JPWO2002045767A1 - Tissue regeneration base material, transplant material, and methods for producing them - Google Patents

Tissue regeneration base material, transplant material, and methods for producing them Download PDF

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Abstract

架橋剤である水溶性エポキシ化合物を添加した１％ヒアルロン酸水溶液を加温して濃縮し、ヒアルロン酸の分子間架橋物を得る。次いで、この分子間架橋物を真空凍結乾燥することにより、ヒアルロン酸スポンジを得る。このヒアルロン酸スポンジにアテロコラーゲン溶液を浸した後、真空凍結乾燥することにより、組織再生用基材を得る。A 1% aqueous solution of hyaluronic acid to which a water-soluble epoxy compound as a cross-linking agent is added is heated and concentrated to obtain a cross-linked product of hyaluronic acid. Next, the intermolecularly crosslinked product is freeze-dried in vacuo to obtain a hyaluronic acid sponge. After immersing the atelocollagen solution in this hyaluronic acid sponge, the substrate for tissue regeneration is obtained by freeze-drying under vacuum.

Description

技術分野
本発明は、医療分野に広く利用可能な組織再生用基材、移植用材料及びそれらの製法に関する。
背景技術
近年、細胞を培養し、組織を再構築する再生組織工学が注目されている。この再生組織工学では、生体親和性の高い種々の材料で形成された組織再生用基材に各種細胞を保持させ、培養することで移植用材料を得ている。
例えば、線維芽細胞等を組み込んだ培養皮膚ではコラーゲンスポンジが組織再生用基材として利用できることが知られており（特開平４−３３２５６１号公報）、最近では、コラーゲンに代えてヒアルロン酸が利用可能であることも示唆されている（特開平１１−３１９０６８号公報）。
ヒアルロン酸は、二糖繰り返し構造を持つムコ多糖の一種であり、主として動物の関節液や眼球硝子体、臍帯や真皮層などの結合組織などに存在する物質である。また、分子量のオーダーは数十万〜数百万であり、非常に多量の水と結合する性質があり、これが例えば関節の低摩擦性や皮膚真皮組織の保水性に関連している。また、損傷を受けた結合組織が修復するとき、ヒアルロン酸の産生が一時的に活発になり、組織再構築における細胞移動を促進する。このようなことから、ヒアルロン酸は創傷被覆材として優れた能力を発揮するものといえる。
しかしながら、ヒアルロン酸は創傷被覆材としては優れた能力を発揮するものの、含水性が非常に高いため、組織再生用基材として利用するには、細胞の接着性が低く、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での細胞培養が困難であるという問題があった。
本発明は上記問題点を解決することを課題とするものであり、ヒアルロン酸を主体とする組織再生用基材であって生体外での細胞培養と、移植後の組織再生に適したものを提供することを目的とする。また、この組織再生用基材の製法を提供することを別の目的とする。更に、この組織再生用基材を利用した移植用材料及びその製法を提供することを別の目的とする。
発明の開示
上記課題を解決するため、本発明者は鋭意研究の結果、下記の第１〜第４の発明を完成するに至った。
本発明の第１は、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体を主体としたヒアルロン酸スポンジと、前記ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面に生体由来の高分子材料からなるスポンジを積層させた細胞接着部とを備えたことを特徴とする。この組織再生用基材の細胞接着部は、生体由来の高分子材料からなるスポンジを積層したものであるため、組織再生用基材に組み込まれる細胞が良好に接着する。また、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体を主体としたヒアルロン酸スポンジを備えているため、細胞増殖の促進等の創傷治癒能力にも優れている。したがって、この組織再生用基材によれば、生体外での細胞培養と、移植後の組織再生を良好に行うことができる。また、細胞を高密度で播種した場合、従来のコラーゲンスポンジでは大きな収縮がみられるのに対して、本発明の組織再生用基材ではそのような収縮はほとんどみられない。この組織再生用基材は、細胞を組み込んで移植用材料として使用してもよいが、それ以外に創傷面を被覆する創傷被覆材として使用してもよい。
ここで、ヒアルロン酸の誘導体としては、例えばヒアルロン酸ナトリウムやヒアルロン酸カリウム等のヒアルロン酸金属塩のほか、ヒアルロン酸のヒドロキシル基やカルボキシル基等がエーテル化、エステル化、アミド化、アセタール化、ケタール化されたもの等が挙げられ、中でも、ヒアルロン酸ナトリウムが好ましい。また、ヒアルロン酸スポンジとしては、分子間架橋されたもの（架橋ヒアルロン酸スポンジ）が好ましい。また、生体由来の高分子材料としては、例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸等が挙げられるが、このうちコラーゲン特に抗原性の少ないアテロコラーゲンが好ましく、また、コラーゲン、ゼラチンは分子間架橋されたものが好ましい。
この組織再生用基材は、ヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との境界付近において、ヒアルロン酸スポンジに生体由来の高分子材料が入り込んだ状態になっていることが好ましい。この場合、ヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との膨潤率に差があったとしても、含水時に両者が剥がれたりするおそれがない。
この組織再生用基材は、ヒアルロン酸スポンジが支持体としての織布、不織布又は編物に支持されていることが好ましい。この場合、支持体によって組織再生用基材の強度が増し、ピンセットで摘んで持ち上げたりする際にも欠損するおそれがなく、ハンドリングが良好になる。ここで、支持体の材質としては、ヒアルロン酸スポンジを補強する役割を果たすものであれば特に限定されないが、例えばナイロン、ポリエステル、シリコーンなどの合成高分子材や、絹、木綿、麻などの天然高分子材等が挙げられる。
本発明の第２は、このような組織再生用基材の製法であって、（１）架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を得る架橋工程と、（２）前記分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るスポンジ化工程と、（３）前記ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより前記細胞接着部を形成する積層工程とを含むことを特徴とする。この製法では、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジとした上で、その少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと再度真空凍結乾燥を行う。この製法によれば、本発明の第１の組織再生用基材を比較的容易に作製できる。
ここで、架橋工程において、架橋剤としては、例えば水溶性エポキシ化合物やグルタールアルデヒド等が挙げられるが、そのうち水溶性エポキシ化合物が好ましい。この水溶性エポキシ化合物としては、例えばエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル等が挙げられる。架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合、その使用量はヒアルロン酸及び／又はその誘導体に対して、重量比で概ね１／２〜１／１０の割合であることが好ましく、特に１／５〜１／１０程度が好ましい。
この架橋工程においては、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を用いるが、この水溶液におけるヒアルロン酸及び／又はその誘導体の濃度は、用いるヒアルロン酸及び／又はその誘導体の種類や分子量等にもよるが、概ね０．５〜１．５重量％である。また、溶媒として用いる水としては、ｐＨ５〜６のイオン交換水が好ましい。
この架橋工程においては、架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋反応を行うが、加温して行うのが好ましい。濃縮時の温度は、架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合には、約３０〜６０℃が好ましく、約４０〜６０℃がより好ましく、約５０℃が特に好ましい。６０℃を越えるような高い温度で加熱すると混合液に気泡が生じて、得られるヒアルロン酸スポンジのスポンジ構造の均一性が十分でない場合がある。一方、３０℃より低い温度では、分子間架橋反応速度が小さくなり、所望の濃度の分子間架橋物を得るのに長時間を要することがある。また、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋反応は、中性領域（ｐＨ５〜８）又は酸性領域（ｐＨ３〜５）で行うことが好ましい。また、酸性領域で行うと、中性領域で行う場合に比べて濃縮時間が短くなる傾向にあるため、好ましい。
この架橋工程において、例えばヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液の濃度が１〜１０重量％、好ましくは２〜５重量％、特に好ましくは約５重量％になった時点で濃縮を終えることが好ましい。濃縮を十分行わなかった場合には、次のスポンジ化工程後に得られるヒアルロン酸スポンジの膨潤性を十分抑制できないことがあるため、好ましくない。即ち、ヒアルロン酸スポンジが高い膨潤性を有していると、例えば細胞培養時に液体培地等に浸した場合に必要以上に膨潤してしまい、その結果脆弱になると共に形状も大きくなるので、ハンドリングが困難になる。これに対して、上述のように濃縮の終点を制御すれば、ヒアルロン酸スポンジの膨潤性が十分抑制されるため、液体培地等に浸した場合に必要以上に膨潤することがなく、その結果脆弱になったり形状が大きく成りすぎることもないので、ハンドリングが容易になる。なお、濃縮液が完全にフィルム状になるまで架橋工程を行うと、真空凍結乾燥によるスポンジ化工程を行ったとしても、ヒアルロン酸スポンジは形成されないため、濃縮液がフィルム状になる前に濃縮の終点を設定する必要がある。
次に、スポンジ化工程においては、架橋工程後の分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るが、真空凍結乾燥時の温度条件は、大きな氷の結晶を形成させないために、約−８５℃〜−３０℃、好ましくは約−８５℃〜−５０℃、より好ましくは約−８５℃であり、真空条件は、３０×１０−３〜１００×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜１０Ｐａ）程度が好ましく、より好ましくは３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）である。
このスポンジ化工程においては、架橋工程で十分な濃縮を行えずに得られた分子間架橋物に対しては、凍結し解凍する操作を少なくとも１回以上行ったあと真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得ることが好ましい。真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作を行わなかった場合には、含水時に形状を保持しにくいスポンジになることがあるのに対して、真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作を行った場合には、おそらく水素結合のような分子間相互作用が促進された結果と思われるが、含水時に形状を保持しやすいスポンジが得られる。このように真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作は複数回行ってもよいが、製造工程の簡素化を考慮すれば１回行うことが好ましい。また、真空凍結乾燥前に凍結、解凍する操作における凍結の温度条件は、約−８５℃〜−３０℃、好ましくは約−８５℃〜−５０℃、より好ましくは約−８５℃であり、また、解凍の温度条件は約２０℃〜３０℃、好ましくは約３０℃付近である。但し、解凍時に温度を多段階に分けて加温して解凍してもよい。この場合には、分子間架橋物が割れたりしないように注意する。なお、架橋工程において適切な濃縮条件で、十分な濃縮を行って得られた分子間架橋物に対しては、十分な強度を有しているので、真空凍結乾燥前の凍結／解凍操作を必ずしも行う必要はない。
次の積層工程に移る前に、スポンジ化工程で作製したヒアルロン酸スポンジを洗浄する水洗工程を設けることが好ましい。この水洗工程においては、未反応の架橋剤を不活性化させる不活性化剤を洗浄水中に添加しておいてもよい。例えば、架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合には、不活性化剤としては、エポキシ基を開環させる機能を持ったもので生体に害を与えないものが好ましく、例えばグリシンが用いられる。
次に、積層工程においては、ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより細胞接着部を形成するが、生体由来の高分子材料としては既述の通り、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸等が挙げられ、このうちコラーゲン特に抗原性の少ないアテロコラーゲンが好ましい。また、生体由来の高分子材料の水溶液としては、０．２〜１．０重量％の水溶液、好ましくは０．２〜０．５重量％の水溶液、より好ましくは０．５重量％程度の水溶液を用いればよく、また、生体由来の高分子材料とヒアルロン酸との重量比は、１：２〜１０、好ましくは１：２〜４、特に好ましくは１：４程度とすればよい。また、真空凍結乾燥の条件は、スポンジ化工程における真空凍結乾燥の条件と同様である。
また、この積層工程では、ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させているため、得られた組織再生用基材のヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との境界付近において、ヒアルロン酸スポンジに生体由来の高分子材料が入り込んだ状態になっている。このため、ヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との膨潤率に差があったとしても、組織再生用基材を含水させた時に両者が剥がれたりするおそれがない。
この積層工程において、ヒアルロン酸スポンジの片面に複数の穴を開け、その穴を開けた片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより前記細胞接着部を形成してもよい。この場合、生体由来の高分子材料の水溶液は、ヒアルロン酸スポンジの有する多孔に浸透するのに加えて複数の穴にも入り込むため、ヒアルロン酸スポンジとの間にアンカーリングの効果も得られる。このようにして各穴や多孔に生体高分子材料の水溶液を浸透させた後真空凍結乾燥することにより、組織再生用基材におけるヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との密着性を一層向上させることができる。なお、ここでいう「穴」には、例えば丸穴や角穴などのような一般的な穴のほか、例えば切れ目や凹凸などのように平面に比べて接触面積が大きくなるようなものも含まれる。
この積層工程において生体由来の高分子材料としてコラーゲン又はゼラチンを用いた場合には、積層工程後に紫外線ランプを照射してコラーゲン又はゼラチンを部分的に分子間架橋することにより含水時にコラーゲン又はゼラチンが流出することを防止するのが好ましく、更にその後にエチレンオキサイドガス等により滅菌するのが好ましい。また、前述の水洗工程を行わなかった場合は、未反応の架橋剤を不活性化させるために、不活性化剤を生体由来の高分子材料の水溶液に添加しておくのが好ましい。不活性化剤としては前述と同様に、例えば、架橋剤として水溶性エポキシ化合物を用いた場合には、グリシン等のエポキシ基を開環させる機能を持ったもので生体に害を与えないものが好ましい。
ところで、前述のスポンジ化工程及び積層工程の代わりに、以下のスポンジ化・積層工程を採用してもよい。即ち、架橋工程後の分子間架橋物を生体由来の高分子材料の水溶液と接触させたあと真空凍結乾燥することにより前記ヒアルロン酸スポンジと共に細胞接着部を形成する工程を採用してもよい。この場合、真空凍結乾燥を一度だけで済ませることができるので、製造プロセスが簡略化される。
このスポンジ化・積層工程では、スポンジ化前の分子間架橋物に生体由来の高分子材料の水溶液を接触させるため、生体由来の高分子材料の水溶液がスポンジ化前の分子間架橋物に浸透しにくく、最終的に得られる組織再生用基材におけるヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との密着性が十分でないおそれがある。そこで、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物の上下方向に複数の穴を設け、生体由来の高分子材料の水溶液との接触面積を大きくしてアンカーリングの効果を得ることが好ましい。このようにして各穴に生体高分子材料の水溶液を浸透させたあと真空凍結乾燥することにより、組織再生用基材におけるヒアルロン酸スポンジと細胞接着部との密着性を向上させることが好ましい。なお、ここでいう「穴」には、例えば丸穴や角穴などのような一般的な穴のほか、例えば切れ目や凹凸などのように平面に比べて接触面積が大きくなるようなものも含まれる。
このスポンジ化・積層工程を採用してヒアルロン酸スポンジが支持体に支持された組織再生用基材を作製するには、例えば以下のような手順で行う。即ち、予め容器の底面に支持体を敷いておき、架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液をこの容器内に入れる。その後、この水溶液を加温して濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を作製する。その後、この容器内で分子間架橋物の上下方向に複数の穴を設け、生体由来の高分子材料の水溶液を加えて分子間架橋物と接触させ、真空凍結乾燥する。なお、必要に応じて、真空凍結乾燥前（例えば穴を設ける前あるいは穴を設けた後）に、分子間架橋物を凍結し解凍する操作を行ってもよい。このような操作を行うことにより、強度が向上し、含水時に形状を保持しやすいスポンジが得られる。
本発明の第３は、移植用材料であって、上述の組織再生用基材と、この組織再生用基材の細胞接着部に保持された細胞とを備えたことを特徴とする。この移植用材料は、細胞が細胞接着部に密着性よく保持されているため生体外で容易に細胞培養が可能であり、しかもヒアルロン酸の細胞移動の促進や保湿効果による創傷治癒能力により組織が適切に再生される。ここで、細胞接着部に保持される細胞はどのような細胞であってもよいが、線維芽細胞、角化細胞、色素産生細胞、血管内皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、ランゲルハンス島細胞等が挙げられる。例えば他人由来の線維芽細胞を保持させた移植用材料を使用するには、皮膚創傷部にこの移植用材料を移植し、抗菌剤を含有する膜（例えばポリウレタン膜）で被覆し、更に包帯で被覆する。そのようにすると、他人由来の線維芽細胞から産生される各種サイトカインにより治癒が促進される。
本発明の第４は、このような移植用材料の製法であって、上述の組織再生用基材を作製したあと、この組織再生用基材の細胞接着部に細胞を組み込むことを特徴とする。この製法によれば、本発明の第３の移植用材料を比較的容易に作製できる。ここで、細胞接着部に細胞を組み込む方法としては、例えば、組織再生用基材を培養液に浸漬させると共に細胞を孔内へ取り込ませることにより保持する方法がある。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の好適な実施例について説明する。本発明は、下記実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下において「％」は特に断りのない限り重量％を表す。
（実施例１）
［１］組織再生用基材の作製（図１参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約２００万）１０ｇを蒸留水１Ｌに溶解して１％ヒアルロン酸水溶液（ｐＨ６）を作製した。ヒアルロン酸の溶解はメカニカルスターラーで攪拌を行いながら十分な時間をかけて行った。一方、水溶性エポキシ化合物として、デナコールＥＸ３１３（グリセロールジグリシジルエーテル；ナガセ化成工業）１ｇを蒸留水２０ｍｌに希釈し、デナコールＥＸ３１３溶液（以下、ＥＸ３１３溶液という）を作製した。このようにして作製したＥＸ３１３溶液２０ｍｌを、攪拌中のヒアルロン酸水溶液に添加し、さらに攪拌を３０分程度行い、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を作製した。
得られたヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を底面積が１８０ｃｍ２（１０ｃｍ×１８ｃｍ）のトレーに１８０ｍｌ注入した。このときのヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液の深さは、およそ１ｃｍとなった。トレーに注入されたヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を室温で２時間静置し、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液内の気泡を抜いた後、予めトレーの大きさに応じて切断したベンリーゼ（不織布；旭化成工業）をヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液に上載した。
不織布を上載した状態のヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を空気循環型乾熱器に入れ、５０℃で１０時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ３１３のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約２／５（つまりヒアルロン酸濃度として約２．５重量％）になるまで濃縮した。このときの濃縮液の深さは、およそ４ｍｍであった。
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。この凍結後、室温に１〜１．５時間放置して一度解凍し、解凍後、再び５〜６時間程度、−８５℃のフリーザで完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
アテロコラーゲン１ｇを蒸留水５００ｍｌに溶解し、１Ｎ　ＨＣｌでｐＨ４に調整し、０．２％アテロコラーゲン水溶液を作製した。作製したアテロコラーゲン水溶液を底面積１８０ｃｍ２のトレーに９０ｍｌ注入した。アテロコラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（１８０ｍｌ）の半分の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比は１：１０となる。
前述のようにして作製した架橋ヒアルロン酸スポンジをアテロコラーゲン水溶液の入ったトレーにベンリーゼが上方に位置するように浸漬し、１時間放置することで架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲン水溶液をしみ込ませた。そして、このコラーゲン水溶液に浸漬させたヒアルロン酸スポンジを−８５℃で凍結後、真空乾燥した。
真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジを積層化したものを、コラーゲンスポンジ側に１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２５ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ（エチレン・オキサイド・ガス）滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジであってベンリーゼ（支持体）に支持されたものを得た。
［２］移植用材料の作製
組織再生用基材のベンリーゼとは反対側の面に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ギブコ社製）中に浮遊した培養ウサギ線維芽細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種したのち、ＣＯ２５％、３７℃のインキュベータ中で７日間培養し、移植用材料としての培養真皮を作製した。培地を除去し、これを凍結保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）に入れ、−１５２℃の冷凍庫内で保存した。
［３］移植試験
冷凍庫内に保存した培養真皮（移植用材料）を使用時に解凍して凍結保存液を除去し、ハンクス液３０ｍｌで２回洗浄して動物実験に使用した。ウサギの背部に直径７ｃｍの円を描き、全層皮膚を切除し、皮膚欠損創とした。この皮膚欠損創に先の培養真皮を適用し、創傷面の周辺を縫合し、その上にポリウレタンフィルム製創傷被覆材を適用し、更に滅菌パットを載せて、創傷の周辺を縫合し、伸縮性包帯で圧迫固定した。その結果、良好な肉芽組織形成と創面積の顕著な減小が観察された。
（実施例２）
［１］組織再生用基材の作製（図２参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
実施例１と同様にして、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を作製し、得られたヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を底面積が１８０ｃｍ２（１０ｃｍ×１８ｃｍ）のトレーに１８０ｍｌ注入した。トレーにはその大きさに合わせて切断したベンリーゼ（前出）が予め載置されており、少量の蒸留水を加えて含水させてトレー底面に接着させておいた。トレーに注入したヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液の深さは、およそ１ｃｍとなった。
この状態のヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液を空気循環型乾熱器に入れ、５０℃で１５時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ３１３のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約１／５（つまりヒアルロン酸濃度として約５重量％）になるまで濃縮された。このときの濃縮液の深さは、およそ２〜３ｍｍであった。
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。その後、未反応の架橋剤を除去するため、１５Ｌのイオン交換水を入れた容器内に架橋ヒアルロン酸スポンジを一日浸漬させ、水洗した。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
アテロコラーゲン２．５ｇを蒸留水５００ｍｌに溶解し、１Ｎ　ＨＣｌでｐＨ３．２に調整し、０．５％アテロコラーゲン水溶液を作製した。水洗した架橋ヒアルロン酸スポンジを、不織布を下側にして底面積１８０ｃｍ２のトレーに置き、この上に作製したアテロコラーゲン水溶液を９０ｍｌ注入した。アテロコラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（１８０ｍｌ）の半分の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比は１：４となる。
架橋ヒアルロン酸スポンジは周囲が若干収縮しており、トレーの側面との間に隙間が生じた。この隙間にアテロコラーゲン水溶液が浸入することにより、ヒアルロン酸スポンジの周囲を包み込むようにコラーゲンが配置され、膨潤時に架橋ヒアルロン酸スポンジとコラーゲンスポンジとが分離するのを抑制した。
アテロコラーゲン水溶液を注入して一昼夜経過後、アテロコラーゲン水溶液を含んだヒアルロン酸スポンジを−８５℃で真空凍結乾燥した。真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジが積層化したものを、コラーゲンスポンジ側に１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２５ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジであってベンリーゼ（支持体）に支持されたものを得た。
［２］移植用材料の作製
上記方法により作製した１８０ｃｍ２の組織再生用基材を切断し、９０ｃｍ２の大きさにした。切断した組織再生用基材を１８０ｃｍ２のトレーに入れ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを１００ｍｌ注入し、ｐＨを調整した。ｐＨを調整後（ｐＨ７．４）、培養液を一度廃棄し、ヒト線維芽細胞懸濁液５ｍｌを組織再生用基材に５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。播種後、３７℃で一晩静置し、ヒト線維芽細胞を組織再生用基材に定着させた。その後、上記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を１００ｍｌ加え、３７℃，５％ＣＯ２下で１週間培養を行った。このように作製した培養真皮（移植用材料）は、十分な強度を有しているばかりでなく、周囲が２〜３ｍｍ程度収縮しているのみであるので、ハンドリングが良好であり、欠損するおそれもないものだった。
（実施例３）
［１］組織再生用基材の作製（図３参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約２００万）２０ｇを蒸留水２Ｌに溶解して１％ヒアルロン酸水溶液（ｐＨ６）を作製した後、１Ｎ　ＨＣｌにてｐＨ３．５に調整した。ヒアルロン酸の溶解はメカニカルスターラーで撹拌を行いながら十分な時間をかけて行った。一方、水溶性エポキシ化合物として、デナコールＥＸ８１０（グリセロールジグリシジルエーテル；ナガセ化成工業）４ｇを蒸留水４０ｍｌに希釈し、デナコールＥＸ８１０溶液（以下、ＥＸ８１０溶液という）を作製した。このようにして作製したＥＸ８１０溶液（４０ｍｌ）を、撹拌中のヒアルロン酸水溶液に添加し、さらに撹拌を３０分程度行い、ヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を作製した。
得られたヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を底面積が１１０ｃｍ２（１０ｃｍ×１１ｃｍ）のトレーに５０ｇ注入した。トレーにはその大きさに合わせて切断したベンリーゼ（前出）が予め載置されており、少量の蒸留水を加えて含水させてトレー底面に接着させておいた。トレーに注入したヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液の深さは、およそ５ｍｍとなった。
この状態のヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を空気循環型加熱器に入れ、５０℃で５時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ８１０のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約１／２（つまりヒアルロン酸濃度として約２重量％）になるまで濃縮された。このときの濃縮液の深さは、およそ２〜３ｍｍであった、
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行った。その後、未反応の架橋剤を除去するため、１Ｌの蒸留水を入れた容器内に架橋ヒアルロン酸スポンジを一晩浸漬させ、水洗した。
水洗後、再び−８５℃のフリーザで完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
コラーゲンスポンジによる積層化に先立ち、剣山を使用して架橋ヒアルロン酸スポンジを穿孔した。このときの孔の間隔は、ほぼ４ｍｍであった。
アテロコラーゲン８ｇを蒸留水１．６Ｌに溶解し、１Ｎ　ＨＣｌでｐＨ３．５に調整し、０．５％アテロコラーゲン水溶液を作製した。作製したアテロコラーゲン水溶液を底面積１１０ｃｍ２のトレーに４０ｇ注入した。アテロコラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（５０ｇ）の約４／５の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比は２：５となる。
前述のようにして作製した架橋ヒアルロン酸スポンジをアテロコラーゲン水溶液の注入したトレーにベンリーゼが上方に位置するように浮かべ、１晩静置することで架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲン水溶液をしみ込ませた。そして、コラーゲン水溶液をしみ込ませたヒアルロン酸スポンジを−８５℃で完全に凍結した後、真空凍結乾燥した。
真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジを積層化したものの両側に、各々１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２０ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ（エチレン・オキサイド・ガス）滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジであって、ベンリーゼ（支持体）に支持されたものを得た。
［２］移植用材料の作製
上記方法により作製した組織再生用基材をトレーに入れ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを５０ｍｌ注入し、ｐＨを調整した。ｐＨを調整後（ｐＨ７．４）、培養液を一度廃棄し、ヒト線維芽細胞懸濁液５ｍｌを組織再生用基材に１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。播種後、３７℃で一晩静置し、ヒト線維芽細胞を組織再生用基材に定着させた。その後、上記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を５０ｍｌ加え、３７℃，５％ＣＯ２下で１週間培養を行った。このように作製した培養真皮（移植用材料）は、培地を除去し、これを凍結保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）に入れ、−１５２℃の冷凍庫内で保存した。
［３］移植試験
冷凍庫内に保存した培養真皮（移植用材料）を使用時に解凍して凍結保存液を除去し、乳酸リンゲル液３０〜５０ｍｌで３回洗浄してヒト臨床適用した。創傷面は残存壊死組織を除去した後、消毒を行い、生理食塩水で十分に洗浄した。この皮膚欠損創に先の培養真皮を適用し、培養真皮の周囲を縫合固定した。その上に抗生剤含有軟膏を染み込ませたガーゼを適用し、さらに滅菌ガーゼを載せて、創傷の周辺を縫合し、伸縮性包帯で圧迫固定した。その結果、良好な肉芽組織形成と創面積の顕著な減少、創周囲からの上皮化が観察された。
（実施例４）
［１］組織再生用基材の作製（図４参照）
［１−１］ヒアルロン酸スポンジの作製
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量約２００万）２ｇを蒸留水２００ｍＬに溶解して１％ヒアルロン酸水溶液（ｐＨ６）を作製した後、１Ｎ　ＨＣｌにてｐＨ３．５に調整した。ヒアルロン酸の溶解はメカニカルスターラーで撹拌を行いながら十分な時間をかけて行った。一方、水溶性エポキシ化合物として、デナコールＥＸ８１０　０．２ｇを蒸留水２ｍｌに希釈し、デナコールＥＸ８１０溶液（以下、ＥＸ８１０溶液という）を作製した。このようにして作製したＥＸ８１０溶液（２ｍｌ）を、撹拌中のヒアルロン酸水溶液に添加し、さらに撹拌を３０分程度行い、ヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を作製した。
得られたヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を底面積がφ３５ｍｍディッシュに４．８ｇ注入した。ディッシュに注入したヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液の深さは、およそ５ｍｍとなった。
この状態のヒアルロン酸−ＥＸ８１０混合液を空気循環型加熱器に入れ、５０℃で５時間静置した。これにより、ヒアルロン酸の水酸基（ハイドロキシル基）やカルボキシル基とデナコールＥＸ８１０のエポキシ基とが反応してヒアルロン酸の分子間架橋物が生成すると共に、液量が約１／２（つまりヒアルロン酸濃度として約２重量％）になるまで濃縮された。このときの濃縮液の深さは、およそ２〜３ｍｍであった、
次に、この濃縮液を−８５℃で凍結した。凍結時間は、フリーザの能力にも左右されるが、およそ５〜６時間程度であり、完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行った。その後、未反応の架橋剤を除去するため、１Ｌの蒸留水を入れた容器内に一晩浸漬させ、水洗した。水洗後、再び−８５℃のフリーザで完全に凍結させた。そして、３０×１０−３〜５０×１０−３ｍｍｂａｒ（３〜５Ｐａ）にて真空凍結乾燥処理を行うことにより、スポンジ構造を有するヒアルロン酸分子間架橋物（以下、架橋ヒアルロン酸スポンジという）を得た。
［１−２］コラーゲンスポンジとの積層化
コラーゲンスポンジによる積層化に先立ち、剣山を使用して架橋ヒアルロン酸スポンジを穿孔した。このときの孔の間隔は、ほぼ４ｍｍであった。
一方、０．５％コラーゲン水溶液（ＫＯＫＥＮＣＥＬＬＧＥＮ　Ｉ−ＰＣ：株式会社高研製）をφ３５ｍｍディッシュに３．８ｇ注入した。コラーゲン水溶液は、もとのヒアルロン酸水溶液の液量（４．８ｇ）の約４／５の液量であり、コラーゲンとヒアルロン酸の重量比はおよそ２：５となる。
前述のようにして作製した架橋ヒアルロン酸スポンジのうち穿孔した面が下になるようにコラーゲン水溶液の注入したディッシュに浮かべ、一晩静置することで架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲン水溶液をしみ込ませた。そして、コラーゲン水溶液をしみ込ませたヒアルロン酸スポンジを−８５℃で完全に凍結した後、真空凍結乾燥した。
真空凍結乾燥後の架橋ヒアルロン酸スポンジにコラーゲンスポンジを積層化したものの両側に、各々１５Ｗの紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を用いて２０ｃｍの距離から３０分間照射することにより、コラーゲンの分子間架橋を行った。その後、滅菌バッグに詰め、ＥＯＧ滅菌を６０℃、２０時間行った。これにより、組織再生用基材、つまり架橋コラーゲンスポンジ（細胞接着部）を備えた架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。この組織再生用基材には、ベンリーゼによる強度付加はなされていないが、ピンセット等による取扱いは容易に行うことができた。
本実施例の組織再生用基材は、実施例１〜３と同様、培養真皮として利用することができるほか、創傷被覆材として用いることもできる。創傷被覆材として用いる場合には、生体吸収性を有しているため除去が不要であるし、コラーゲン側を創傷面に当てることによりコラーゲンの細胞保持効果が得られ、創傷適用後にヒアルロン酸が創傷面に溶出して細胞遊走性を発揮し治癒促進効果が得られることが期待される。
なお、実施例２の別例として、ヒアルロン酸−ＥＸ３１３混合液の分子間架橋反応後、真空凍結乾燥することなく架橋反応物の上下方向に穴を開け、その穴を開けた面とアテロコラーゲン水溶液とを接触させたあと真空凍結乾燥することにより、ヒアルロン酸スポンジにすると同時にコラーゲンスポンジにすることもできる。この場合、製造プロセスが簡略化されるし、両スポンジは穴の存在によりアンカーリングの効果が得られるので良好に密着する。
産業上の利用の可能性
本発明は、ヒアルロン酸を主体とする組織再生用基材であって生体外での細胞培養と移植後の組織再生に適しているため、医療分野に広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例１の組織再生用基材の作製手順を表す説明図、図２は実施例２の組織再生用基材の作製手順を表す説明図、図３は実施例３の組織再生用基材の作製手順を表す説明図、図４は実施例４の組織再生用基材の作製手順を表す説明図である。Technical field
The present invention relates to a tissue regeneration substrate, a transplant material, and a method for producing the same, which can be widely used in the medical field.
Background art
In recent years, regenerative tissue engineering for culturing cells and reconstructing tissue has attracted attention. In this regenerative tissue engineering, a transplant material is obtained by holding and culturing various cells on a tissue regeneration substrate formed of various materials having high biocompatibility.
For example, it is known that collagen sponge can be used as a substrate for tissue regeneration in cultured skin incorporating fibroblasts or the like (Japanese Patent Laid-Open No. 4-332561). Recently, hyaluronic acid can be used instead of collagen. (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-319068).
Hyaluronic acid is a type of mucopolysaccharide having a disaccharide repeating structure, and is a substance mainly present in joint fluid of animals, vitreous body of eyes, connective tissues such as umbilical cord and dermis layer, and the like. The molecular weight is on the order of hundreds of thousands to millions, and has a property of binding to a very large amount of water, which is related to, for example, low friction of joints and water retention of skin dermis tissue. Also, when damaged connective tissue repairs, production of hyaluronic acid is temporarily activated, promoting cell migration in tissue remodeling. Thus, it can be said that hyaluronic acid exhibits excellent ability as a wound dressing.
However, although hyaluronic acid exhibits excellent ability as a wound dressing material, it has very high water content, so that it has low cell adhesion and is in vitro for use as a tissue regeneration substrate. However, there is a problem that cell culture is difficult.
An object of the present invention is to solve the above-described problems, and it is an object of the present invention to provide a tissue regeneration substrate mainly composed of hyaluronic acid, which is suitable for cell culture in vitro and tissue regeneration after transplantation. The purpose is to provide. It is another object of the present invention to provide a method for producing the tissue regeneration substrate. It is another object of the present invention to provide a transplant material using the tissue regeneration substrate and a method for producing the same.
Disclosure of the invention
In order to solve the above problems, the present inventors have made intensive studies, and as a result, have completed the following first to fourth inventions.
A first aspect of the present invention includes a hyaluronic acid sponge mainly composed of hyaluronic acid and / or a derivative thereof, and a cell adhesion portion in which a sponge made of a biological material derived from a living body is laminated on at least one surface of the hyaluronic acid sponge. It is characterized by having. Since the cell adhesion portion of the tissue regeneration substrate is formed by laminating sponges made of a biological material derived from a living body, cells incorporated in the tissue regeneration substrate adhere well. In addition, since a hyaluronic acid sponge mainly containing hyaluronic acid and / or a derivative thereof is provided, the wound healing ability such as promotion of cell proliferation is excellent. Therefore, according to this tissue regeneration substrate, cell culture in vitro and tissue regeneration after transplantation can be favorably performed. Further, when cells are seeded at a high density, the conventional collagen sponge shows large shrinkage, whereas the tissue regeneration substrate of the present invention hardly shows such shrinkage. The substrate for tissue regeneration may be used as a material for transplantation by incorporating cells, but may also be used as a wound dressing for covering a wound surface.
Here, as the derivative of hyaluronic acid, for example, in addition to metal salts of hyaluronic acid such as sodium hyaluronate and potassium hyaluronate, the hydroxyl group and carboxyl group of hyaluronic acid are etherified, esterified, amidated, acetalized, and ketalized. And the like, among which sodium hyaluronate is preferred. As the hyaluronic acid sponge, an intermolecularly crosslinked one (crosslinked hyaluronic acid sponge) is preferable. Examples of the biological material derived from a living body include, for example, collagen, gelatin, fibrin, and alginic acid. Among these, collagen, particularly atelocollagen having a low antigenicity, is preferable. preferable.
It is preferable that the tissue regeneration base material is in a state in which a bio-derived polymer material has entered the hyaluronic acid sponge near the boundary between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion part. In this case, even if there is a difference in the swelling ratio between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion portion, there is no risk that the two will be peeled off when containing water.
In the tissue regeneration substrate, it is preferable that the hyaluronic acid sponge is supported by a woven fabric, a nonwoven fabric, or a knitted fabric as a support. In this case, the strength of the tissue regeneration base material is increased by the support, and there is no possibility that the tissue regeneration base material will be damaged when picked up and lifted with tweezers. Here, the material of the support is not particularly limited as long as it plays a role of reinforcing the hyaluronic acid sponge, and for example, synthetic polymer materials such as nylon, polyester, and silicone, and natural materials such as silk, cotton, and hemp. Polymer materials and the like can be mentioned.
The second aspect of the present invention is a method for producing such a tissue regeneration base material, which comprises (1) concentrating an aqueous solution of hyaluronic acid and / or a derivative thereof to which a cross-linking agent has been added to thereby provide hyaluronic acid and / or a derivative thereof. (2) a sponge step of obtaining a hyaluronic acid sponge by vacuum freeze-drying the intermolecular cross-linked product, and (3) a biologically-derived product from at least one surface of the hyaluronic acid sponge. A layering step of forming the cell adhesion portion by vacuum freeze-drying after absorbing the aqueous solution of the polymer material. In this method, an intermolecularly crosslinked product of hyaluronic acid and / or a derivative thereof is freeze-dried in vacuo to form a hyaluronic acid sponge, and after absorbing an aqueous solution of a polymer material derived from a living body from at least one surface thereof, the vacuum is applied again. Freeze dry. According to this manufacturing method, the first tissue regeneration substrate of the present invention can be produced relatively easily.
Here, in the crosslinking step, examples of the crosslinking agent include a water-soluble epoxy compound and glutaraldehyde, and among them, a water-soluble epoxy compound is preferable. Examples of the water-soluble epoxy compound include ethylene glycol diglycidyl ether, glycerol diglycidyl ether, and glycerol triglycidyl ether. When a water-soluble epoxy compound is used as a cross-linking agent, its amount is preferably about 1/2 to 1/10 by weight relative to hyaluronic acid and / or a derivative thereof, and particularly preferably 1/5. It is preferably about 1/10.
In this cross-linking step, an aqueous solution of hyaluronic acid and / or a derivative thereof is used. The concentration of hyaluronic acid and / or a derivative thereof in the aqueous solution depends on the type and molecular weight of the hyaluronic acid and / or a derivative thereof. , Approximately 0.5 to 1.5% by weight. Further, as the water used as the solvent, ion-exchanged water having a pH of 5 to 6 is preferable.
In this cross-linking step, the aqueous solution of hyaluronic acid and / or a derivative thereof to which a cross-linking agent has been added is concentrated to carry out an intermolecular cross-linking reaction of hyaluronic acid and / or a derivative thereof. When a water-soluble epoxy compound is used as a cross-linking agent, the concentration temperature is preferably about 30 to 60 ° C, more preferably about 40 to 60 ° C, and particularly preferably about 50 ° C. When the mixture is heated at a high temperature exceeding 60 ° C., bubbles are generated in the mixed solution, and the sponge structure of the resulting hyaluronic acid sponge may not be sufficiently uniform. On the other hand, at a temperature lower than 30 ° C., the intermolecular cross-linking reaction rate becomes low, and it may take a long time to obtain a desired concentration of intermolecular cross-linked products. Further, the intermolecular crosslinking reaction of hyaluronic acid and / or a derivative thereof is preferably performed in a neutral region (pH 5 to 8) or an acidic region (pH 3 to 5). Further, it is preferable to perform the treatment in the acidic region, since the concentration time tends to be shorter than that in the case of performing the treatment in the neutral region.
In this cross-linking step, for example, the concentration is preferably completed when the concentration of the aqueous solution of hyaluronic acid and / or a derivative thereof reaches 1 to 10% by weight, preferably 2 to 5% by weight, particularly preferably about 5% by weight. . If the concentration is not sufficiently performed, the swelling property of the hyaluronic acid sponge obtained after the next sponging step may not be sufficiently suppressed, which is not preferable. That is, if the hyaluronic acid sponge has a high swelling property, for example, when immersed in a liquid medium or the like during cell culture, it swells more than necessary, and as a result, it becomes brittle and the shape becomes large, so handling is difficult. It becomes difficult. On the other hand, if the end point of concentration is controlled as described above, the swelling property of the hyaluronic acid sponge is sufficiently suppressed, so that the sponge does not swell more than necessary when immersed in a liquid medium or the like, and as a result, it is weak Handling becomes easy because the shape does not become too large and the shape does not become too large. In addition, if the cross-linking step is performed until the concentrated liquid completely turns into a film, even if the sponge step by vacuum freeze-drying is performed, since the sponge of hyaluronic acid is not formed, the concentration of the concentrated liquid is reduced before the liquid becomes a film. You need to set the end point.
Next, in the sponge forming step, a hyaluronic acid sponge is obtained by vacuum freeze-drying the intermolecularly crosslinked product after the cross-linking step, but the temperature condition during vacuum freeze-drying is to prevent the formation of large ice crystals. The temperature is about −85 ° C. to −30 ° C., preferably about −85 ° C. to −50 ° C., more preferably about −85 ° C., and the vacuum condition is 30 × 10 -3 ~ 100 × 10 -3 mmbar (3 to 10 Pa) is preferable, and more preferably 30 × 10 -3 ~ 50 × 10 -3 mmbar (3-5 Pa).
In this sponging step, the intermolecular cross-linked product obtained without sufficient concentration in the cross-linking step is subjected to at least one operation of freezing and thawing, followed by freeze-drying in a vacuum to obtain hyaluronic acid. Preferably, a sponge is obtained. If the operation of freezing and thawing is not performed before vacuum freeze-drying, the sponge may not easily retain its shape when wet, whereas the operation of freezing and thawing before vacuum freeze-drying is performed Although this is probably due to the promotion of intermolecular interactions such as hydrogen bonding, a sponge that easily retains its shape when hydrated is obtained. The operation of freezing and thawing before vacuum freeze-drying may be performed a plurality of times, but is preferably performed once in consideration of simplification of the manufacturing process. Further, the freezing temperature conditions in the operation of freezing and thawing before vacuum freeze-drying are about -85 ° C to -30 ° C, preferably about -85 ° C to -50 ° C, more preferably about -85 ° C, The temperature conditions for thawing are about 20 ° C to 30 ° C, preferably about 30 ° C. However, at the time of thawing, the temperature may be divided into multiple stages and heated for thawing. In this case, care should be taken not to break the intermolecular crosslinked product. In addition, since the intermolecular crosslinked product obtained by performing sufficient concentration under appropriate concentration conditions in the crosslinking step has sufficient strength, the freeze / thaw operation before vacuum freeze-drying is not necessarily performed. No need to do.
It is preferable to provide a water washing step for washing the hyaluronic acid sponge produced in the sponge forming step before moving to the next laminating step. In the water washing step, an inactivating agent for inactivating the unreacted crosslinking agent may be added to the washing water. For example, when a water-soluble epoxy compound is used as a cross-linking agent, a deactivator that has a function of opening the epoxy group and does not harm the living body is preferable, for example, glycine is used. .
Next, in the laminating step, a cell adhesion portion is formed by absorbing an aqueous solution of a biologically-derived polymer material from at least one surface of the hyaluronic acid sponge and then freeze-drying the solution. As described above, collagen, gelatin, fibrin, alginic acid and the like can be mentioned, and among them, collagen, particularly atelocollagen having low antigenicity, is preferable. As the aqueous solution of the polymer material derived from a living body, an aqueous solution of 0.2 to 1.0% by weight, preferably an aqueous solution of 0.2 to 0.5% by weight, more preferably an aqueous solution of about 0.5% by weight The weight ratio of the bio-derived polymer material to hyaluronic acid may be about 1: 2 to 10, preferably about 1: 2 to 4, and particularly preferably about 1: 4. The conditions for vacuum freeze-drying are the same as the conditions for vacuum freeze-drying in the sponge forming step.
In addition, in this lamination step, since the aqueous solution of the polymer material derived from a living body is absorbed from at least one surface of the hyaluronic acid sponge, the vicinity of the boundary between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion part of the obtained tissue regeneration substrate is obtained. In this state, a bio-derived polymer material has entered the hyaluronic acid sponge. For this reason, even if there is a difference in the swelling ratio between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion portion, there is no possibility that the two will be separated when the tissue regeneration substrate is hydrated.
In this laminating step, a plurality of holes are formed on one surface of the hyaluronic acid sponge, and the cell adhesion portion is formed by absorbing an aqueous solution of a polymer material derived from a living body from one of the holes and then freeze-drying in a vacuum. May be. In this case, the aqueous solution of the polymer material derived from a living body penetrates into the pores of the hyaluronic acid sponge and also enters a plurality of holes, so that an effect of anchoring with the hyaluronic acid sponge can be obtained. In this way, by infiltrating the aqueous solution of the biopolymer material into each of the holes and the pores and then freeze-drying in a vacuum, the adhesion between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion portion in the tissue regeneration substrate can be further improved. it can. In addition, the “hole” here includes not only a general hole such as a round hole or a square hole, but also a hole having a larger contact area than a plane such as a cut or unevenness. It is.
When collagen or gelatin is used as a biological material derived from a living body in this laminating step, an ultraviolet lamp is irradiated after the laminating step to partially crosslink the collagen or gelatin, whereby the collagen or gelatin flows out when water is contained. It is preferable to prevent this from happening, and then it is preferable to further sterilize with ethylene oxide gas or the like. When the above-mentioned washing step is not performed, it is preferable to add an inactivating agent to an aqueous solution of a biological material derived from a living body in order to inactivate an unreacted crosslinking agent. As described above, for example, when a water-soluble epoxy compound is used as a cross-linking agent, a deactivator having a function of opening an epoxy group such as glycine and not harming a living body is used. preferable.
By the way, instead of the above-mentioned sponge forming step and laminating step, the following sponge forming and laminating step may be adopted. That is, a step of forming a cell adhesion portion together with the hyaluronic acid sponge by bringing the intermolecular crosslinked product after the crosslinking step into contact with an aqueous solution of a polymer material derived from a living body and then freeze-drying in a vacuum may be employed. In this case, since the vacuum freeze-drying can be performed only once, the manufacturing process is simplified.
In this sponging and laminating step, an aqueous solution of a biologically-derived polymer material is brought into contact with the intermolecular cross-linked product before sponging, so that the aqueous solution of the biologically-derived polymer material penetrates into the intermolecular cross-linked product before sponging. The adhesiveness between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion part in the finally obtained tissue regeneration substrate may not be sufficient. Therefore, it is preferable to provide a plurality of holes in the vertical direction of the intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid and / or a derivative thereof to increase the contact area with the aqueous solution of the polymer material derived from a living body to obtain the effect of anchoring. In this manner, it is preferable to improve the adhesion between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion part in the tissue regeneration substrate by infiltrating the aqueous solution of the biopolymer material into each hole and then performing vacuum freeze-drying. In addition, the “hole” here includes not only a general hole such as a round hole or a square hole, but also a hole having a larger contact area than a plane such as a cut or unevenness. It is.
In order to produce a tissue regeneration base material in which a hyaluronic acid sponge is supported on a support by adopting this sponging / lamination process, for example, the following procedure is performed. That is, a support is placed on the bottom surface of the container in advance, and an aqueous solution of hyaluronic acid and / or a derivative thereof to which a crosslinking agent has been added is put into the container. Thereafter, the aqueous solution is heated and concentrated to prepare an intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid and / or a derivative thereof. Thereafter, a plurality of holes are provided in the container in the vertical direction of the intermolecular cross-linked product, an aqueous solution of a polymer material derived from a living body is added, and the resulting solution is brought into contact with the intermolecular cross-linked product, followed by vacuum freeze-drying. If necessary, an operation of freezing and thawing the intermolecularly crosslinked product may be performed before freeze-drying in a vacuum (for example, before or after providing a hole). By performing such an operation, a sponge whose strength is improved and which easily retains its shape when containing water can be obtained.
A third aspect of the present invention is a transplantation material, comprising the above-described tissue regeneration base material and cells held in a cell adhesion portion of the tissue regeneration base material. This transplantation material allows cells to be cultured easily in vitro because the cells are held in good contact with the cell adhesion area.Furthermore, the tissue is promoted by the ability of hyaluronic acid to promote cell migration and wound healing by moisturizing effect. Plays properly. Here, any cells may be retained in the cell adhesion portion, but fibroblasts, keratinocytes, pigment-producing cells, vascular endothelial cells, endothelial cells, epithelial cells, chondrocytes, osteoblasts Examples include cells, myoblasts, fat cells, hepatocytes, nerve cells, cardiomyocytes, Langerhans islet cells, and the like. For example, in order to use a transplant material retaining fibroblasts derived from another person, the transplant material is transplanted into a wound on the skin, covered with a film containing an antibacterial agent (eg, a polyurethane film), and further bandaged. Cover. In such a case, healing is promoted by various cytokines produced from fibroblasts derived from others.
A fourth aspect of the present invention is a method for producing such a transplantation material, which comprises preparing the above-described tissue regeneration base material and then incorporating cells into a cell adhesion portion of the tissue regeneration base material. . According to this production method, the third transplant material of the present invention can be produced relatively easily. Here, as a method of incorporating cells into the cell adhesion part, for example, there is a method of immersing a substrate for tissue regeneration in a culture solution and holding the cells by taking them into pores.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, a preferred embodiment of the present invention will be described. The present invention is not limited to the following examples. In the following, "%" represents% by weight unless otherwise specified.
(Example 1)
[1] Preparation of tissue regeneration base material (see FIG. 1)
[1-1] Production of hyaluronic acid sponge
10 g of sodium hyaluronate (molecular weight: about 2 million) was dissolved in 1 L of distilled water to prepare a 1% aqueous solution of hyaluronic acid (pH 6). Dissolution of hyaluronic acid was carried out for a sufficient time while stirring with a mechanical stirrer. On the other hand, as a water-soluble epoxy compound, 1 g of Denacol EX313 (glycerol diglycidyl ether; Nagase Kasei Kogyo) was diluted with 20 ml of distilled water to prepare a Denacol EX313 solution (hereinafter referred to as an EX313 solution). 20 ml of the EX313 solution thus prepared was added to the stirring aqueous hyaluronic acid solution, and stirring was further performed for about 30 minutes to prepare a hyaluronic acid-EX313 mixed solution.
The obtained hyaluronic acid-EX313 mixed solution has a bottom area of 180 cm. 2 180 ml was poured into a (10 cm × 18 cm) tray. At this time, the depth of the hyaluronic acid-EX313 mixture was about 1 cm. The hyaluronic acid-EX313 mixed solution injected into the tray was allowed to stand at room temperature for 2 hours to remove air bubbles in the hyaluronic acid-EX313 mixed solution, and then cut in advance according to the size of the tray to obtain a benlyse (nonwoven fabric; Asahi Kasei Corporation) ) Was placed on a hyaluronic acid-EX313 mixture.
The mixed solution of hyaluronic acid and EX313 with the non-woven fabric mounted thereon was put into an air circulation type dry heater and allowed to stand at 50 ° C. for 10 hours. As a result, the hydroxyl group (hydroxyl group) or carboxyl group of hyaluronic acid reacts with the epoxy group of Denacol EX313 to form an intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid, and the liquid volume is reduced to about 2/5 (that is, the hyaluronic acid concentration). To about 2.5% by weight). At this time, the depth of the concentrate was approximately 4 mm.
Next, the concentrate was frozen at -85 ° C. The freezing time depends on the capacity of the freezer, but is about 5 to 6 hours, and was completely frozen. After this freezing, it was left at room temperature for 1-1.5 hours to thaw it once, and after thawing, it was completely frozen again in a -85 ° C freezer for about 5-6 hours. And 30 × 10 -3 ~ 50 × 10 -3 By performing a vacuum freeze-drying treatment at mmbar (3 to 5 Pa), a crosslinked hyaluronic acid molecule having a sponge structure (hereinafter referred to as a crosslinked hyaluronic acid sponge) was obtained.
[1-2] Lamination with collagen sponge
1 g of atelocollagen was dissolved in 500 ml of distilled water and adjusted to pH 4 with 1N HCl to prepare a 0.2% atelocollagen aqueous solution. Prepare the atelocollagen aqueous solution with a bottom area of 180 cm 2 90 ml was poured into the tray. The aqueous solution of atelocollagen is half the amount of the original aqueous solution of hyaluronic acid (180 ml), and the weight ratio of collagen to hyaluronic acid is 1:10.
The crosslinked hyaluronic acid sponge prepared as described above was immersed in a tray containing an atelocollagen aqueous solution such that the benlyse was positioned above, and allowed to stand for 1 hour to allow the collagen aqueous solution to soak into the crosslinked hyaluronic acid sponge. Then, the hyaluronic acid sponge immersed in the collagen aqueous solution was frozen at -85 ° C, and then dried under vacuum.
The collagen sponge is laminated on the crosslinked hyaluronic acid sponge after vacuum freeze-drying, and the collagen sponge is irradiated with a 15 W ultraviolet lamp (254 nm) from a distance of 25 cm for 30 minutes using a 15 W ultraviolet lamp, thereby forming intermolecular crosslinks of collagen. went. Then, it was packed in a sterilization bag and sterilized by EOG (ethylene oxide gas) at 60 ° C. for 20 hours. As a result, a tissue regeneration substrate, that is, a crosslinked hyaluronic acid sponge provided with a crosslinked collagen sponge (cell adhesion portion) and supported by benlyse (support) was obtained.
[2] Preparation of transplantation material
Cultured rabbit fibroblasts suspended in Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM + 10% FBS, Gibco) containing 10% fetal bovine serum (FBS) were placed on the side of the tissue regeneration substrate opposite to the benlyse. 5 × 10 4 Cells / cm 2 After sowing at a density of CO 2 The cells were cultured in a 5%, 37 ° C. incubator for 7 days to prepare cultured dermis as a material for transplantation. The medium was removed, and this was placed in a cryopreservation solution (DMEM containing 10% DMSO + 20% FBS) and stored in a freezer at -152 ° C.
[3] Transplant test
The cultured dermis (material for transplantation) stored in the freezer was thawed at the time of use to remove the cryopreservation solution, washed twice with 30 ml of Hanks' solution, and used for animal experiments. A 7 cm diameter circle was drawn on the back of the rabbit, and the full-thickness skin was excised to obtain a skin defect wound. The above cultured dermis is applied to this skin defect wound, the periphery of the wound surface is sutured, a wound dressing made of polyurethane film is applied thereon, and a sterile pad is further placed thereon, and the periphery of the wound is sutured, and stretchable. Compression fixed with a bandage. As a result, good granulation tissue formation and remarkable reduction in wound area were observed.
(Example 2)
[1] Preparation of tissue regeneration base material (see FIG. 2)
[1-1] Production of hyaluronic acid sponge
A hyaluronic acid-EX313 mixed solution was prepared in the same manner as in Example 1, and the obtained hyaluronic acid-EX313 mixed solution had a bottom area of 180 cm. 2 180 ml was poured into a (10 cm × 18 cm) tray. A bemliese (described above) cut in accordance with the size of the tray was previously placed on the tray, and a small amount of distilled water was added to make the tray wet and adhered to the bottom of the tray. The depth of the hyaluronic acid-EX313 mixture injected into the tray was approximately 1 cm.
The mixed solution of hyaluronic acid and EX313 in this state was put into an air circulation type dry heater and allowed to stand at 50 ° C. for 15 hours. As a result, the hydroxyl group (hydroxyl group) or carboxyl group of hyaluronic acid reacts with the epoxy group of Denacol EX313 to form an intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid, and the liquid volume is reduced to about 1/5 (that is, the hyaluronic acid concentration). To about 5% by weight). At this time, the depth of the concentrated liquid was approximately 2 to 3 mm.
Next, the concentrate was frozen at -85 ° C. The freezing time depends on the capacity of the freezer, but is about 5 to 6 hours, and was completely frozen. And 30 × 10 -3 ~ 50 × 10 -3 By performing a vacuum freeze-drying treatment at mmbar (3 to 5 Pa), a crosslinked hyaluronic acid molecule having a sponge structure (hereinafter referred to as a crosslinked hyaluronic acid sponge) was obtained. Thereafter, in order to remove the unreacted cross-linking agent, the cross-linked hyaluronic acid sponge was immersed in a container containing 15 L of ion-exchanged water for one day and washed with water.
[1-2] Lamination with collagen sponge
2.5 g of atelocollagen was dissolved in 500 ml of distilled water and adjusted to pH 3.2 with 1N HCl to prepare a 0.5% atelocollagen aqueous solution. The cross-linked hyaluronic acid sponge washed with water, the bottom area is 180 cm with the nonwoven fabric on the lower side 2 , And 90 ml of the aqueous atelocollagen solution prepared above was injected. The aqueous solution of atelocollagen is half the amount of the original aqueous solution of hyaluronic acid (180 ml), and the weight ratio of collagen to hyaluronic acid is 1: 4.
The periphery of the crosslinked hyaluronic acid sponge was slightly shrunk, and a gap was formed between the sponge and the side surface of the tray. The infiltration of the atelocollagen aqueous solution into these gaps arranged the collagen so as to wrap around the hyaluronic acid sponge, thereby suppressing separation of the crosslinked hyaluronic acid sponge and collagen sponge during swelling.
One day after the injection of the atelocollagen aqueous solution, the hyaluronic acid sponge containing the atelocollagen aqueous solution was freeze-dried in vacuum at -85 ° C. The collagen sponge is laminated on the crosslinked hyaluronic acid sponge after vacuum freeze-drying, and the collagen sponge is irradiated with a 15 W ultraviolet lamp (254 nm) from a distance of 25 cm for 30 minutes using a 15 W ultraviolet lamp to form intermolecular crosslinks of collagen. went. Then, it was packed in a sterilization bag and sterilized by EOG at 60 ° C. for 20 hours. As a result, a tissue regeneration substrate, that is, a crosslinked hyaluronic acid sponge provided with a crosslinked collagen sponge (cell adhesion portion) and supported by benlyse (support) was obtained.
[2] Preparation of transplantation material
180cm produced by the above method 2 Cut the tissue regeneration substrate of 2 The size of. 180 cm of cut tissue regeneration substrate 2 And 100 ml of DMEM + 10% FBS was injected to adjust the pH. After adjusting the pH (pH 7.4), the culture solution was once discarded, and 5 ml of a human fibroblast cell suspension was added to a tissue regeneration substrate in an amount of 5 × 10 5. 5 Cells / cm 2 Seeded at a density of After seeding, the cells were allowed to stand at 37 ° C. overnight, and human fibroblasts were fixed on a substrate for tissue regeneration. Thereafter, 100 ml of the above DMEM + 10% FBS medium was added, and the mixture was added at 37 ° C. and 5% CO 2 The culture was performed for one week under the following conditions. The cultured dermis (material for transplantation) thus produced not only has sufficient strength but also has a contraction of only about 2 to 3 mm around the periphery, so that it has good handling and may be damaged. There was no one.
(Example 3)
[1] Preparation of tissue regeneration base material (see FIG. 3)
[1-1] Production of hyaluronic acid sponge
20 g of sodium hyaluronate (molecular weight: about 2 million) was dissolved in 2 L of distilled water to prepare a 1% aqueous solution of hyaluronic acid (pH 6), and then adjusted to pH 3.5 with 1N HCl. The dissolution of hyaluronic acid was carried out for a sufficient time while stirring with a mechanical stirrer. On the other hand, as a water-soluble epoxy compound, 4 g of Denacol EX810 (glycerol diglycidyl ether; Nagase Kasei Kogyo) was diluted with 40 ml of distilled water to prepare a Denacol EX810 solution (hereinafter referred to as an EX810 solution). The EX810 solution (40 ml) thus prepared was added to the stirring aqueous solution of hyaluronic acid, and stirring was further performed for about 30 minutes to prepare a hyaluronic acid-EX810 mixed solution.
The obtained hyaluronic acid-EX810 mixed solution has a bottom area of 110 cm. 2 50 g was poured into a (10 cm × 11 cm) tray. A bemliese (described above) cut to fit the size of the tray was previously placed on the tray, and a small amount of distilled water was added to make the tray wet and adhered to the bottom of the tray. The depth of the hyaluronic acid-EX810 mixture injected into the tray was approximately 5 mm.
The hyaluronic acid-EX810 mixed liquid in this state was put into an air circulation type heater and allowed to stand at 50 ° C. for 5 hours. As a result, the hydroxyl group (hydroxyl group) or carboxyl group of hyaluronic acid reacts with the epoxy group of Denacol EX810 to form an intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid, and the liquid volume is reduced to about 1/2 (that is, the hyaluronic acid concentration). To about 2% by weight). The depth of the concentrated liquid at this time was approximately 2-3 mm.
Next, the concentrate was frozen at -85 ° C. The freezing time depends on the capacity of the freezer, but is about 5 to 6 hours, and was completely frozen. And 30 × 10 -3 ~ 50 × 10 -3 Vacuum freeze-drying was performed at mmbar (3 to 5 Pa). Thereafter, in order to remove the unreacted cross-linking agent, the cross-linked hyaluronic acid sponge was immersed in a container containing 1 L of distilled water overnight and washed with water.
After washing with water, it was completely frozen again in a freezer at -85 ° C. And 30 × 10 -3 ~ 50 × 10 -3 By performing a vacuum freeze-drying treatment at mmbar (3 to 5 Pa), a crosslinked hyaluronic acid molecule having a sponge structure (hereinafter referred to as a crosslinked hyaluronic acid sponge) was obtained.
[1-2] Lamination with collagen sponge
Prior to lamination with a collagen sponge, a crosslinked hyaluronic acid sponge was perforated using Kenzan. The space between the holes at this time was approximately 4 mm.
8 g of atelocollagen was dissolved in 1.6 L of distilled water and adjusted to pH 3.5 with 1N HCl to prepare a 0.5% atelocollagen aqueous solution. Prepared atelocollagen aqueous solution with bottom area 110cm 2 40 g was poured into the tray. The atelocollagen aqueous solution is about 4/5 of the original hyaluronic acid aqueous solution (50 g), and the weight ratio of collagen to hyaluronic acid is 2: 5.
The crosslinked hyaluronic acid sponge prepared as described above was floated on the tray into which the atelocollagen aqueous solution was poured so that the benlyse was positioned above, and allowed to stand overnight, so that the aqueous solution of collagen was soaked into the crosslinked hyaluronic acid sponge. Then, the hyaluronic acid sponge impregnated with the collagen aqueous solution was completely frozen at -85 ° C, and then freeze-dried in vacuum.
The collagen sponge was laminated on the crosslinked hyaluronic acid sponge after vacuum freeze-drying, and both sides were irradiated with a 15 W ultraviolet lamp (254 nm) from a distance of 20 cm for 30 minutes using a 15 W ultraviolet lamp to carry out intermolecular crosslinking of collagen. . Then, it was packed in a sterilization bag and sterilized by EOG (ethylene oxide gas) at 60 ° C. for 20 hours. As a result, a tissue regeneration base material, that is, a crosslinked hyaluronic acid sponge provided with a crosslinked collagen sponge (cell adhesion portion), which was supported by benlyse (support), was obtained.
[2] Preparation of transplantation material
The substrate for tissue regeneration prepared by the above method was placed in a tray, and 50 ml of DMEM + 10% FBS was injected to adjust the pH. After adjusting the pH (pH 7.4), the culture solution was once discarded, and 5 ml of a human fibroblast suspension was applied to a tissue regeneration substrate at 1 × 10 5 5 Cells / cm 2 Seeded at a density of After seeding, the cells were allowed to stand at 37 ° C. overnight, and human fibroblasts were fixed on a substrate for tissue regeneration. Thereafter, 50 ml of the above DMEM + 10% FBS medium was added, and the mixture was added at 37 ° C. and 5% CO 2. 2 The culture was performed for one week under the following conditions. The culture dermis (transplant material) thus prepared was subjected to removal of the culture medium, and then to a cryopreservation solution (DMEM containing 10% DMSO + 20% FBS), which was stored in a freezer at -152 ° C.
[3] Transplant test
The cultured dermis (material for transplantation) stored in the freezer was thawed at the time of use to remove the cryopreservation solution, washed three times with 30 to 50 ml of Ringer's lactate solution, and applied to human clinical practice. After removing the residual necrotic tissue, the wound surface was disinfected and washed sufficiently with physiological saline. The above cultured dermis was applied to the skin defect wound, and the periphery of the cultured dermis was sutured and fixed. Gauze impregnated with an antibiotic-containing ointment was applied thereon, and sterile gauze was further placed thereon, sutured around the wound, and compression-fixed with an elastic bandage. As a result, good granulation tissue formation, remarkable decrease in wound area, and epithelialization around the wound were observed.
(Example 4)
[1] Preparation of tissue regeneration base material (see FIG. 4)
[1-1] Production of hyaluronic acid sponge
2 g of sodium hyaluronate (molecular weight: about 2 million) was dissolved in 200 mL of distilled water to prepare a 1% aqueous solution of hyaluronic acid (pH 6), and then adjusted to pH 3.5 with 1N HCl. The dissolution of hyaluronic acid was carried out for a sufficient time while stirring with a mechanical stirrer. On the other hand, as a water-soluble epoxy compound, 0.2 g of Denacol EX810 was diluted with 2 ml of distilled water to prepare a Denacol EX810 solution (hereinafter, referred to as an EX810 solution). The EX810 solution (2 ml) thus prepared was added to the stirring aqueous solution of hyaluronic acid, and the mixture was further stirred for about 30 minutes to prepare a hyaluronic acid-EX810 mixed solution.
4.8 g of the obtained hyaluronic acid-EX810 mixed solution was poured into a dish having a bottom area of 35 mm. The depth of the hyaluronic acid-EX810 mixture injected into the dish was about 5 mm.
The hyaluronic acid-EX810 mixed liquid in this state was put into an air circulation type heater and allowed to stand at 50 ° C. for 5 hours. As a result, the hydroxyl group (hydroxyl group) or carboxyl group of hyaluronic acid reacts with the epoxy group of Denacol EX810 to form an intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid, and the liquid volume is reduced to about 1/2 (that is, the hyaluronic acid concentration). To about 2% by weight). The depth of the concentrated liquid at this time was approximately 2-3 mm.
Next, the concentrate was frozen at -85 ° C. The freezing time depends on the capacity of the freezer, but is about 5 to 6 hours, and was completely frozen. And 30 × 10 -3 ~ 50 × 10 -3 Vacuum freeze-drying was performed at mmbar (3 to 5 Pa). Then, in order to remove the unreacted cross-linking agent, it was immersed in a container containing 1 L of distilled water overnight and washed with water. After washing with water, it was completely frozen again in a freezer at -85 ° C. And 30 × 10 -3 ~ 50 × 10 -3 By performing a vacuum freeze-drying treatment at mmbar (3 to 5 Pa), a crosslinked hyaluronic acid molecule having a sponge structure (hereinafter referred to as a crosslinked hyaluronic acid sponge) was obtained.
[1-2] Lamination with collagen sponge
Prior to lamination with a collagen sponge, a crosslinked hyaluronic acid sponge was perforated using Kenzan. The space between the holes at this time was approximately 4 mm.
On the other hand, 3.8 g of a 0.5% collagen aqueous solution (KOKENCELLGEN I-PC: manufactured by Koken Co., Ltd.) was injected into a φ35 mm dish. The aqueous collagen solution is about 4/5 of the original aqueous solution of hyaluronic acid (4.8 g), and the weight ratio of collagen to hyaluronic acid is about 2: 5.
The crosslinked hyaluronic acid sponge was floated on a dish into which a collagen aqueous solution had been poured such that the perforated surface of the sponge prepared as described above was facing down, and allowed to stand overnight to allow the collagen aqueous solution to soak into the crosslinked hyaluronic acid sponge. Then, the hyaluronic acid sponge impregnated with the collagen aqueous solution was completely frozen at -85 ° C, and then freeze-dried in vacuum.
The collagen sponge was laminated on the crosslinked hyaluronic acid sponge after vacuum freeze-drying, and both sides were irradiated with a 15 W ultraviolet lamp (254 nm) from a distance of 20 cm for 30 minutes using a 15 W ultraviolet lamp to carry out intermolecular crosslinking of collagen. . Then, it was packed in a sterilization bag and sterilized by EOG at 60 ° C. for 20 hours. As a result, a tissue regeneration substrate, ie, a crosslinked hyaluronic acid sponge provided with a crosslinked collagen sponge (cell adhesion portion) was obtained. The substrate for tissue regeneration was not added with strength by Bemliese, but could be easily handled by tweezers or the like.
The substrate for tissue regeneration of this example can be used as a cultured dermis, as in Examples 1 to 3, and can also be used as a wound dressing. When used as a wound dressing, it is bioabsorbable and therefore does not need to be removed.By applying the collagen side to the wound surface, a cell retaining effect of collagen is obtained, and after application of the wound, hyaluronic acid is applied to the wound. It is expected that the compound will elute to the surface and exhibit cell migration, and a healing promoting effect will be obtained.
As another example of Example 2, after the intermolecular cross-linking reaction of the hyaluronic acid-EX313 mixed solution, holes were formed in the vertical direction of the cross-linked reaction product without vacuum freeze-drying, and the surface with the holes and the atelocollagen aqueous solution And then freeze-dried under vacuum to form a hyaluronic acid sponge and a collagen sponge at the same time. In this case, the manufacturing process is simplified, and the two sponges adhere well because the presence of the hole provides an anchoring effect.
Industrial potential
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is a substrate for tissue regeneration mainly composed of hyaluronic acid and is suitable for cell culture in vitro and tissue regeneration after transplantation, and thus can be widely used in the medical field.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram showing a procedure for producing a tissue regeneration substrate of Example 1, FIG. 2 is an explanatory diagram showing a procedure for producing a tissue regeneration substrate of Example 2, and FIG. FIG. 4 is an explanatory diagram showing a procedure for producing a substrate, and FIG. 4 is an explanatory diagram showing a procedure for producing a substrate for tissue regeneration of Example 4.

Claims (17)

ヒアルロン酸及び／又はその誘導体を主体としたヒアルロン酸スポンジと、
前記ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面に生体由来の高分子材料からなるスポンジを積層させた細胞接着部と
を備えたことを特徴とする組織再生用基材。A hyaluronic acid sponge based on hyaluronic acid and / or a derivative thereof;
A tissue-adhering portion comprising a hyaluronic acid sponge and a sponge made of a bio-derived polymer material laminated on at least one surface of the hyaluronic acid sponge. 請求項１記載の組織再生用基材であって、
前記生体由来の高分子材料はコラーゲン、ゼラチン、フィブリン又はアルギン酸であることを特徴とする組織再生用基材。The tissue regeneration substrate according to claim 1,
The tissue regeneration base material, wherein the bio-derived polymer material is collagen, gelatin, fibrin, or alginic acid. 請求項１又は２記載の組織再生用基材であって、
前記ヒアルロン酸スポンジ及び前記細胞接着部はいずれも分子間架橋されていることを特徴とする組織再生用基材。The tissue regeneration substrate according to claim 1 or 2,
The substrate for tissue regeneration, wherein both the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion part are intermolecularly crosslinked. 請求項１〜３のいずれかに記載の組織再生用基材であって、
前記ヒアルロン酸スポンジと前記細胞接着部との境界付近は、ヒアルロン酸スポンジに生体由来の高分子材料が入り込んだ状態であることを特徴とする組織再生用基材。A tissue regeneration substrate according to any one of claims 1 to 3,
A tissue regeneration substrate, characterized in that the vicinity of the boundary between the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion part is in a state in which a bio-derived polymer material has entered the hyaluronic acid sponge. 請求項１〜４のいずれかに記載の組織再生用基材であって、
前記ヒアルロン酸スポンジは、支持体としての織布、不織布又は編物に支持されていることを特徴とする組織再生用基材。A tissue regeneration substrate according to any one of claims 1 to 4,
The tissue regeneration substrate, wherein the hyaluronic acid sponge is supported on a woven fabric, a nonwoven fabric, or a knitted fabric as a support. 請求項１〜４のいずれかに記載の組織再生用基材を製造する方法であって、
（１）架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を得る架橋工程と、
（２）前記分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るスポンジ化工程と、
（３）前記ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより前記細胞接着部を形成する積層工程と
を含むことを特徴とする組織再生用基材の製法。A method for producing a tissue regeneration substrate according to any one of claims 1 to 4,
(1) a cross-linking step of obtaining an intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid and / or a derivative thereof by concentrating an aqueous solution of hyaluronic acid and / or a derivative thereof to which a cross-linking agent has been added;
(2) a sponge step of obtaining a hyaluronic acid sponge by freeze-drying the intermolecularly crosslinked product under vacuum;
(3) a laminating step of forming the cell adhesive portion by absorbing an aqueous solution of a polymer material derived from a living body from at least one surface of the hyaluronic acid sponge, followed by freeze-drying in a vacuum. Base material manufacturing method. 請求項５記載の組織再生用基材を製造する方法であって、
（１）架橋剤を添加したヒアルロン酸及び／又はその誘導体の水溶液を織布、不織布又は編物と接触させた状態で濃縮することによりヒアルロン酸及び／又はその誘導体の分子間架橋物を得る架橋工程と、
（２）前記分子間架橋物を真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得るスポンジ化工程と、
（３）前記ヒアルロン酸スポンジの少なくとも片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより前記細胞接着部を形成する積層工程と
を含むことを特徴とする組織再生用基材の製法。A method for producing a tissue regeneration substrate according to claim 5,
(1) Cross-linking step of obtaining an intermolecular cross-linked product of hyaluronic acid and / or a derivative thereof by concentrating an aqueous solution of hyaluronic acid and / or a derivative thereof to which a cross-linking agent has been added, in contact with a woven fabric, a nonwoven fabric, or a knitted fabric When,
(2) a sponge step of obtaining a hyaluronic acid sponge by freeze-drying the intermolecularly crosslinked product under vacuum;
(3) a laminating step of forming the cell adhesive portion by absorbing an aqueous solution of a polymer material derived from a living body from at least one surface of the hyaluronic acid sponge, followed by freeze-drying in a vacuum. Base material manufacturing method. 請求項６又は７記載の製法であって、
前記架橋工程において、ヒアルロン酸及び／又はその誘導体の濃度が１〜１０重量％となった時点を濃縮の終点としたことを特徴とする組織再生用基材の製法。The method according to claim 6 or 7, wherein
A method for producing a tissue regeneration substrate, wherein in the cross-linking step, the point at which the concentration of hyaluronic acid and / or a derivative thereof becomes 1 to 10% by weight is determined as the end point of concentration. 請求項６〜８のいずれかに記載の製法であって、
前記スポンジ化工程において、前記分子間架橋物を凍結し解凍する操作を少なくとも１回以上行ったあと真空凍結乾燥することによりヒアルロン酸スポンジを得ることを特徴とする組織再生用基材の製法。The method according to any one of claims 6 to 8, wherein
In the sponging step, a method for producing a substrate for tissue regeneration, wherein a hyaluronic acid sponge is obtained by performing at least one operation of freezing and thawing the intermolecularly crosslinked product, followed by freeze-drying in a vacuum. 請求項６〜９のいずれかに記載の製法であって、
前記積層工程において、前記ヒアルロン酸スポンジの片面に複数の穴を開け、その穴を開けた片面から生体由来の高分子材料の水溶液を吸収させたあと真空凍結乾燥することにより前記細胞接着部を形成することを特徴とする組織再生用基材の製法。It is a manufacturing method in any one of Claims 6-9, Comprising:
In the laminating step, a plurality of holes are formed on one surface of the hyaluronic acid sponge, and the cell adhesion portion is formed by vacuum-freezing and drying after absorbing an aqueous solution of a polymer material derived from a living body from one surface of the hole. A method for producing a substrate for tissue regeneration. 請求項６〜８のいずれかに記載の製法であって、
前記スポンジ化工程及び前記積層工程の代わりに、
前記架橋工程後の分子間架橋物を生体由来の高分子材料の水溶液と接触させたあと真空凍結乾燥することにより前記ヒアルロン酸スポンジと該高分子材料からなる前記細胞接着部とを形成するスポンジ化・積層工程
を含むことを特徴とする組織再生用基材の製法。The method according to any one of claims 6 to 8, wherein
Instead of the sponging step and the laminating step,
A sponge that forms the hyaluronic acid sponge and the cell adhesion portion made of the polymer material by contacting the intermolecularly crosslinked product after the cross-linking step with an aqueous solution of a polymer material derived from a living body and then freeze-drying in a vacuum. A method for producing a tissue regeneration substrate, which comprises a lamination step. 請求項１１記載の製法であって、
前記スポンジ化・積層工程において、前記架橋工程後の分子間架橋物の上下方向に複数の穴を設ける工程と、生体由来の高分子材料の水溶液と接触させてこの水溶液を前記穴に浸透させる工程と、真空凍結乾燥することにより前記ヒアルロン酸スポンジと該高分子材料からなる前記細胞接着部とを形成する工程とを有することを特徴とする組織再生用基材の製法。The method according to claim 11, wherein
In the sponging / laminating step, a step of providing a plurality of holes in the vertical direction of the intermolecular crosslinked product after the cross-linking step, and a step of bringing the aqueous solution into the holes by contact with an aqueous solution of a polymer material derived from a living body And a step of forming the hyaluronic acid sponge and the cell-adhered portion comprising the polymer material by vacuum freeze-drying. 請求項１１又は１２記載の製法であって、
前記スポンジ化・積層工程において、前記架橋工程後の分子間架橋物を凍結し解凍する操作を少なくとも１回以上行ったあと真空凍結乾燥することを特徴とする組織再生用基材の製法。The method according to claim 11 or 12, wherein
In the sponging and laminating step, a method for producing a tissue regeneration base material, characterized in that an operation of freezing and thawing the intermolecular crosslinked product after the crosslinking step is performed at least once and then vacuum freeze-dried. 請求項６〜１３のいずれかに記載の製法であって、
さらに前記細胞接着部を分子間架橋する接着部架橋工程を有することを特徴とする組織再生用基材の製法。It is a manufacturing method in any one of Claims 6-13, Comprising:
A method for producing a tissue regeneration base material, further comprising an adhesion crosslinking step of intermolecularly crosslinking the cell adhesion part. 請求項１〜５のいずれかに記載の組織再生用基材又は請求項６〜１４のいずれかに記載の製法によって作製された組織再生用基材と、
前記組織再生用基材の細胞接着部に保持された細胞と
を備えたことを特徴とする移植用材料。A tissue regeneration substrate according to any one of claims 1 to 5 or a tissue regeneration substrate prepared by the method according to any one of claims 6 to 14,
And a cell held in a cell adhesion portion of the tissue regeneration substrate. 請求項１５記載の移植用材料であって、
前記細胞は、線維芽細胞、角化細胞、色素産生細胞、血管内皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞又はランゲルハンス島細胞である移植用材料。The implant material according to claim 15, wherein
The cells are fibroblasts, keratinocytes, pigment-producing cells, vascular endothelial cells, endothelial cells, epithelial cells, chondrocytes, osteoblasts, myoblasts, adipocytes, hepatocytes, nerve cells, cardiomyocytes or Langerhans Transplant material that is islet cells. 請求項１５又は１６記載の移植用材料を製造する方法であって、
請求項６〜１４のいずれかに記載の組織再生用基材の製法によって組織再生用基材を作製したあと、この組織再生用基材の細胞接着部に細胞を組み込むことを特徴とする移植用材料の製法。A method for producing an implantable material according to claim 15 or 16,
A method for producing a tissue regeneration substrate according to any one of claims 6 to 14, wherein a tissue regeneration substrate is produced, and then cells are incorporated into a cell adhesion portion of the tissue regeneration substrate. Material manufacturing method.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6358531A (en) * 1986-08-29 1988-03-14 Hitachi Ltd Detector for display position
WO2004050102A2 (en) * 2002-06-27 2004-06-17 Roberto Beretta Methods for preparing a solid-fibrin web
WO2004103427A1 (en) * 2003-05-23 2004-12-02 M D Bio Inc Filling material and manipulation method
BRPI0722363B8 (en) 2006-12-22 2021-06-22 Laboratoire Medidom S A implantable laminated cartilage patch patch
CN101724164B (en) * 2008-10-31 2011-12-14 科妍生物科技股份有限公司 Method for preparing cross-linked hyaluronic acid
CN101912633A (en) * 2010-08-03 2010-12-15 孙伟庆 Hyaluronic acid sponge and preparation method thereof
CN102558600A (en) * 2011-12-01 2012-07-11 上海白衣缘生物工程有限公司 Cross-linked hyaluronan sponge and preparation method for same
ES2686114T3 (en) * 2011-12-20 2018-10-16 Angioclinic Ag Hyaluronic acid and its use for the treatment of venous insufficiency and varicose veins
KR101240518B1 (en) * 2012-03-26 2013-03-11 주식회사 제네웰 Raw materials for transplantation using biocompatible polymers
EP2910255A1 (en) * 2014-02-19 2015-08-26 MedSkin Solutions Dr. Suwelack AG Methods for the production of biopolymers with defined average molecular weight
CN106110367A (en) * 2016-07-29 2016-11-16 北京化工大学常州先进材料研究院 Based on natural polymer MULTILAYER COMPOSITE medical dressing and preparation method thereof
EP3768337A1 (en) * 2018-03-22 2021-01-27 Queen Mary University of London Implantable cell dressing for treatment of disease
KR102113778B1 (en) * 2018-09-27 2020-05-21 한국화학연구원 Myocardial-like structures prepared using porous supports method for evaluating drug toxicity using the same
CN109998775A (en) * 2019-03-21 2019-07-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 A kind of compressed tampon dressing and the preparation method and application thereof
CN114681654B (en) * 2020-12-31 2023-04-18 广州迈普再生医学科技股份有限公司 Absorbable sponge dressing with wound repair function and preparation method thereof
CN115671365B (en) * 2022-11-04 2024-02-13 浙江诸暨聚源生物技术有限公司 Crosslinked recombinant collagen sponge and preparation method and application thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989008465A1 (en) * 1988-03-09 1989-09-21 Terumo Kabushiki Kaisha Medical material permitting cells to enter thereinto and artificial skin
JPH04332561A (en) * 1991-05-09 1992-11-19 Koken Co Ltd Matrix for culture skin
IT1263144B (en) * 1993-02-04 1996-08-01 Lanfranco Callegaro PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS INCLUDING SPONGY MATERIAL CONSTITUTED FROM FOREIGN DERIVATIVES OF HYALURONIC ACID IN ASSOCIATION WITH OTHER PHARMACOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
JPH06292716A (en) * 1993-04-09 1994-10-21 Shimizu Yoshihiko Medical material
JPH11319066A (en) * 1998-05-11 1999-11-24 Mitsubishi Chemical Corp Wound coating material
JPH11322807A (en) * 1998-05-11 1999-11-26 Mitsubishi Chemical Corp Production of crosslinked hyaluronic acid sponge
DE60018814T2 (en) * 1999-01-21 2006-04-06 Nipro Corp. Sewable membrane for adhesion prevention
JP2000237294A (en) * 1999-02-18 2000-09-05 Denki Kagaku Kogyo Kk Medical material containing hyaluronic acid gel
JP2001212224A (en) * 2000-02-04 2001-08-07 Toyobo Co Ltd Wound coating material

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