【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は高分子ヒアルロン酸を収得する改良法
に関する。詳しくは、鳥類のトサカ、臍帯、硝子
体などのヒアルロン酸を多量に含有する動物組織
を約70〜100℃で加熱処理し、混入しているヒア
ルロニダーゼを失活させた後、高分子ヒアルロン
酸を収率よくかつ、大量に収得する方法に関す
る。
ヒアルロン酸は、関節、硝子体、軟骨、皮膚、
臍帯、トサカなどの結合組織中に構成成分として
存在し、組織の柔軟性、構造維持、細胞の代謝調
節などに重要な機能を果している。このような機
能を効率的に果すためには、ヒアルロン酸は高分
子であることが必要である。すなわち、高分子ヒ
アルロン酸は粘性が高く、そのため結合組織にお
いて潤滑油的役割をはたすものとして有用であ
り、また低濃度で十分な効果を発揮し、細胞表面
での結合が十分に期待できる。
ヒアルロン酸を収得する方法としては、多数の
方法が報告されているが、高分子ヒアルロン酸を
収得する方法として詳細に検討されたものは少な
い。ヒアルロン酸は安定性に乏しく、ヒアルロニ
ダーゼ処理、高温加熱、紫外線照射、放射線照
射、酸化還元剤、強酸、強アルカリ処理等の処理
により低分子化する。そのため、ヒアルロン酸は
製造中においてその多くが低分子化してしまう。
かかる実情に鑑みて本発明者らは、高分子ヒア
ルロン酸の製造法を確立するために、これらのヒ
アルロン酸を低分子化させる要因がどのようなも
のであるのか、種々検討した。この結果後述の実
験例２に示す通りヒアルロン酸の低分子化に最も
強力に作用するのはヒアルロニダーゼであること
を見出した。
ところで、ライソゾーム由来のヒアルロニダー
ゼは、血液、組織中に存在することが知られてい
るが、ニワトリのトサカ、ヒトの臍帯の抽出液中
のヒアルロニダーゼ活性を測定した結果を後記実
験例３に示す。この実験より明らかなようにヒト
の臍帯中には、かなりのヒアルロニダーゼ活性が
検出された。このヒアルロニダーゼは、70℃、10
分間の加熱処理に付すことにより完全に失活し
た。
一方、新鮮トサカ中には、ヒアルロニダーゼ活
性は、ほとんど検出されず、新鮮トサカ抽出液中
のヒアルロン酸の極限粘度は45.0（dl／ｇ）であ
つた。ところが、新鮮トサカを室温で２日間放置
したものは、極限粘度が0.4（dl／ｇ）に低下し、
ほとんど粘性を示さなくなつていた。これは、細
菌増殖により産生された細菌性ヒアルロニダーゼ
がヒアルロン酸を分解したものと思われる。後述
の実験例４に示すように、精製ヒアルロン酸2.0
ml（0.2mg／ml）に、トサカを２日間放置して、
５倍量の生理食塩液中で抽出した抽出液50μを
添加すると図−１に示すように経時的に粘度が低
下してきた。一方、このトサカの抽出液を90℃で
10分間加熱処理した後、その50μを精製ヒアル
ロン酸２ml（0.2mg／ml）に添加したものでは、
全く粘度の低下は認められなく、ヒアルロニダー
ゼが完全に失活したことを示した。
新鮮トサカ抽出液では、還元末端法で測定する
限りにおいては、ヒアルロニダーゼを検出するこ
とはできなかつたが、ヒアルロン酸の製造におい
て、多量の原料を集荷する場合においては、多少
の細菌の混入はさけられないものであり、組織中
に存在するライソゾーム由来のヒアルロニダーゼ
および細菌に由来する極微量のヒアルロニダーゼ
の作用によつてヒアルロン酸の分解が起こること
が危惧される。
本発明者らは、上述のような実験結果にもとづ
き高分子ヒアルロン酸の製造方法を検討して本発
明を完成した。
本発明の目的は、高分子ヒアルロン酸を製造す
る方法を提供するものであり、さらに詳しくは、
高分子ヒアルロン酸を製造するにあたり原料およ
び製造工程中において混入するヒアルロニダーゼ
をあらかじめ失活させてヒアルロン酸の低分子化
を防止した後、原料から高分子ヒアルロン酸を分
離することによつて高分子ヒアルロン酸を製造す
る方法を提供することにある。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法にて用いられる原料は、たとえば鳥
類のトサカ、動物（たとえば、ウシ、ウマ、ヤ
ギ、ヒツジなどの哺乳類）の臍帯、硝子体などの
ヒアルロン酸含有物であり、原料は切断、分離
後、直ちに使用するかあるいは分離後直ちに冷凍
し、凍結状態にして保存することが望ましい。原
料は一般にミンチにすることなくそのまま本発明
の特徴である加熱処理に付すことが好ましい。
加熱処理は一般に水中で行われる。加熱温度は
約70〜100℃、好ましくは約70〜90℃であり、加
熱時間は通常約10〜120分間である。
この加熱処理によつて、原料中に混入している
細菌による細菌性ヒアルロニダーゼおよび組織中
のライソゾーム由来ヒアルロニダーゼが不活性化
され、以後の工程中におけるヒアルロン酸の分解
が防止される。
かくして加熱処理した原料から自体既知の方法
にてヒアルロン酸を分離することによつて高分子
ヒアルロン酸が製造される。たとえば次の如き方
法が例示される。
まず、原料をミンチ状に細断した後、蛋白分解
酵素によつて原料の消化、ヒアルロン酸の抽出を
行う。蛋白分解酵素としては、プロナーゼ〔科研
化学(株)製〕、プロリシン〔上田化学工業(株)製〕、パ
パイン等が利用できる。これら蛋白分解酵素によ
る処理条件は一般に水溶液のPH６〜８、30〜70
℃、２〜40時間である。かくして水溶液中にヒア
ルロン酸が抽出される。
抽出されたヒアルロン酸は、塩化セチルピリジ
ニウムあるいは、エタノール分画によつて沈澱と
して回収される。エタノール分画の場合は、40〜
60％程度で沈澱する画分を回収する。このとき、
水溶液中に0.5〜1.5Mの塩化ナトリウムを添加し
ておくことは、ヒアルロン酸の分離、回収のため
に好ましい。塩化セチルピリジニウムによつて分
画する場合には、極めて微量の塩化セチルピリジ
ニウムの添加（終濃度0.01〜0.05％ｗ／ｖ）によ
つてヒアルロン酸は沈澱として回収される。
かかる分画手段をへて回収されるヒアルロン酸
は、極限粘度30（dl／ｇ）以上であり、一般に30
〜45（dl／ｇ）である。この極限粘度とヒアルロ
ン酸の分子量は比例し、かくして得られたヒアル
ロン酸の分子量は約190万以上である。
本発明にて得られた、ヒアルロン酸は関節炎等
に対する抗炎症作用を有しており抗炎症剤として
使用されるが、分子量が大きいゆえ、組織中での
生理的条件により適合するものである。
本品は、一般に局所投与され、たとえば関節
腔、眼球内等に投与される。
局所投与される製剤は液状製剤、乾燥製剤など
の形をとりうるが、液状製剤が便宜的である。
製剤化に際しては、たとえば80〜100℃にて間
欠滅菌しておくことが好ましい。
なお、ヒアルロン酸の極限粘度は、日本薬局方
９局一般試験法第25粘度測定法によつて測定し
た。
次に、実施例、実験例によつて本発明の方法を
詳細に説明するが、本発明は、下記の実施例に限
定され、あるいは制約されるものではない。
実施例 １
ニワトリを断頭後直ちに水洗し、凍結保存した
トサカ１Kgをそのまま80℃の温水５中に30分間
保つた後、トサカを取り出し、３mmのミンチと
し、50ｍＭリン酸２ナトリウム溶液４中に投入
し、プロナーゼ（科研化学(株)製、蛋白質分解酵素
の一種）100mgを添加し、37℃に４時間、撹拌し
ながら消化・抽出を行う。次に、遠心により沈澱
物を除去し、その上澄液に塩化ナトリウムを1M
濃度になるように添加する。そして、エタノール
を55％濃度になるように添加する。生じた沈澱物
を遠心により回収する。回収した沈澱を50ｍＭリ
ン酸緩衝液（PH8.0）１中に溶解し、プロナー
ゼ10mgを添加し、37℃に４時間再び消化する。再
消化後、ハイフロースーパーセルをプリコートし
たろ過器でろ過し、得られたろ液に10％塩化セチ
ルピリジニウム溶液120mlを添加し、ヒアルロン
酸を沈澱させ回収する。次に、0.5M塩化ナトリ
ウム溶液１で沈澱を溶解し、ヒアルロン酸を抽
出し、混入していたコンドロイチン硫酸を沈澱と
して除去する。得られた抽出液に塩化ナトリウム
を1M濃度になるよう添加し、エタノールを45％
濃度になるよう添加して、ヒアルロン酸を沈澱さ
せ回収する。ここで得られた沈澱は、75％エタノ
ール、99％エタノールで順次洗浄し、最後に減圧
乾燥してヒアルロン酸4.2ｇを得た。このものの
極限粘度は35.6で、ヒアルロン酸に対する蛋白質
混入率は、0.07％であつた。また、セルロース・
アセテート膜電気泳動でのトルイジンブルーＯ染
色で、ヒアルロン酸のスポツトのみを検出し、他
の酸性ムコ多糖は検出されなかつた。
実施例 ２
ニワトリを断頭後直ちに水洗し、凍結乾燥した
トサカ10Kgを実施例１と同様に処理し、（ただし
各工程でのプロナーゼ、緩衝液の添加量は10倍量
である。）精製ヒアルロン酸49ｇを得た。このも
のの極限粘度は34.7で、ヒアルロン酸に対する蛋
白質混入率は、0.03％であつた。また、セルロー
ス・アセテート膜電気泳動でも、ヒアルロン酸以
外のスポツトは、認められなかつた。
実験例 １
ニワトリを断頭後直ちに水洗し、凍結乾燥した
トサカ１Kgにつき５倍量の水を加え、37℃、50
℃、70℃、80℃、100℃の各温度に、30分間保つ
た後、トサカを取り出し、３mmのミンチとし、以
下実施例１と同様に処理して精製ヒアルロン酸を
得た。各条件で得られたヒアルロン酸の極限粘
度、収量は表−１の通りであつた。
以上の結果から明らかな如く、80℃で最も極限
粘度が高く、収量も多かつた。37℃、50℃、100
℃では、極限粘度が低かつた。100℃の場合には、
加熱時間が30分間と長すぎたため、高温によるヒ
アルロン酸の低分子化が起つたものと考えられ
る。
The present invention relates to an improved method for obtaining polymeric hyaluronic acid. Specifically, animal tissues that contain large amounts of hyaluronic acid, such as bird crests, umbilical cords, and vitreous bodies, are heat-treated at approximately 70 to 100°C to inactivate the hyaluronidase contained therein, and then polymeric hyaluronic acid is extracted. The present invention relates to a method for obtaining a large amount of food with good yield. Hyaluronic acid is used in joints, vitreous body, cartilage, skin,
It exists as a component in connective tissues such as the umbilical cord and crest, and plays important functions in maintaining tissue flexibility, structure, and regulating cell metabolism. In order to efficiently perform these functions, hyaluronic acid needs to be a polymer. That is, high molecular weight hyaluronic acid has high viscosity and is therefore useful as a lubricant in connective tissue, exhibits sufficient effects at low concentrations, and can be expected to fully bind to cell surfaces. Although many methods for obtaining hyaluronic acid have been reported, few methods for obtaining high molecular weight hyaluronic acid have been studied in detail. Hyaluronic acid has poor stability and is reduced in molecular weight by treatments such as hyaluronidase treatment, high temperature heating, ultraviolet irradiation, radiation irradiation, redox agent, strong acid, and strong alkali treatment. Therefore, most of hyaluronic acid becomes low molecular weight during manufacturing. In view of this situation, the present inventors conducted various studies on the factors that cause these hyaluronic acids to become low molecular weight, in order to establish a method for producing high molecular weight hyaluronic acids. As a result, as shown in Experimental Example 2 below, it was found that hyaluronidase has the strongest effect on reducing the molecular weight of hyaluronic acid. By the way, hyaluronidase derived from lysosomes is known to exist in blood and tissues, and the results of measuring hyaluronidase activity in extracts of chicken comb and human umbilical cord are shown in Experimental Example 3 below. As is clear from this experiment, considerable hyaluronidase activity was detected in the human umbilical cord. This hyaluronidase was produced at 70°C for 10
It was completely inactivated by heat treatment for 1 minute. On the other hand, almost no hyaluronidase activity was detected in fresh comb, and the intrinsic viscosity of hyaluronic acid in the fresh comb extract was 45.0 (dl/g). However, when fresh comb is left at room temperature for 2 days, its intrinsic viscosity drops to 0.4 (dl/g).
It had become almost non-viscous. This seems to be due to bacterial hyaluronidase produced by bacterial growth decomposing hyaluronic acid. As shown in Experimental Example 4 below, purified hyaluronic acid 2.0
ml (0.2 mg/ml), leave the crest for 2 days,
When 50μ of the extract extracted in 5 times the volume of physiological saline was added, the viscosity decreased over time as shown in Figure 1. On the other hand, heat the extract of this crest at 90℃.
After heat treatment for 10 minutes, 50μ was added to 2ml (0.2mg/ml) of purified hyaluronic acid.
No decrease in viscosity was observed, indicating that hyaluronidase was completely inactivated. Hyaluronidase could not be detected in the fresh crest extract using the reducing end method, but when collecting a large amount of raw materials in the production of hyaluronic acid, contamination with some bacteria is inevitable. There is a concern that hyaluronic acid may be degraded by the action of lysosomal-derived hyaluronidase and minute amounts of bacterial-derived hyaluronidase present in tissues. The present inventors investigated a method for producing high molecular weight hyaluronic acid based on the above experimental results and completed the present invention. The object of the present invention is to provide a method for producing polymeric hyaluronic acid, and more specifically,
When producing polymeric hyaluronic acid, the hyaluronidase that is mixed into the raw materials and during the manufacturing process is inactivated in advance to prevent hyaluronic acid from becoming low-molecular weight, and then the polymeric hyaluronic acid is separated from the raw materials to produce polymeric hyaluronic acid. An object of the present invention is to provide a method for producing acid. The present invention will be explained in detail below. The raw materials used in the method of the present invention are, for example, hyaluronic acid-containing substances such as the crest of birds, the umbilical cord of animals (for example, mammals such as cows, horses, goats, and sheep), and the vitreous body. It is desirable to use it immediately or freeze it immediately after separation and store it in a frozen state. Generally, it is preferable that the raw materials are subjected to the heat treatment, which is a feature of the present invention, as they are without being minced. Heat treatment is generally performed in water. The heating temperature is about 70-100°C, preferably about 70-90°C, and the heating time is usually about 10-120 minutes. This heat treatment inactivates bacterial hyaluronidase caused by bacteria contained in the raw material and hyaluronidase derived from lysosomes in the tissue, thereby preventing decomposition of hyaluronic acid during subsequent steps. Polymer hyaluronic acid is produced by separating hyaluronic acid from the heat-treated raw material by a method known per se. For example, the following method is exemplified. First, after cutting the raw material into minced pieces, the raw material is digested with a proteolytic enzyme and hyaluronic acid is extracted. As the protease, pronase (manufactured by Kaken Kagaku Co., Ltd.), prolysin (manufactured by Ueda Chemical Industry Co., Ltd.), papain, etc. can be used. The treatment conditions for these proteolytic enzymes are generally aqueous pH 6-8, 30-70.
°C for 2 to 40 hours. Hyaluronic acid is thus extracted into the aqueous solution. The extracted hyaluronic acid is recovered as a precipitate by cetylpyridinium chloride or ethanol fractionation. For ethanol fraction, 40~
Collect the fraction that precipitates at about 60%. At this time,
It is preferable to add 0.5 to 1.5M sodium chloride to the aqueous solution for separation and recovery of hyaluronic acid. When fractionating with cetylpyridinium chloride, hyaluronic acid is recovered as a precipitate by adding a very small amount of cetylpyridinium chloride (final concentration 0.01-0.05% w/v). Hyaluronic acid recovered through such fractionation means has an intrinsic viscosity of 30 (dl/g) or more, and generally has an intrinsic viscosity of 30 (dl/g) or more.
~45 (dl/g). This intrinsic viscosity is proportional to the molecular weight of hyaluronic acid, and the molecular weight of the hyaluronic acid thus obtained is about 1.9 million or more. The hyaluronic acid obtained in the present invention has an anti-inflammatory effect against arthritis and the like and is used as an anti-inflammatory agent, but because of its large molecular weight, it is more compatible with physiological conditions in tissues. This product is generally administered locally, for example into the joint cavity or into the eyeball. Formulations for topical administration may take the form of liquid formulations, dry formulations, etc., although liquid formulations are convenient. During formulation, it is preferable to perform intermittent sterilization at, for example, 80 to 100°C. In addition, the intrinsic viscosity of hyaluronic acid was measured by the Japanese Pharmacopoeia 9th Bureau General Test Method No. 25 Viscosity Measurement Method. Next, the method of the present invention will be explained in detail using Examples and Experimental Examples, but the present invention is not limited or restricted to the Examples below. Example 1 Immediately after decapitating a chicken, the chicken was washed with water, and 1 kg of the frozen crest was kept in warm water at 80°C for 30 minutes.The crest was then taken out, minced into 3 mm pieces, and placed in 50 mM disodium phosphate solution 4. Then, 100 mg of pronase (manufactured by Kaken Kagaku Co., Ltd., a type of proteolytic enzyme) is added, and digestion and extraction are carried out at 37°C for 4 hours with stirring. Next, remove the precipitate by centrifugation, and add 1M sodium chloride to the supernatant.
Add to the desired concentration. Then, ethanol is added to a concentration of 55%. The resulting precipitate is collected by centrifugation. The collected precipitate is dissolved in 1 part of 50mM phosphate buffer (PH8.0), 10mg of pronase is added, and the mixture is digested again at 37°C for 4 hours. After re-digestion, it is filtered through a filter pre-coated with High Flow Super Cell, and 120 ml of 10% cetylpyridinium chloride solution is added to the resulting filtrate to precipitate and collect hyaluronic acid. Next, the precipitate is dissolved in 0.5M sodium chloride solution 1, hyaluronic acid is extracted, and the mixed chondroitin sulfate is removed as a precipitate. Sodium chloride was added to the obtained extract to a concentration of 1M, and ethanol was added to 45%.
Add to the desired concentration to precipitate and collect hyaluronic acid. The precipitate obtained here was washed successively with 75% ethanol and 99% ethanol, and finally dried under reduced pressure to obtain 4.2 g of hyaluronic acid. The intrinsic viscosity of this product was 35.6, and the protein contamination rate with respect to hyaluronic acid was 0.07%. In addition, cellulose
Toluidine blue O staining in acetate membrane electrophoresis detected only hyaluronic acid spots and no other acidic mucopolysaccharides. Example 2 Immediately after decapitating a chicken, it was washed with water and 10 kg of freeze-dried crest was treated in the same manner as in Example 1 (however, the amount of pronase and buffer added in each step was 10 times the amount) to obtain purified hyaluronic acid. Obtained 49g. The intrinsic viscosity of this product was 34.7, and the protein contamination rate with respect to hyaluronic acid was 0.03%. Furthermore, no spots other than hyaluronic acid were observed in cellulose acetate membrane electrophoresis. Experimental example 1 After decapitating a chicken, immediately wash it with water, add 5 times the amount of water per 1 kg of freeze-dried comb, and heat at 37°C for 50 minutes.
After being kept at each temperature of .degree. C., 70.degree. C., 80.degree. C., and 100.degree. C. for 30 minutes, the crest was taken out and minced into 3 mm pieces, which were then treated in the same manner as in Example 1 to obtain purified hyaluronic acid. The intrinsic viscosity and yield of hyaluronic acid obtained under each condition are shown in Table 1. As is clear from the above results, the intrinsic viscosity was highest at 80°C and the yield was also high. 37℃, 50℃, 100
At ℃, the intrinsic viscosity was low. In case of 100℃,
It is thought that because the heating time was too long (30 minutes), the high temperature caused the hyaluronic acid to become lower in molecular weight.
【表】
実験例 ２
ヒアルロン酸の低分子化の要因を追求するため
比較実験を行つた。実施例１と同様の操作によつ
て得られた精製ヒアルロン酸（極限粘度35.0dl／
ｇ）を用いて実験し、表−２に示すような各々の
処理を行い、ヒアルロン酸の極限粘度の低下を調
べた。その結果を、表−２に示した。低分子化の
要因としてヒアルロニダーゼが最も大きなものと
考えられる。[Table] Experimental Example 2 A comparative experiment was conducted to investigate the factors contributing to the lower molecular weight of hyaluronic acid. Purified hyaluronic acid (intrinsic viscosity 35.0 dl/
g) was used, and each treatment shown in Table 2 was performed to investigate the decrease in the intrinsic viscosity of hyaluronic acid. The results are shown in Table-2. Hyaluronidase is considered to be the most important factor in reducing molecular weight.
【表】
実験例 ３
各種原料の抽出液中のヒアルロニダーゼの活性
を調べた。その結果を表−３に示す。ヒアルロニ
ダーゼの活性測定法は、山田らの方法〔ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー、81巻 485〜494
頁（1977年）〕を用いた。原料としては、表中の
ものを使用した。[Table] Experimental Example 3 The activity of hyaluronidase in extracts of various raw materials was investigated. The results are shown in Table-3. The method for measuring the activity of hyaluronidase is the method of Yamada et al. [Journal of Biochemistry, Vol. 81, 485-494]
(1977)] was used. The raw materials listed in the table were used.
【表】
実験例 ４
原料としてニワトリのトサカを用い、生理食塩
液で抽出し、精製したヒアルロン酸（極限粘度
45.0dl／ｇ）を用いて、37℃での経時的な粘度低
下を調べた。
室温で２日間放置したトサカを５倍量の生理食
塩液で抽出し、その抽出液50μを精製ヒアルロ
ン酸２ml（0.2mg／ml）に添加した試料と室温
で２日間放置したトサカを５倍量の生理食塩液で
抽出し、その抽出液を90℃で10分間加熱処理した
後、その50μを精製ヒアルロン酸２ml（0.2mg／
ml）に添加した試料を用いた。
その結果を図−１に示したが、この図より加熱
処理した試料では、粘度の低下は認められなかつ
た。[Table] Experimental example 4 Using chicken crest as a raw material, extracting with physiological saline solution and purified hyaluronic acid (intrinsic viscosity
45.0 dl/g) to examine the viscosity decrease over time at 37°C. The crest left at room temperature for 2 days was extracted with 5 times the volume of physiological saline, and 50μ of the extract was added to 2 ml (0.2 mg/ml) of purified hyaluronic acid. After heating the extract at 90℃ for 10 minutes, 50μ of it was extracted with 2ml of purified hyaluronic acid (0.2mg/
ml) was used. The results are shown in Figure 1, and as can be seen from this figure, no decrease in viscosity was observed in the heat-treated samples.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
図−１はヒアルロン酸の粘度の37℃における経
時変化を示したものであり、実線は試料の経時
変化を、破線は試料の経時変化を示す。
Figure 1 shows the change in viscosity of hyaluronic acid over time at 37°C, with the solid line showing the change over time of the sample and the broken line showing the change over time of the sample.