JPWO2002086127A1

JPWO2002086127A1 - Acylase gene

Info

Publication number: JPWO2002086127A1
Application number: JP2002583641A
Authority: JP
Inventors: 大久保　聡子; 聡子大久保; 哲也長岡; 真一横田; 英作小西; 徹角谷
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2001-04-17
Filing date: 2002-04-16
Publication date: 2004-08-12
Also published as: WO2002086127A1

Abstract

キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することである。キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子をクローニングして、ＤＮＡ塩基配列及びそれから予想されるアミノ酸配列を決定した。この遺伝子がコードするタンパク質は、６３７残基からなる分子量７１ｋＤａのタンパク質であることが判明し、β−ラクタムアシラーゼ活性を有していた。An object of the present invention is to provide a β-lactam acylase protein belonging to the genus Xanthomonas, a gene encoding the protein, a recombinant vector having the gene, and a transformant containing the recombinant vector. The Xanthomonas citri β-lactam acylase gene was cloned to determine the DNA base sequence and the amino acid sequence predicted therefrom. The protein encoded by this gene was found to be a protein consisting of 637 residues and having a molecular weight of 71 kDa, and had β-lactam acylase activity.

Description

技術分野
本発明はキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼをコードするＤＮＡを有する遺伝子、当該遺伝子の塩基配列から予想されるタンパク質、当該遺伝子によりコードされたアシラーゼ、当該遺伝子を有する組換えベクター、および当該組換えベクターを含む形質転換体を提供する当該酵素の製造方法に関する。
背景技術
β−ラクタム系抗生物質の基本となる物質は、原理的に発酵により得られる。ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属およびセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属等の菌類が、ペニシリンＧ（ＰｅｎＧ）、ペニシリンＶ（ＰｅｎＶ）およびセファロスポリンＣ等のβ−ラクタム系抗生物質の原料物質の製造に利用される。これら発酵生成物は、ほとんど全ての一般的に販売されているペニシリン類およびセファロスポリン類に対する出発物質となっている。ＰｅｎＧ、ＰｅｎＶあるいはセファロスポリンＣからアミド結合を開裂（脱アシル化）し、半合成ペニシリン及びセファロスポリンの工業的生産の最も重要な中間体である６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）あるいは７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を生成するために、ペニシリンＧアシラーゼ（ペニシリンＧアミダーゼとも称されるベンジルペニシリンアミドヒドロラーゼ、ＥＣ３．５．１．１１）が産業上使用されている。この酵素は、ＰｅｎＧから通常化学的に製造されるフェニルアセチル−７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸から、７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）への生産にも工業的に使用されている。これらβ−ラクタム母核である６−ＡＰＡ、７−ＡＣＡ、７−ＡＤＣＡと側鎖化合物との化学反応による合成により製造された半合成ペニシリン類およびセファロスポリン類が、β−ラクタム系抗生物質の重要な市場を形成している。
従来β−ラクタム母核生産での脱アシル化において有用な加水分解酵素は、化学反応の形態に基づくと加水分解酵素として分類されるが、当該分野においては通常「アシラーゼ」もしくは「アミダーゼ」と呼ばれている。しかし、全てのアシラーゼがβ−ラクタム系抗生物質を基質として認識するわけではないので、さらに「β−ラクタムアシラーゼ」として特定されている。アシラーゼの活性とは、アシル基が水に転化される場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。この化学的形態は次の一般式によって表される。即ち、アシラーゼによって基質として受け入れられる化合物：Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙにおける当該化学的形態ＸおよびＹの特性は、該当するアシラーゼの基質特異性によって決定される。Ｘは側鎖を表し、一方Ｙはアシルアクセプタ基を表している。例えば、ＰｅｎＧの場合Ｘ−ＣＯ−はフェニルアセチル側鎖を表し、かつ−ＮＨ−Ｙは６−ＡＰＡを表している。これを認識するβ−ラクタムアシラーゼは、脱アシル化／アシル基転移の両方を触媒することより、現在β−ラクタム系抗生物質の生産におけるアシル基転移反応工程を化学合成から酵素法への転換での利用が注目されている。
β−ラクタムアシラーゼは、基質特異性や分子的特徴において以下のように分類されている（ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，１３１，１９９２、ＷｏｒｌｄＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１２９，１９９４）。β−ラクタムアシラーゼは大きく分けて、ペニシリンアシラーゼとセファロスポリンアシラーゼに分類され、さらにペニシリンアシラーゼはペニシリンＶアシラーゼとペニシリンＧアシラーゼとアンピシリンアシラーゼに細分類され、セファロスポリンアシラーゼは、セファロスポリンアシラーゼとグルタリル−７−ＡＣＡ（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼに細分類される。
一般的にペニシリンＶアシラーゼは分子量３５ＫＤａのサブユニットの４量体を形成している。ペニシリンＧアシラーゼは小サブユニット（α：１６−２６ｋＤａ）と大サブユニット（β：５４−６６ｋＤａ）からなるヘテロ２量体を形成している。アンピシリンアシラーゼは分子量７２ｋＤａのホモ２量体を形成している。一方ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼもヘテロ２量体を形成していることが知られている。
これらアシラーゼのうちペニシリンＧアシラーゼをコードしている微生物のアシラーゼ遺伝子配列が明らかにされている。即ち、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラシトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシアレテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａｒｅｔｔｇｅｒｉ）（ＤＮＡｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクタービスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓｕｓ）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバスフルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ）（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルスメガテリウム（Ｂａｔｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２５，２８７，１９９５）等である。また、ヘテロ２量体構造を持つＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、セファロスポリンアシラーゼはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）等が明らかにされている。しかしながら、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子配列は報告されていない。
キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）が持つβ−ラクタムアシラーゼは、α−アミノ酸化合物に基質特異性が高いことから、α−アミノ酸エステルヒドロラーゼとも呼ばれている（Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，３０Ｓ，Ｓ−２３０，１９７７、特開昭４７−２５３８８）。この酵素は分子量７２ｋＤａの単量体をサブユニットに持つ２８０ｋＤａのホモ４量体構造をとることが既に報告されている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４，１０６９，１９８０）が、いまだその遺伝子配列は報告されていない。即ち、ペニシリンＧアシラーゼやセファロスポリンアシラーゼのように、１本の前駆体ポリペプチド鎖が最初に翻訳され、その後酵素消化されることによってα，βのヘテロ２量体構造を示す酵素は、多くの微生物から遺伝子が単離されているが、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）のホモ４量体構造をとる酵素についてはアミノ酸配列やＤＮＡ配列の報告はない。また、シュードモナスメラノゲナム（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｍ）アシラーゼについても、ホモ２量体構造をとることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０４０，１２，１９９０）が、タンパク化学的報告にとどまり、そのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列に関する報告はない。さらにバチラスラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）のＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼがクローニングされており（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７８４８，１９９１）、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼと同グループを形成する可能性が示されているが、サブユニット構造からの推測にすぎず、これら情報によりアシラーゼ遺伝子がクローニングされた報告はない。一方、ヘテロ２量体構造をとるアシラーゼは、数多く報告されている。即ち、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラシトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシアレテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａｒｅｔｔｇｅｒｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＤＮＡｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクタービスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓｕｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバスフルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ）ペニシリンアシラーゼ（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルスメガテリウム（Ｂａｔｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２５，２８７，１９９５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｃ４２７ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＧＫ１６セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ８３セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）。これらは、遺伝子ファミリーとしてＤＮＡレベルで明らかにされているため、ＤＮＡプローブ設計から簡単に遺伝子クローニングができ、また、微生物ゲノムライブラリーの酵素活性を指標にした方法にスクリーニングによっても容易にこれらＤＮＡを取得できる。
発明の要約
本発明が解決しようとする課題は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼタンパク質、当該アシラーゼタンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体を提供することである。
本発明のキサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ酵素は、報告されているイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４（１４），５７１３，１９９６）、クルイベラシトロフィリア（Ｋｌｕｙｖｅｒａｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ｇｅｎｅ，４９，６９，１９８６）、アルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（特開平４−２２８０７３）、プロビデンシアレテゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａｒｅｔｔｇｅｒｉ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＤＮＡｓｅｑ．，３，１９５，１９９２）、アリスロバクタービスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓｕｓ）ペニシリンＧアシラーゼ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，２６０３，１９８８）、アーケオグロバスフルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ）ペニシリンアシラーゼ（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，３６４，１９９７）、バチルスメガテリウム（Ｂａｔｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ペニシリンＧアシラーゼ（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２５，２８７，１９９５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｃ４２７ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７，５９１，１９９４）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＧＫ１６セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６３，１２２２，１９８５）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ８３セファロスポリンアシラーゼ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５８２１，１９８７）の遺伝子配列と特徴的な相同性を示さない。また、これら相同的プローブを用いて実施したキサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼに関するＤＮＡ配列ならびにアミノ酸配列に関する報告はない。
我々はキサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ゲノムライブラリーから通常のアシラーゼ酵素活性測定スクリーニングも試みたが、報告されているヘテロ２量体アシラーゼやバチラスラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＧＬ−７−ＡＣＡアシラーゼ等と異なり、活性を示す陽性クローンを得ることはできなかった。この酵素活性測定スクリーニングにおいて、宿主大腸菌内でのコピー数が異なるプラスミドを用いてライブラリーを作成し、スクリーニングを実施した。即ちｐＢＲ３２２プラスミドを用いたゲノムライブラリーでは、平均約６Ｋｂｐのゲノム断片が挿入された１．９万コロニーをスクリーニングして理論上１１０Ｍｂｐのゲノムについてスクリーニングを行い、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドを用いたライブラリーでは、平均約６−７Ｋｂｐのゲノム断片が挿入された２万コロニーをスクリーニングし、理論上１２０−１４０Ｍｂｐのゲノムについてスクリーニングを行った。一般的にはゲノムライブラリーのスクリーニングでは全ゲノム長の１０倍の長さをスクリーニングする必要があるといわれているが、今回は１００倍近い長さを網羅しており、スクリーニングする長さとして十分であったと考えられたが、いずれのライブラリーからも陽性株を取得することは出来なかった。これは、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼの宿主大腸菌内での発現が非常に弱いことが考えられた。そこで、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼタンパク質の精製を行い、アミノ酸配列を決定することを試みたが、Ｎ末端配列を決定することができなかった。これは、なんらかの末端アミノ酸修飾でブロックされていると考えられた。このようなアシラーゼの取得の困難性より、これまでキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属β−ラクタムアシラーゼ遺伝子についての報告はなされていない。
本発明者らは、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を明らかにすることによる産業的意義は大きいと考え、β−ラクタムアシラーゼの内部アミノ酸配列を決定し、その配列を用いたスクリーニングによる鋭意研究を重ねた結果、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子をクローニングして配列番号１で示されるＤＮＡ塩基配列を決定した。当該遺伝子のオープンリーディングフレームは１９１４塩基からなり、配列番号２で示される６３７アミノ酸配列からなる分子量７１ｋＤａのタンパク質をコードしていることが判明した。さらに、当該遺伝子を宿主中で発現させ、アシル化活性を有することを確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関し、また、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関し、さらに、配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する。また、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された上記遺伝子に関する。
また、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された上記ポリヌクレオチド；配列番号５で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質；配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有する組換えタンパク質に関する。
また、本発明は、上記遺伝子に含まれる転写調節配列；上記遺伝子に含まれる翻訳調節配列；転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にある上記遺伝子であって、当該調節配列の一方又は両方がそれぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子に関する。
さらに、本発明は、上記遺伝子を１以上含む組換えベクター；上記組換えベクターを含む形質転換体；形質転換宿主がグラム陰性微生物である上記形質転換体；形質転換宿主がグラム陽性微生物である上記形質転換体に関する。
また、本発明は、上記形質転換体を培養し、アシラーゼを回収することからなるアシラーゼの製造方法；上記ポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるアシラーゼ；上記形質転換体を培養し、その菌体混合培養液もしくは菌体の破砕物を固定化してなる固定化アシラーゼ；上記組換えベクターを調製し、当該ベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でアシラーゼを産生する又はその産生を増強する方法に関する。
発明の詳細な開示
以下、本発明を詳細に説明する。
ここで述べる遺伝子とは、アミノ酸をコードする領域と、５’上流および３’下流でＲＮＡに転写される領域、さらにこの領域外の部分でも転写および翻訳の実行や効率に関わる調節領域を含む領域のことを示す。
また、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）由来の本発明の遺伝子をキサントモナスシトリβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子（ｘｃａｃｙ）、ｘｃａｃｙ遺伝子の発現ポリペプチドをＸＣＡＣＹと略する。
本発明の一つの形態によると、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを有する遺伝子、及び、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ＤＮＡ変異体」と称することもある）を有する遺伝子が提供される。
当該遺伝子は、好ましくはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離されたものである。より好ましくはキサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）、さらに好ましくはキサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株から単離されたものである。
ここで、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」とは、活性が性質的に同質なタンパク質をコードしており、配列番号２で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。
また、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されることを意味する。
つまり、本発明において、ＤＮＡ変異体は、当該分野において既知の方法によって、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡから調製することができる。このような操作としては、例えば、部位特異的突然変異誘発、点変異、欠失、重複、逆位、転座、遺伝コードの縮重等により、アミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを変更する保存的変更が挙げられる。
アシラーゼ活性とは、アシル基が水に転化される場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。なお、加水分解活性の場合は、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）の加水分解を触媒する酵素量とし、また、転移活性の場合は、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンを合成する酵素量とし、ＨＰＬＣ等を用いて定量を行うことができる。
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。つまり、配列番号１で示される塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸をコードするＤＮＡを含有するものである。
また、本発明は、以下のポリヌクレオチドを提供するものである。配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする部分に対応する塩基配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属から単離された上記ポリヌクレオチド；配列番号５で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
さらに、本発明の組換えタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質であってもよいし、また、配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシラーゼ活性を有する組換えタンパク質（以下、「変異タンパク質」とも称する）であってもよい。
この際、変異タンパク質としては、上述のようなＤＮＡ変異体によってコードされるタンパク質、さらには、基本的なβ−ラクタムアシラーゼ活性は変化させずにアミノ酸配列が保存的あるいは半保存的に変更（例えば、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族鎖を有するアミノ酸同士の置換や、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の芳香族鎖を有するアミノ酸同士の置換）されたタンパク質等が挙げられる。
また、本発明は、上述の本発明の遺伝子に含まれる転写調節配列、及び、翻訳調節配列を提供する。当該転写調節配列としては、配列番号１の１６４番目から１６９番目のｔｔｇａｃａを含む配列、１９４番目から１９９番目のｔａｃａｇｔを含む配列である。また、翻訳調節配列としては、配列番号１の２２１番目から２２９番目のｃｇｇａｇｔｃｇｔを含む配列である。
さらに、本発明は、転写及び／又は翻訳調節配列を含むレギュロンの制御下にあり、当該調節配列の一方又は両方が、それぞれ同じ又は異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配列に置き換えられている遺伝子を提供する。
ここで、同じ又は異なる生物から得られた他の転写調節配列及び翻訳調節配列としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されることはなく、当該分野において既知のものが使用される。
本発明の別の形態によると、上述の本発明の遺伝子を１以上含む組換えベクターが提供される。また、当該組換えベクターを含む形質転換体も提供される。
この組換えベクターは、本発明の遺伝子を適当な制限酵素で切断された発現用ベクター中に連結させることによって調製される。
また、形質転換体の作製に用いられる形質転換宿主としては、特に限定されないが、例えば、グラム陰性微生物、グラム陽性微生物等が挙げられる。グラム陰性微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等が挙げられ、グラム陽性微生物としては、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等が挙げられる。
さらに、本発明は、上述した制御配列（転写及び／又は翻訳調節配列）に関して操作された、アシラーゼ遺伝子を含むベクター、および当該ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明の別の形態によると、上記形質転換体を培養し、アシラーゼを回収することからなるアシラーゼの製造方法、つまり、アシラーゼをコードされた形質転換体を培養し、単離形態のアシラーゼを回収することからなるアシラーゼの製造方法を提供する。
また、上記ポリヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列からなるアシラーゼ；上記形質転換体を培養し、その菌体混合培養液もしくは菌体の破砕物を固定化してなる固定化アシラーゼを提供する。さらに、上記組換えベクターを調製し、当該ベクターで宿主を形質転換し、得られた形質転換体をクローン化し選択することからなる、形質転換体中でアシラーゼを産生する又はその産生を増強する方法を提供する。
形質転換株は、通常の栄養培地で培養することにより、導入した組換えＤＮＡの形質を発現させることができる。組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由来の性質が付与されている場合は、その性質に合わせて培地に薬剤（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等）を補ってもかまわない。
このようにして得られた形質転換株を酵素源として得るには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが、必要に応じてＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）等の添加等の、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
形質転換株の培養のために用いられる培地としては、通常、炭素源（例えば、グルコースやシュークロース等の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類等）、窒素源（例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩等）および無機イオン（例えば、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン等）を含有する普通の培地等が挙げられる。これに、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。
さらに本発明の別の形態によると、前記アシラーゼ酵素を作用させる様態としては、当該転換株の培養液、菌体、菌体処理物、固定化菌体、菌体から抽出した酵素、固定化酵素等を挙げることができる。これらは、大規模なアシル化またはアシル基転換化工程で使用することができる。
菌体処理物としては、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥体、アセトン乾燥体、リゾチームで処理した菌体、超音波破砕した菌体が挙げられる。
さらに、これら菌体、菌体処理物、無細胞酵素抽出物、精製酵素は、公知の手段で固定化することができる。固定化は、当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法等で行うことができる。なお、固定化法については、例えばＷＯ９６／２０２７５に示される方法が参考になる。
固定化に使用される支持体としては、ＤｕｏｌｉｔｅＡ５６８またはＤＳ１７１８６（ローム・アンド・ハース社：登録商標）等のフェノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲＡ９３５、ＩＲＡ９４５、ＩＲＡ９０１（ローム・アンド・ハース社：登録商標）、ＬｅｗａｔｉｔＯＣ１０３７（バイエル社：登録商標）、ＤｉａｉｏｎＥＸ−０５（三菱化学：登録商標）等のポリスチレン樹脂のような、各種アミンやアンモニウム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種陰イオン交換樹脂が適している。その他、ＤＥＡＥ−セルロース等の支持体も使用することができる。
さらに、酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、通常、架橋剤を用いるが、好適な例としてグルタルアルデヒド等を挙げることができる。使用する酵素は、精製酵素だけでなく、菌体、菌体処理物、無細胞酵素抽出物等、種々の精製度のものが使用できる。固定化菌体あるいは固定化酵素の調整は、菌体液あるいは酵素液に、支持体を加えて攪拌して吸着させた後、架橋処理をする等の通常の調整法が使用できる。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により本発明をさらに説明する。つまり、本発明の遺伝子、タンパク質、組換えベクター、形質転換体等の実施態様を以下に説明するが、本発明は下記実施態様に制限されるものではない。
材料及び方法
アシラーゼ遺伝子のクローニング
全体的な遺伝子操作およびクローニング法は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に記載されているように行った。ＤＮＡ操作に使用した酵素、プラスミド及びイーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニング宿主は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用した。
培地
Ｂ培地：ペプトン５ｇ／ｌ、イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４２ｇ／ｌ、シュークロース２０ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ１ｇ／ｌ、グルタミン酸ナトリウム２ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／ｌ、ｐＨ７．２
ＬＢ培地：バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０
緩衝液
１×ＳＳＣ：０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ
３０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ６．０）：３０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整
５０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ５．０）：５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＯＨでｐＨ５．０に調整
菌株
キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株を、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の供与株として使用した。
イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を組換えプラスミドの宿主として使用した。
アシラーゼ活性
アシラーゼの活性とは、アシル基が水に転化される場合には加水分解（脱アシル）活性をさし、可逆反応として活性化された側鎖基質から求核物質へのアシル基の転移を触媒する場合には転移活性をさす。
加水分解活性の場合、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル（ＨＰＧＯＭｅ）の加水分解を触媒する酵素量とする。
転移活性の場合、１ユニットは１分間あたり１μｍｏｌｅのアモキシシリンを合成する酵素量とする。
それぞれの反応条件は以下に示し、定量はＨＰＬＣにより行った。
ＨＰＧＯＭｅ加水分解反応
ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ８．０）に０．５％になるように溶かして基質液とした。菌体あるいは粗酵素液を基質液に懸濁し、３０℃で４時間振とうしながら反応させた。１ＮＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。
アモキシシリン合成反応
６−ＡＰＡ、ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌを３０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ６．０）に０．５％になるように溶かして基質液とした。菌体あるいは粗酵素液を基質液に懸濁し、３０℃で４時間振とうしながら反応させた。１ＮＨＣｌを基質液の１／２０量加えて反応を停止させた。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いた検出
菌体反応、粗酵素反応における、アモキシシリンの検出を薄層クロマトグラフィーで行った。反応液を遠心して上清を回収してシリカゲル薄層プレートに微量スポットし、酢酸エチル：酢酸：水＝６０：２０：２０の展開溶媒にて展開させ、溶媒除去後、ニンヒドリン反応にてアモキシシリンを検出した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた検出
反応液を遠心して上清を回収し、移動相で１０倍希釈してＨＰＬＣで測定した。分析条件は、カラムはコスモシル５Ｃ１８ＡＲ（ナカライテスク社）を用い、移動相は１％アセトニトリル／５０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ５．０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度３５℃、測定波長２２５ｎｍで行った。ピークは標準品を用いて同定し、アモキシシリンの標準品として、アモキシシリン三水和物（和光純薬）を用いた。保持時間は、ＨＰＧ（Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン）１．８ｍｉｎ、６−ＡＰＡ５．９ｍｉｎ、アモキシシリン７．５ｍｉｎ、ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ９．４ｍｉｎであった。
（実施例１）キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のβ−ラクタムアシラーゼの精製
キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株をＢ培地で３０℃で増殖させた。以下の操作は、４℃で行った。細胞を遠心分離により回収し、０．１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、ＥＤＴＡ・２Ｎａを４．７ｇ／ｌ、リゾチームを０．１３ｇ／ｌになるよう添加し、一晩撹拌した。ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを３．１３ｇ／ｌ、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼＩ（ｂｏｖｉｎｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）を０．０６ｍｇ／ｌになるように添加して一晩反応させ、菌体を超音波破砕し、上清を遠心分離で回収した。Ｃａ（ＣＨ_３ＣＯＯＨ）_２・Ｈ_２Ｏを２２．９ｇ／ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４を２２．９ｇ／ｌになるよう添加し、上清を遠心分離で回収した。透析後、陽イオン交換ゲルクロマトグラフ（ＣＭセファロースＣＬ−６Ｂ）を３回、ゲル濾過クロマトグラフ（セファクリル−３００）を１回用いて精製を行った（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４（５），１０６９，１９８０）。カラムから溶出された画分はＴＬＣによりアモキシシリン合成活性を確認し、次の精製段階へ進めた。得られたＸＣＡＣＹタンパク質は、約７０ｋＤａのサブユニットからなることが分かった。
（実施例２）キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のβ−ラクタムアシラーゼのアミノ酸配列の決定
上記実施例１の精製法で得られたＸＣＡＣＹタンパク質を、リジルエンドペプチダーゼにより限定分解し、ペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。ＸＣＡＣＹタンパク質をバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４ＭＵｒｅａ）に懸濁して、リジルエンドペプチダーゼをＸＣＡＣＹタンパク質の１／５０量になるよう添加し、３７℃で６時間反応させた。逆相カラム（ＹＭＣ−ＰａｃｋＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ワイエムシィ社））にてペプチドを分取し、Ｍｏｄｅｌ４９Ｘプロテインシークエンサー（アプライド・バイオシステム社）で解析を行った。得られたアミノ酸配列を、配列番号３に示した。
（実施例３）キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子のクローニング
キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３８３５株のゲノムＤＮＡを単離してＥｃｏＲＩで消化した１０−２０ｋｂｐのフラクションを、ＥｃｏＲＩおよびアルカリフォスファターゼ（ＣＩＡＰ）処理したｐＵＣ１９プラスミドにクローニングしたものを、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株に形質転換し、Ｌ−Ａｍｐプレート（ＬＢ培地にバクトアガー１５ｇ／ｌ、アンピシリン５０ｍｇ／ｌになるよう添加したもの）にまき、３７℃で一晩培養した。このプレートのコロニーをナイロンメンブレンにレプリカし、コロニーが適当な大きさになるまで培養した後、菌体を溶菌してフィルターを作成した。配列番号３に含まれるアミノ酸配列で、配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４：Ｘ１オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＩｍａｇｅｓ３’−ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ（アマシャムファルマシアバイオテック社）でＸ１オリゴヌクレオチドの３’末端を蛍光ラベルし、５０℃のハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ、２０倍希釈ｌｉｑｕｉｄｂｌｏｃｋ（アマシャムファルマシアバイオテック社）、０．５％ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｐｈａｔｅ）中で一晩ハイブリダイズさせた。室温の５×ＳＳＣ溶液（０．１％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、次いで４２℃の１×ＳＳＣ溶液（０．１％ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）中でメンブレンを洗浄し、ＧｅｎｅＩｍａｇｅｓＣＤＰ−Ｓｔａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｏｄｕｌｅ（アマシャムファルマシアバイオテック社）で検出を行い、陽性クローンを得た。このクローンより得られたプラスミドをｐＵＣＸＣ４（図１）とした。
（実施例４） β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の配列決定
上記で得られた陽性クローンの配列を、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｅｎｃｉｎｇＦＳＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（アプライド・バイオシステム社）を用いたデオキシ配列決定によりシークエンシング反応を行い、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステム社）で解析を行った。得られたβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子配列を配列番号１に、予測されたアミノ酸配列を配列番号２に示した。
（実施例５） β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の組換えベクターの構築
ｐＵＣ１９プラスミドのｌａｃＺ遺伝子の開始コドン部位にＮｄｅＩサイトを作製するプライマーを作製してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｐＵＣ１９プラスミドにＮｄｅＩサイトを１カ所加えたｐＵＣＮｄｅプラスミドを作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテック社）プラスミドも同様にＰＣＲを行い、ＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変えたｐＴｒｃＮｄｅプラスミドを作製した。ｐＵＣＮｄｅプラスミドをＮｄｅＩ、ＳｓｐＩで切断した２．０ｋｂｐ断片と、ｐＴｒｃＮｄｅプラスミドをＮｄｅＩ、ＳｓｐＩで切断した０．６ｋｂｐ断片をライゲーションして、ｐＵＣＮＴプラスミドを作製した。
ｐＵＣＮＴプラスミドをＣｒｆ１０Ｉ、ＳｓｐＩで切断した１．８ｋｂｐの断片と、ｐＫＣ７プラスミド（Ｇｅｎｅ，７，７９，１９７９）をテンプレートとしてカナマイシン耐性遺伝子をＣｒｆ１０Ｉ、ＳｓｐＩサイトを持つようにＰＣＲで１．２ｋｂｐの断片を作製し、ライゲーションしてｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５（ｋａｍ^ｒ）プラスミドを作製した。
ｐＵＣＸＣ４プラスミドをテンプレートとし、Ｘ４５−ＮｄｅＩプライマー（ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＧＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣ）とＸ３８−ＢａｍＨＩプライマー（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＧＴＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＴＧＡ）を用いて、ＰＣＲを行ってＣＤＳ断片を増幅した。このＣＤＳ断片をｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５（ｋａｍ^ｒ）プラスミドベクターのＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトにクローニングし、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣとした。この組換えベクターの構築を図２に示した。
（実施例６） β−ラクタムアシラーゼ遺伝子の発現
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１に形質転換した株（ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣ／ＨＢ１０１）を、ＬＢ培地にカナマイシンを５０ｍｇ／ｌになるよう添加したものにまき、３０℃で一晩培養した。菌体を遠心分離で回収し、３０ｍＭＫＰＢに懸濁した後、超音波破砕して、上清を遠心分離で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ったところ、約７０ｋＤａのバンドが確認され、β−ラクタムアシラーゼが発現されていることが確認された。
（実施例７） β−ラクタムアシラーゼ活性の確認
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣ／ＨＢ１０１株を実施例６と同様に一晩培養後、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加してさらに３時間培養した。菌体をＬｙｓｏｚｙｍｅ０．４４ｍｇ／ｍｌで１５分間氷上で処理し、超音波破砕遠心した上清を粗酵素液とした。粗酵素液の総タンパク質量はブラッドフォード法にて定量した。基質（０．５％ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ，０．５％６−ＡＰＡ）２００μｌに２５μｇのタンパク質を添加し、３０℃で１時間振とうしながら反応させ、１０倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析し、アモキシシリンのピークを検出した。これにより、ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５プラスミドにクローニングされたＸ．ｃｉｔｒｉ β−ラクタムアシラーゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株で発現され、活性を持つことが確認された。
（実施例８） β−ラクタムアシラーゼの樹脂への固定化
ｐＵＣＮＴｋｍＴｎ５−ＸＣ／ＨＢ１０１株を実施例７と同様に培養後、菌体破砕処理を行い、粗酵素液を調整した。これに、０．１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）で平衡化したＤｕｏｌｉｔｅＡ−５６８（ローム・アンド・ハース社）を、総タンパク質４０ｍｇに対して樹脂１ｇになるように添加し、窒素シール下、４℃で２０時間攪拌し、吸着させた。この吸着樹脂を０．１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）および１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で洗浄後、０．２％グルタルアルデヒド、０．１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）を用いて、４℃で１０分間反応させてタンパク質を架橋し、固定化樹脂を作製した。基質（０．５％ＨＰＧＯＭｅ・ＨＣｌ，０．５％６−ＡＰＡ）２００μｌに１ｍｇの当該固定化樹脂を添加し、３０℃で４時間振とうしながら反応させ、１０倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣで分析し、アモキシシリンのピークを検出した。
産業上の利用可能性
キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）由来のβ−ラクタムアシラーゼ遺伝子を発現用ベクターに結合して組換えベクターを得、形質転換を行い、発現させることにより、効率よくβ−ラクタムアシラーゼを調製することができる。このβ−ラクタムアシラーゼを単離あるいは粗精製の状態で、大量の脱アシル化／アシル基転換化の工程に使用することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、キサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉ）β−ラクタムアシラーゼの遺伝子領域を含むｐＵＣＸＣ４の制限酵素地図を示す。
図２は、組換えベクターの構築を示す。Technical field
The present invention relates to a gene having a DNA encoding Xanthomonas genus β-lactam acylase, a protein predicted from the nucleotide sequence of the gene, an acylase encoded by the gene, a recombinant vector having the gene, and a combination thereof. The present invention relates to a method for producing the enzyme, which provides a transformant containing the replacement vector.
Background art
Basic substances of β-lactam antibiotics are obtained by fermentation in principle. Fungi such as the genus Penicillium and the genus Cephalosporium are used for producing raw materials for β-lactam antibiotics such as penicillin G (PenG), penicillin V (PenV) and cephalosporin C. You. These fermentation products are starting materials for almost all commonly marketed penicillins and cephalosporins. 6-aminopenicillanic acid (6-APA), which cleaves (deacylates) the amide bond from PenG, PenV or Cephalosporin C and is the most important intermediate for industrial production of semisynthetic penicillin and cephalosporin Alternatively, penicillin G acylase (benzylpenicillin amide hydrolase, also referred to as penicillin G amidase, EC 3.5.1.11) has been used industrially to produce 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA). This enzyme is also used industrially for the production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) from phenylacetyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid, which is usually produced chemically from PenG. I have. Semi-synthetic penicillins and cephalosporins produced by the chemical reaction of 6-APA, 7-ACA, and 7-ADCA, which are β-lactam nuclei, with side-chain compounds are used as β-lactam antibiotics. Is forming an important market.
Conventionally, hydrolases useful in deacylation in the production of β-lactam nuclei are classified as hydrolases based on the form of the chemical reaction, but are commonly referred to in the art as “acylase” or “amidase”. Have been. However, not all acylases recognize β-lactam antibiotics as substrates, and are further specified as “β-lactam acylases”. Acylase activity refers to hydrolysis (deacylation) activity when an acyl group is converted to water, and catalyzes the transfer of an acyl group from a side chain substrate activated to a nucleophile as a reversible reaction. In this case, it refers to metastatic activity. This chemical form is represented by the following general formula: That is, the properties of the chemical forms X and Y in a compound that is accepted as a substrate by an acylase: X—CO—NH—Y are determined by the substrate specificity of the corresponding acylase. X represents a side chain, while Y represents an acyl acceptor group. For example, in the case of PenG, X-CO- represents a phenylacetyl side chain, and -NH-Y represents 6-APA. Beta-lactam acylase that recognizes this catalyzes both deacylation / transacylation, and currently converts the acyl transfer reaction step in the production of β-lactam antibiotics from chemical synthesis to enzymatic method. The use of is attracting attention.
β-lactam acylase is classified as follows in terms of substrate specificity and molecular characteristics (Process Biochemistry, 27, 131, 1992, World J. Microbiology & Biotechnology, 10, 129, 1994). β-lactam acylase is roughly divided into penicillin acylase and cephalosporin acylase, and penicillin acylase is further subdivided into penicillin V acylase, penicillin G acylase and ampicillin acylase, and cephalosporin acylase is classified as cephalosporin acylase. It is subdivided into glutaryl-7-ACA (GL-7-ACA) acylase.
Generally, penicillin V acylase forms a tetramer of a subunit having a molecular weight of 35 KDa. Penicillin G acylase forms a heterodimer consisting of a small subunit (α: 16-26 kDa) and a large subunit (β: 54-66 kDa). Ampicillin acylase forms a homodimer with a molecular weight of 72 kDa. On the other hand, it is known that GL-7-ACA acylase also forms a heterodimer.
Among these acylases, the acylase gene sequence of a microorganism encoding penicillin G acylase has been elucidated. That is, E. coli (Nucleic Acids Res., 14 (14), 5713, 1996), Kluyvera citrophilia (Gene, 49, 69, 1986), Alcaligenes faecalis (Alcaligenes faecalis) Kaihei 4-228733), Providencia rettgeri (DNA seq., 3, 195, 1992), Arthrobacter viscosus (Appl. Environ. Microbiol., 88, 54, 260, 54). Fulgidas (Archaeoglobus fulgidus) (Nature, 390, 3 64, 1997), and Bacillus megaterium (FEMS Microbiol. Lett. 125, 287, 1995). In addition, GL-7-ACA acylase having a heterodimer structure is available from Pseudomonas sp. (J. Ferment. Bioeng., 77, 591, 1994), cephalosporin acylase is available from Pseudomonas sp. (J. Bacteriol., 163, 1222, 1985, J. Bacteriol., 169, 5821, 1987) and the like. However, the β-lactam acylase gene sequence of Xanthomonas citri has not been reported.
Β-lactam acylase of Xanthomonas citri is also called α-amino acid ester hydrolase because of its high substrate specificity for α-amino acid compounds (Jpn. J. Antibiot., 30S, S-230). , 1977, JP-A-47-25388). It has been reported that this enzyme has a homotetramer structure of 280 kDa having a monomer having a molecular weight of 72 kDa as a subunit (Agric. Biol. Chem., 44, 1069, 1980), but its gene sequence is still present. Has not been reported. That is, many enzymes, such as penicillin G acylase and cephalosporin acylase, exhibit a heterodimer structure of α and β when one precursor polypeptide chain is first translated and then enzymatically digested. However, no amino acid sequence or DNA sequence has been reported for an enzyme having a homotetramer structure of Xanthomonas citri. In addition, it has been reported that Pseudomonas melanogenum acylase has a homodimeric structure (Biochim. Biophys. Acta, 1040, 12, 1990), but it is reported only in protein chemistry, and its amino acid sequence is reported. And no reports on DNA sequences. Furthermore, GL-7-ACA acylase of Bacillus laterosporus has been cloned (J. Bacteriol., 173, 7848, 1991) and may form the same group as Xanthomonas citri β-lactam acylase. Is shown, but it is only a guess from the subunit structure, and there is no report that the acylase gene was cloned based on this information. On the other hand, many acylases having a heterodimeric structure have been reported. That is, E. coli penicillin G acylase (Nucleic Acids Res., 14 (14), 5713, 1996), Kluyvera citrophilia penicillin G acylase (Gene, 49, 69, 1986), Alcaligenes faecalis (Alcaligenes faecalis) penicillin G acylase (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 4-280773), Providencia rettgeri penicillin G acylase (DNA seq., 3, 195, 1992), Arislobacter biscospinas (Arvisprosacinas). Environ.Microbiol., 54, 2603, 1 88), Archaeoglobus fulgidus penicillin acylase (Nature, 390, 364, 1997), Bacillus megaterium (Batilus megaterium) penicillin G acylase (FEMS Microbiol. GL-7-ACA acylase (J. Ferment. Bioeng., 77, 591, 1994), Pseudomonas GK16 cephalosporin acylase (J. Bacteriol., 163, 1222, 1985), Pseudomonas SE83 Sephalos. Phosphorus acylase (J. Bacteri) l., 169,5821,1987). Since these are clarified at the DNA level as a gene family, gene cloning can be easily carried out from DNA probe design, and these DNAs can be easily obtained by screening using a method using the enzyme activity of a microorganism genomic library as an index. Can be obtained.
Summary of the Invention
An object of the present invention is to provide a β-lactam acylase protein belonging to the genus Xanthomonas, a gene encoding the acylase protein, a recombinant vector having the gene, and a transformant containing the recombinant vector. It is.
The Xanthomonas citri β-lactam acylase enzyme of the present invention can be any of the reported E. coli penicillin G acylase (Nucleic Acids Res., 14 (14), 5713, 1996), Kluyvera citrophilia ( Kluyvera citrophila penicillin G acylase (Gene, 49, 69, 1986), Alcaligenes faecalis penicillin G acylase (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 4-28073), and Providencia reticelliase (Providencia gerigeria resentase). , 1992), Arthrobacter viscosus (Arthrobacter vi) cosus) penicillin G acylase (Appl. Environ. Microbiol., 54, 2603, 1988), archaeoglobus fulgidus (Archaeoglobus fulgidus) penicillin acylase (Nature, 390, 364, 1997), and Bacillus megalysium gerium gerium gerium gerium gerium gersium gerium gerium gerium gerium gerium gerium gerium gerium gerium gerium gerium germyl gersium germyl gersium germite FEMS Microbiol. Lett., 125, 287, 1995), Pseudomonas C427 GL-7-ACA acylase (J. Ferment. Bioeng., 77, 591, 1994), Pseudomonas (Pseudomonas) GK16 Sepharose JK16 Sepharose JK. Bacteriol., 163, 1222. 985), Pseudomonas (Pseudomonas) SE83 cephalosporin acylase (J. Bacteriol., Does not exhibit gene sequences characteristic homology 169,5821,1987). In addition, there is no report on the DNA sequence and amino acid sequence of Xanthomonas citri β-lactam acylase carried out using these homologous probes.
We have also tried a normal acylase enzyme activity assay screening from the Xanthomonas citri genomic library, but unlike the reported heterodimer acylase and Bacillus laterosporus GL-7-ACA acylase. No positive clones showing activity could be obtained. In this enzyme activity measurement screening, a library was prepared using plasmids having different copy numbers in the host Escherichia coli, and screening was performed. That is, in a genomic library using the pBR322 plasmid, 19,000 colonies into which a genomic fragment of about 6 Kbp was inserted were screened to screen a 110 Mbp genome in theory, and in a library using the pACYC184 plasmid, 20,000 colonies into which a genomic fragment of about 6-7 Kbp was inserted were screened, and a screen was theoretically screened for a 120-140 Mbp genome. It is generally said that it is necessary to screen a genome library 10 times as long as the whole genome in screening a genomic library. However, no positive strain could be obtained from any of the libraries. This suggests that the expression of Xanthomonas citri β-lactam acylase in host E. coli was very weak. Therefore, purification of Xanthomonas citri β-lactam acylase protein was attempted to determine the amino acid sequence, but the N-terminal sequence could not be determined. This was thought to be blocked by some terminal amino acid modification. Due to the difficulty in obtaining such an acylase, no report has been made on a β-lactam acylase gene of the genus Xanthomonas.
The present inventors consider that clarifying the DNA sequence and amino acid sequence of Xanthomonas citri β-lactam acylase has great industrial significance, and determined the internal amino acid sequence of β-lactam acylase, As a result of intensive studies by screening using Xanthomonas citri (Xanthomonas citri) β-lactam acylase gene, the DNA base sequence represented by SEQ ID NO: 1 was determined. The open reading frame of this gene was found to consist of 1914 bases and encode a protein having a molecular weight of 71 kDa and a 637 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Furthermore, the gene was expressed in a host, and it was confirmed that the gene had an acylation activity. Thus, the present invention was completed.
That is, the present invention relates to a gene comprising a DNA encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, Gene comprising a DNA encoding a protein having an acylase activity, wherein the gene comprises a deletion, substitution and / or addition amino acid sequence, and further comprises a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 The base sequence corresponding to the portion encoding the amino acid sequence shown in the present invention relates to a gene consisting of DNA encoding the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. The present invention also relates to the above gene isolated from the genus Xanthomonas.
The present invention also relates to a polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; A polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein having an acylase activity; and a nucleotide sequence comprising a deletion, substitution and / or addition of an amino acid, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. A nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence-encoding portion has a nucleotide sequence encoding the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; Xanthomonas ( Xanthomonas) A polynucleotide consisting of identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a substantially nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence; Li nucleotides.
Furthermore, the present invention relates to a recombinant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added; And a recombinant protein having
The present invention also relates to the above-described gene under the control of a transcription regulatory sequence contained in the gene; a translation regulatory sequence contained in the gene; a regulon containing a transcriptional and / or translational regulatory sequence; Or both have been replaced by other transcriptional and / or translational regulatory sequences obtained from the same or different organisms, respectively.
Further, the present invention provides a recombinant vector comprising one or more of the above genes; a transformant containing the above recombinant vector; the above transformant wherein the transformed host is a Gram-negative microorganism; It relates to a transformant.
In addition, the present invention provides a method for producing an acylase, which comprises culturing the above-mentioned transformant and recovering an acylase; an acylase comprising an amino acid sequence encoded by the above-mentioned polynucleotide; Immobilized acylase obtained by immobilizing a mixed culture or disrupted cells; preparing the recombinant vector, transforming a host with the vector, cloning and selecting the obtained transformant, The present invention relates to a method for producing or enhancing the production of acylase in a transformant.
Detailed Disclosure of the Invention
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The gene described here is a region encoding an amino acid, a region transcribed into RNA at 5 ′ upstream and 3 ′ downstream, and a region outside this region including a regulatory region related to the execution and efficiency of transcription and translation. Indicates that.
Further, the gene of the present invention derived from Xanthomonas citri is abbreviated as Xanthomonas citri β-lactam acylase gene (xcacy), and the expression polypeptide of the xcacy gene is abbreviated as XCACY.
According to one aspect of the present invention, there is provided a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and one or several amino acids lacking in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. There is provided a protein consisting of the lost, substituted and / or added amino acid sequence and having an acylase activity.
Furthermore, a gene having a DNA encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 being deleted. There is provided a gene having a DNA comprising a lost, substituted and / or added amino acid sequence and encoding a protein having an acylase activity (hereinafter, also referred to as “DNA mutant”).
The gene is preferably isolated from the genus Xanthomonas. More preferably, it is isolated from Xanthomonas citri, and still more preferably isolated from Xanthomonas citri IFO3835 strain.
Here, “an amino acid sequence that is substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” encodes a protein whose activity is the same in nature and has a homology to the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. An amino acid sequence having a degree of sex of about 80% or more, preferably about 90% or more on the whole.
The term "deletion, substitution and / or addition of one or several amino acids" means that a sufficient number of amino acids can be deleted, substituted and / or added by a well-known method such as site-directed mutagenesis. It means deletion, substitution and / or addition.
That is, in the present invention, a DNA mutant can be prepared from a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 by a method known in the art. Such operations include, for example, site-directed mutagenesis, point mutations, deletions, duplications, inversions, translocations, degeneracy of the genetic code, etc., which change only the base sequence without changing the amino acid sequence. Conservative changes.
Acylase activity refers to hydrolysis (deacylation) activity when an acyl group is converted to water, and catalyzes the transfer of an acyl group from a side chain substrate activated to a nucleophile as a reversible reaction. In some cases, it refers to metastatic activity. In the case of hydrolysis activity, one unit is the amount of an enzyme that catalyzes the hydrolysis of 1 μmole of Dp-hydroxyphenylglycine methyl ester (HPGOMe) per minute, and in the case of transfer activity, one unit is one unit. The amount of the enzyme that synthesizes 1 μmole of amoxicillin per minute can be determined using HPLC or the like.
Furthermore, in the gene of the present invention, in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence corresponding to the portion encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It may be a gene consisting of an encoding DNA. That is, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 contains a DNA encoding the same amino acid as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Further, the present invention provides the following polynucleotides. A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; one or several amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A polynucleotide comprising a substituted and / or added amino acid sequence and comprising a nucleotide sequence encoding a protein having acylase activity; a portion of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; isolated from the genus Xanthomonas The above-described polynucleotide A polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
Furthermore, the recombinant protein of the present invention may be a recombinant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or may have one or several amino acids deleted, substituted, or deleted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may be a recombinant protein comprising an added amino acid sequence and having an acylase activity (hereinafter, also referred to as “mutant protein”).
At this time, as the mutant protein, the protein encoded by the DNA mutant as described above, and further, the amino acid sequence is conservatively or semi-conservatively changed without changing the basic β-lactam acylase activity (for example, , Glycine, valine, leucine, isoleucine and the like, and substitution of amino acids having an aliphatic chain such as phenylalanine, tyrosine, and tryptophan).
The present invention also provides a transcription regulatory sequence and a translation regulatory sequence contained in the above-described gene of the present invention. The transcription control sequence is a sequence containing ttgaca at positions 164 to 169 of SEQ ID NO: 1 and a sequence containing tacagt at positions 194 to 199 of SEQ ID NO: 1. The translation control sequence is a sequence containing cggagtcgt at positions 221 to 229 of SEQ ID NO: 1.
Furthermore, the present invention is under the control of a regulon containing transcriptional and / or translational regulatory sequences, wherein one or both of said regulatory sequences are associated with other transcriptional and / or translational regulatory sequences, respectively, obtained from the same or different organisms. Provide the gene that has been replaced.
Here, other transcription regulatory sequences and translation regulatory sequences obtained from the same or different organisms are not particularly limited as long as they can express the gene of the present invention, and those known in the art can be used. Is done.
According to another aspect of the present invention, there is provided a recombinant vector comprising one or more of the above-described genes of the present invention. Also provided is a transformant containing the recombinant vector.
This recombinant vector is prepared by ligating the gene of the present invention into an expression vector cut with an appropriate restriction enzyme.
Moreover, the transformed host used for producing the transformant is not particularly limited, and includes, for example, Gram-negative microorganisms, Gram-positive microorganisms, and the like. Gram-negative microorganisms include, for example, Escherichia and Pseudomonas, and gram-positive microorganisms include, for example, Bacillus and Streptomyces.
Furthermore, the present invention provides a vector containing an acylase gene, which has been manipulated with respect to the above-mentioned control sequence (transcription and / or translation control sequence), and a transformant containing the vector.
According to another aspect of the present invention, a method for producing an acylase, which comprises culturing the above transformant and collecting an acylase, that is, culturing a transformant encoding an acylase and recovering an isolated form of acylase To provide a method for producing an acylase.
An acylase comprising an amino acid sequence encoded by the polynucleotide; and an immobilized acylase obtained by culturing the transformant and immobilizing a mixed culture of the cells or a crushed product of the cells. Further, a method for producing or enhancing the production of acylase in a transformant, comprising preparing the recombinant vector, transforming a host with the vector, and cloning and selecting the resulting transformant. I will provide a.
The transformant can express the character of the introduced recombinant DNA by culturing it in a usual nutrient medium. When properties derived from gene DNA or vector DNA are imparted to the recombinant DNA, a medium (eg, kanamycin, neomycin, chloramphenicol, tetracycline, etc.) may be supplemented to the medium according to the properties. .
In order to obtain the thus obtained transformant as an enzyme source, cultivation may be carried out using a normal medium, but if necessary, such as addition of IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) or the like, Alternatively, a treatment for enzyme induction can be performed.
As the medium used for culturing the transformant, usually, a carbon source (for example, carbohydrates such as glucose and sucrose, an organic acid such as acetic acid, alcohols, etc.), a nitrogen source (for example, ammonia gas, aqueous ammonia) , Ammonium salts, etc.) and inorganic media (for example, phosphate ions, magnesium ions, potassium ions, iron ions, etc.). When organic micronutrients such as vitamins and amino acids are added to this, favorable results are often obtained.
According to still another embodiment of the present invention, the form in which the acylase enzyme is allowed to act includes a culture solution of the transformed strain, cells, treated cells, immobilized cells, enzymes extracted from the cells, immobilized enzymes. And the like. These can be used in large-scale acylation or acyl group conversion steps.
Examples of the treated cells include a crude extract, a freeze-dried cultured cell, an acetone-dried cell, a cell treated with lysozyme, and an ultrasonically disrupted cell.
Furthermore, these cells, treated cells, cell-free enzyme extract, and purified enzyme can be immobilized by known means. The immobilization can be performed by a method known to those skilled in the art, such as a crosslinking method, a covalent bonding method, a physical adsorption method, an entrapment method, or the like. For the immobilization method, for example, the method described in WO96 / 20275 is referred to.
Examples of the support used for the immobilization include phenol formaldehyde anion exchange resin such as Duolite A568 or DS17186 (registered trademark) and Amberlite IRA935, IRA945, IRA901 (registered trademark). Trademark), Lewatit OC1037 (Bayer Corp .: registered trademark), Diaion EX-05 (Mitsubishi Chemical: registered trademark), and other polystyrene resins such as polystyrene resins, various anion exchange resins having a functional group of amine or ammonium salt or diethanolamine type. Is suitable. In addition, a support such as DEAE-cellulose can also be used.
Further, in order to make the enzyme adsorption more robust and stable, a cross-linking agent is usually used, and preferable examples thereof include glutaraldehyde. As the enzyme to be used, not only the purified enzyme but also those having various degrees of purification such as bacterial cells, processed cells, and cell-free enzyme extracts can be used. For the preparation of the immobilized bacterial cells or the immobilized enzyme, a usual adjusting method such as adding a support to the bacterial cell liquid or the enzyme solution, stirring and adsorbing the mixture, and then performing a crosslinking treatment can be used.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The following examples further illustrate the invention. That is, embodiments of the gene, protein, recombinant vector, transformant and the like of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the following embodiments.
Materials and methods
Cloning of acylase gene
The overall genetic manipulation and cloning procedures were performed as described in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Enzymes, plasmids and E. coli cloning hosts used for DNA manipulation were purchased from commercial suppliers and used as described.
Culture medium
B medium: peptone 5 g / l, yeast extract 5 g / l, K₂HPO₄ 2g / l, sucrose 20g / l, MgCl₂・ 6H₂O 1 g / l, sodium glutamate 2 g / l, FeSO₄・ 7H₂O 0.1 g / l, pH 7.2
LB medium: bactotryptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, NaCl 5 g / l, pH 7.0
Buffer
1 × SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate
30 mM KPB (pH 6.0): 30 mM KH₂PO₄Adjusted to pH 6.0 with KOH
50 mM KPB (pH 5.0): 50 mM KH₂PO₄Adjusted to pH 5.0 with KOH
Strain
Xanthomonas citri IFO3835 strain was used as a donor strain of Xanthomonas citri β-lactam acylase gene.
E. coli DH5α strain and E. coli HB101 strain were used as recombinant plasmid hosts.
Acylase activity
Acylase activity refers to hydrolysis (deacylation) activity when an acyl group is converted to water, and catalyzes the transfer of an acyl group from a side chain substrate activated to a nucleophile as a reversible reaction. In this case, it refers to metastatic activity.
In the case of the hydrolysis activity, one unit is the amount of an enzyme that catalyzes the hydrolysis of 1 μmole of Dp-hydroxyphenylglycine methyl ester (HPGOMe) per minute.
In the case of transfer activity, one unit is the amount of an enzyme that synthesizes 1 μmole of amoxicillin per minute.
The respective reaction conditions are shown below, and the quantification was performed by HPLC.
HPGOMe hydrolysis reaction
HPGOMe.HCl was dissolved in 30 mM KPB (pH 8.0) to a concentration of 0.5% to prepare a substrate solution. The cells or the crude enzyme solution were suspended in the substrate solution and reacted while shaking at 30 ° C. for 4 hours. The reaction was stopped by adding 1/20 volume of 1N HCl to the substrate solution.
Amoxicillin synthesis reaction
6-APA and HPGOMe.HCl were dissolved in 30 mM KPB (pH 6.0) to a concentration of 0.5% to prepare a substrate solution. The cells or the crude enzyme solution were suspended in the substrate solution and reacted while shaking at 30 ° C. for 4 hours. The reaction was stopped by adding 1/20 volume of 1N HCl to the substrate solution.
Detection using thin layer chromatography (TLC)
Amoxicillin in the cell reaction and the crude enzyme reaction was detected by thin-layer chromatography. The reaction solution was centrifuged to collect the supernatant, spotted on a silica gel thin layer plate in a trace amount, developed with a developing solvent of ethyl acetate: acetic acid: water = 60: 20: 20, and after removing the solvent, amoxicillin was removed by ninhydrin reaction. Detected.
High-performance liquid chromatography (HPLC) detection
The reaction solution was centrifuged to recover the supernatant, diluted 10-fold with the mobile phase, and measured by HPLC. The analysis conditions were as follows: Cosmosil 5C18 AR (Nacalai Tesque) was used for the column, the mobile phase was 1% acetonitrile / 50 mM KPB (pH 5.0), the flow rate was 1.0 ml / min, the column temperature was 35 ° C., and the measurement wavelength was 225 nm. . The peak was identified using a standard, and amoxicillin trihydrate (Wako Pure Chemical Industries) was used as a standard for amoxicillin. The retention time was 1.8 min of HPG (Dp-hydroxyphenylglycine), 5.9 min of 6-APA, 7.5 min of amoxicillin, 9.4 min of HPGOMe.HCl.
(Example 1) Purification of β-lactam acylase of Xanthomonas citri IFO3835 strain
Xanthomonas citri strain IFO3835 was grown on B medium at 30 ° C. The following operation was performed at 4 ° C. The cells were collected by centrifugation, suspended in 0.1 M Tris.HCl (pH 8.0), 4.7 g / l of EDTA.2Na and 0.13 g / l of lysozyme were added, and the mixture was stirred overnight. . MgSO₄・ 7H₂O was added at a concentration of 3.13 g / l, bovine pancreatic deoxyribonuclease I at a concentration of 0.06 mg / l, and the mixture was allowed to react overnight. The cells were sonicated, and the supernatant was centrifuged. Collected in. Ca (CH₃COOH)₂・ H₂O 22.9 g / l, KH₂PO₄Was added to 22.9 g / l, and the supernatant was collected by centrifugation. After the dialysis, purification was carried out using a cation exchange gel chromatograph (CM Sepharose CL-6B) three times and a gel filtration chromatograph (Sephacryl-300) once (Agric. Biol. Chem., 44 (5), 1069, 1980). The fraction eluted from the column was confirmed for amoxicillin synthesizing activity by TLC and proceeded to the next purification step. The obtained XCACY protein was found to consist of a subunit of about 70 kDa.
(Example 2) Determination of amino acid sequence of β-lactam acylase of Xanthomonas citri IFO3835 strain
The XCACY protein obtained by the purification method of Example 1 was limitedly digested with lysyl endopeptidase, and the amino acid sequence of the peptide fragment was determined. The XCACY protein was suspended in a buffer (10 mM Tris.HCl (pH 9.0), 4 M Urea), lysyl endopeptidase was added to 1/50 of the XCACY protein, and reacted at 37 ° C. for 6 hours. Peptides were collected on a reversed-phase column (YMC-Pack PROTEIN-RP (YMC)) and analyzed using a Model 49X protein sequencer (Applied Biosystems). The obtained amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
(Example 3) Cloning of β-lactam acylase gene of Xanthomonas citri IFO3835 strain
The genomic DNA of Xanthomonas citri strain IFO3835 was isolated and the 10-20 kbp fraction digested with EcoRI was cloned into a pUC19 plasmid that had been treated with EcoRI and alkaline phosphatase (CIAP). The strain was transformed into the DH5α strain, spread on an L-Amp plate (LB medium supplemented with 15 g / l of Bactoagar and 50 mg / l of ampicillin) and cultured overnight at 37 ° C. The colony of this plate was replicated on a nylon membrane, and cultured until the colony became an appropriate size. Then, the cells were lysed to prepare a filter. Colony hybridization was performed using the amino acid sequence contained in SEQ ID NO: 3 and the SEQ ID NO: 4: X1 oligonucleotide encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 as a probe. The 3 ′ end of the X1 oligonucleotide was fluorescently labeled with Gene Images 3′-oligolabelling (Amersham Pharmacia Biotech), and a 50 ° C. hybridization buffer (5 × SSC, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 20-fold diluted liquid block) was used. (Amersham Pharmacia Biotech), 0.5% dextran sulphate). The membrane is washed in a 5 × SSC solution (0.1% sodium dodecyl sulfate) at room temperature, and then at 42 ° C. in a 1 × SSC solution (0.1% sodium dodecyl sulfate), and the Gene Images CDP-Star detection system is used. (Biotech) to obtain positive clones. The plasmid obtained from this clone was designated as pUCXC4 (FIG. 1).
(Example 4) Sequencing of β-lactam acylase gene
The sequence of the positive clone obtained above was subjected to a sequencing reaction by deoxy sequencing using the BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), and the ABI PRISM 310 Genetic Biosystems (Applied Biosystems, Inc.) was used. ). The resulting β-lactam acylase gene sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the predicted amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
(Example 5) Construction of recombinant vector of β-lactam acylase gene
A primer for creating an NdeI site was prepared at the start codon site of the lacZ gene of the pUC19 plasmid, and a polymerase chain reaction (PCR) was carried out. Thus, a pUCNde plasmid was prepared by adding one NdeI site to the pUC19 plasmid. PCR was similarly performed for the pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech) plasmid to prepare a pTrcNde plasmid in which the NcoI site was changed to an NdeI site. A 2.0 kbp fragment obtained by cutting the pUCNde plasmid with NdeI and SspI and a 0.6 kbp fragment obtained by cutting the pTrcNde plasmid with NdeI and SspI were ligated to prepare a pUCNT plasmid.
A 1.8 kbp fragment obtained by cutting the pUCNT plasmid with Crf10I and SspI and a 1.2 kbp fragment by PCR using the pKC7 plasmid (Gene, 7, 79, 1979) as a template to have the kanamycin resistance gene as Crf10I and SspI sites. It is prepared, ligated and pUCNTkmTn5 (kam^r) A plasmid was prepared.
Using the pUCXC4 plasmid as a template, a CDS fragment was amplified by PCR using an X45-NdeI primer (GGAATTCCATATGCGCCGCCTTTGCCACCTGC) and an X38-BamHI primer (CGCGGATCCTCAACGTACCGGCAGAACTGA). This CDS fragment was converted to pUCNTkmTn5 (kam^r) The plasmid was cloned into the NdeI site and the BamHI site of the plasmid vector to obtain pUCNTkmTn5-XC. The construction of this recombinant vector is shown in FIG.
(Example 6) Expression of β-lactam acylase gene
The pUCNTkmTn5-XC plasmid was transformed into E. coli. Escherichia coli HB101 (pUCNTkmTn5-XC / HB101) was spread on LB medium supplemented with kanamycin at 50 mg / l, and cultured at 30 ° C. overnight. The cells were collected by centrifugation, suspended in 30 mM KPB, sonicated, the supernatant was collected by centrifugation, and SDS-PAGE was performed.A band of about 70 kDa was confirmed. It was confirmed that β-lactam acylase was expressed.
(Example 7) Confirmation of β-lactam acylase activity
After culturing the pUCNTkmTn5-XC / HB101 strain overnight as in Example 6, IPTG was added to 1 mM, and the cells were further cultured for 3 hours. The cells were treated with Lysozyme at 0.44 mg / ml on ice for 15 minutes, and the supernatant obtained by sonication and centrifugation was used as a crude enzyme solution. The total protein content of the crude enzyme solution was determined by the Bradford method. 25 μg of protein was added to 200 μl of a substrate (0.5% HPGOMe · HCl, 0.5% 6-APA), reacted at 30 ° C. with shaking for 1 hour, diluted 10-fold, and analyzed by HPLC for 10 μl. Then, the amoxicillin peak was detected. This resulted in the X. coli cloned into the pUCNTkmTn5 plasmid. The citri β-lactam acylase gene was expressed in Escherichia coli HB101 strain and confirmed to have activity.
(Example 8) Immobilization of β-lactam acylase to resin
After culturing pUCNTkmTn5-XC / HB101 strain in the same manner as in Example 7, the cells were crushed to prepare a crude enzyme solution. To this, Duolite A-568 (Rohm & Haas) equilibrated with 0.1 M KPB (pH 7.0) was added so that the amount of the resin was 1 g per 40 mg of the total protein. And the mixture was adsorbed for 20 hours. After washing the adsorbed resin with 0.1 M KPB (pH 7.0) and 10 mM dithiothreitol (DTT), the resin is washed with 0.2% glutaraldehyde and 0.1 M KPB (pH 7.0) at 4 ° C. for 10 minutes. The proteins were crosslinked by reacting to produce an immobilized resin. 1 mg of the immobilized resin was added to 200 µl of a substrate (0.5% HPGOMe · HCl, 0.5% 6-APA), reacted at 30 ° C for 4 hours with shaking, diluted 10-fold, and 10 µl was added. Analysis by HPLC detected the amoxicillin peak.
Industrial applicability
A β-lactam acylase gene derived from Xanthomonas citri is ligated to an expression vector to obtain a recombinant vector, transformed, and expressed, whereby β-lactam acylase can be efficiently prepared. This β-lactam acylase can be used in a large-scale deacylation / acyl group conversion step in an isolated or partially purified state.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a restriction map of pUCXC4 containing the gene region of Xanthomonas citri β-lactam acylase.
FIG. 2 shows the construction of the recombinant vector.

Claims

A gene comprising DNA encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

A gene consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and comprising a DNA encoding a protein having an acylase activity.

A gene consisting of a DNA encoding the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

The gene according to any one of claims 1 to 3, which is isolated from the genus Xanthomonas.

A polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

A polynucleotide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added, and having a base sequence encoding a protein having an acylase activity.

In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence corresponding to a portion encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 .

A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

The polynucleotide according to any one of claims 5 to 8, which is isolated from the genus Xanthomonas.

A polynucleotide comprising a base sequence encoding the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.

A recombinant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

A recombinant protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and having an acylase activity.

A transcription regulatory sequence contained in the gene according to any one of claims 1 to 4.

A translation regulatory sequence contained in the gene according to any one of claims 1 to 4.

The gene according to any one of claims 1 to 4, which is under the control of a regulon containing a transcription and / or translation regulatory sequence, wherein one or both of the regulatory sequences are obtained from the same or different organisms. A gene that has been replaced with a transcriptional and / or translational regulatory sequence.

A recombinant vector comprising one or more genes according to claims 1 to 4.

A transformant comprising the recombinant vector according to claim 16.

18. The transformant according to claim 17, wherein the transformed host is a gram-negative microorganism.

The transformant according to claim 17, wherein the transformed host is a Gram-positive microorganism.

A method for producing an acylase, comprising culturing the transformant according to any one of claims 17 to 19 and recovering the acylase.

An acylase comprising an amino acid sequence encoded by the polynucleotide according to any one of claims 5 to 9.

An immobilized acylase obtained by culturing the transformant according to any one of claims 17 to 19 and immobilizing a mixed culture of the cells or a crushed product of the cells.

Preparing a recombinant vector according to claim 16, transforming a host with the vector, and cloning and selecting the obtained transformant. How to strengthen.