × 10 5 Expression of IL-1β, IL-6, and MIP-1α is induced by adding 10 μg / mL LPS to about 0.5 mL of the cells seeded at a concentration of cells / well. , 12 and 24 hours later, the secretion amounts of IL-1β, IL-6 and MIP-1α protein in the culture supernatant were measured. The expression levels of each cytokine and chemokine were quantified using the ELISA method in the same manner as in Test Example 1.
The results with fetal fibroblasts (MEFs) are shown in FIGS. 6 and 7, and the results with spleen cells (splenocytes) are shown in FIGS. In embryonic fibroblasts (MEFs) derived from ASK1 knockout mice, the expression level of IL-6 protein decreased dramatically both temporally (Fig. 6) and LPS dose-dependently (Fig. 7). It was confirmed that In addition, in spleen cells derived from ASK1 knockout mice, the expression levels of the respective proteins of IL-1β (FIG. 8), IL-6 (FIG. 9) and MIP-1α (FIG. 10) Was also confirmed to decrease dramatically. That is, in the ASK1 knockout mouse-derived cells, the expression levels by LPS stimulation such as IL-1β, IL-6, and chemokine MIP-1α, which are important cytokines related to a wide range of pathological conditions, are dramatically decreased. Turned out to be. These experimental results clearly demonstrate that inhibition of ASK1 activity actually suppresses cytokine and chemokine production, and that ASK1 inhibitors are useful in various immune diseases.
Test example 4
Resistance of ASK1 knockout mice to a sepsis model
The survival rates of ASK1 knockout mice and wild type mice for the sepsis model were compared. Sepsis was induced by injecting LPS into the peritoneal cavity of mice at a dose of 18.7 mg / kg body weight. In sepsis, a rapid increase in cytokines has been observed, which has been shown to cause subsequent shock death. Accordingly, the blood TNF-α concentration was measured 2 hours after the induction, and then the survival rate of the individual was observed over time. Ten knockout mice and 10 wild type mice were used.
FIG. 11 shows the change over time in the survival rate of individuals, and FIG. 12 shows the blood TNF-α concentration 2 hours after induction, compared with ASK1 knockout mice and wild type mice, respectively. In the ASK1 knockout mice, the blood TNF-α concentration was hardly increased (FIG. 12), and the survival rate was remarkably improved (FIG. 11). These results indicate that inhibition of ASK1 activity is significantly effective in improving pathological conditions such as sepsis.
Industrial applicability
The present invention relates to prevention or treatment of immune diseases using an ASK1 inhibitor as an active ingredient. According to the present invention, various immune diseases such as rheumatoid arthritis, type I diabetes, systemic lupus erythematosus, psoriasis, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, thrombocytopenia, Sjogren's syndrome, bronchial asthma, atopic dermatitis, sepsis, etc. A prophylactic or therapeutic agent or a prophylactic or therapeutic method can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows various cytokines (IL-1α, IL-1β) and various chemokines (IL-8) in normal human cultured skin keratinocytes when active ASK1 (ASK1-ΔN) is overexpressed by the adenovirus method. , MIP-3α, MIP-1β) and GAPDH mRNA expression levels were compared with control (untreated cells and cells expressing β-galactosidase (β-Gal) instead of active ASK1). , Quantified using RNase protection assay. The vertical axis shows the names of detected genes, that is, the names of various cytokines and chemokines, and GAPDH as a negative control, and the horizontal axis shows the group name.
FIG. 2 shows the actual protein expression level of IL-8 when activated ASK1 (ASK1-ΔN) is overexpressed in normal human cultured skin keratinocytes by the adenovirus vector method. And a cell in which β-galactosidase (β-Gal) is expressed instead of active ASK1), is a graph quantified by ELISA. The vertical axis represents the concentration of IL-8 secreted into the culture supernatant (pg / mL), and the horizontal axis represents the group name. Error bars represent standard deviation.
FIG. 3 shows the actual protein expression level of MIP-1α when activated ASK1 (ASK1-ΔN) is overexpressed in normal human cultured skin keratinocytes by the adenovirus vector method. And a cell in which β-galactosidase (β-Gal) is expressed instead of active ASK1), is a graph quantified by ELISA. The vertical axis indicates the concentration (pg / mL) of MIP-1α secreted into the culture supernatant, and the horizontal axis indicates the group name. Error bars represent standard deviation.
FIG. 4 shows the actual protein expression level of MIP-1β when activated ASK1 (ASK1-ΔN) is overexpressed in normal human cultured skin keratinocytes by the adenovirus vector method. And a cell in which β-galactosidase (β-Gal) is expressed instead of active ASK1), is a graph quantified by the ELISA method. The vertical axis represents the concentration (pg / mL) of MIP-1β secreted into the culture supernatant, and the horizontal axis represents the group name. Error bars represent standard deviation.
FIG. 5 shows the actual protein expression level of MIP-3α when activated ASK1 (ASK1-ΔN) is overexpressed in normal human cultured skin keratinocytes by the adenovirus vector method. And a cell in which β-galactosidase (β-Gal) is expressed instead of active ASK1), is a graph quantified by ELISA. The vertical axis indicates the concentration (pg / mL) of MIP-3α secreted into the culture supernatant, and the horizontal axis indicates the group name. Error bars represent standard deviation.
FIG. 6 shows the temporal change in the expression level of IL-6 protein induced by LPS using fetal fibroblasts (MEFs) as cells derived from ASK1 knockout mice. MEFs cells derived from ASK1 knockout mice (ASK1) -/-; White bars) and wild-type MEFs cells (ASK1 + / +; black bars) are comparatively quantified by ELISA. The vertical axis indicates the concentration (pg / mL) of the IL-6 protein secreted into the culture supernatant, and the horizontal axis indicates time (hour). Error bars represent standard deviation.
FIG. 7 shows the dose dependency of LPS on the expression level of IL-6 protein by LPS stimulation using fetal fibroblasts (MEFs) as cells derived from ASK1 knockout mice. MEFs cells derived from ASK1 knockout mice ( ASK1-/-; white bars) and wild-type MEFs cells (ASK1 + / +; black bars) are graphs comparatively quantified by ELISA. The vertical axis represents the concentration of IL-6 protein secreted into the culture supernatant (pg / mL), and the horizontal axis represents the concentration of LPS (μg / mL). Error bars represent standard deviation.
FIG. 8 shows the temporal change in the expression level of IL-1β protein induced by LPS using spleen cells derived from ASK1 knockout mice (splenocytes), and Splenocytos (ASK1 − / −; white circles derived from ASK1 knockout mice). ) And wild-type splenocytes (ASK1 + / +; black circles) are comparatively quantified by ELISA. The vertical axis indicates the concentration of IL-1β protein secreted into the culture supernatant (pg / mL), and the horizontal axis indicates time (hours). Error bars represent standard deviation.
FIG. 9 shows the temporal change in the expression level of IL-6 protein by LPS stimulation using spleen cells derived from ASK1 knockout mice (splenocytes), and spleencytoses (ASK1 − / −; white circles derived from ASK1 knockout mice). ) And wild-type splenocytes (ASK1 + / +; black circles) are comparatively quantified by ELISA. The vertical axis indicates the concentration (pg / mL) of the IL-6 protein secreted into the culture supernatant, and the horizontal axis indicates time (hour). Error bars represent standard deviation.
FIG. 10 shows the temporal change in the expression level of MIP-1α protein by LPS stimulation using spleen cells (splenocytes) derived from ASK1 knockout mice, and the changes in splenocytes (ASK1 − / −; white circles derived from ASK1 knockout mice). ) And wild-type splenocytes (ASK1 + / +; black circles) are comparatively quantified by ELISA. The vertical axis represents the concentration (pg / mL) of the MIP-1α protein secreted into the culture supernatant, and the horizontal axis represents time (hour). Error bars represent standard deviation.
FIG. 11 is a graph comparing the survival rates of ASK1 knockout mice (ASK1 − / −; white circles) and wild type mice (ASK1 + / +; black circles) with respect to the sepsis model over time. The vertical axis shows the survival rate (%), and the horizontal axis shows the group name.
FIG. 12 is a graph comparing blood TNF-α concentration 2 hours after LPS induction in a sepsis model between ASK1 knockout mice (ASK1 − / −; white circles) and wild type mice (ASK1 + / +; black circles). . The vertical axis represents the blood TNF-α concentration (ng / mL), and the horizontal axis represents the group name. Error bars represent standard deviation.
