JPWO2002033054A1

JPWO2002033054A1 - polyβ2 gene deficient animal

Info

Publication number: JPWO2002033054A1
Application number: JP2002536424A
Authority: JP
Inventors: 池田　恭治; 本山　昇; 高井　裕之; 小林　洋介; 渡部　美穂
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2004-02-26
Also published as: AU2001295982A1; WO2002033054A1

Abstract

ジーンターゲティングを用い片方の遺伝子座を不活性化したＥＳ細胞を樹立し、その細胞を用いてキメラマウスを作成し、該キメラマウスを用いた交配により、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方または双方が不活性化された遺伝子改変動物を作成することに成功した。このノックアウトマウスは、水頭症、発育不良、内臓逆位、精子の成熟不良、脳室上衣細胞および気管上皮細胞の線毛における繊毛構造異常（ダイニン内腕欠損）を特徴としていた。Gene targeting is used to establish ES cells in which one of the loci has been inactivated, and a chimeric mouse is prepared using the cells. By mating using the chimeric mouse, one or both of the polyβ2 gene pairs are disabled. We succeeded in creating an activated genetically modified animal. This knockout mouse was characterized by hydrocephalus, poor growth, visceral inversion, poor sperm maturation, abnormal ciliary structure in the cilia of ventricular ependymal cells and tracheal epithelial cells (dynein inner arm defect).

Description

技術分野
本発明は、ｐｏｌｙβ２遺伝子がノックアウトされた細胞およびげっ歯類動物、並びにそれらの利用に関する。
背景技術
ＤＮＡポリメラーゼβ２（ｐｏｌｙβ２）遺伝子はＮ末端にＢＲＣＴモチーフを含み、Ｃ末端側にＤＮＡポリメラーゼβと３０％程度の相同性を示す領域を有している遺伝子である（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８，３６８４−３６９３，（２０００），Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０１，８５１−８６７，（２０００），ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＦ１７６０９８，ＤＤＢＪ　ＡＦ１０１０１９，ＥＭＢＬ　ＡＦ１７６０９７）。
しかしながら、その機能に関しては未だ解明されておらず、その機能の解明に有用な実験系が求められている。
ｐｏｌｙβ２遺伝子対が不活性化され、ｐｏｌｙβ２の活性を全く持たない遺伝子改変動物、遺伝子改変動物から樹立された細胞株（遺伝子改変マウス由来細胞株）、あるいはＥＳ細胞株があれば、個体レベルおよび細胞レベルでの生理機能の解明が可能となり、該遺伝子に関連した疾患の治療薬などの研究に利用することが可能となる。
発明の開示
そこで、本発明は、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が人為的に抑制された遺伝子改変動物および該遺伝子改変動物から樹立された細胞株、及び遺伝子改変ＥＳ細胞株、並びにそれらの用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決する為に鋭意検討を重ねた結果、ジーンターゲティングを用い片方の遺伝子座を不活性化したＥＳ細胞を樹立し、その細胞を用いてキメラマウスを作成し、該キメラマウスを用いた交配により、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方または双方が不活性化された遺伝子改変動物を作成することに成功した。Ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の双方が不活性化された遺伝子改変動物は、水頭症、発育不良、内臓逆位、精子の成熟不良、脳室上衣細胞および気管上皮細胞の線毛における繊毛構造異常（ダイニン内腕欠損）を特徴としていた。従って、ｐｏｌｙβ２遺伝子が不活性化されたＥＳ細胞や動物は、これら疾患の解明や治療薬などの開発などに有効である。
即ち、本発明は、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変動物およびＥＳ細胞株、および当該遺伝子改変動物から樹立された細胞株、並びにそれらの利用に関し、より詳しくは、
（１）　ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とするげっ歯類ＥＳ細胞、
（２）　ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とするげっ歯類ＥＳ細胞、
（３）　げっ歯類ＥＳ細胞がマウスＥＳ細胞である（１）または（２）記載のＥＳ細胞、
（４）　ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変げっ歯類動物、
（５）　ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とするげっ歯類動物、
（６）　げっ歯類動物がマウスである（４）または（５）記載の動物、および
（７）　（４）〜（６）のいずれかに記載の動物から樹立された細胞株、を提供するものである。
本発明の遺伝子改変ＥＳ細胞および遺伝子改変動物は、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする。マウスｐｏｌｙβ２遺伝子は８つのエクソンからなり、１９番染色体上にコードされていた（図１）。成体マウスにおいてｐｏｌｙβ２ｍＲＮＡはほぼすべての組織に発現しているが、精巣で最も発現が高く認められた。ｐｏｌｙβ２は分子量約６０ｋＤａの蛋白質として核に局在していた。マウスとヒトのｐｏｌｙβ２遺伝子の塩基配列の比較を図２に示す。
本発明においてｐｏｌｙβ２遺伝子の改変の対象となる動物は、好ましくはマウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。本発明においてｐｏｌｙβ２遺伝子の改変の対象となるＥＳ細胞もまた、げっ歯類に由来するものが好ましく、特にマウス由来が好ましい。
本発明において「ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が抑制されている」とは、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が完全に抑制されている場合の他、遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合のように、不完全に抑制されている場合も含む意である。本発明においては、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が特異的に抑制されていることが好ましい。
本発明の遺伝子改変ＥＳ細胞および遺伝子改変動物において、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、ｐｏｌｙβ２遺伝子を欠損させる方法やｐｏｌｙβ２遺伝子の発現制御領域の一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することによりｐｏｌｙβ２遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好ましい態様において、遺伝子改変ＥＳ細胞および遺伝子改変動物は、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする。
本発明の遺伝子改変マウスは、以下のようにして作成することができる。まず、マウスからｐｏｌｙβ２遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡを単離し、このＤＮＡ断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポーレーション法などによりマウスＥＳ細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためにはターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくこともできる。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、ターゲッティングベクターにジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子などを結合させておくこともできる。これにより、非相同的な組換えを起こした細胞株を排除することができる。また、ＰＣＲおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率的に得ることもできる。
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあるので、複数のクローンを用いてキメラ作成を行うことが好ましい。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤胞にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを得ることができる。マウス以外のＥＳ細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行なうことができる。
また、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株は、以下の方法により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性化された細胞株、即ち、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。
本発明の遺伝子改変動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法を用いることができる（新生化学実験講座、１８巻、１２５頁〜１２９頁東京化学同人、及びマウス胚の操作マニュアル、２６２頁〜２６４頁、近代出版）。
本実施例において作成されたｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の双方が不活性化されたマウスは、通常の割合で生まれ、出生直後は外見上の異常は観察されなかった。しかし、生後２週間以降、発育不良と頭部の膨隆が観察された。病理解析の結果、側脳室、第三脳室の著名な拡大と脳実質の減少が観察された。このことから、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の双方が不活性化されたマウスは水頭症を発症していると考えられた。また、内臓逆位が観察されたマウスも存在した。さらに、オスマウスにおいては未熟な精子細胞の増加と、成熟した精子細胞の減少が認められた。また、脳室上衣細胞および気管上皮細胞の線毛におけるダイニン内腕欠損が認められた。胸腺、脾臓におけるＴリンパ球およびＢリンパ球の分化に異常は認められなかった。以上の結果から、ｐｏｌｙβ２遺伝子の遺伝子対の双方が不活性化されたマウスは、水頭症、発育不良、内臓逆位、精子の成熟不良、脳室上衣細胞および気管上皮細胞の線毛におけるダイニン内腕欠損を特徴とすることが判明した。即ち、ｐｏｌｙβ２遺伝子は水頭症、発育不良、内臓逆位、精子の成熟不良、脳室上衣細胞および気管上皮細胞の線毛におけるダイニン内腕欠損等に関与していると考えられる。また、これらの結果からｐｏｌｙβ２はｉｍｍｏｔｉｌｅ　ｃｉｌｉａ症候群、例えば気管支拡張症と慢性副鼻腔炎を伴う全内臓逆位症、繊毛の動きの障害、呼吸気道上皮における線毛粘液移送の障害などを特徴とするＫａｒｔａｇｅｎｅｒ’ｓ症候群への関与が示唆される。
従って、本発明の遺伝子改変動物、該動物から樹立した細胞株、及びＥＳ細胞株は、ｐｏｌｙβ２遺伝子の詳細な機能の解析に利用できるだけでなく、例えば、水頭症、発育不良、内臓逆位、精子の成熟不良、ｉｍｍｏｔｉｌｅ　ｃｉｌｉａ症候群などの疾患の解明に利用できる。さらに、それらの疾患の治療薬などのスクリーニングにも利用することが可能である。また、ｐｏｌｙβ２遺伝子及びタンパク質は上記疾患の治療薬などとして利用することが可能であると考えられ、特に、ｐｏｌｙβ２遺伝子は、遺伝子治療による上記疾患の治療への利用が期待される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ｐｏｌｙβ２遺伝子の相同組み換えベクターの作製
本実施例では、マウスｐｏｌｙβ２遺伝子の相同組み換えベクターを構築するために、まずマウスｐｏｌｙβ２ゲノム遺伝子のクローニングを行った。１２９ＳｖＪマウス肝臓ゲノムＤＮＡのライブラリーを用いて、マウスｐｏｌｙβ２ｃＤＮＡをプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行い、ｐｏｌｙβ２遺伝子エクソン１を含む約２０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を単離し、制限酵素部位のマッピングを行った。
相同組み換えによりｐｏｌｙβ２遺伝子のエクソン１からエクソン６をネオマイシン耐性遺伝子発現カセットと置換するよう、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットの両端にエクソン１の５’側配列を含む遺伝子断片およびエクソン７、８を含む遺伝子断片を結合することで相同領域を配し、さらに３’下流側にｔｋ発現カセットを結合し、相同組み換えベクターを作成した（図９ａ上段）。ｐｏｌｙβ２遺伝子座は、エクソン１の上流に制限酵素ＸｂａＩ認識部位（Ｘ）があり、エクソン３と４の間に制限酵素ＳｐｅＩ認識部位（Ｓｐ）をもつ（図９ａ中段）。相同組み換えによりｐｏｌｙβ２遺伝子のエクソン１からエクソン６がネオマイシン耐性遺伝子発現カセットと置換されると、エクソン１の上流にあるＸｂａＩ認識部位は保存されるが、エクソン３とエクソン４の間にあったＳｐｅＩ認識部位はなくなり、挿入されたネオマイシン耐性遺伝子発現カセット内に存在するＳｐｅＩ認識部位が生じることになる（図９ａ下段）。ＸｂａＩおよびＳｐｅＩで消化したゲノムＤＮＡに対し、５’プローブとして表記した部分の塩基配列をプローブとして用いハイブリダイゼーションを行うと、正常のｐｏｌｙβ２遺伝子座からは１１．０ｋｂ長のバンドが、変異ｐｏｌｙβ２遺伝子座からは９．２ｋｂ長のバンドが検出される。
［実施例２］相同組み換えにより変異ｐｏｌｙβ２遺伝子が挿入されｐｏｌｙβ２遺伝子対の一方が不活性化されたＥＳ細胞の樹立
本実施例では、相同組み換え用ベクターを、エレクトロポレーション法によりマウスＥＳ細胞Ｅ１４（Ｈｏｐｐｅｒ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９２−２９５，１９８７）に導入、ついでＧ４１８、ガンシクロビルにより選択培養を行った。得られたＧ４１８／ガンシクロビル耐性コロニーについて、ＰＣＲおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、ｐｏｌｙβ２遺伝子対の一方に変異ｐｏｌｙβ２遺伝子が挿入された細胞株を４クローン得た。
得られたクローンについてサザン解析により変異遺伝子の挿入の確認を行なった（図９ｂ）。その結果、変異遺伝子の挿入を行っていないＥＳ細胞株Ｅ１４では、１１ｋｂのバンドのみが検出されたのに対し、相同組み換え用ベクターの導入および薬剤選択により得られた細胞株９６、９７、１１０では、正常ｐｏｌｙβ２遺伝子座に由来する１１ｋｂのバンドおよび、変異ｐｏｌｙβ２遺伝子座に由来する９．２ｋｂのバンドが検出された。
［実施例３］相同組換えにより変異ｐｏｌｙβ２遺伝子が挿入されｐｏｌｙβ２遺伝子対の双方が不活性化されたＥＳ細胞の樹立
相同組換え用のベクターの導入により変異ｐｏｌｙβ２遺伝子が挿入されｐｏｌｙβ２遺伝子の一方が不活性化されたＥＳ細胞株を高濃度Ｇ４１８による選別を行うことにより、もう一方の遺伝子対も不活性化された細胞株、即ち本発明のマウスＥＳ細胞株を２クローン得た。
［実施例４］ｐｏｌｙβ２遺伝子対の一方が不活性化されたＥＳ細胞によるキメラマウスの作製
ｐｏｌｙβ２遺伝子の一方が不活性化されたＥＳ細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚盤胞にインジェクションしキメラマウスを得た。
［実施例５］ｐｏｌｙβ２遺伝子対の双方が不活性化されたマウスの作製
ｐｏｌｙβ２遺伝子対の一方が不活性化されたＥＳ細胞を用いて作製されたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配し、ｐｏｌｙβ２遺伝子対の一方が不活性化された細胞から成るマウス（以下、「ｐｏｌｙβ２＋／−マウス」と称する）を得た。これらのｐｏｌｙβ２＋／−マウス同士を交配することにより、ｐｏｌｙβ２遺伝子対の双方が不活性化されたマウス（以下、「ｐｏｌｙβ２−／−マウス」と称する）を得た。これらのマウスのｐｏｌｙβ２遺伝子対の双方に変異遺伝子が挿入されていることをサザン解析により確認した。
［実施例６］ｐｏｌｙβ２−／−マウスの特徴
（１）　逆位
ｐｏｌｙβ２−／−マウスにおいて、２３例中３例で、心臓および内臓が鏡像対称となる完全内臓逆位を示す個体が見られた（図１０）。
（２）　水頭症
ｐｏｌｙβ２−／−マウスは水頭症を発症する。水頭症の程度には個体差が見られるが、重症のものでは生後２週間目から頭部の膨隆が顕著となり（図３ａ、ｂ、ｃ）、脳室の拡張が見られる（図３ｃ、４ｂ）。また、外見上頭部の膨隆を示さない個体においても、組織標本を作成し観察すると、側脳室の拡張が認められる。
側脳室の拡張すなわち水頭症の発症は、胎生１０．５日から１８．５日では認められない。しかしながら、外見上は正常であるが生後１日目には認められるようになる（図４ａ）。この時、大脳皮質は正常であり（図４ａ）、圧迫はされているが海馬、視床、中脳、小脳、随脳は保存されている。
生後５週齢までにさらに側脳室の拡張が進み、大脳皮質の薄層化や脳梁の希薄化が認められるようになる（図４ｂ）。
顕著な側脳室拡張を起こした成体マウスでは、脳室周囲の上衣細胞においてアポトーシスが見られる。このようなアポトーシスは脳室拡張前の脳室周辺においては認められない。
脳室の拡張は、側脳室と第三脳室で認められるが、第四脳室および中脳水道では認められない。また、胎生１４．５日以降から第三脳室および中脳水道の上衣細胞の過形成が見られる（図４ｃ−ｅ）。
ｐｏｌｙβ２遺伝子が不活性化されていない正常個体では、脳室上衣細胞は脳室を取り巻くように並んだ数層の細胞層を構成しているが（図５ｇ、ｈ）、ｐｏｌｙβ２−／−マウス成体の脳では第三脳室および中脳水道の上衣細胞の過形成が見られ層構造が破綻している部分が認められる（図５ａ−ｆ）。これら上衣細胞過形成部位では、球形で明確な核を持つ単核の細胞とエオジン好性の細胞質を持つ単核の細胞が認められる（図５ｃ）。
水頭症を示している脳室の上衣細胞を電子顕微鏡で観察すると、上衣細胞の多層化および微絨毛縁の崩壊が見られる（図４ｆ）。
水頭症の原因の一つとして脳脊髄液の循環経路における閉塞が考えられるため、脳室内にトリパンブルーを注入し脊柱管への流入を調べる手法（Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２，１０９２−１０９８，２０００）を用いて閉塞の有無を調べたところ、脳脊髄液の排液経路が開口していないことが判明した。
双方のｐｏｌｙβ２遺伝子が不活性化されたマウスにおける水頭症の発症原因は、脳脊髄液循環経路の閉塞および上衣細胞の微絨毛縁の崩壊による、脳脊髄液の産生およびあるいは再吸収における異常であると考えられる。
（３）　発育不良
水頭症を発症したｐｏｌｙβ２−／−マウスは、ｐｏｌｙβ２遺伝子が不活性化されていない野生型マウス（以下「ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス」と称する）に比べて発育遅延を示す（図３ａ）。生後１４日目、２１日目において、ｐｏｌｙβ２−／−マウスの体重はｐｏｌｙβ２＋／＋マウスの６０〜８０％程度である。
（４）　生存曲線
離乳後の観察によると、ｐｏｌｙβ２−／−マウスは、生後３週齢から死亡し始め、５週齢までには生存率が５０％となる（図８）。死亡するｐｏｌｙβ２−／−マウスは大部分が水頭症を示す個体であり、５週齢を越えて生存するｐｏｌｙβ２−／−マウスは、外見上は正常マウスと同一である。
（５）　脳におけるｐｏｌｙβ２遺伝子の発現
ｐｏｌｙβ２遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の局在をｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた。ｐｏｌｙβ２ｍＲＮＡは、野生型マウスの胎児脳の脳室周辺の細胞および成体の脳室上衣細胞および脈絡叢に局在しており、ｐｏｌｙβ２−／−マウスではそれらの細胞におけるｐｏｌｙβ２ｍＲＮＡの局在は認められない（図６ａ−ｃ）。
（６）　精巣におけるｐｏｌｙβ２遺伝子の発現
ｐｏｌｙβ２遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の局在をｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた。ｐｏｌｙβ２ｍＲＮＡは、野生型マウスの精巣での局在が認められる。ｐｏｌｙβ２−／−マウスでは精巣におけるｐｏｌｙβ２ｍＲＮＡの局在は認められない（図６ｄ）。
また、ノーザンブロット解析によりｐｏｌｙβ２−／−マウスの精巣におけるｐｏｌｙβ２遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の発現解析を行なった（図９ｃ）。ｐｏｌｙβ２＋／＋マウスおよび、（ｐｏｌｙβ２＋／−マウスでは、ｐｏｌｙβ２遺伝子ｍＲＮＡの発現が認められるが、ｐｏｌｙβ２−／−マウスでは、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現は認められない。図９ｃ下段はＥＦ−１αの発現を示したものであり、これにより各レーンにＲＮＡサンプルが存在することが証明される。
（７）　生殖能力
ｐｏｌｙβ２−／−マウスの生殖能力について調べた。６例のｐｏｌｙβ２−／−マウスそれぞれを２例ずつのＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスと同居させ、３０日間妊娠の成立の有無を観察した。その結果、いずれも交配成立を示す膣栓の形成は観察されるものの産仔は得られなかった。一方、ｐｏｌｙβ２−／−メスマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオスマウスあるいはｐｏｌｙβ２＋／−オスマウスとの交配が成立し、３例のｐｏｌｙβ２−／−メスマウスで産仔が得られた。これらのこのことからｐｏｌｙβ２−／−オスマウスは不妊であるが、ｐｏｌｙβ２−／−メスマウスは正常の生殖能力をもつといえる。
（８）　精子および精巣の解析
ｐｏｌｙβ２−／−オスマウスは不妊であったことから、精子および精巣の解析を行った。ｐｏｌｙβ２−／−オスマウスの精巣上体尾部から得た精子は運動能力を欠損しており、頭部のみ、奇形頭部を有する、尾部が短いといった奇形精子が多く見られた（図７ｂ）。精巣の病理解析を行ったところ、ｐｏｌｙβ２−／−の精巣は、１２段階に分けられる精子形成過程すべての段階を有する精細管を有し（図７ｄ）、また、パキテン期精母細胞の減数分裂が見られ（図７ｆ）、これらはｐｏｌｙβ２＋／＋のそれ（図７ｃ、ｅ）と同様であった。しかしながら、ｐｏｌｙβ２−／−の精巣では未熟な精子細胞がセルトリ細胞から遊離しており、成熟し伸長した核をもつ精子細胞はわずかに認められる程度であった（図７ｈ）。ｐｏｌｙβ２−／−の精巣上体体部中には、成熟した精子細胞数は少なく、未熟な精子細胞とエオジン好性の物質が多く見られた（図７ｊ）。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス精子の核の成熟度を調べるため、未受精卵の細胞質内へ精子頭部を顕微注入することによって受精させ（顕微受精）、後の胚発生を調べた。Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統の未受精卵にｐｏｌｙβ２−／−マウスの精子頭部を顕微注入し、受精の成立した２３個の受精卵を偽妊娠メスの卵管内に移植し、妊娠を継続させた。その結果、１２匹の産仔が得られこれらは正常に成長した。このことから、ｐｏｌｙβ２−／−マウス精子の核成熟は正常に起こっていると考えられる。
（９）　電子顕微鏡による線毛構造の解析
ｐｏｌｙβ２−／−マウスにおいて、内臓逆位、水頭症、精子の運動不全が見られ、線毛運動の異常が疑われたため、電子顕微鏡による線毛構造の解析を行った。ｐｏｌｙβ２＋／＋マウスの脳室上衣細胞（図１１左上）および気管上皮細胞（図１１左下）の線毛の断面で見られるように、正常な線毛は、一組の単微小管対と９組の周辺二連微小管からなり、二連微小管は二本のダイニン腕（外腕と内腕）を持つ（図１２）。ｐｏｌｙβ２−／−マウスの脳室上衣細胞（図１１右上）および気管上皮細胞（図１１右下）の線毛の断面では、ダイニン内腕が欠損している様子が観察された。
（１０）　慢性副鼻腔炎
ｐｏｌｙβ２−／−マウスにおいてダイニン内腕の欠損が見られたことから、Ｋａｒｔａｇｅｎｅｒ症候群の症状のひとつである慢性副鼻腔炎の検索をｐｏｌｙβ２−／−マウスにて行った。対照群であるｐｏｌｙβ２＋／−マウスでは鼻腔・副鼻腔に空洞が認められたが（図１３ａ）、ｐｏｌｙβ２−／−マウスでは鼻腔・副鼻腔内に内容物が認められた（図１３ｂ）。拡大すると、鼻腔内には分葉好中球が充満し、粘膜下組織には形質細胞浸潤と毛細血管増生がみられ（図１３ｃ）、ｐｏｌｙβ２−／−マウスは慢性化膿性鼻腔炎を発症していると診断された。気管上皮細胞や脳室上衣細胞の繊毛で見られたのと同様の繊毛構造異常（ダイニン内腕欠損）が、鼻腔粘膜を構成する鼻粘膜繊毛細胞の繊毛でも起こっているために運動障害が起こり、鼻腔炎を発症しているものと推察される。
産業上の利用の可能性
本発明により、ｐｏｌｙβ２遺伝子の発現が人為的に抑制されたＥＳ細胞およびマウスが提供され、該マウスが、水頭症、発育不良、内臓逆位、精子の成熟不良、脳室上衣細胞および気管上皮細胞の線毛における繊毛構造異常（ダイニン内腕欠損）を特徴とすることが明らかとなった。従って、本発明の遺伝子改変ＥＳ細胞、遺伝子改変動物、あるいは該動物から樹立した細胞株を利用すれば、ｐｏｌｙβ２遺伝子の機能の解析の他、水頭症、発育不良、内臓逆位、精子の成熟不良、ｉｍｍｏｔｉｌｅ　ｃｉｌｉａ症候群などの疾患の解明やこれら疾患の治療薬などのスクリーニングを行なうことも可能である。また、ｐｏｌｙβ２遺伝子及びタンパク質は上記疾患の治療薬などとして利用することが可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスｐｏｌｙβ２遺伝子のエクソン・イントロン構造を示す図である。Ａは、エクソン・イントロン構造の全体像を示し、Ｂは、エクソンとイントロンの境界領域の塩基配列を示す。
図２は、マウスとヒトのｐｏｌｙβ２遺伝子の塩基配列の比較を示す図である。
図３は、
ａ．生後４週齢の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左：ベージュ）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右：白）を示す写真である。
ｐｏｌｙβ２−／−マウスでは頭部の膨隆が見られ、また発育の遅れが観察される。
ｂ．生後５週齢の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の外部形態を示した写真である。
エーテル麻酔による安楽死の後、頭部皮膚を切開し、頭蓋骨を部分的に除去し、大脳上部を露出させた。ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）では、脳の拡張と大脳皮質の薄層化が観察される。
ｃ．生後５週齢の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の冠状断面（上段）と矢状断面（下段）をしめした写真である。
ｂと同じくエーテル麻酔による安楽死の後、頭部を剖出し、冠状断標本及び矢状断標本を作成した。ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）では、側脳室の拡張と大脳皮質の薄層化が観察される。
図４は、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウスとｐｏｌｙβ２−／−マウスの脳の切片標本を示した写真である。
ａ．生後１日のｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の横断切片標本を示した写真である。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）では、側脳室の拡張が認められる。
ｂ．生後５週の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の横断切片標本を示した写真である。
双方のｐｏｌｙβ２遺伝子が不活性化されたマウス（右）において脳室の拡張が認められる。
ｃ．胎生１４．５日の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の横断切片標本を示した写真である。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）において、脳室上衣細胞の細胞分裂を伴う過形成が認められる。
ｄ．生後１日の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の横断切片標本を示した写真である。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）において、脳室上衣細胞の乳頭状の細胞増殖を伴う過形成が認められる。
ｅ．生後５週齢の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の横断切片標本を示した写真である。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）において、第三脳室上衣細胞の乳頭状の細胞増殖を伴う過形成が認められる。
ｆ．生後５週齢の、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）とｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳の電子顕微鏡解析標本を示した写真である。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）において、上衣細胞の多層化および微絨毛縁の崩壊が認められる。
図５は、脳の矢状断連続切片標本を示した写真である。
ａに示すように正中面近くの断面の連続切片（ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）を作成した。
ｐｏｌｙβ２＋／＋マウスの脳室上衣細胞は、脳室を取り巻くように数層の細胞層を構成しているが（図４ｇ、ｈ）、ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳では第三脳室（３Ｖ）および中脳水道（Ａｑ）の上衣細胞の過形成が見られ、層構造が破綻している部分が認められる（図４ｃ−ｆ）。ｃに挿入した拡大写真でわかるように、上衣細胞の過形成部位では、球形で明確な核をもつ単核細胞とエオジン好性の細胞質をもつ単核細胞が認められる（図４ｃ）。
図６は、脳および精巣におけるｐｏｌｙβ２遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の局在をｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより調べた結果を示す写真である。
ａ．胎生１４．５日のｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）の脳では、脳室周辺の細胞でｐｏｌｙβ２遺伝子ｍＲＮＡの局在が見られるが、ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳ではそれらは見られない。
ｂ．生後５週齢のｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）の脳では、側脳室の上衣細胞（矢印）と脈絡叢（矢頭）でｐｏｌｙβ２遺伝子ｍＲＮＡの局在が見られるが、ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳ではそれらは見られない。
ｃ．生後５週齢のｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）の脳では、中脳水道の上衣細胞でｐｏｌｙβ２遺伝子ｍＲＮＡの局在が見られるが、ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）の脳では見られない。＊は中脳水道腔を表す。
ｄ．生後７週齢のｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（左）の精巣ではｐｏｌｙβ２遺伝子ｍＲＮＡの局在が見られるが、ｐｏｌｙβ２−／−マウス（右）では見られない。＊は精細管の管腔を表す。
図７
ａ、ｂ．精巣上体尾部から得られた精子を位相差顕微鏡で観察した写真である。生後９週齢のｐｏｌｙβ２＋／＋マウスの精子（ａ）の形状に比べ、ｐｏｌｙβ２−／−マウスの精子（ｂ）は、短い尾部をもつもの、尾部をもたないもの、円形頭部をもつものなどの奇形精子が見られた。
ｃ−ｈ．精巣の病理解析を行った結果を示した写真である。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス精巣（ｄ）は、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス精巣（ｃ）と同様の精細管構造を有する。
ｐｏｌｙβ２−／−マウス精巣（ｆ）では、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス精巣（ｅ）と同様に、パキテン期精母細胞の減数分裂が見られる。
ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス精巣（ｇ）では、成熟し伸長した核を持ち伸長した尾部を伴う精子細胞が見られるのに対し、ｐｏｌｙβ２−／−マウス精巣（ｈ）では成熟した精子細胞はわずかに認められる程度であり、未熟な精子細胞がセルトリ細胞から遊離している。
ｉ、ｊ．精巣上体体部の病理解析を行った結果を示した写真である。
ｐｏｌｙβ２＋／＋マウス（ｉ）では、成熟した精子細胞が見られるのに対し、ｐｏｌｙβ２−／−マウス（ｊ）では、成熟した精子細胞は少なく、未熟な精子細胞とエオジン好性の物質が多く見られた。
図８は、ｐｏｌｙβ２−／−マウスの生存曲線を示す。
図９
ａ．マウスのｐｏｌｙβ２遺伝子を不活性化するために用いた相同組み換え用ベクターの構築を示す図である。
ｂ．相同組み換えベクターを導入したＥＳ細胞クローンにおける変異遺伝子の挿入をサザン解析により検出した結果を示す写真である。
ｃ．ｐｏｌｙβ２−／−マウスの精巣におけるｐｏｌｙβ２遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の発現をノーザンブロット解析により検出した結果を示す写真である。対照としてＥＦ−１αを用いた。
図１０は、ｐｏｌｙβ２−／−マウスとｐｏｌｙβ２＋／＋マウスの内臓配置を示した解剖写真である。内臓配置をわかりやすくするために肋骨および肝臓を切除してある。ｐｏｌｙβ２−／−マウスの内臓配置は、ｐｏｌｙβ２＋／＋マウスの内臓配置の鏡像対称となっている。図中、ＡｐはＡｐｅｘ（尖）、ＦｓはＦｏｒｅｓｔｏｍａｃｈ（前胃）、ＳｐはＳｐｌｅｅｎ（脾臓）を示す記号である。
図１１は、ｐｏｌｙβ２−／−マウスの線毛構造を電子顕微鏡で観察した写真である。上段は脳室上衣細胞の線毛の断面、下段は気管上皮細胞の線毛の断面を示している。ｐｏｌｙβ２−／−マウスでは、脳室上衣細胞の線毛（右上）、気管上皮細胞の線毛（右下）において、ダイニン内腕の欠損が見られる。
図１２は、二連微小管の二本のダイニン腕（外腕と内腕）の模式図である。
図１３
ａ．対照群であるｐｏｌｙβ２＋／−マウスにおいて、鼻腔・副鼻腔に空洞が認められたことを示す写真である。
ｂ．ｐｏｌｙβ２−／−マウスにおいて、鼻腔・副鼻腔内に内容物が認められたことを示す写真である。
ｃ．ｐｏｌｙβ２−／−マウスにおける鼻腔・副鼻腔内の拡大写真である。鼻腔内には分葉好中球が充満し、粘膜下組織には形質細胞浸潤と毛細血管増生がみられる。 Technical field
The present invention relates to cells and rodents in which the polyβ2 gene has been knocked out, and uses thereof.
Background art
The DNA polymerase β2 (polyβ2) gene is a gene containing a BRCT motif at the N-terminus and having a region showing about 30% homology with DNA polymerase β at the C-terminus (Nucleic Acids Research 28, 3684-). 3693, (2000), Journal of Molecular Biology, 301, 851-867, (2000), GenBank AF176098, DDBJ AF101019, EMBL AF176097).
However, its function has not been elucidated yet, and an experimental system useful for elucidating its function has been demanded.
If the polyβ2 gene pair is inactivated, and there is a genetically modified animal having no polyβ2 activity at all, a cell line established from the genetically modified animal (a cell line derived from a genetically modified mouse), or an ES cell line, the individual level and cells It is possible to elucidate the physiological function at the level, and it can be used for research on therapeutic drugs for diseases related to the gene.
Disclosure of the invention
Therefore, an object of the present invention is to provide a genetically modified animal in which the expression of the polyβ2 gene is artificially suppressed, a cell line established from the genetically modified animal, a genetically modified ES cell line, and uses thereof. I do.
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, as a result, established ES cells inactivated one of the loci using gene targeting, to create a chimeric mouse using the cells, By mating using the chimeric mouse, a genetically modified animal in which one or both of the polyβ2 gene pair was inactivated was successfully produced. Genetically modified animals in which both gene pairs of the Polyβ2 gene are inactivated include hydrocephalus, poor growth, visceral inversion, poor sperm maturation, abnormal ciliary structure in cilia of ventricular ependymal cells and tracheal epithelial cells (dynin Inner arm defect). Therefore, ES cells or animals in which the polyβ2 gene has been inactivated are effective for elucidation of these diseases, development of therapeutic agents and the like.
That is, the present invention relates to genetically modified animals and ES cell lines in which the expression of the polyβ2 gene is artificially suppressed, cell lines established from the genetically modified animals, and uses thereof.
(1) a rodent ES cell, wherein the expression of the Δpolyβ2 gene is artificially suppressed;
(2) a rodent ES cell, wherein a foreign gene has been inserted into one or both of the gene pair of the Δpolyβ2 gene,
(3) The ES cell according to (1) or (2), wherein the rodent ES cell is a mouse ES cell.
(4) a genetically modified rodent, wherein expression of the Δpolyβ2 gene is artificially suppressed;
(5) a rodent, wherein a foreign gene is inserted into one or both of the gene pair of the Δpolyβ2 gene,
(6) The animal according to (4) or (5), wherein the rodent is a mouse, and
(7) A cell line established from the animal according to any one of (4) to (6).
The genetically modified ES cells and genetically modified animals of the present invention are characterized in that the expression of the polyβ2 gene is artificially suppressed. The mouse polyβ2 gene consists of eight exons and was encoded on chromosome 19 (FIG. 1). Polyβ2 mRNA is expressed in almost all tissues in adult mice, but the highest expression was observed in testis. Polyβ2 was localized in the nucleus as a protein having a molecular weight of about 60 kDa. FIG. 2 shows a comparison of the nucleotide sequences of the mouse and human polyβ2 genes.
In the present invention, the target animal for the modification of the polyβ2 gene is preferably a rodent such as a mouse, a rat or a hamster, and among them, a mouse is particularly preferable. In the present invention, ES cells targeted for modification of the polyβ2 gene are also preferably derived from rodents, and particularly preferably derived from mice.
In the present invention, “expression of the polyβ2 gene is suppressed” refers to a case where the expression of the polyβ2 gene is completely suppressed and a case where only the expression of one gene of the gene pair is suppressed. It is intended to include the case where it is imperfectly suppressed. In the present invention, it is preferable that the expression of the polyβ2 gene is specifically suppressed.
Examples of means for artificially suppressing the expression of the polyβ2 gene in the genetically modified ES cells and the genetically modified animals of the present invention include a method for deleting the polyβ2 gene and a method for deleting a part of the expression control region of the polyβ2 gene. However, a preferred method is to inactivate the polyβ2 gene by inserting a foreign gene into one or both of the polyβ2 gene pair. That is, in a preferred embodiment of the present invention, the genetically modified ES cell and the genetically modified animal are characterized in that a foreign gene has been inserted into one or both of the polyβ2 gene pair.
The genetically modified mouse of the present invention can be prepared as follows. First, a DNA containing an exon portion of the polyβ2 gene is isolated from a mouse, and an appropriate marker gene is inserted into this DNA fragment to construct a targeting vector. This targeting vector is introduced into a mouse ES cell line by electroporation or the like, and a cell line in which homologous recombination has occurred is selected. As a marker gene to be inserted, an antibiotic resistance gene such as a neomycin resistance gene is preferable. When an antibiotic resistance gene is inserted, a cell line in which homologous recombination has occurred can be selected only by culturing in a medium containing the antibiotic. For more efficient selection, a thymidine kinase gene or the like can be linked to a targeting vector. As a result, cell lines that have undergone heterologous recombination can be excluded. Further, a diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or the like can be linked to a targeting vector. As a result, cell lines that have undergone heterologous recombination can be excluded. In addition, a homologous recombinant can be assayed by PCR and Southern blot to efficiently obtain a cell line in which one of the polyβ2 gene pair is inactivated.
When selecting a cell line in which homologous recombination has occurred, it is preferable to create a chimera using a plurality of clones in addition to the homologous recombination site, since there is a risk of unknown gene disruption due to gene insertion. A chimeric mouse can be obtained by injecting the obtained ES cell line into a mouse blastocyst. By mating this chimeric mouse, a mouse in which one of the polyβ2 gene pair has been inactivated can be obtained. Furthermore, by mating this mouse, it is possible to obtain a mouse in which both gene pairs of the polyβ2 gene have been inactivated. Gene modification can also be performed in animals other than mice in which ES cells have been established by the same method.
In addition, an ES cell line in which both the polyβ2 gene pair is inactivated can be obtained by the following method. That is, by culturing an ES cell line in which one of the gene pairs has been inactivated in a medium containing a high concentration of an antibiotic, the cell line in which the other of the gene pairs has also been inactivated, ie, the gene pair of the polyβ2 gene, An ES cell line in which both are inactivated can be obtained. Alternatively, it can be prepared by selecting an ES cell line in which one of the gene pairs has been inactivated, introducing a targeting vector again into this cell line, and selecting a cell line in which homologous recombination has occurred. It is preferable to use a marker gene to be inserted into the targeting vector, which is different from the marker gene described above.
As a method for establishing the cell line derived from the genetically modified animal of the present invention, a known method can be used. For example, in rodents, the method of primary culture of fetal cells can be used (Shinsei Kagaku Kenkyusho, Vol. 18, pages 125 to 129, Tokyo Kagaku Dojin, and an operation manual for mouse embryos, pages 262 to 264). , Modern Publishing).
Mice in which both gene pairs of the polyβ2 gene prepared in this example were inactivated were born at a normal ratio, and no apparent abnormality was observed immediately after birth. However, from 2 weeks after birth, poor growth and swelling of the head were observed. As a result of pathological analysis, remarkable enlargement of the lateral ventricle and third ventricle and a decrease in brain parenchyma were observed. From this, it was considered that a mouse in which both of the polyβ2 gene pair was inactivated developed hydrocephalus. In addition, some mice showed visceral inversion. Furthermore, in male mice, an increase in immature sperm cells and a decrease in mature sperm cells were observed. In addition, dynein inner arm deficiency was found in the pili of ventricular ependymal cells and tracheal epithelial cells. No abnormalities were observed in the differentiation of T lymphocytes and B lymphocytes in the thymus and spleen. Based on the above results, mice in which both gene pairs of the polyβ2 gene were inactivated were found to have hydrocephalus, poor growth, visceral inversion, poor sperm maturation, intraventricular ependymal cells and endothelial cells in the pili of the trachea. It was found to be characterized by arm loss. That is, the polyβ2 gene is considered to be involved in hydrocephalus, poor growth, visceral inversion, poor sperm maturation, dynein inner arm deficiency in fimbria of ventricular ependymal cells and tracheal epithelial cells. In addition, from these results, polyβ2 is characterized by immotile @ cilia syndrome, for example, total visceral inversion with bronchiectasis and chronic sinusitis, impaired cilia movement, impaired ciliary mucus transport in respiratory airway epithelium, and the like. Involvement in Kartagener's syndrome is suggested.
Therefore, the genetically modified animal of the present invention, the cell line established from the animal, and the ES cell line can be used not only for analyzing the detailed function of the polyβ2 gene, but also for hydrocephalus, poor growth, visceral inversion, sperm It can be used for elucidation of diseases such as poor maturation and immortile @ cilia syndrome. Furthermore, it can also be used for screening therapeutic agents for those diseases. In addition, it is considered that the polyβ2 gene and protein can be used as a therapeutic agent for the above-mentioned diseases and the like. In particular, the polyβ2 gene is expected to be used for the treatment of the above-mentioned diseases by gene therapy.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[Example 1] Construction of homologous recombination vector of polyβ2 gene
In the present example, in order to construct a homologous recombination vector for the mouse polyβ2 gene, first, the mouse polyβ2 genomic gene was cloned. Using a library of 129SvJ mouse liver genomic DNA, plaque hybridization was performed using mouse polyβ2 cDNA as a probe, a genomic DNA fragment of about 20 kb containing exon 1 of the polyβ2 gene was isolated, and restriction enzyme sites were mapped.
A gene fragment containing the 5 'side sequence of exon 1 and a gene fragment containing exons 7 and 8 at both ends of the neomycin resistance gene expression cassette so that exon 1 to exon 6 of the polyβ2 gene are replaced with the neomycin resistance gene expression cassette by homologous recombination. To form a homologous recombination vector, and further, a tk expression cassette was connected to the 3 ′ downstream side to prepare a homologous recombination vector (FIG. 9a, upper row). The polyβ2 locus has a restriction enzyme XbaI recognition site (X) upstream of exon 1 and a restriction enzyme SpeI recognition site (Sp) between exons 3 and 4 (middle row of FIG. 9a). When exon 1 to exon 6 of the polyβ2 gene are replaced with the neomycin resistance gene expression cassette by homologous recombination, the XbaI recognition site upstream of exon 1 is conserved, but the SpeI recognition site located between exon 3 and exon 4 is As a result, a SpeI recognition site existing in the inserted neomycin resistance gene expression cassette is generated (FIG. 9a, lower panel). When hybridization was performed on the genomic DNA digested with XbaI and SpeI using the nucleotide sequence of the portion represented as the 5 ′ probe as a probe, a 11.0 kb long band from the normal polyβ2 locus was found to be mutated polyβ2 locus. , A 9.2 kb long band is detected.
[Example 2] Establishment of ES cells in which a mutated polyβ2 gene was inserted by homologous recombination and one of the polyβ2 gene pairs was inactivated
In this example, a vector for homologous recombination was introduced into mouse ES cells E14 (Hopper, M. et al .: Nature, 326, 292-295, 1987) by electroporation, followed by selective culture with G418 and ganciclovir. went. The obtained G418 / ganciclovir-resistant colonies were tested for homologous recombinants by PCR and Southern blot, and four clones of cell lines in which the mutated polyβ2 gene was inserted into one of the polyβ2 gene pairs were obtained.
For the obtained clone, insertion of the mutant gene was confirmed by Southern analysis (FIG. 9b). As a result, in the ES cell line E14 in which the mutant gene was not inserted, only the 11 kb band was detected, whereas in the cell lines 96, 97, and 110 obtained by introducing the homologous recombination vector and selecting the drug, , A 11 kb band derived from the normal polyβ2 locus and a 9.2 kb band derived from the mutant polyβ2 locus were detected.
[Example 3] Establishment of ES cells in which a mutated polyβ2 gene was inserted by homologous recombination and both of the polyβ2 gene pairs were inactivated
The introduction of the vector for homologous recombination inserted the mutant polyβ2 gene, and the ES cell line in which one of the polyβ2 genes was inactivated was selected by high concentration G418, whereby the other gene pair was also inactivated. Two cell lines, that is, two mouse ES cell lines of the present invention were obtained.
[Example 4] Production of chimeric mice using ES cells in which one of the polyβ2 gene pair was inactivated
An ES cell line in which one of the polyβ2 genes was inactivated was injected into blastocysts derived from C57BL / 6 mice to obtain chimeric mice.
[Example 5] Production of a mouse in which both of the polyβ2 gene pairs are inactivated
A chimeric mouse prepared using ES cells in which one of the polyβ2 gene pair is inactivated is crossed with a C57BL / 6 mouse, and a mouse composed of cells in which one of the polyβ2 gene pair is inactivated (hereinafter, “polyβ2 + / -Mouse "). By crossing these polyβ2 +/− mice, mice in which both of the polyβ2 gene pairs were inactivated (hereinafter referred to as “polyβ2 − / − mice”) were obtained. Southern analysis confirmed that the mutant gene was inserted into both polyβ2 gene pairs of these mice.
[Example 6] Characteristics of polyβ2 − / − mice
(1) Inversion
In polyβ2 − / − mice, in 3 out of 23 cases, individuals showing complete visceral inversion in which the heart and internal organs were mirror-image-symmetric were found (FIG. 10).
(2) Hydrocephalus
Polyβ2 − / − mice develop hydrocephalus. Although there is an individual difference in the degree of hydrocephalus, head swelling becomes remarkable from the second week after birth (FIGS. 3a, b, c), and dilation of the ventricles is observed (FIGS. 3c, 4b). ). Further, even in an individual who does not show the appearance of head bulge, dilation of the lateral ventricle is recognized when a tissue specimen is prepared and observed.
The onset of lateral ventricle dilation or hydrocephalus is not observed between 10.5 and 18.5 days of fetal life. However, it is normal in appearance, but becomes visible on the first day of life (FIG. 4a). At this time, the cerebral cortex is normal (FIG. 4a), and the hippocampus, thalamus, midbrain, cerebellum, and cerebrum are preserved while being compressed.
By the age of 5 weeks after birth, the lateral ventricle further expands, and thinning of the cerebral cortex and thinning of the corpus callosum are observed (FIG. 4b).
Adult mice with marked lateral ventricular dilation show apoptosis in ependymal cells around the ventricle. Such apoptosis is not observed around the ventricle before ventricular dilation.
Ventricular dilatation is found in the lateral and third ventricles, but not in the fourth and middle ventricles. In addition, hyperplasia of ependymal cells in the third ventricle and the middle cerebral aqueduct is observed from day 14.5 onward (Fig. 4c-e).
In a normal individual in which the polyβ2 gene is not inactivated, the ventricular ependymal cells constitute several cell layers arranged so as to surround the ventricle (FIGS. 5g and h), but adult polyβ2 − / − mice. In the brain, hyperplasia of the ependymal cells of the third ventricle and the middle cerebral aqueduct was observed, and a part where the layer structure was broken was observed (FIGS. 5a to 5f). At these ependymal hyperplasia sites, mononuclear cells having a spherical and well-defined nucleus and mononuclear cells having an eosinphilic cytoplasm are observed (FIG. 5c).
Electron microscopy of ependymal cells showing hydrocephalus reveals multilayering of ependymal cells and disruption of the microvilli margin (FIG. 4f).
One possible cause of hydrocephalus is obstruction in the cerebrospinal fluid circulation path. Therefore, a technique of injecting trypan blue into the ventricle and examining the influx into the spinal canal (Genes II & Development, 12, 1092-1098, 2000) The presence or absence of occlusion was examined using a liposome, and it was found that the drainage route of cerebrospinal fluid was not open.
The cause of hydrocephalus in mice in which both polyβ2 genes have been inactivated is an abnormality in cerebrospinal fluid production and / or reabsorption due to occlusion of the cerebrospinal fluid circulation pathway and disruption of ependymal cell microvilli margins it is conceivable that.
(3) Poor growth
Polyβ2 − / − mice that have developed hydrocephalus exhibit growth retardation compared to wild-type mice in which the polyβ2 gene is not inactivated (hereinafter, referred to as “polyβ2 + / + mice”) (FIG. 3a). On the 14th and 21st days after birth, the weight of polyβ2 − / − mice is about 60 to 80% of that of polyβ2 + / + mice.
(4) Survival curve
According to the observation after weaning, the polyβ 2 − / − mice began to die from the age of 3 weeks after birth, and the survival rate reached 50% by the age of 5 weeks (FIG. 8). Polyβ2 − / − mice that die are mostly individuals showing hydrocephalus, and polyβ2 − / − mice that survive beyond 5 weeks of age are apparently identical to normal mice.
(5) Expression of polyβ2 gene in brain
The localization of the transcription product (mRNA) of the polyβ2 gene was examined by in situ hybridization. Polyβ2 mRNA is localized in cells around the ventricle of the fetal brain of wild-type mice and in adult ependymal ependymal cells and choroid plexus, and polyβ2 mRNA is not localized in these cells in polyβ2 − / − mice. (FIGS. 6a-c).
(6) Expression of polyβ2 gene in testis
The localization of the transcription product (mRNA) of the polyβ2 gene was examined by in situ hybridization. Polyβ2 mRNA is localized in the testis of wild-type mice. In polyβ2 − / − mice, no localization of polyβ2 mRNA in testis is observed (FIG. 6d).
In addition, the expression analysis of polyβ2 gene transcript (mRNA) in the testis of polyβ2 − / − mice was performed by Northern blot analysis (FIG. 9c). In the polyβ2 + / + mouse and the (polyβ2 +/− mouse, the expression of the polyβ2 gene mRNA is observed, but in the polyβ2 − / − mouse, the expression of the polyβ2 gene is not observed. The lower part of FIG. 9c shows the expression of EF-1α. This demonstrates the presence of the RNA sample in each lane.
(7) Fertility
Polyβ2 − / − mice were examined for fertility. Six polyβ2 − / − mice were allowed to live together with two C57BL / 6J female mice, and the presence or absence of pregnancy for 30 days was observed. As a result, the formation of vaginal plug showing the establishment of mating was observed, but no offspring were obtained. On the other hand, polyβ2 − / − female mice were mated with C57BL / 6J male mice or polyβ2 +/− male mice, and offspring were obtained from 3 cases of polyβ2 − / − female mice. From these facts, it can be said that polyβ 2 − / − male mice are infertile, whereas polyβ 2 − / − female mice have normal fertility.
(8) Analysis of sperm and testis
Since polyβ2 − / − male mice were infertile, sperm and testis analysis was performed. Spermatozoa obtained from the epididymis of the polyβ2 − / − male mouse lacked motor ability, and many malformed spermatozoa such as a head alone, a malformed head, and a short tail were observed (FIG. 7b). When testicular pathological analysis was performed, the testis of polyβ2 − / − had seminiferous tubules having all stages of spermatogenesis divided into 12 stages (FIG. 7d), and meiosis of pachytene spermatocytes (FIG. 7f), which were similar to those of polyβ2 + / + (FIGS. 7c, e). However, in the testis of polyβ2 − / −, immature sperm cells were released from Sertoli cells, and only a few sperm cells having matured and elongated nuclei were observed (FIG. 7h). In the epididymis of polyβ2 − / −, the number of mature sperm cells was small, and immature sperm cells and eosin-philic substances were many (FIG. 7j).
In order to examine the degree of maturation of the nuclei of polyβ2 − / − mouse spermatozoa, unfertilized eggs were fertilized by microinjecting the sperm head into the cytoplasm (microfertilization), and subsequent embryo development was examined. Sperm heads of polyβ2 − / − mice were microinjected into unfertilized eggs of the B6C3F1 strain, and 23 fertilized eggs that had been fertilized were transplanted into the oviduct of a pseudopregnant female to continue pregnancy. As a result, 12 offspring were obtained and these grew normally. From this, it is considered that the nuclear maturation of polyβ2 − / − mouse sperm has occurred normally.
(9) Analysis of ciliary structure by electron microscope
In polyβ2 − / − mice, visceral inversion, hydrocephalus, and sperm dysmotility were observed, and abnormal pilus motility was suspected. Thus, the pilus structure was analyzed by electron microscopy. As seen in the cross-sections of the pili of polyβ2 + / + mice (upper left of FIG. 11) and tracheal epithelial cells (lower left of FIG. 11), normal pili consisted of one pair of single microtubules and 9 pairs. The peripheral microtubules have two dynein arms (outer and inner arms) (FIG. 12). In the cross section of the pili of the polyventricular ependymal cells (upper right of FIG. 11) and tracheal epithelial cells (lower right of FIG. 11) of polyβ2 − / − mice, a state in which the inner arm of dynein was defective was observed.
(10) Chronic sinusitis
Since the dynein inner arm was deficient in polyβ2 − / − mice, a search for chronic sinusitis, one of the symptoms of Kartagener syndrome, was performed on polyβ2 − / − mice. In the control group, polyβ2 +/− mice, cavities were observed in the nasal cavity and paranasal sinuses (FIG. 13a), whereas in the polyβ2 − / − mice, contents were observed in the nasal cavity and sinuses (FIG. 13b). Upon enlargement, the nasal cavity was filled with lobulated neutrophils, the submucosa showed plasma cell infiltration and capillary hyperplasia (FIG. 13c), and the polyβ2 − / − mice developed chronic purulent rhinitis. I was diagnosed with. Movement disorders occur because ciliary structural abnormalities (dynein inner arm defects) similar to those seen in the cilia of tracheal epithelial cells and ependymal cells also occur in the cilia of nasal mucociliary cells that constitute the nasal mucosa It is presumed that rhinitis has developed.
Industrial potential
According to the present invention, there are provided ES cells and mice in which the expression of the polyβ2 gene is artificially suppressed, wherein the mice have hydrocephalus, poor growth, visceral inversion, poor sperm maturation, ventricular ependymal cells and tracheal epithelial cells It was found to be characterized by abnormal ciliary structure (dynein inner arm deficiency) in fimbriae. Therefore, if the genetically modified ES cells, genetically modified animals, or cell lines established from the animals of the present invention are used, analysis of the function of the polyβ2 gene, as well as hydrocephalus, poor growth, visceral inversion, and poor sperm maturation It is also possible to elucidate diseases such as immortile @ cilia syndrome and to screen therapeutic agents for these diseases. In addition, it is considered that polyβ2 gene and protein can be used as a therapeutic agent for the above-mentioned diseases and the like.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the exon / intron structure of the mouse polyβ2 gene. A shows the whole image of the exon / intron structure, and B shows the nucleotide sequence of the boundary region between the exon and the intron.
FIG. 2 is a diagram showing a comparison of the nucleotide sequences of mouse and human polyβ2 genes.
FIG.
a. It is a photograph which shows the poly (beta) 2 + / + mouse (left: beige) and the poly (beta) 2-/-mouse (right: white) 4 weeks after birth.
In polyβ2 − / − mice, head swelling is observed, and developmental delay is observed.
b. 5 is a photograph showing the external morphology of the brain of a polyβ2 + / + mouse (left) and a polyβ2 − / − mouse (right) at 5 weeks of age.
After euthanasia by ether anesthesia, the head skin was incised, the skull was partially removed, and the upper cerebrum was exposed. In polyβ2 − / − mice (right), dilation of the brain and thinning of the cerebral cortex are observed.
c. It is the photograph which showed the coronal section (upper part) and sagittal section (lower part) of the brain of the polybeta2 + / + mouse (left) and the polybeta2-/-mouse (right) at the age of 5 weeks after birth.
After euthanasia under ether anesthesia as in b), the head was dissected and coronal and sagittal specimens were prepared. In polyβ2 − / − mice (right), dilatation of the lateral ventricle and thinning of the cerebral cortex are observed.
FIG. 4 is a photograph showing a slice specimen of the brain of polyβ2 + / + mouse and polyβ2 − / − mouse.
a. It is the photograph which showed the cross section sample of the brain of the polybeta2 + / + mouse (left) and the polybeta2-/-mouse (right) 1 day after birth.
In polyβ2 − / − mice (right), dilation of the lateral ventricle is observed.
b. 5 is a photograph showing a cross section specimen of the brain of a polyβ2 + / + mouse (left) and a polyβ2 − / − mouse (right) 5 weeks after birth.
Ventricular dilation is observed in mice in which both polyβ2 genes have been inactivated (right).
c. It is a photograph showing the cross section specimen of the brain of the polyβ2 + / + mouse (left) and polyβ2 − / − mouse (right) on embryonic day 14.5.
In polyβ2 − / − mice (right), hyperplasia with cell division of ventricular ependymal cells is observed.
d. 1 is a photograph showing a cross section specimen of the brain of a polyβ2 + / + mouse (left) and a polyβ2 − / − mouse (right) one day after birth.
Hyperplasia with papillary cell proliferation of ventricular ependymal cells is observed in polyβ2 − / − mice (right).
e. It is the photograph which showed the cross section specimen of the brain of the polybeta2 + / + mouse (left) and the polybeta2-/-mouse (right) of 5 weeks old after birth.
In polyβ2 − / − mice (right), hyperplasia with papillary cell proliferation of third ventricular ependymal cells is observed.
f. It is the photograph which showed the electron-microscope analysis sample of the brain of the polybeta2 + / + mouse (left) and the polybeta2-/-mouse (right) 5 weeks old after birth.
In polyβ2 − / − mice (right), multilayering of ependymal cells and disruption of microvilli margins are observed.
FIG. 5 is a photograph showing a sagittal cut serial section specimen of the brain.
As shown in a, a continuous section (c, d, e, f) of a cross section near the median plane was created.
The ventricular ependymal cells of polyβ2 + / + mice constitute several layers of cells surrounding the ventricles (FIGS. 4g, h), but the third ventricle in the brain of polyβ2 − / − mice (right). (3V) and hyperplasia of ependymal cells in the middle cerebral aqueduct (Aq) are observed, and a part where the layer structure is broken is observed (FIGS. 4c-f). As can be seen from the enlarged photograph inserted in Fig. c, at the hyperplastic site of the ependymal cells, mononuclear cells having a spherical and distinct nucleus and mononuclear cells having an eosinophil cytoplasm are observed (Fig. 4c).
FIG. 6 is a photograph showing the result of examining the localization of the transcription product (mRNA) of the polyβ2 gene in the brain and testis by in situ hybridization.
a. In the brain of polyβ2 + / + mice (left) at embryonic day 14.5, localization of polyβ2 gene mRNA is found in cells around the ventricle, but not in the brain of polyβ2 − / − mice (right). .
b. In the brain of a 5-week-old polyβ2 + / + mouse (left), localization of the polyβ2 gene mRNA is found in the ependymal cells of the lateral ventricle (arrow) and the choroid plexus (arrowhead), whereas the polyβ2 − / − mouse (right) They are not seen in the brain).
c. In the brain of a 5 week-old polyβ2 + / + mouse (left), localization of the polyβ2 gene mRNA is found in the ependymal cells of the midbrain aqueduct, but not in the brain of the polyβ2 − / − mouse (right). * Represents the midbrain aqueduct.
d. In the testes of 7-week-old polyβ2 + / + mice (left), localization of polyβ2 gene mRNA is observed, but not in polyβ2-/ − mice (right). * Represents the lumen of the seminiferous tubule.
FIG.
a, b. It is the photograph which observed the sperm obtained from the epididymis tail with a phase contrast microscope. Compared to the shape of spermatozoa of 9-week-old polyβ2 + / + mice (a), spermatozoa of polyβ2 − / − mice (b) have a short tail, no tail, and a round head Deformed spermatozoa were seen.
ch-h. It is the photograph which showed the result of having performed pathological analysis of a testis.
Polyβ2 − / − mouse testis (d) has a similar tubule structure as polyβ2 + / + mouse testis (c).
In the polyβ2 − / − mouse testis (f), meiosis of pachytene spermatocytes is observed as in the polyβ2 + / + mouse testis (e).
In polyβ2 + / + mouse testis (g), sperm cells with mature and elongated nuclei and elongated tails are seen, whereas in polyβ2 − / − mouse testis (h), few mature sperm cells are observed. And immature sperm cells are released from Sertoli cells.
i, j. It is the photograph which showed the result of having performed the pathological analysis of the epididymis.
In the polyβ2 + / + mouse (i), mature sperm cells are found, whereas in the polyβ2 − / − mouse (j), few mature sperm cells are found, and immature sperm cells and eosinophils are many. Was done.
FIG. 8 shows a survival curve of polyβ2 − / − mice.
FIG.
a. FIG. 2 is a view showing the construction of a homologous recombination vector used for inactivating a mouse polyβ2 gene.
b. It is a photograph which shows the result of having detected insertion of the mutant gene in the ES cell clone which introduced the homologous recombination vector by Southern analysis.
c. It is a photograph which shows the result of having detected the expression of poly (beta) 2 gene transcription product (mRNA) in the testis of poly (beta) 2-/-mouse by Northern blot analysis. EF-1α was used as a control.
FIG. 10 is an anatomical photograph showing the internal organ arrangement of polyβ2 − / − and polyβ2 + / + mice. Ribs and liver have been resected for better visibility of internal organs. The visceral arrangement of polyβ2 − / − mice is mirror image symmetric of the visceral arrangement of polyβ2 + / + mice. In the figures, Ap is a symbol indicating Apex (tip), Fs is Forestomach (fore-stomach), and Sp is a symbol indicating Spleen (spleen).
FIG. 11 is a photograph of the pilus structure of polyβ2 − / − mice observed with an electron microscope. The upper part shows the cross section of the fimbria of the ependymal cells of the ventricle, and the lower part shows the cross section of the pili of the tracheal epithelial cells. In polyβ2 − / − mice, a defect in the inner arm of dynein is observed in the pili of ependymal cells (upper right) and the pili of tracheal epithelial cells (lower right).
FIG. 12 is a schematic diagram of two dynein arms (outer arm and inner arm) of a double microtubule.
FIG.
a. It is a photograph showing that cavities were observed in the nasal cavity and paranasal sinuses in the control group polyβ2 +/− mice.
b. It is a photograph which shows that the content was recognized in the nasal cavity and the paranasal sinuses in polyβ2 − / − mice.
c. It is an enlarged photograph in a nasal cavity and a paranasal sinus in poly (beta) 2-/-mouse. The nasal cavity is filled with lobulated neutrophils, and the submucosa has plasma cell infiltration and capillary hyperplasia.

Claims

A rodent ES cell, wherein the expression of the polyβ2 gene is artificially suppressed.

A rodent ES cell comprising a foreign gene inserted into one or both of the polyβ2 gene pair.

3. The ES cell according to claim 1, wherein the rodent ES cell is a mouse ES cell.

A genetically modified rodent, wherein the expression of the polyβ2 gene is artificially suppressed.

A rodent animal wherein a foreign gene has been inserted into one or both of the polyβ2 gene pairs.

The animal according to claim 4 or 5, wherein the rodent is a mouse.

A cell line established from the animal according to any one of claims 4 to 6.