JPWO2002066069A1

JPWO2002066069A1 - Inflammatory / neoplastic disease treatment

Info

Publication number: JPWO2002066069A1
Application number: JP2002565627A
Authority: JP
Inventors: 松森　昭; 昭松森; 宮崎　純一; 純一宮崎; 敦中野
Original assignee: Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Current assignee: Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2004-09-24
Also published as: WO2002066069A1

Abstract

本発明は、免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターを有効成分とする炎症・腫瘍性疾患治療剤に関する。また、本発明は、免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む治療的有効量の発現ベクターを、炎症・腫瘍性疾患を患う患者に投与することを含む炎症・腫瘍性疾患の治療方法に関する。The present invention relates to a therapeutic agent for inflammatory and neoplastic diseases, which comprises an expression vector containing an immunosuppressive cytokine gene and / or a soluble cytokine receptor gene in an expressible state as an active ingredient. In addition, the present invention relates to an inflammatory method comprising administering a therapeutically effective amount of an expression vector containing an immunosuppressive cytokine gene and / or a soluble cytokine receptor gene in a state capable of expressing the same to a patient suffering from an inflammatory or neoplastic disease. -It relates to a method for treating a neoplastic disease.

Description

技術分野
本発明は、炎症・腫瘍性疾患治療剤に関する。
背景技術
心疾患は、先進諸国の中で主要な死因の１つとなっている。なかでも急性ウイルス性心筋炎は、心臓の多病巣性炎症により特徴付けられ、慢性相では、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、心室瘤、不整脈原性右心室形成異常症を導く。脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルスは、マウスで心筋炎を誘発し、この実験モデルを用いた研究は心筋炎及びＤＣＭのメカニズムに重要な洞察を提供した（松森、１９９７）。このモデルにおいて、細胞性免疫が賦活化され、サイトカイン発現の亢進並びに心筋層中の細胞障害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化が認められる。従って、免疫系は治療的標的と考えられる。
直接的ウイルス性障害及び宿主の免疫応答は、ウイルス性心疾患の病因に重要な役割を果たす（Ｂｏｗｌｅｓら、１９９８）。免疫応答はウイルス感染と戦うのに重要な役割を果たすが、同時にそれは心筋細胞を不適切に攻撃することにより宿主に有害な効果を有し得る。このような保護効果と有害作用のバランスは、疾患の予後を最終的に決定し得る。さらに、心臓中の炎症性サイトカイン発現の亢進は、ウイルス性心筋炎に伴う心筋機能の低下に関与し得る（Ｓｈｉｏｉら，１９９６）。インターロイキン（ＩＬ）−１β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、及びインターフェロン（ＩＦＮ）−γを含むサイトカインｍＲＮＡは、ウイルス接種の３日後に誘導されるが、その時点では細胞浸潤はほとんど見られない（Ｓｈｉｏｉら，１９９６）。
ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、ＩＬ−１ファミリーのメンバーであり、ＩＬ−１受容体に結合するが、細胞内応答を誘発せず、重要な内在性の抗炎症蛋白質である（Ａｒｅｎｄら，１９９８；Ｂｒｅｓｎｉｈａｎら，１９９８）。ウイルス性ＩＬ−１０（ｖＩＬ−１０）は、ＥＢウイルスにより捕捉される細胞性サイトカインと考えられ、細胞性ＩＬ−１０の抗炎症特性の多くを共有するが、免疫刺激作用を欠如し、それゆえ優れた免疫抑制を提供し得る。これらは、ウイルス性心筋炎の治療剤の有望な候補である。
免疫抑制性サイトカインを利用した抗炎症剤としては、特開２０００−２３９１８２号に記載されているが、このように、サイトカインを蛋白質として投与することは非常にコストがかかる欠点がある。
また、特開２０００−４７１５号公報には、サイトカイン遺伝子を組み込んだプラスミドが記載されているが、該公報には、このようなプラスミドを用いて心筋炎等の炎症を治療する具体的な方法については記載されていない。
本発明は、免疫抑制性サイトカインを生体内で産生し得る炎症・腫瘍性疾患治療剤を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、以下の炎症・腫瘍性疾患治療剤を提供するものである。
（１）免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む発現ベクターを有効成分とする炎症・腫瘍性疾患治療剤。
（２）免疫抑制性サイトカイン及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子がＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくとも１種である（１）に記載の治療剤。
（３）炎症・腫瘍性疾患が心血管系疾患である（１）に記載の治療剤。
（４）炎症・腫瘍性疾患が心筋炎である（３）に記載の治療剤。
（５）免疫抑制性サイトカイン遺伝子及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子を発現可能な状態で含む治療的有効量の発現ベクターを、炎症・腫瘍性疾患を患う患者に投与することを含む炎症・腫瘍性疾患の治療方法。
（６）治療的有効量の該発現ベクターの投与後に、該投与部位を挟むようにして電気パルスを与えることを特徴とする（５）に記載の治療方法。
（７）免疫抑制性サイトカイン及び／又は可溶性サイトカイン受容体遺伝子がＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔからなる群から選ばれる少なくとも１種である（５）に記載の治療方法。
（８）炎症・腫瘍性疾患が心血管系疾患である（５）に記載の治療方法。
（９）炎症・腫瘍性疾患が心筋炎である（８）に記載の治療方法。
発明の詳細な説明
本発明において、免疫抑制性サイトカインとしては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ｖＩＬ−１０、ＩＬ−２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８などのインターロイキン類、インターフェロン（α、β、γ）、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＲＡＮＴＥＳ，Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３，γＩＰ−１０，ＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β，ＭＩＰ−２，ＭＣＰ−１，２，３，Ｍ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，ＥＰＯ，ＴＰＯ，ＳＣＦ，ＬＩＦ，ＰＤＧＦ，ＫＧＦ，ＩＧＦ，ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＣＤＴＦ，ＯＳＭ，ＨＧＦなどが例示される。また、これらのサイトカインの可溶性受容体に対しては可溶性サイトカイン受容体も含まれる。例えばＳＣＦに対しては可溶性ｃ−ｋｉｔが例示され、他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−αに対しては可溶性ＴＮＦ−α受容体が例示される。これらの免疫抑制性サイトカインの遺伝子配列は、公知であり、特にヒトの免疫抑制性サイトカイン遺伝子を用いるのが好ましい。
発現ベクターとしては、例えばｐＣＡＧＧＳを使用することができ、プロモーター／エンハンサー配列、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を適宜に組み合わせて用いることができる。免疫抑制性サイトカイン遺伝子を発現可能な状態で含むサイトカイン発現ベクターの構築は、例えば本明細書の下記の記載及び特開２０００−４７１５号公報の記載を参照して当業者であれば、容易に行うことができる。
炎症・腫瘍性疾患としては、心筋炎、脳心筋炎、拡張性心筋症、心不全、冠動脈炎、移植心の早期冠動脈硬化、血管炎、大動脈炎などの心血管系の疾患、関節炎、腰痛、痛風、気管支喘息、びまん性肺疾患、アトピー、アレルギー、肝炎、肝硬変、腎炎、胃潰瘍、腸炎、脳脊髄炎、多発性硬化症、自己免疫病、癌、骨髄腫などが例示される。
本発明において、特定の免疫抑制性サイトカインと治療対象疾患との組み合わせとしては、インターフェロンα（慢性髄性白血病、多発性骨髄腫、腎癌、悪性黒皮腫、慢性Ｔ細胞白血病、肝炎）、インターフェロンβ（脳腫瘍、、肝炎）、インターフェロンγ（慢性肉芽腫症）、ＩＬ−２（原発性免疫不全症、悪性黒皮腫、腎癌、肝癌）、ＩＬ−６（血小板減少症）、ＩＬ−１１（血小板減少症）、Ｅｐｏ（血小板減少症）、ＭＣＳＦ（血小板減少症、急性白血病、好中球減少症）、ＧＣＳＦ（急性白血病、好中球減少症）、ＩＬ−３（好中球減少症）、ＧＭＣＳＦ（好中球減少症）、ＳＣＦ（好中球減少症）が例示される。
本発明の炎症・腫瘍性疾患治療剤は、好ましくは注射（筋肉内、皮下、皮内、臓器内など）等の非経口経路により、例えば生理食塩水等の任意の溶媒を用いて投与することができる。投与部位は、四肢の筋肉内などが好ましい。治療的有効量は、成人１日当たり０．００００１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ程度であり、１回又は数回に分けて投与され得る。
本発明の炎症・腫瘍性疾患治療剤は、投与後、好ましくは投与直後に、投与部位を挟むようにして電気パルスを与えるエレクトロポレーションを行うのが好ましい。電気パルスは、例えば、任意のパルス形状、パルス幅、パルス頻度、電圧等からなるＤＣパルスであり、これらのパルス変数およびパルス印加時間等は対象動物（好ましくはヒト）の種類、発現プラスミドＤＮＡの注入部位、注入量等に応じて適宜に設定することができる。エレクトロポレーションは、好ましくは投与部位の周囲に複数箇所電極を差し込み、５０〜１００Ｖ程度の電圧を印加し、波形は矩形波、パルス幅は約０．１〜約１００ｍ秒、パルス頻度は１〜１０パルス／秒、回数は１〜１０回である。
発明を実施するための最良の形態
以下、免疫抑制性サイトカインとしてｖＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ及び可溶性ｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦ受容体）を用いて心筋炎を治療する例を示すが、他のサイトカインについても同様にして本発明の炎症・腫瘍性疾患治療剤を得ることができる。
方法及び結果
・心筋炎のマウスモデル
４週齢ｉｎｂｒｅｄオスＤＢＡ／２マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＭ変異株を１０ｐｆｕ腹腔内接種した。
・プラスミドＤＮＡ
マウスＩＬ−１ｒａｃＤＮＡをマウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１から抽出された全ＲＮＡからＰＣＲにより抽出した。プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａをＣＡＧプロモーター及びｐＣＡＧＧＳ発現ベクター上のウサギβ−グロブリン遺伝子の３’−フランキング配列の間のＸｈｏＩ部位にマウスＩＬ−１ｒａｃＤＮＡを挿入することにより構築した（Ｎｉｗａら，１９９１）。同様に、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｖＩＬ−１０はマウスｖＩＬ−１０ｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ発現ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより構築された（Ｎｉｔｔａら，１９９８）。ｖＩＬ−１０はｐｃＤＳＲα−ＢＣＲＦに由来のものであった（Ｓｕｚｕｋｉら，１９９５）。同様に、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｃ−ｋｉｔはマウスｃ−ｋｉｔｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ発現ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより同様に構築された。ｃ−ｋｉｔはｐＣＡＧｎ−ｃ−ｋｉｔ−ｈＦｃに由来のものであった（Ｋａｔａｏｋａ，Ｔａｋａｋｕｒａら，１９９７）。プラスミドは大腸菌株ＤＨ１０Ｂ細胞で増殖し、アルカリ性溶菌法（ａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ）により抽出し、２サイクルのエチジウムブロミド−ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心分離法により精製した。プラスミドをイソプロパノール沈殿、フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりさらに精製した。プラスミドＤＮＡは次いでＰＢＳに溶解した。
・Ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーション
マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。プラスミドＤＮＡ（７５μｇ、各々１．５μｇ／μｌ）を両側前脛骨筋に注入し、電気パルスを既述のように与えた（Ａｉｈａｒａら，１９９８）。簡単に述べると、１対の電極針を筋肉に深さ５ｍｍで挿入し、ＤＮＡ注入部位とした。６回のパルスを両側筋に電気パルス発生器（ＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅＰｏｒａｔｏｒＴ８２０Ｍ；ＢＴＸ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）により１パルス／秒の割合で、各パルスが５０ｍｓｅｃの持続時間で発した。
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング
ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａおよびｐＣＡＧＧＳをＢＭＴ−１０細胞にリポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、培養上清を３分の１容量のＳＤＳサンプルバッファー（７５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，６％ＳＤＳ，１５％グリセロール，１５％ＭＥおよび０．０１５％ブロモフェノールブルー）と混合し、９８℃で５分間加熱し、１５％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。組換えマウスＩＬ−１ｒａは同時にゲルにロードされた。電気泳動後、サンプルをポリビニリデンジフルオライド膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に移した。膜は室温で３時間ヤギ抗ＩＬ−１ｒａポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とインキュベートし、洗浄した。次いで膜は室温で１時間ビオチン化抗ヤギＩｇＧ２ａとインキュベートし、洗浄し、製造業者の仕様書に従い、化学発光法（ＥＣＬキット；ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いたオートラジオグラフィー処理した。
・ＥＬＩＳＡ
ＩＬ−１ｒａＥＬＩＳＡのために、マウス尾静脈から得られた血清サンプルをＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用い、供給元の仕様書に従いアッセイした。組換えマウスＩＬ−１ｒａ（Ｒ＆Ｄシステム）の連続希釈物を標準品として使用した。ｖＩＬ−１０の血清濃度は、以下のようにしてアッセイした：９６−ウェルプレートを２μｇ／ｍｌのラット抗ＩＬ−１０ｍＡｂ，ＪＥＳ３−９Ｄ７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とともに４℃で終夜コートし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で１時間洗浄した。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、適切に希釈されたサンプルを該ウェルに加えた。プレートを４℃で終夜インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ビオチン化ラット抗ＩＬ−１０ｍＡｂ（ＪＥＳ３−１２Ｇ８；２μｇ／ｍｌ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を該ウェルに加え、プレートを室温で３時間激しく振とうしながらインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄後、希釈されたストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体をウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。基質（ｏ−フェニレンジアミン）をウェルに加え、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。組換えｖＩＬ−１０（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を標準品として用い、このＥＬＩＳＡシステムの直線範囲は３０〜２０００ｐｇ／ｍｌであった。このＥＬＩＳＡシステムはマウスＩＬ−１０を検出しない。
・組織学的知見
心臓を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン上に包埋し、切片標本とし、マッソン三色染色により染色した。心臓切片標本をＣＣＤカメラで写真撮影し、全心臓切片標本の面積及び浸潤ゾーンの面積をブラインド様式（ｂｌｉｎｄｆａｓｈｉｏｎ）で、ＮＩＨイメージソフトウェアにより測定した。細胞浸潤の程度を浸潤ゾーンの面積を全心臓切片標本の面積で割ることにより計算した。
・リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡをグアニジンチオシアネート−セシウムクロライド遠心分離法によりマウスの心臓から抽出した。ＲＮＡをオリゴｄＴプライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて逆転写した。心臓中のサイトカインのｍＲＮＡのレベルを測定するために、リアルタイム定量ＰＣＲをＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ７７００Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）（Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈら，１９９９）を用いて行った。これらの分析のために使用したプライマー対及びプローブは、以下の通りである。

これらのプローブは、適切なＰＣＲ産物を汚染されたゲノムＤＮＡ由来の増幅産物と区別するために、イントロン配列を包含するように設計された。プローブの５’及び３’末端を６−カルボキシフルオレセイン及び６−カルボキシテトラメチルローダミンで各々標識した。
・統計的分析
生存をカプランメイヤー法（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒｍｅｔｈｏｄ）で分析した。統計的比較は、ｌｏｇ−ランクテスト及びＡＮＯＶＡにより行った。スチューデントのｔ検定を使用して組織学的知見、サイトカインの血清レベルおよび心臓のサイトカインの発現を比較した。
結果
・導入された遺伝子の発現
マウスＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０及びｃ−ｋｉｔがｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに挿入されて、ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａ及びｐＣＡＧＧＳ−ｖＩＬ−１０及びｐＣＡＧＧＳ−ｃ−ｋｉｔを得た。ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａを用いてトランスフェクトされたＢＭＴ−１０由来の培養上清のイムノブロッティングは、正確なサイズのマウスＩＬ−１ｒａである、１７ｋＤａ蛋白質の成功した発現を示した（図１Ａ）。同様に、ｖＩＬ−１０発現は、ｐＣＡＧＧＳ−ｖＩＬ−１０のＢＭＴ−１０細胞への一時的トランスフェクションにより確認された。同様に、ｃ−ｋｉｔ発現は、ｐＣＡＧＧＳ−ｃ−ｋｉｔのＢＭＴ−１０細胞への一時的トランスフェクションにより確認された。各プラスミドのエレクトロポレーションが蛋白質の生理学的に有意なレベルを生じるかどうかを測定するために、ＥＭＣＶ接種されたＤＢＡ／２マウスの両側性前脛骨筋に７５μｇのプラスミドを注入し、導入された遺伝子の発現レベルがそのピークと予測されるときに、ＩＬ−１ｒａまたはｖＩＬ−１０の血清レベルをエレクトロポレーションの５日後ＥＬＩＳＡにより測定した（図１Ｂ；Ａｉｈａｒａら，１９９８）。ＩＬ−１ｒａの濃度は、未感染のコントロールマウスよりもＥＭＣＶ接種マウスが３．５倍高く（ｐ＜０．００５）、ＩＬ−１ｒａ遺伝子導入は、さらに血清ＩＬ−１ｒａレベルを１．９倍増大した（ｐ＜０．０１、ＥＭＣＶ感染マウスとの比較）。ＩＬ−１ｒａの血清濃度は、未感染マウスへのエレクトロポレーションの０，３，５，７及び１４日後調べられた。該時間経過は、ＩＬ−１ｒａの血清濃度は第５日（ｐ＜０．０１、第０日との比較）でピークとなり、その後徐々に減少し（図１Ｃ）、この結果は既報告と一致する（Ｗｅｌｌｓ，１９９３；Ｖｉｔａｄｅｌｌｏら、１９９４）。ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションの５日後のｖＩＬ−１０濃度は２２９４ｐｇ／ｍｌであった（図１Ｄ）。これらの結果は明らかにｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションがサイトカインを全身に送達するのに優れていることを示す。
・心筋炎に関するＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０及び可溶性ｃ−ｋｉｔの導入
ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーション法を適用し、本発明者は実験的心筋炎に対するサイトカイン遺伝子治療を試みた。４週齢のＤＢＡ／２雄マウスに１０ｐｆｕのＥＭＣＶを接種した。接種１４日後に生存するのはこれらマウスの２０％未満であった。ＩＬ−１ｒａ遺伝子導入の結果の統計的分析は、処理群が有意に高い生存を示すことを明らかにした（図２Ａ）。ｖＩＬ−１０遺伝子導入は、ＥＭＣＶ接種後の死亡率も減少し（図２Ｂ）、ＩＬ−１ｒａ導入よりもわずかに良好な生存率を生じた。これらのデータは、２つの抑制性サイトカインが有利な効果を有することを示唆した。プラスミド自身が効果を有する可能性を排除するために、空のｐＣＡＧＧＳプラスミドを同様に感染マウスに導入し、生存率をＰＢＳ注入マウスと比較した。図２Ｃに示すように、空のプラスミドの導入は、生存曲線を変化させなかった。
可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入では、空のｐＣＡＧＧＳプラスミド群では１０匹中５匹が死亡したのに対し、可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入群では１０匹中死亡はなく、ＥＭＣＶ接種後の死亡率を有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
・組織学的知見
ＩＬ−１ｒａ処理群及びｖＩＬ−１０処理群において、心臓切片標本を炎症は進行するがどのマウスも死んでいない時点である第５日に組織学的に評価した（図３Ａ）。心筋浸潤の定量的病理学的スコアは、ＩＬ−１ｒａ処理群及びｖＩＬ−１０処理群の両方で明らかな改善が見られ、このことは生存率の改善は心筋障害の緩和によるものであることを示唆した。可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入でも心筋の細胞浸潤は減少した（図３Ｂ）
・心臓におけるサイトカイン発現
ＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０の有利な効果に横たわるメカニズムをさらに明らかにするために、心臓における炎症遺伝子の発現レベルをリアルタイム定量的ＰＣＲ法で測定した。ＩＬ−１ｒａ導入マウスにおいて、ＴＮＦ−α及びｉＮＯＳの発現は未処理マウスで見られるレベルの４７％及び８３％に抑制し（ＴＮＦ−α，ｐ＜０．００１；ｉＮＯＳ，ｐ＜０．０５；図４Ａ）、一方、ｖＩＬ−１０導入マウスにおいて、ＩＦＮ−γ及びｉＮＯＳは各々１４％及び１６％に抑制された（ＩＦＮ−γ，ｐ＜０．０１；ｉＮＯＳ，ｐ＜０．００５；図４Ｂ）。ＩＬ−１βはまたｖＩＬ−１０処理群で減少した。これらの炎症遺伝子の発現パターンの相違は、これら２つの免疫調節処理が異なるメカニズムでその治療的効果を引き出すことを示唆する。
現在、感染は多くの心臓疾患の病因に関与すると考えられている。ウイルス性心筋炎は、特に懸念され、各種の形態が見られる（Ｍａｔｓｕｍｏｒｉ，１９９７）。過去数年において、サイトカイン、特にＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのような前炎症（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインは、心筋炎及び心筋症の病因に重要な因子としてますます認識されている。各種の形態のストレスに対応して、心臓はＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのような前炎症サイトカイン、単球走化性蛋白質−１の様なケモカイン、誘導性一酸化窒素合成酵素の様な炎症性酵素、細胞内接着分子−１のような接着分子を含むサイトカインを分泌する。これらの生成物は、病因に関係なく心臓病患者の心臓、並びに実験的心臓機能不全を有する動物の心臓で増加する。これらの生成物は、炎症及び免疫応答を介在し、全てＮＦ−κＢにより調節される。興味深いことに、前炎症サイトカインであるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの発現はＮＦ−κＢの活性化を必要とするだけでなく、逆にその活性化を引き起こす。このタイプのポジティブレギュレーションループは、局所炎症反応を増強し及び永続的にし得る。この観点から、ウイルス性心筋炎を治療するために抗サイトカイン又は免疫調節剤を利用する幾つかの治療法が報告された。しかしながら、薬物送達の伝統的な方法は、組換え蛋白質に適用されるとき多くの落とし穴：短持続性の効力、頻回投与の必要性、及び最も重要である蛋白質を送達することの不適切さ、を有する。例えば、ＩＬ−１βは実験的敗血症の間１５０−２００ｐｇ／ｍｌの最大濃度に達し、ＩＬ−１受容体を発現する細胞中のＩＬ−１応答の５０％を抑制するために１０〜１００倍過剰量のＩＬ−１ｒａが要求される（Ｂｒｅｓｎｉｈａｎら，１９９８；Ｇｒａｎｏｗｉｔｚら，１９９１）。この研究で、本発明者はｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションを用いた遺伝子導入を行うことによりこれらの落とし穴を克服した。この方法により高レベルのサイトカインが血清中で得ることができる。
ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＩＬ−１の多くの作用をｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの両方でＩＬ−１受容体に競合することで抑制する。ＩＬ−１のアゴニスト効果は、部分的にはＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１受容体の相互作用により調節される。組換えＩＬ−１ｒａの投与は、マウスにおけるＴＮＦ投与による致死率を改善し、ＬＰＳの腹腔内投与は、正常マウスよりもＩＬ−１ｒａノックアウトマウスでより致死的である（Ａｒｅｎｄら，１９９８；Ｅｖｅｒａｅｒｄｔら，１９９４）。一方、内因性ＩＬ−１ｒａを欠損するマウスは正常マウスよりもＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの感染により感受性が低く、これはＩＬ−１は細胞内生物による感染に対する抵抗性に重要な役割を果たしているという考えを支持する。これらの研究は、内因性ＩＬ−１及びＩＬ−１ｒａの間のｉｎｖｉｖｏバランスが感染に対する宿主応答の影響に重要であることを確立する。ウイルスベクターを用いたＩＬ−１ｒａ遺伝子導入は最近関節炎及び虚血性脳障害のような炎症性疾患の実験的動物モデルで調べられた（Ｈｕｎｇら，１９９４；Ｍａｋａｒｏｖら，１９９６；Ｏｔａｎｉら，１９９６；Ｙａｎｇら，１９９７；Ｙａｎｇら，１９９８；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら，１９９９）；。これらの研究のデータは、ＩＬ−１ｒａの治療的非有用性及びｉｎｖｉｖｏでの炎症細胞の活性化におけるＩＬ−１の重要な役割を示唆する。本発明の研究は、遺伝子導入によりＩＬ−１ｒａを用いた心筋炎治療のための新規な治療的アプローチを示唆し、そこでは、導入効率がエレクトロポレーションによって増大された。本発明者はさらにＩＬ−１ｒａが心筋損傷を軽減するメカニズムを分析した。ＩＬ−１経路は、心筋層のｉＮＯＳの調節に決定的な役割を果たす（Ｕｎｇｕｒｅａｎｕ−Ｌｏｎｇｒｏｉｓら、１９９５）。ＴＮＦ−αは培養心筋細胞に直接的細胞障害性効果及び負の変力作用を有し、さらに細胞障害性Ｔ細胞を活性化し、それは筋細胞障害を引き起こし得る（Ｐｉｎｓｋｙら，１９９５；Ｙｏｋｏｙａｍａら，１９９３；Ｗｏｏｄｌｅｙら，１９９１）。ＴＮＦ−αが免疫応答の非常に初期の段階で重要な役割を果たすこと、及び抗ＴＮＦ−α ｍＡｂの投与は急性ウイルス性心筋炎の初期の経路を妨げ得ることが示唆された（Ｙａｍａｄａら，１９９４）。本研究では、ＩＬ−１ｒａでの処置がｉＮＯＳ及びＴＮＦ−α発現の抑制により心筋を保護し得る。
ＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０は両方とも本発明の心筋炎のマウスモデルに有効な処置であったが、ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションそのものによる処置はＥＭＣＶ接種されたマウスの生存率を変化させなかった。ＩＬ−１０はウイルス感染の初期の免疫応答の重要なレギュレータであると考えられる。ウイルス誘導された脳脊髄炎を有するＩＬ−１０ノックアウトマウスで致死率及び炎症は増大する（Ｌｉｎら，１９９８）。最近、本発明者は組換えＩＬ−１０を用いた処置が、致死率及び心筋炎のマウスモデルにおける心臓でのサイトカイン発現を減少することを示した（Ｎｉｓｈｉｏら，１９９９）。本発明では、ｖＩＬ−１０処置はこの実験的心筋炎の効果を強力に改善した。細胞性ＩＬ−１０及びｖＩＬ−１０は多くの免疫抑制特性を共有する：それらは、ともに活性化マウスＴｈ１クローン、ヒト末梢性単核細胞、ヒトナチュラルキラー細胞によるＩＮＦ−γ産生を抑制する（Ｈｓｕら，１９９０；Ｖｉｅｉｒａら，１９９１；ｄｅＷａａｌＭａｌｅｆｙｔら，１９９１）。以前の報告によると、ＩＦＮ−γの発現の減少は、ｖＩＬ−１０処理群でも観察された。ｖＩＬ−１０はＥＢウイルスにより捕捉された細胞性サイトカインであると考えられる。しかしながら、ＩＬ−１０及びｖＩＬ−１０の効果の間にいくつかの相違がある。ｖＩＬ−１０はＩＬ−１０に比してサイトカイン合成抑制因子としては活性が低いが、それは単球、リンパ球及び肥満細胞に対するＩＬ−１０の免疫刺激活性のいくつかを欠如する。それゆえ、ｖＩＬ−１０は優れた免疫抑制を提供し得る（Ｄｒａｚａｎら，１９９６；Ｄｅｂｒｕｙｎｅら，１９９８；Ｈｅｎｋｅら，２０００）。これらの相違は、ＩＬ−１０と比較して心筋炎の作用を減少する点に関するｖＩＬ−１０の優れた効果を説明し得る。最近、ＩＬ−１０及びｖＩＬ−１０の異なる活性の構造的基礎が解明された（Ｄｉｎｇら，２０００）。該結果は、単一アミノ酸がＩＬ−１０の免疫刺激活性に重要であることを示唆する。本発明者のモデルでは、心筋層におけるｉＮＯＳ発現はまたｖＩＬ−１０処理マウスで抑制され、単球／マクロファージの直接的脱活性化またはＩＦＮ−γの阻害を介した間接的脱活性化を示唆する。ＬＰＳ−刺激白血球では、ＩＬ−１０はｍＲＮＡ安定化によりＩＬ−１ｒａを誘導することが知られ、一方、それはＩＬ−１β、ＴＮＦ及びＩＬ−８の産生を抑制する（Ｃａｓｓａｔｅｌｌａら，１９９４；Ｃｈｏｍａｒａｔら，１９９５）。ｖＩＬ−１０がＩＬ−１ｒａを誘導するかどうかは不明であるが、ｖＩＬ−１０を導入されたマウスはＩＬ−１ｒａの上昇した血清濃度（８７４ｐｇ／ｍｌ）を示す。このｖＩＬ−１０の付加的な効果は、ＩＬ−１ｒａと比較して、そのより高い有効性を説明するかもしれない。
サイトカイン発現の１つの一般的な効果はｉＮＯＳの誘導である。一酸化窒素（ＮＯ）はＥＭＣＶにより誘導されるサイトカインに応答した亜急性期中に生成される。一酸化窒素は両刃の剣である（Ｂｅｃｋｍａｎら，１９９０；Ｂｅｃｋｍａｎ，１９９１）。一酸化窒素は免疫学的自己防御メカニズムのモジュレーターとして有用であり、同時に、それは病原菌を殺すのに重要な役割を果たす。逆に、ｉＮＯＳにより産生される過剰の一酸化窒素もウイルス性心筋炎及び自己免疫性心筋炎において心筋組織に有害な効果を与える。炎症性サイトカインの直接のネガティブ変力効果が一酸化窒素により介在されるかもしれない（Ｂａｌｌｉｇａｎｄら，１９９３；Ｕｎｇｕｒｅａｎｕ−Ｌｏｎｇｒｏｉｓら，１９９５）。この研究では、ｉＮＯＳ発現はＩＬ−１ｒａおよびｖＩＬ−１０投与の両方で抑制され、これは、一酸化窒素が心筋炎における心筋損傷のターミナルエフェクターであることを示唆する。結論として、本発明者は、（１）ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションがｉｎｖｉｖｏでサイトカインサイトカイン遺伝子を導入する有効な方法であること、（２）抑制性サイトカインＩＬ−１ｒａ及びｖＩＬ−１０の遺伝子導入が心筋炎のマウスモデルの死亡率を低下させること、（３）治療効果は心臓における免疫抑制性サイトカインの阻害にあることを実証した。これらの結果は、サイトカイン治療を開発する根拠を強力に支持し、ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションによるサイトカイン治療は心筋炎だけでなく、他の心血管系疾患に対する新規な治療的アプローチを切り開くものである。
本発明の治療剤によれば、免疫抑制性サイトカインを生体内で持続的に産生・放出することが可能となり、高価なサイトカイン蛋白質を頻回投与する必要がない。
また、疾患に関係する免疫抑制性サイトカインの種類を適切に選択し、あるいは組み合わせることにより、高レベルの免疫抑制性サイトカインを血液中で得ることができ、１以上の炎症・腫瘍性疾患を効率的に治療することができる。
本明細書に記載した文献を以下に列挙する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜図１Ｄは、導入遺伝子の発現を示す。
図１Ａは、１７−ｋＤａ蛋白質の成功した発現及びマウスＩＬ−１ｒａの正確なサイズを示すｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａでトランスフェクトされたＢＭＴ−１０細胞由来の培養上清のイムノブロットである。各レーンは、ｐＣＡＧＧＳでトランスフェクトされた細胞及びｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−１ｒａでトランスフェクトされた細胞、及び組換えマウスＩＬ−１ｒａを示す。
図１Ｂは、ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションの５日後のＩＬ−１ｒａの血清レベルである。ＩＬ−１ｒａ濃度は、ＥＭＣＶ−接種マウス（ｎ＝５）は未感染コントロールマウス（ｎ＝４）（ｐ＜０．００５）より３．５倍高く、ＩＬ−１ｒａ遺伝子導入（ＩＬ−１ｒａ−ＥＭＣＶ）（ｎ＝５）は、ＥＭＣＶ−接種マウス（ＰＢＳ−ＥＭＣＶ）よりもさらに１．９倍（ｐ＜０．０１）血清ＩＬ−１ｒａレベルを増加させる。
図１Ｃにおいて、タイムコースは、ＩＬ−１ｒａの血清濃度は（０日目と比較して、ｐ＜０．０１）第５日にピークとなり、その後徐々に減少する（それぞれｎ＝３）。
図１Ｄにおいて、ｉｎｖｉｖｏエレクトロポレーションの導入５日目の血中濃度はＩＬ−１ｒａ（１７３４ｐｇ／ｍｌ），ｖＩＬ−１０（２２９４ｐｇ／ｍｌ）（それぞれｎ＝５）であった。
図２Ａ〜図２Ｃは、ＥＭＣＶ接種後の生存曲線を示す。
図２Ａにおいて、生存曲線の分析は、ＩＬ−１ｒａ処理群（○；ｎ＝１７）がＰＢＳ−処理群（□；ｎ＝２９）よりも有意に高い生存率を示した（ｐ＜０．０５）。
図２Ｂにおいて、ｖＩＬ−１０遺伝子導入（□；ｎ＝１９）もＰＢＳ処理（○；ｎ＝２７）と比較してＥＭＣＶで接種されたマウスの死亡率を減少した（ｐ＜０．０１）。
図２Ｃにおいて、空のｐＣＡＧＧＳ導入（□；ｎ＝１０）はＰＢＳ処理（○；ｎ＝１０）と比較して生存曲線を変化しない。
図３Ａは、組織学的知見である。図３Ａにおいて、心筋浸潤の定量的病理学的スコアは、ＩＬ−１ｒａ処理群及びｖＩＬ−１０処理群（各々ｎ＝５）の両方における有意な改善を示す（ＩＬ−１ｒａ処理群ｖｓコントロール、ｐ＜０．０１；ｖＩＬ−１０処理群ｖｓコントロールｐ＜０．０１）。下のパネルは各群の代表的な組織学的結果を示す。
図３Ｂは、可溶性ｃ−ｋｉｔ遺伝子導入によるＥＭＣＶ接種後６日後の組織学的知見を示す。図３Ｂにおいて、細胞浸潤の定量的病理学的スコアは可溶性ｃ−ｋｉｔ処理群（ｎ＝７、１．４±０．７平均±標準偏差）で空プラスミド群（ｎ＝９、０．９±０．４）に対し有意な改善を示す（ｐ＜０．０５）。
図４は、心臓におけるサイトカイン発現を示す。図４ＡのＩＬ−１ｒａ導入マウスにおいて、心臓におけるＴＮＦ−α及びｉＮＯＳの発現レベルは有意に減少した（各々ｎ＝５）。図４ＢのｖＩＬ−１０導入マウスにおいて、心臓におけるＩＦＮ−γ及びｉＮＯＳの発現レベルは有意に減少した。ＩＬ−１βもｖＩＬ−１０処理群において減少した（各々ｎ＝５）。Technical field
The present invention relates to a therapeutic agent for inflammatory / neoplastic diseases.
Background art
Heart disease is one of the leading causes of death in developed countries. Acute viral myocarditis, among others, is characterized by multifocal inflammation of the heart, leading in the chronic phase to dilated cardiomyopathy (DCM), ventricular aneurysm, arrhythmogenic right ventricular dysplasia. Encephalomyocarditis (EMC) virus induces myocarditis in mice, and studies using this experimental model have provided important insights into the mechanisms of myocarditis and DCM (Matsumori, 1997). In this model, cellular immunity is activated, and enhanced cytokine expression and activation of cytotoxic T cells and macrophages in the myocardium are observed. Thus, the immune system is considered a therapeutic target.
Direct viral disorders and the host immune response play an important role in the pathogenesis of viral heart disease (Bowles et al., 1998). While the immune response plays an important role in fighting viral infections, it can have detrimental effects on the host by improperly attacking cardiomyocytes. The balance between such protective and adverse effects may ultimately determine the prognosis of the disease. In addition, increased expression of inflammatory cytokines in the heart may be involved in reduced myocardial function associated with viral myocarditis (Shioi et al., 1996). Cytokine mRNAs, including interleukin (IL) -1β, tumor necrosis factor (TNF) -α, and interferon (IFN) -γ, are induced 3 days after virus inoculation, at which time cellular infiltration is almost observed None (Shioi et al., 1996).
IL-1 receptor antagonists (IL-1ra) are members of the IL-1 family and bind to the IL-1 receptor but do not elicit an intracellular response and are important endogenous anti-inflammatory proteins. (Arend et al., 1998; Bresnihan et al., 1998). Viral IL-10 (vIL-10) is considered a cellular cytokine captured by the EB virus and shares many of the anti-inflammatory properties of cellular IL-10, but lacks immunostimulatory effects and therefore It can provide excellent immunosuppression. These are promising candidates for therapeutic agents for viral myocarditis.
Although an anti-inflammatory agent utilizing an immunosuppressive cytokine is described in JP-A-2000-239182, administration of the cytokine as a protein has the disadvantage of being very costly.
In addition, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-4715 discloses a plasmid incorporating a cytokine gene. The publication discloses a specific method for treating inflammation such as myocarditis using such a plasmid. Is not listed.
An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for inflammatory and neoplastic diseases capable of producing an immunosuppressive cytokine in a living body.
Disclosure of the invention
The present invention provides the following therapeutic agents for inflammatory and neoplastic diseases.
(1) A therapeutic agent for inflammatory / neoplastic diseases, comprising as an active ingredient an expression vector containing an immunosuppressive cytokine gene and / or a soluble cytokine receptor gene in an expressible state.
(2) The therapeutic agent according to (1), wherein the immunosuppressive cytokine and / or soluble cytokine receptor gene is at least one selected from the group consisting of IL-1ra, vIL-10 and soluble c-kit.
(3) The therapeutic agent according to (1), wherein the inflammatory / neoplastic disease is a cardiovascular disease.
(4) The therapeutic agent according to (3), wherein the inflammatory / neoplastic disease is myocarditis.
(5) An inflammatory / neoplastic method comprising administering a therapeutically effective amount of an expression vector containing an immunosuppressive cytokine gene and / or a soluble cytokine receptor gene in an expressible state to a patient suffering from an inflammatory / neoplastic disease. How to treat the disease.
(6) The method according to (5), wherein after administration of a therapeutically effective amount of the expression vector, an electric pulse is applied so as to sandwich the administration site.
(7) The method according to (5), wherein the immunosuppressive cytokine and / or soluble cytokine receptor gene is at least one selected from the group consisting of IL-1ra, vIL-10 and soluble c-kit.
(8) The treatment method according to (5), wherein the inflammatory / neoplastic disease is a cardiovascular disease.
(9) The treatment method according to (8), wherein the inflammatory / neoplastic disease is myocarditis.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, as the immunosuppressive cytokine, IL-1α, IL-1β, IL-1ra, vIL-10, IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, and 12 are used. , 13, 14, 15, 16, 17, 18, and 18 interleukins, interferons (α, β, γ), TNF-α, TGF-β, GM-CSF, EGF, FGF, RANTES, I-309 / TCA −3, γIP-10, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MCP-1,2,3, M-CSF, G-CSF, EPO, TPO, SCF, LIF, PDGF, KGF, IGF, NGF , BDNF, CDTF, OSM, HGF and the like. The soluble cytokine receptors for these cytokines also include soluble cytokine receptors. For example, soluble c-kit is exemplified for SCF, and soluble TNF-α receptor is exemplified for other cytokines such as TNF-α. The gene sequences of these immunosuppressive cytokines are known, and it is particularly preferable to use human immunosuppressive cytokine genes.
As an expression vector, for example, pCAGGS can be used, and a promoter / enhancer sequence, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like can be appropriately used in combination. Construction of a cytokine expression vector containing an immunosuppressive cytokine gene in an expressible state can be easily performed by those skilled in the art with reference to, for example, the following description of the present specification and the description of JP-A-2000-4715. be able to.
Inflammatory / neoplastic diseases include cardiovascular diseases such as myocarditis, encephalomyocarditis, dilated cardiomyopathy, heart failure, coronary arteritis, early coronary sclerosis of transplanted hearts, vasculitis, aorticitis, arthritis, back pain, and gout , Bronchial asthma, diffuse lung disease, atopy, allergy, hepatitis, cirrhosis, nephritis, gastric ulcer, enteritis, encephalomyelitis, multiple sclerosis, autoimmune disease, cancer, myeloma and the like.
In the present invention, the combination of a specific immunosuppressive cytokine and the disease to be treated includes interferon α (chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, renal cancer, malignant melanoma, chronic T-cell leukemia, hepatitis), interferon β (brain tumor, hepatitis), interferon γ (chronic granulomatosis), IL-2 (primary immunodeficiency, malignant melanoma, kidney cancer, liver cancer), IL-6 (thrombocytopenia), IL-11 (Thrombocytopenia), Epo (thrombocytopenia), MCSF (thrombocytopenia, acute leukemia, neutropenia), GCSF (acute leukemia, neutropenia), IL-3 (neutropenia) ), GMCSF (neutropenia) and SCF (neutropenia).
The therapeutic agent for inflammatory / neoplastic diseases of the present invention is preferably administered by parenteral route such as injection (intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraorgan, etc.) using any solvent such as physiological saline. Can be. The administration site is preferably in the muscles of the extremities. The therapeutically effective amount is about 0.00001 mg to 1000 mg, preferably about 0.001 mg to 100 mg, more preferably about 0.01 to 10 mg per day for an adult, and may be administered once or in divided doses.
It is preferable that the therapeutic agent for inflammatory and neoplastic diseases of the present invention is subjected to electroporation that gives an electric pulse across the administration site after administration, preferably immediately after administration. The electric pulse is, for example, a DC pulse having an arbitrary pulse shape, pulse width, pulse frequency, voltage, and the like. These pulse variables, pulse application time, and the like depend on the type of the target animal (preferably human), the expression plasmid DNA, It can be set appropriately according to the injection site, injection amount, and the like. Electroporation is preferably performed by inserting electrodes at a plurality of points around the administration site, applying a voltage of about 50 to 100 V, a rectangular waveform, a pulse width of about 0.1 to about 100 ms, and a pulse frequency of 1 to 100 ms. 10 pulses / sec, the number of times is 1 to 10 times.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, an example of treating myocarditis using vIL-10, IL-1ra and soluble c-kit (SCF receptor) as immunosuppressive cytokines will be described. An agent for treating a neoplastic disease can be obtained.
Methods and results
・ Mouse model of myocarditis
Four week old inbred male DBA / 2 mice were inoculated intraperitoneally with 10 pfu of the M mutant of encephalomyocarditis virus (EMCV) diluted in phosphate buffered saline (PBS).
・ Plasmid DNA
The mouse IL-1ra cDNA was transferred to the mouse macrophage cell line J774A. 1 was extracted by PCR from the total RNA extracted. Plasmid pCAGGS-IL-1ra was constructed by inserting mouse IL-1ra cDNA into the XhoI site between the CAG promoter and the 3′-flanking sequence of the rabbit β-globulin gene on the pCAGGS expression vector (Niwa et al., 1991). ). Similarly, the plasmid pCAGGS-vIL-10 was constructed by inserting the mouse vIL-10 cDNA into the EcoRI site of a pCAGGS expression vector (Nitta et al., 1998). vIL-10 was derived from pcDSRα-BCRF (Suzuki et al., 1995). Similarly, plasmid pCAGGS-c-kit was similarly constructed by inserting the mouse c-kit cDNA into the EcoRI site of the pCAGGS expression vector. c-kit was derived from pCAGn-c-kit-hFc(Kataoka, Takakura et al., 1997.). Plasmids were propagated in E. coli strain DH10B cells, extracted by alkaline lysis method, and purified by two cycles of ethidium bromide-CsCl equilibrium density gradient centrifugation. The plasmid was further purified by isopropanol precipitation, phenol extraction, phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Plasmid DNA was then dissolved in PBS.
・ In vivo electroporation
Mice were anesthetized with sodium pentobarbital. Plasmid DNA (75 μg, 1.5 μg / μl each) was injected into bilateral tibialis anterior muscle and electrical pulses were given as previously described (Aihara et al., 1998). Briefly, a pair of electrode needles was inserted into the muscle at a depth of 5 mm to serve as a DNA injection site. Six pulses were emitted to both muscles by an electric pulse generator (Electro Square Porator T820M; BTX, San Diego, Calif.) At a rate of 1 pulse / sec, each pulse having a duration of 50 msec.
・ SDS-PAGE and Western blotting
pCAGGS-IL-1ra and pCAGGS were transfected into BMT-10 cells using Lipofectamine 2000 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Two days after transfection, the culture supernatant was combined with one-third volume of SDS sample buffer (75 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% SDS, 15% glycerol, 15% ME and 0.015% bromophenol blue). Mix, heat at 98 ° C. for 5 minutes, and run on SDS-PAGE on a 15% polyacrylamide gel. Recombinant mouse IL-1ra was simultaneously loaded on the gel. After electrophoresis, the samples were transferred onto a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore Corp., Bedford, Mass.). The membrane was incubated with goat anti-IL-1ra polyclonal antibody (R & D Systems, Minneapolis, MN) for 3 hours at room temperature and washed. The membrane was then incubated for 1 hour at room temperature with biotinylated anti-goat IgG2a, washed, and autoradiographed using chemiluminescence (ECL kit; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) according to the manufacturer's specifications. .
・ ELISA
For IL-1ra ELISA, serum samples obtained from mouse tail vein were assayed using an ELISA kit (Biosource International, Camarillo, Calif.) According to the supplier's specifications. Serial dilutions of recombinant mouse IL-1ra (R & D system) were used as standards. Serum concentrations of vIL-10 were assayed as follows: 96-well plates were coated overnight at 4 ° C. with 2 μg / ml rat anti-IL-10 mAb, JES3-9D7 (PharMingen) and contained 1% BSA. The plate was washed with PBS for 1 hour at room temperature. After washing with PBS containing 0.05% Tween (PBS / Tween), appropriately diluted samples were added to the wells. Plates were incubated overnight at 4 ° C. and washed with PBS / Tween. Biotinylated rat anti-IL-10 mAb (JES3-12G8; 2 μg / ml, PharMingen) was added to the wells and the plates were incubated at room temperature for 3 hours with vigorous shaking. After washing with PBS / Tween, diluted streptavidin horseradish peroxidase complex was added to the wells. Plates were incubated for 30 minutes at room temperature and washed with PBS / Tween. Substrate (o-phenylenediamine) was added to the wells and the absorbance at 490 nm was measured with a microplate reader. Recombinant vIL-10 (PharMingen) was used as a standard, and the linear range of this ELISA system was 30-2000 pg / ml. This ELISA system does not detect mouse IL-10.
・ Histological findings
Hearts were fixed in 10% formalin, embedded on paraffin, sectioned, and stained with Masson's trichrome stain. Heart section specimens were photographed with a CCD camera and the area of all heart section specimens and the area of the infiltration zone were measured in a blind fashion with NIH image software. The extent of cell invasion was calculated by dividing the area of the invasion zone by the area of the whole heart section specimen.
・ Real-time PCR
Total RNA was extracted from mouse hearts by guanidine thiocyanate-cesium chloride centrifugation. RNA was reverse transcribed using an oligo dT primer and Superscript II reverse transcriptase (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Real-time quantitative PCR was performed using ABIPRISM ™ 7700 System (PE Biosystems, Foster City, Calif.) (Overbergh et al., 1999) to measure levels of cytokine mRNA in the heart. The primer pairs and probes used for these analyzes are as follows.

These probes were designed to include intron sequences to distinguish appropriate PCR products from amplification products from contaminated genomic DNA. The 5 'and 3' ends of the probe were labeled with 6-carboxyfluorescein and 6-carboxytetramethylrhodamine, respectively.
・ Statistical analysis
Survival was analyzed by the Kaplan-Meier method. Statistical comparisons were made by log-rank test and ANOVA. Histological findings, cytokine serum levels and cardiac cytokine expression were compared using the Student's t-test.
result
・ Expression of introduced genes
Mouse IL-1ra and vIL-10 and c-kit were inserted into pCAGGS expression vector to obtain pCAGGS-IL-1ra and pCAGGS-vIL-10 and pCAGGS-c-kit. Immunoblotting of culture supernatants from BMT-10 transfected with pCAGGS-IL-1ra showed successful expression of the 17 kDa protein, a mouse IL-1ra of the correct size (FIG. 1A). Similarly, vIL-10 expression was confirmed by transient transfection of pCAGGS-vIL-10 into BMT-10 cells. Similarly, c-kit expression was confirmed by transient transfection of pCAGGS-c-kit into BMT-10 cells. To determine whether electroporation of each plasmid resulted in physiologically significant levels of protein, 75 μg of plasmid was injected into bilateral tibialis anterior muscles of EMCA-vaccinated DBA / 2 mice and introduced. Serum levels of IL-1ra or vIL-10 were measured by ELISA 5 days after electroporation when the gene expression level was expected to be at its peak (FIG. 1B; Aihara et al., 1998). IL-1ra concentrations were 3.5-fold higher in EMCV-inoculated mice than in uninfected control mice (p <0.005), and IL-1ra gene transfer further increased serum IL-1ra levels by 1.9-fold (P <0.01, compared to EMCV infected mice). Serum concentrations of IL-1ra were determined 0, 3, 5, 7, and 14 days after electroporation into uninfected mice. In the time course, the serum concentration of IL-1ra peaked on day 5 (p <0.01, compared with day 0), and then gradually decreased (FIG. 1C). (Wells, 1993; Vitadello et al., 1994). The vIL-10 concentration 5 days after in vivo electroporation was 2294 pg / ml (FIG. 1D). These results clearly indicate that in vivo electroporation is superior for delivering cytokines systemically.
-Introduction of IL-1ra and vIL-10 and soluble c-kit for myocarditis
Applying the in vivo electroporation method, the present inventors attempted cytokine gene therapy for experimental myocarditis. Four week old DBA / 2 male mice were inoculated with 10 pfu of EMCV. Less than 20% of these mice survived 14 days after inoculation. Statistical analysis of the results of the IL-1ra gene transfer revealed that the treatment group showed significantly higher survival (FIG. 2A). vIL-10 gene transfer also reduced mortality after EMCV inoculation (FIG. 2B) and resulted in slightly better survival than IL-1ra transfer. These data suggested that the two inhibitory cytokines had a beneficial effect. To exclude the possibility of the plasmid itself having an effect, empty pCAGGS plasmid was similarly introduced into infected mice and the viability compared to PBS-injected mice. As shown in FIG. 2C, introduction of the empty plasmid did not change the survival curve.
In the case of the soluble c-kit gene transfer, 5 out of 10 animals died in the empty pCAGGS plasmid group, whereas there were no deaths in 10 animals in the soluble c-kit gene transfer group, and the mortality after EMCV inoculation was significantly reduced. Decreased (p <0.05).
・ Histological findings
In the IL-1ra and vIL-10 treated groups, heart section specimens were evaluated histologically on day 5, when inflammation progressed but none of the mice died (FIG. 3A). Quantitative pathological scores for myocardial invasion showed a clear improvement in both the IL-1ra and vIL-10 treatment groups, indicating that the improvement in survival was due to a reduction in myocardial damage. Suggested. Cell invasion of myocardium was also reduced by introduction of soluble c-kit gene (FIG. 3B).
・ Cytokine expression in heart
To further elucidate the mechanisms underlying the beneficial effects of IL-1ra and vIL-10, expression levels of inflammatory genes in the heart were measured by real-time quantitative PCR. In IL-1ra transfected mice, expression of TNF-α and iNOS was suppressed to 47% and 83% of the level seen in untreated mice (TNF-α, p <0.001; iNOS, p <0.05; On the other hand, IFN-γ and iNOS were suppressed to 14% and 16%, respectively, in the vIL-10-introduced mouse (IFN-γ, p <0.01; iNOS, p <0.005; FIG. 4B ). IL-1β was also reduced in the vIL-10 treated group. Differences in the expression patterns of these inflammatory genes suggest that these two immunomodulatory processes elicit their therapeutic effects by different mechanisms.
Currently, infections are thought to be involved in the pathogenesis of many heart diseases. Viral myocarditis is of particular concern and has various forms (Matsumori, 1997). In the past few years, cytokines, especially proinflammatory cytokines such as IL-1β and TNF-α, have been increasingly recognized as important factors in the pathogenesis of myocarditis and cardiomyopathy. In response to various forms of stress, the heart is stimulated by pro-inflammatory cytokines such as IL-1β and TNF-α, chemokines such as monocyte chemotactic protein-1, and inflammation such as inducible nitric oxide synthase. It secretes cytokines, including sex enzymes, adhesion molecules such as intracellular adhesion molecule-1. These products are increased in the heart of patients with heart disease, regardless of etiology, as well as in animals with experimental cardiac dysfunction. These products mediate inflammatory and immune responses and are all regulated by NF-κB. Interestingly, the expression of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α not only requires activation of NF-κB, but conversely causes its activation. This type of positive regulation loop can enhance and make the local inflammatory response permanent. In this regard, several treatments have been reported that utilize anti-cytokines or immunomodulators to treat viral myocarditis. However, traditional methods of drug delivery have many pitfalls when applied to recombinant proteins: short-lasting efficacy, the need for frequent dosing, and the inadequacy of delivering the most important protein. And For example, IL-1β reaches a maximum concentration of 150-200 pg / ml during experimental sepsis and a 10-100 fold excess to suppress 50% of the IL-1 response in cells expressing the IL-1 receptor. Quantities of IL-1ra are required (Bresnihan et al., 1998; Granowitz et al., 1991). In this study, we overcome these pitfalls by performing gene transfer using in vivo electroporation. In this way, high levels of cytokines can be obtained in serum.
IL-1ra is a member of the IL-1 gene family and suppresses many effects of IL-1 by competing with the IL-1 receptor both in vitro and in vivo. The agonist effect of IL-1 is regulated, in part, by the interaction of IL-1ra and the IL-1 receptor. Administration of recombinant IL-1ra improves mortality due to TNF administration in mice, and intraperitoneal administration of LPS is more lethal in IL-1ra knockout mice than in normal mice (Arend et al., 1998; Everaerdt et al.). , 1994). On the other hand, mice lacking endogenous IL-1ra are less susceptible to Listeria monocytogenes infection than normal mice, supporting the notion that IL-1 plays an important role in resistance to infection by intracellular organisms. I do. These studies establish that the in vivo balance between endogenous IL-1 and IL-1ra is important for the effect of host response to infection. IL-1ra gene transfer using viral vectors has recently been investigated in experimental animal models of inflammatory diseases such as arthritis and ischemic encephalopathy (Hung et al., 1994; Makarov et al., 1996; Otani et al., 1996; Yang). Yang et al., 1998; Fernandez et al., 1999); The data from these studies suggest the therapeutic non-usefulness of IL-1ra and a key role for IL-1 in activating inflammatory cells in vivo. The studies of the present invention suggest a novel therapeutic approach for the treatment of myocarditis with IL-1ra by gene transfer, where the transduction efficiency was increased by electroporation. The inventors have further analyzed the mechanism by which IL-1ra reduces myocardial damage. The IL-1 pathway plays a critical role in regulating myocardial iNOS (Ungureanu-Longgrois et al., 1995). TNF-α has a direct cytotoxic and negative inotropic effect on cultured cardiomyocytes, and further activates cytotoxic T cells, which can cause myocyte damage (Pinsky et al., 1995; Yokoyama et al., 1993; Woodley et al., 1991). It has been suggested that TNF-α plays an important role at the very early stages of the immune response, and that administration of anti-TNF-α mAbs can interfere with the early pathways of acute viral myocarditis (Yamada et al., 1994). In this study, treatment with IL-1ra may protect myocardium by suppressing iNOS and TNF-α expression.
Although both IL-1ra and vIL-10 were effective treatments in the myocarditis mouse model of the present invention, treatment with in vivo electroporation itself did not alter the survival of EMCV-vaccinated mice. IL-10 is thought to be a key regulator of the immune response early in viral infection. Mortality and inflammation are increased in IL-10 knockout mice with virus-induced encephalomyelitis (Lin et al., 1998). Recently, we have shown that treatment with recombinant IL-10 reduces mortality and cytokine expression in the heart in a mouse model of myocarditis (Nishio et al., 1999). In the present invention, vIL-10 treatment strongly improved the effects of this experimental myocarditis. Cellular IL-10 and vIL-10 share many immunosuppressive properties: they both suppress INF-γ production by activated mouse Th1 clones, human peripheral mononuclear cells, human natural killer cells (Hsu Vieira et al., 1991; deWal Malefyt et al., 1991). According to previous reports, a decrease in IFN-γ expression was also observed in the vIL-10 treated group. vIL-10 is thought to be a cellular cytokine captured by the EB virus. However, there are some differences between the effects of IL-10 and vIL-10. Although vIL-10 is less active as a cytokine synthesis inhibitor than IL-10, it lacks some of the immunostimulatory activity of IL-10 on monocytes, lymphocytes and mast cells. Therefore, vIL-10 may provide excellent immunosuppression (Drazan et al., 1996; Debryne et al., 1998; Henke et al., 2000). These differences may explain the superior effect of vIL-10 on reducing the effects of myocarditis as compared to IL-10. Recently, the structural basis of the different activities of IL-10 and vIL-10 has been elucidated (Ding et al., 2000). The results suggest that a single amino acid is important for the immunostimulatory activity of IL-10. In our model, iNOS expression in the myocardium was also suppressed in vIL-10 treated mice, suggesting direct deactivation of monocytes / macrophages or indirect deactivation via inhibition of IFN-γ. . In LPS-stimulated leukocytes, IL-10 is known to induce IL-1ra by mRNA stabilization, while it suppresses the production of IL-1β, TNF and IL-8 (Casatella et al., 1994; Chomarat et al.) , 1995). It is unknown whether vIL-10 induces IL-1ra, but mice transfected with vIL-10 show elevated serum concentrations of IL-1ra (874 pg / ml). This additional effect of vIL-10 may explain its higher efficacy compared to IL-1ra.
One common effect of cytokine expression is the induction of iNOS. Nitric oxide (NO) is produced during the subacute phase in response to cytokines induced by EMCV. Nitric oxide is a double-edged sword (Beckman et al., 1990; Beckman, 1991). Nitric oxide is useful as a modulator of immunological self-defense mechanisms, while at the same time it plays an important role in killing pathogens. Conversely, excess nitric oxide produced by iNOS also has deleterious effects on myocardial tissue in viral and autoimmune myocarditis. The direct negative inotropic effects of inflammatory cytokines may be mediated by nitric oxide (Balligand et al., 1993; Ungureanu-Longgrois et al., 1995). In this study, iNOS expression was suppressed by both IL-1ra and vIL-10 administration, suggesting that nitric oxide is a terminal effector of myocardial damage in myocarditis. In conclusion, the present inventors have determined that (1) in vivo electroporation is an effective method for introducing cytokine cytokine genes in vivo, and (2) gene transfer of suppressor cytokines IL-1ra and vIL-10. It has been demonstrated that the mortality of the mouse model of myocarditis is reduced, and (3) the therapeutic effect lies in the inhibition of immunosuppressive cytokines in the heart. These results strongly support the basis for developing cytokine therapy, and cytokine therapy by in vivo electroporation opens up new therapeutic approaches to myocarditis as well as other cardiovascular diseases.
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to the therapeutic agent of this invention, it becomes possible to produce | generate and release | release an immunosuppressive cytokine in a living body continuously, and it is not necessary to administer expensive cytokine protein frequently.
In addition, by appropriately selecting or combining the types of immunosuppressive cytokines related to diseases, high levels of immunosuppressive cytokines can be obtained in the blood, and one or more inflammatory / neoplastic diseases can be efficiently treated. Can be treated.
The documents described in this specification are listed below.

[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
1A-1D show transgene expression.
FIG. 1A is an immunoblot of culture supernatant from BMT-10 cells transfected with pCAGGS-IL-1ra showing successful expression of 17-kDa protein and the correct size of mouse IL-1ra. Each lane shows cells transfected with pCAGGS and cells transfected with pCAGGS-IL-1ra, and recombinant mouse IL-1ra.
FIG. 1B shows serum levels of IL-1ra 5 days after in vivo electroporation. The IL-1ra concentration was 3.5-fold higher in EMCV-inoculated mice (n = 5) than in uninfected control mice (n = 4) (p <0.005), and IL-1ra gene transfer (IL-1ra-EMCV). ) (N = 5) increase serum IL-1ra levels 1.9-fold (p <0.01) more than EMCV-vaccinated mice (PBS-EMCV).
In FIG. 1C, in the time course, the serum concentration of IL-1ra peaks on day 5 (p <0.01 compared to day 0) and then gradually decreases (n = 3 each).
In FIG. 1D, the blood concentrations on day 5 after the introduction of in vivo electroporation were IL-1ra (1734 pg / ml) and vIL-10 (2294 pg / ml) (n = 5 each).
2A-2C show survival curves after EMCV inoculation.
In FIG. 2A, analysis of the survival curve showed that the IL-1ra treated group (（; n = 17) showed significantly higher survival rate than the PBS-treated group (□; n = 29) (p <0.05). ).
In FIG. 2B, vIL-10 gene transfer (□; n = 19) also reduced the mortality of mice inoculated with EMCV compared to PBS treatment (○; n = 27) (p <0.01).
In FIG. 2C, empty pCAGGS introduction (□; n = 10) does not change the survival curve as compared to PBS treatment (○; n = 10).
FIG. 3A is a histological finding. In FIG. 3A, the quantitative pathological score of myocardial invasion shows a significant improvement in both the IL-1ra treated group and the vIL-10 treated group (n = 5 each) (IL-1ra treated group vs control, p <0.01; vIL-10 treatment group vs control p <0.01). The lower panel shows representative histological results for each group.
FIG. 3B shows histological findings 6 days after EMCV inoculation with soluble c-kit gene transfer. In FIG. 3B, the quantitative pathological score for cell invasion was the soluble c-kit treatment group (n = 7, 1.4 ± 0.7 mean ± SD) and the empty plasmid group (n = 9, 0.9 ± 0.4) (p <0.05).
FIG. 4 shows cytokine expression in the heart. In the IL-1ra-transfected mouse of FIG. 4A, the expression levels of TNF-α and iNOS in the heart were significantly reduced (n = 5 each). In the vIL-10-introduced mouse of FIG. 4B, the expression levels of IFN-γ and iNOS in the heart were significantly reduced. IL-1β was also reduced in the vIL-10 treated group (n = 5 each).

Claims

An agent for treating an inflammatory or neoplastic disease, comprising as an active ingredient an expression vector containing an immunosuppressive cytokine gene and / or a soluble cytokine receptor gene in an expressible state.

The therapeutic agent according to claim 1, wherein the immunosuppressive cytokine and / or soluble cytokine receptor gene is at least one selected from the group consisting of IL-1ra, vIL-10 and soluble c-kit.

The therapeutic agent according to claim 1, wherein the inflammatory / neoplastic disease is a cardiovascular disease.

The therapeutic agent according to claim 3, wherein the inflammatory / neoplastic disease is myocarditis.

Treatment of an inflammatory / neoplastic disease comprising administering to a patient suffering from an inflammatory / neoplastic disease a therapeutically effective amount of an expression vector containing an immunosuppressive cytokine gene and / or a soluble cytokine receptor gene in an expressible state. Method.

The therapeutic method according to claim 5, wherein after administration of a therapeutically effective amount of the expression vector, an electric pulse is applied so as to sandwich the administration site.

The method according to claim 5, wherein the immunosuppressive cytokine and / or soluble cytokine receptor gene is at least one selected from the group consisting of IL-1ra, vIL-10 and soluble c-kit.

The treatment method according to claim 5, wherein the inflammatory / neoplastic disease is a cardiovascular disease.

9. The treatment method according to claim 8, wherein the inflammatory / neoplastic disease is myocarditis.