JPS63501734A - 減圧による分子移動装置及び電気泳動と減圧とによる分子移動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 電気泳動及び減圧による分子移動装置 本発明は電気泳動及び減圧による分子移動装置に関する。

ゲル媒体上での電気泳動によって、巨大分子を分離することは、化学、生物学及 び医学の分野で良く知られた普通の技術である。この分離技術で一般に使用され る装置には、二つのタイプがある。その一つは垂直に置かれた二枚のガラス板の 間に、分離用のゲルマトリックスを組込み、ガラス板の頭部及び底部を貯槽に入 れた電気泳動バッファーに接触させ、各貯槽に適当な電極を取付けたタイプで、 電極には通常白金線が使用される。この装置では試料がゲルの上部表面（陰極） にあてがわれ、付与した電場の影響で試料は下方（陽極）に移動する。もう一つ のタイプは、ゲルの型枠として機能する突出端部を備えた板の上に、ゲルを水平 に鋳込んだもので、板状ゲルの突出端部を横断する位置に、試料を入れる溝が適 当な溝付は機でゲルに設けられている。電極とバッファー貯槽はゲルの両端に置 かれ、ゲルに通じる電気的接続は、例えば、適当な芯によって行なわれるか、も しくはゲルを完全にバッファー貯槽に浸漬することで行なわれる。後者の場合の 装置は、通常サブマリンゲルタンクと呼ばれる。

電気泳動により巨大分子の分離が完了すると、ゲルはさらに処理するために、例 えば分子の回収又は写真撮影のために電気泳動装置から取外される。デオキシリ ポ核１１　（ＤＮＡ）の場合、分離の目的がハイブリダイゼーションによって分 子を同定することであれば、ゲルは次の処理工程に向けられる。処理工程は、例 えば回収を容易にするためにデブリネーションによって、大きい断片の分子量が 減少するように設計され、あるいはハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成 ）膜への付着を容易にし、爾後のハイブリダイゼーションを生起可能にするため に、二本鎖ＤＮＡが変性され、平衡化されるよう設計されている。これらの処理 には通常幾つかの独立したゲル取扱い工程が必要であり、作業を終えるまでには １〜２時間を要する。

適当に調製されたゲルからフィルター膜上に、例えばニトロセルロースのフィル ター股上に、分子を移動させる手段として、現在採用されている基本的な技法は 、拡散及び毛管流れの原理を利用したもので、これを「プロッティング」という 。典型的には、移動バッファーの貯槽に接触したフィルター上にゲルを載置し、 その上に適当なハイブリダイゼーション用フィルター膜を載せて、分子が移動し てくる領域を明確にするために、プラスチックフィルムでマスクする。次いでゲ ルから流体が流れて分子がフィルター膜に移動するよう、マスク及びフィルター 膜の上に乾燥した吸着用紙タオルを重ねて置く。プロッティングは巨大分子の分 析に必須の工程であるので、分子生物学及び生物工学の分野では基本的な重要事 項である。サザンブＯツティングはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の移動に関 する技法を言い、ノザンブロツティングはリボ核酸（ＲＮＡ）の、ウェスタンプ ロッティングは蛋白質のそれぞれ移動に関する技法を言う。

毛管流れと拡散は本来遅く、通常のプロッティング条件下では二方向性であるの で、一つの平面状媒体から別の媒体に分子を移動させる手段としてはあまり好ま しくない。そして、サザンブロツティングでは、国によっては入手することが難 しい高価な精製紙製品を多量に必要とする。プロッティングに関する現存の改良 技術は、このような不都合を回避し、移動を促進する電気泳動の技術を利用して 作業のスピードアップを図っている。この方法は電気プロッティングと呼ばれ、 これに使用される装置は商業的に入手可能である。電気プロッティング装置では 、時間がかかって不便な電気泳動が終了した後に、ゲルを別に調製して据付けな ければならない。そして、この装置は比較的複雑で高価である。また、ある場合 には電気泳動タンクの構造材によって電場が妨害されるために、移動パターンに 人工的なバンドが生ずることもある。さらに、電気泳動の電場の影響で小さい分 子がフィルター膜を通過して遺失してしまうこともある。

流体から巨大分子を減圧濾過することは良く知られているが、本発明の如く、ゲ ルから巨大分子を回収するだめに利用された例はない。しかし、減圧濾過の利用 可能性は、蛋白質についてはＨ，ペフエロン、Ｒ，ヒューブレッチ及びＡ、ディ ーローフが（ＦＥＢＳ　ＬｅｔｔｅｒＳ　１４５Ｎｏ、２．３６９−３７２頁、 １９８２年参照）、またＤＮＡについては１．ツアイツエフ及びＡ、Ｇ、ヤコレ フが（Ｂｙｕｌｌｅｔｅｎ’Ｅｋｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ’ｎｏｉ　Ｂｉｏｌｏ ｇｉｉ　ｉ　Ｈｅｄｉｔｓｉｎｙ　ｏｆ　ｔｈｅＵＳＳＲＮ、Ｂ、Ｂｏｃｈｋｏ ｂ、　９６巻、１０号、８４−８６頁、１９８３年参照）それぞれ示している。

上記した従来法は、作業に時間を要し、また望ましくない多数の別工程を含む欠 点がある。

本発明の目的は上記した不利を緩和又は解消することにある。

本発明によれば、ゲル電気泳動で分子を分離するための本体と、この本体に取付 けられ、ゲルから分離移動する分子を受けるためのフィルターと、前記本体に接 続され、ゲルから分離された分子が前記のフィルターに移動するのを促すために フィルターを介して前記本体に真空状態を付与するための真空装置からなるとこ ろの電気泳動及び減圧技術を利用した移動装置が提供される。

本発明の装置は巨大分子の電気泳動による分離に有効であって、特に電気泳動で 分離された分子をナイロンベースのフィルターに減圧移動させる技術との組合せ では、核酸の分離に有効である。この装置は電気泳動を行ってから分子をハイブ リダイゼーション膜に移動させるまでの間、ゲルに手を触れる必要がないよう設 計されている。

好ましくは、本発明の装置はゲル電気泳動タンクを備え、そのタンクは電気泳動 完了後ゲルから適当なフィルター膜への巨大分子の移動を促進するための真空装 置と一体化される。そのために、本発明の装置には試料受りを取付けるための器 具と電極が組込まれたサブマリンゲルタンク型の上部区画室が設けられる。そし て、この上部区画室は、真空源のアタッチメントとの接続具を有する真空室から なる真空装置の上に載置される。サブマリンゲルタンクの下部として機能する真 空室の上側は、嵌込み式の多孔性支持プレートからなり、そのプレートは流体の 通過が可能な例えば多孔性ポリエチレンで作られる。この多孔性プレートの透過 領域は、非透過性の取外し可能なマスキング膜で調節される。マスキング膜の開 口部は、ゲルから分子が移動してくるフィルター膜より僅かに小さい。こうする ことで流体は減圧下にゲルだけを通って移動できる。

装置を組立てる際は、真空室と、サブマリンゲルタンクとして機能する上部開放 領域との間に、マスキング膜がしっかり取付けられる。真空室の接合面とサブマ リンゲルタンクとの間にセットされるＯ−リングは、流体密封シールを形成する 。

アガロースゲルを鋳込んだ際、これとの接着を避けるためにナイロンベースであ るフィルター膜は、溶けたアガロースで多孔性支持プレートが汚れないように、 そして真空室にリークしないようにシールされる。組立てられた装置には、真空 度を狭い特定な範囲に調節する手段を備えた真空ポンプとの接続手段が設けられ る。

本発明の具体例を添付の図面にそって説明する。

第１図は本発明によって組立てた電気泳動及び減圧による分子移動装置も透視図 である。

第２図は第１図の装置の分解して第１図の矢印Ａの方向から見た透視図である。

第３図は第１図及び第２図に示す装置の上部平面図である。

第４図は第２図のＩＶ　−ＩＶ線に於ける透視平面図である。

第５図は第１〜４図に示した装置の側面図であり、ここには上部ゲルタンクを真 空室に接続するための固定手段が組込まれている。

図面において、本発明の電気泳動及び減圧による分子移動装置は、サブマリンゲ ルタンク１０を構成する合成プラスチック製の上部本体と、真空室１１を構成す る同じく合成プラスチック製の下部本体を包含する。ゲルタンク１０は真空室１ １に重ねられて分解可能に固定され、その間にはマスキング膜１２と、例えばナ イロン製の多孔性フィルター膜１３がサイドイツチにされている。

真空室１１の上部周表面に設けたＯ−リングシール１４は、ゲルタンク１０と真 空室１１との接合面からの流体の漏洩を防止し、さらにこのリングは膜１２の下 側に対してもシールの役割を果す。

サブマリンゲルタンク１０は分子移動用ゲルを調製する際の貯槽として機能し、 ゲルタンク１０の壁の溝１６には試料受はカム１５が設けられる。またタンク１ ０には陰極１７及び陽極１８が設けられる。

真空室１１は長方形の凹部１９を有し、そのなかにはハニカｌ＼構造のプラスチ ック製スペーサー２０が設置され、スペーサー２０はその上面で例えばポリエチ レン製の多孔性プレート２１を支持する。スペーサー２０とプレート２１が凹部 １９内に位置する場合、プレート２１の上面は真空室１１の上端部と同一平面に ある。多孔性プレート２１は減圧下に流体の通過を許し、フィルター膜１３及び マスキング膜１２の支持体としても機能する。マスキング膜１２は多孔性プレー ト２１の周辺部だけをマスキングして、分子がゲルからフィルター膜１３に移動 できる中央領域２２を形成する。

真空室１１には排気口２３が設けられ、これを介して真空室１１は公知の方法で 真空ポンプ（図示なし）に接続される。

第５図に示すように、上部のゲルタンク１０と下部の真空室１１は固定具によっ て着脱可能に固定される。固定具は一対の留め金具２４からなり、各留め金具は 下部真空室１１に２５で蝶番式に取付けられ、ゲルタンク１０の上面に係合して これを真空室１１と一体に締め付ける。

第５図では固定具を一対の蝶番式留め金具で説明したが、別の形の固定具も勿論 使用可能である。例えば、ゲルタンク１０から真空室１１まで伸びてこれらを着 脱可能に係合するネジを固定具に使用することもできる。

必要ならば、適当なトラップを設けて液体の真空室への侵入を防止することもで きる。

上記した電気泳動及び減圧による分子移動装置を使用するには、まずスペーサー ２０が真空室１１の凹部１９内に設置される。別法として、スペーサーの深さを 浅くして真空室１１の本体の一部に組入れておくこともできる。次いでプラスチ ック製の多孔性支持プレート２１を、真空室の上部表面が形成されるよう、スペ ーサー２０の上に置く。次に、Ｏ−リングシール１４が位置する領域まで伸び、 ゲルの面積よりも若干小さい非マスキング域を有するマスキング膜１２を支持プ レート２１上に置く。

フィルター膜１３の非マスキング域は、ゲルが鋳込まれる間シールされる。しか る後、上部サブマリンゲルタンク１０をマスキング膜１２の上に載せ、留め金具 ２４で真空室１１に締付け、Ｏ−リングシールをマスキング膜１２と係合させて タンク１０及び真空室１１の相互の周辺接合面から流体が漏洩しないようにする 。フィルター膜１３に接触するまでには至らない試料受はカム１５が設置される が、その位置は適用試料の元の位置が分るように、フィルター膜１３にマークさ れる。次いで平板状ゲルがフィルター膜の上に鋳込まれ、ゲルタンク１０と真空 室１１の間の全空間に充填される。そして適当な電気泳動バッファーがゲルの上 に添加される。試料を試料受け１５に注入し、電極１７．１８を電気的に接続す ることにより常法通り電気泳動が実施される。電気泳動が完了すると、電流を遮 断して電気泳動バッファーを吸引除去し、分子移動用ゲルを作成するための適当 な流体で置換する。このゲル作成用流体は最終的には通常２０Ｘ　ＳＳＣの移動 バッファーに置換される。流体トラップを経て接続される真空ポンプを作動させ 、ゲルからフィルター膜１３への分子の移動を完了するまで、通常約１時間続行 する。

この装置では二つの別の機能を互いに独立に利用できる。すなわち、サブマリン ゲル電気泳動モジュールは、フィルター膜１３を外し、適当な不透過性マスクを 上部モジュールと下部モジュールとの間に、換言すればタンク１０と真空室１１ との間に挿入することで単独使用に適用することができる。同様に、真空室モジ ュールは別の電気泳動タンクで処理されたゲルから核酸を移動させるのに別途使 用することができる。この場合、電気泳動したゲルはマスクの開口部２２の上に 、端部が重なるように、かつハイブリダイゼーション膜１３の真下に接触するよ う載せられる。この態様では熱いゲルが使用されないので、ナイロンベース膜以 外の膜でも移動を行うことができる。さらにまた、電気泳動装置に設置する前に 、ゲルを別に鋳込むこともできる。この場合、いかなるタイプのハイブリダイゼ ーション膜も使用可能である。そして多孔性プレート２１とフィルター膜１３は 、真空ポンプの作動によって減圧になる場所に保持されたプラスチックシートに より密封される。

電気泳動が完了すると、プラスチックシートが除去されて電気泳動バッファーが 排出され、一方ゲルは減圧による移動が可能な位置にある。浅い真空室を組込ん だ装置にあっては、その空間を満たす流体の容積は僅かであるので、サブマリン ゲルタンク１０を真空室１１からシールする必要がない。

プロッティング装置に接続して使用するポンプは、真空度を正確に調節できるも のであれば、いかなるタイプでも使用できる。真空ゲージと例えば空気吹出し弁 のようなレギュレターを備えた電動膜ポンプが適している。真空度はゲルが崩壊 しないよう調節され、目指す巨大分子がそこから移動する前は、分子移動が制限 され減速される。アガロースゲルからのＲＮＡ及びの真空度が適当である。

移動が完了した後の装置の分解は、真空ポンプの電源を切り、上記した組立て工 程とは逆の順序で分解される。

望む場合には、装置をすべて自動的操作で組立てることもできる。その場合には 流体を取替えるすべての操作が自動的に行えるようプログラム通りに作動するポ ンプと流体貯槽が組込まれる。

プロッティングでＤＮＡを移動される場合、従来の方法ではまず試料を平板状ゲ ルの上で電気泳動によって分離し、次いでゲルを別の容器に移して最初にＤＮＡ 変性溶液に晒し、次に中和溶液に晒すが、この方法では約１〜２時間が必要であ る。次にゲルはプロッティング用に用意され、適当なプロッティング装置に移さ れる。しかし、上記した本発明の装置は、プロッティングされる平板状ゲルを装 置から取出すことなくプロッティング用の予備処理に供することができる点で利 点がある。この装置を使用すると、例えば、ＤＮＡプロットが数分間で変性され 、中和される。

上記して来たところから明らかなように、本発明は電気泳動によるゲル媒体上の 巨大分子の分離機能と、ゲル上の分子を吸着媒体に移動させる機能を、調節され た真空技術で有効に組合せた装置を提供する。

国際調査報告 ＋Ｍ″′ＭＩｌｅＭＩ　Ａｓ″””””’　ＰＣＴ／ＧＢ　８６／ＣＯ５７４− ２−ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔ）ＩＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨ ＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ゲル電気泳動で分子を分離するための本体と、この本体に取付けられ、ゲル から分離移動する分子を受けるためのフィルターと、前記本体に接続され、ゲル から分離された分子が前記のフィルターに移動するのを促すためにフィルターを 介して前記本体に真空状態を付与するための真空装置からなる電気泳動及び減圧 技術を利用した移動装置。
2. ２．本体が電気泳動を行う第１の部分と、真空を付与する第２の部分からなり、 前記のフィルターが第１の部分と第２の部分の間に保持される請求の範囲１記載 の装置。
3. ３．第１の部分がゲルタンクであり、第２の部分が真空室であり、真空室の上に ゲルタンクが、間に前記のフィルターを挟みながら流体漏洩のない状態で、固定 具により着脱可能に固定される請求の範囲２の記載の装置。
4. ４．固定具がタンクと真空室を互いに締め付ける留め金具で構成される請求の範 囲３記載の装置。
5. ５．ゲルタンクが下側にゲルを受ける凹部を有し、さらに凹部内のゲルに電流を 供給する電極と、ゲル中に１個又はそれ以上の試料受けを有する請求の範囲３又 は４記載の装置。
6. ６．真空室が真空ボンブに接続可能で、その真空室がフィルターを支持するため の多孔性支持具を備えている請求の範囲３〜５のいずれか１記載の装置。
7. ７．前記の支持具が真空室と切り離されている請求の範囲６記載の装置。
8. ８．フィルターが多孔性フィルター膜である上記請求の範囲のいずれかに記載の 装置。
9. ９．フィルターが減圧下に保持される領域を区画する不透過性のマスキング膜を 備えている請求の範囲８記載の装置。
10. １０．真空ボンブと接続可能で、しかもフィルター膜を支持するための平板状の 多孔性支持具を有する減圧ユニットからなり、上記請求の範囲のいずれかに記載 の装置と共に使用される減圧移動ユニット。