JPS633799A - Production of protein by extracellular secretion - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
(発明の背景)
〔従来技術〕
本発明は、遺伝子工学的手法を利用した菌体外分泌によ
る蛋白質の製造法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Background of the Invention) [Prior Art] The present invention relates to a method for producing proteins by extracellular secretion using genetic engineering techniques.
さらに具体的には、本発明は、アルカリ性ホスファター
ゼ由来のプロモーターをコードする遺伝子を具備すると
共に、その制御下にシグナル配列をコードする遺伝子を
も具備したベクターに、所望外来性蛋白質をコードする
遺伝子を組込んで組換DNAとし、これを宿主微生物(
以下微生物を単に「菌」と記すこともある)細胞内に移
入させることにより宿主の形質転換を行って形質転換体
を得て、これを−定条件下で培養することにより所望蛋
白質を宿主菌体外(培地中)に分泌させたのち、培地中
から所望蛋白質を回収することよりなる遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造法に関する。More specifically, the present invention provides a vector that includes a gene encoding a promoter derived from alkaline phosphatase and a gene encoding a signal sequence under the control of the gene encoding a desired foreign protein. This is integrated into a recombinant DNA, which is then transferred to a host microorganism (
(Hereinafter, microorganisms may be simply referred to as "bacteria") The host is transformed by transferring it into cells to obtain a transformant, and by culturing this under certain conditions, the desired protein is transferred to the host cell. The present invention relates to a method for producing a protein using genetic engineering techniques, which comprises secreting the desired protein outside the body (into a medium) and then recovering the desired protein from the medium.
(先行技術)
現在、組換えDNA技術によって遺伝子工学的に有用物
質を生産する方法が確立されつつあり、具体的な方法に
ついては種々の成田や文献、公開特許公報および特許公
報を参照することができる。(Prior Art) Currently, methods for producing useful substances through genetic engineering using recombinant DNA technology are being established, and for specific methods, reference may be made to various publications, published patent publications, and patent publications. can.
このような手法による物質の生産方法は、通常、ベクタ
ーに所望物質をコードする遺伝子を組込んで造成した組
換えDNAを用いて宿主微生物を形質転換し、得られた
形質転換体を培養したのち、所望物質を回収することよ
りなるものである。A method for producing a substance using such a method usually involves transforming a host microorganism using a recombinant DNA created by incorporating a gene encoding a desired substance into a vector, culturing the resulting transformant, and then culturing the resulting transformant. , recovering the desired substance.
このような方法によって非分泌性の蛋白質の生産を行う
場合は、微生物細胞内で産生された蛋白質は宿主菌のプ
ロテアーゼによって分解(PrOC。When non-secreted proteins are produced by such a method, the proteins produced in microbial cells are degraded by host bacterial protease (PrOC).
Natl、 Acad、 Sci、USA、 79.1
830−1833<1982) )される恐れがあるの
で所望蛋白質を安定かつ人世に得ることができないとい
う問題点があった。また、このような非分泌性の蛋白質
を回収するに際しては宿主微生物を物理的に破壊したの
ち、所望蛋白質の分離・精製を行うのであるから、−般
にこのような回収操作は複雑であり、そのため所望蛋白
質の収率が低かったり、活性を有するものは回収操作中
に失活する恐れもあるという問題点があった。そこで、
上記問題点に対処すべく、蛋白質の膜通過に関与するシ
グナル配列(蛋白質・核酸・醇素、26.386〜39
4 (1981))の作用を利用して、宿主微生物細胞
内で産生きれた蛋白質を細胞外あるいは細胞質膜外に分
泌させる方法が種々提案されたく特開昭55−1909
2号、同55−45395号、同56−137896号
、同56−145221号、同56−154999号各
公報等)。Natl, Acad, Sci, USA, 79.1
830-1833<1982))), there was a problem in that the desired protein could not be obtained stably and on a regular basis. In addition, in recovering such non-secreted proteins, the host microorganism is physically destroyed and then the desired protein is separated and purified; therefore, such recovery operations are generally complex; Therefore, there are problems in that the yield of the desired protein is low, and that the active protein may be deactivated during the recovery operation. Therefore,
In order to address the above-mentioned problems, we developed signal sequences involved in protein membrane passage (proteins, nucleic acids,
4 (1981)), various methods have been proposed for secreting proteins produced within host microorganism cells to the outside of the cell or the cytoplasmic membrane.
No. 2, No. 55-45395, No. 56-137896, No. 56-145221, No. 56-154999, etc.).
ところで、上記シグナル配列を利用した遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造において組換えDNAが移入され
得る宿主微生物は、大腸菌が普通である。この大腸菌は
ダラム陰性菌であって、このような菌には細胞質膜およ
び外股がある(これらの膜間をペリプラズムという)と
ころ、このような菌に組換えDNAを移入させて形質転
換体としてこの形質転換体を通常の培養に付すと、所望
蛋白質はべりブラズムに蓄積される。このペリプラズム
に蓄積された蛋白質は、オスモティック・ショック法(
J、 Riot、 Chet 240.3865(19
65))によってペリプラズムから菌体外へ放出させな
ければ回収することができない。このオスモティック・
ショック法は、まず遠心により菌体を回収したのち、こ
れを高濃度ショ糖液〔20%シュークロース、30mM
トリス塩酸緩衝液(DH8,0)、1mMエチレンジア
ミン四酢酸(EDTA))に懸濁させてから集菌し、さ
らにこの菌体を冷水に懸濁させ、そして水浴中で放置す
ることにより所望蛋白質を含む画分を菌体外に放出させ
、ついで遠心により上清(所望蛋白質を含む)を得る、
という方法である。そして所望蛋白質を回収するには、
さらにクロマトグラフィー等によってこの上清を処理す
ることになる。このように、従来から大腸菌のようなダ
ラム陰性菌を宿主とし、これに蛋白質の分泌様能を具備
した組換えDNAを移入させて形質転換体を得て、これ
を培養することミニより所望蛋白質を生産させるという
方法は、ダラム陽性菌(枯草菌、酵母菌等)を宿主とし
た場合に比べ余分な処理操作(オスモティック・ショッ
ク法)が必要となる。By the way, the host microorganism into which recombinant DNA can be transferred in the production of proteins by genetic engineering techniques using the above-mentioned signal sequences is usually Escherichia coli. This Escherichia coli is a Durham-negative bacterium, and such bacteria have a cytoplasmic membrane and an outer membrane (the space between these membranes is called the periplasm), so recombinant DNA is introduced into such bacteria to create a transformant. When this transformant is subjected to normal culture, the desired protein is accumulated in the elliplast. The proteins accumulated in the periplasm are absorbed by the osmotic shock method (
J, Riot, Chet 240.3865 (19
65)), it cannot be recovered unless it is released from the periplasm to the outside of the bacterial cell. This osmotic
In the shock method, cells are first collected by centrifugation, and then added to a high-concentration sucrose solution [20% sucrose, 30mM
The desired protein is collected by suspending the cells in Tris-HCl buffer (DH8,0), 1mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), suspending the cells in cold water, and leaving them in a water bath. The containing fraction is released outside the bacterial cells, and then a supernatant (containing the desired protein) is obtained by centrifugation.
This is the method. And to recover the desired protein,
This supernatant will be further processed by chromatography or the like. In this way, it has been conventional to use Durham-negative bacteria such as Escherichia coli as a host, and to obtain a transformant by introducing recombinant DNA with the ability to secrete a protein into the host, and to obtain a transformant, which is then cultured. The method of producing 100 ml requires an extra processing operation (osmotic shock method) compared to the case where Durham-positive bacteria (Bacillus subtilis, yeast, etc.) are used as hosts.
しかしながら、ダラム陽性菌を宿主とする場合は、ダラ
ム陰性菌に認められる上記のような問題点はないとして
も、菌体内に移入された組換えDNAの安定性に問題点
を有する上、大腸菌はど宿主−ベクター系も開発されて
おらず、また菌の取扱いも大腸菌はど容易でない。However, when Durham-positive bacteria are used as hosts, even though they do not have the above-mentioned problems observed with Durham-negative bacteria, there is a problem with the stability of the recombinant DNA transferred into the bacterial body, and E. coli No host-vector system has yet been developed, and handling of Escherichia coli is not easy.
一つの解決策
従って、大腸菌のような一般的な菌株を宿主とし、効率
よくしかも大過に所望の蛋白質を製造すべく、本発明者
らは種々検討を重ねた結果、以下のような方法を確立し
ている。すなわち、その方法は、アルカリ性ホスファタ
ーゼ由来のプロモーターをコードする遺伝子(以下プロ
モーター遺伝子という)を具備し、その制御下にシグナ
ル配列をコードする遺伝子(シグナル遺伝子)をも具備
したベクターに、所望の外来性蛋白質をコードする遺伝
子(外来性蛋白質の構造遺伝子)を組込んで組換えDN
Aを造成し、この組換えDNAを宿主微生物細胞内に移
入させて形質転換体となし、この形質転換体を一定条件
下で培養することによって所望蛋白質を菌体外(培養液
中)に分泌させ、これを回収する、という遺伝子工学的
手法による蛋白質の製造法である(特願昭60−951
81号および同60−121249号の明細書参照。One Solution Therefore, in order to efficiently and easily produce the desired protein using a common bacterial strain such as E. coli, the present inventors have conducted various studies and have developed the following method. Established. That is, the method involves injecting a desired exogenous gene into a vector that is equipped with a gene that encodes a promoter derived from alkaline phosphatase (hereinafter referred to as promoter gene) and also has a gene that encodes a signal sequence (signal gene) under its control. Recombinant DNA is created by incorporating a protein-encoding gene (structural gene of a foreign protein).
A, this recombinant DNA is transferred into host microorganism cells to create a transformant, and this transformant is cultured under certain conditions to secrete the desired protein outside the microbial cell (into the culture solution). This is a method for producing proteins using genetic engineering techniques, in which the protein is recovered (patent application 1986-951).
See specifications of No. 81 and No. 60-121249.
以下、これらを「先願発明」という。)。Hereinafter, these will be referred to as "prior inventions." ).
この方法は前記の問題点を解決したものとして有用なも
のであるが、技術というものの通性としてこの先願発明
もまた更なる改良と対象となりうる。This method is useful as it solves the above-mentioned problems, but as is common in technology, this prior invention may also be subject to further improvement.
本発明は、上記先願発明の培養工程においてその培養条
件中、温度をシフトすることにより、所望蛋白質の産生
効率が向上することを見出して完成されたものである。The present invention was completed based on the discovery that the production efficiency of a desired protein can be improved by shifting the temperature during the culture conditions in the culture process of the prior invention.
従って本発明による菌体外分泌による蛋白質の製造法は
、下記(A)〜(D)の工程よりなること、を特徴とす
るものである。Therefore, the method for producing proteins by extracellular secretion according to the present invention is characterized by comprising the following steps (A) to (D).
(A> アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモータ
ーをコードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシ
グナル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定し
た宿主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を用意する
こと。(A> Prepare a vector that is equipped with a gene that encodes a promoter derived from alkaline phosphatase, and also has a gene that encodes a signal sequence under its control, and that can proliferate within the intended host microorganism cell.
(8) 上記ベクターに外来蛋白質をコードする遺伝
子を組込んで組換えDNAを造成し、ついでこの組換え
DNAを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主
の形質転換を行って、形質転換体を得ること。(8) A gene encoding a foreign protein is inserted into the above vector to create a recombinant DNA, and then the host is transformed by transferring this recombinant DNA into host microorganism cells to produce a transformant. to get.
(C) 上記形質転換体を、微生物の増殖過程におけ
る対数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能
の誘導がおこるに必要な吊の無機燐を含有する培地での
培養に付し、その際に蛋白質合成能の誘導が起る前は低
温域で、蛋白質合成能誘導後は高温域で培養を行って、
両培養温度差が少なくとも4℃となるようにすること。(C) The above transformant is cultured in a medium containing the amount of inorganic phosphorus necessary for induction of protein synthesis ability from the late logarithmic growth phase to the early arrest phase in the growth process of the microorganism; Before induction of protein synthesis ability occurs, culturing is carried out in a low temperature range, and after induction of protein synthesis ability, culture is carried out in a high temperature range,
The temperature difference between both cultures should be at least 4°C.
(D) 上記培養終了後、培地中より産生外来性蛋白
質を回収すること。(D) After the completion of the above culture, collect the produced exogenous protein from the medium.
効 果
このように本発明は、ダラム陰性菌(大腸菌)を用いた
遺伝子工学的手法による蛋白質の造成にあたり、従来の
ように所望蛋白質をペリプラズムに留めることなく菌体
外(培地中)への分泌を行わせるべく、(イ)アルカリ
性ホスファターゼ由来のプロモーター遺伝子を具備し、
その制御下にシグナル遺伝子をも具備するものであって
、かつ(ロ)予定した宿主細胞内で増殖可能なベクター
を用意し、ついでこれに所望の外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んで組換えDNAとし、これを宿主菌に移入さ
せることによって形質転換体を得て、これを−定条件下
(前記の工程(C)で)培養することにより所望蛋白質
を菌体外(培地中)に分泌させ、これを回収することか
らなる遺伝子工学的手法による蛋白質の製造方法に関す
るものである。Effects As described above, the present invention enables the production of proteins using genetic engineering techniques using Durham-negative bacteria (Escherichia coli) by secreting the desired proteins outside the bacterial cells (into the medium) instead of retaining them in the periplasm as in the past. In order to perform this, (a) a promoter gene derived from alkaline phosphatase is provided,
A vector that also has a signal gene under its control and (b) is capable of proliferating in the intended host cell is prepared, and then the structural gene of the desired foreign protein is incorporated into it for recombination. A transformant is obtained by transferring the DNA into a host bacterium, and the desired protein is secreted outside the bacterium (into the medium) by culturing this under constant conditions (in step (C) above). The present invention relates to a method for producing proteins using genetic engineering techniques, which comprises the steps of:
本発明の好ましい態様は、上記(イ)および(ロ)より
なるベクターが、そのシグナル遺伝子の下流側末端直後
に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を結合し得るように
仕組まれたものを用いる方法である。そして、シグナル
遺伝子の直後に外来性蛋白質の構造遺伝子の導入を容易
にしようとするならば、シグナル遺伝子の塩基対の少な
くとも一つを構成員の少なくとも一部として人工的に創
出された制限酵素認識部位を有するものを用いるとよい
。A preferred embodiment of the present invention is a method in which the vector consisting of the above (a) and (b) is designed to be able to bind the structural gene of a desired foreign protein immediately after the downstream end of the signal gene. It is. In order to facilitate the introduction of a structural gene of a foreign protein immediately after the signal gene, it is necessary to recognize an artificially created restriction enzyme with at least one of the base pairs of the signal gene as a member. It is better to use one that has parts.
この制限酵素WX識部位を創出するに当っては、DNA
塩基対からなるコドンには縮重があるということを巧み
に利用することができる。すなわち、創出された制限酵
素認識/切断部位を該制限酵素で切断すれば、その切断
部位がシグナル遺伝子の下流側末端に接して存在する場
合は、該制限酵素切断端と相補性の端部を上流側に形成
させた外来性遺伝子を用意してこれを上記切断端におい
てシグナル遺伝子と結合させることによってシグナル遺
伝子の下流側に外来性遺伝子を直結させることができる
。また、シグナル遺伝子の切断部位が該遺伝子の下流側
末端より上流側に存在する場合は、該遺伝子の該切断部
位より下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側に
結合した断片を用意して上記と同じ結合を行えば、−旦
切断されたシグナル遺伝子がDNAの両鎖について復元
されると共にその下流側に外来性遺伝子が直結された構
造゛が実現される(詳細後記)。In creating this restriction enzyme WX recognition site, the DNA
The fact that codons, which are made up of base pairs, are degenerate can be cleverly exploited. That is, when the created restriction enzyme recognition/cleavage site is cleaved with the restriction enzyme, if the cleavage site is in contact with the downstream end of the signal gene, the end complementary to the restriction enzyme cleavage end is cut. By preparing an exogenous gene formed on the upstream side and linking it to the signal gene at the cut end, the exogenous gene can be directly linked to the downstream side of the signal gene. In addition, if the cleavage site of the signal gene is located upstream of the downstream end of the gene, a fragment that is linked to the upstream side of the foreign gene is prepared by synthesizing the downstream part of the gene from the cleavage site. When the same ligation as described above is performed, the previously cleaved signal gene is restored on both strands of the DNA, and a structure in which the foreign gene is directly linked to the downstream side is realized (details will be described later).
このようなベクターに所望外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んで組換えDNAとし、この組換えり、NAで宿主
菌を形質転換して形質転換体を得て、これを−定条件下
(本発明の工程(C)により)で培養すれば、宿主菌が
大腸菌のようなダラム陰性菌であっても、所望蛋白質は
べりブラズムに蓄積することなく菌体外(培養液中)ま
で分泌される。そして培養中から所望外来性蛋白質を回
収することにより本発明目的が達成される。A structural gene of a desired exogenous protein is incorporated into such a vector to obtain a recombinant DNA, and a host bacterium is transformed with this recombinant NA to obtain a transformant, which is then transformed under constant conditions (in this case). When cultured according to step (C) of the invention), even if the host bacterium is a Durham-negative bacterium such as Escherichia coli, the desired protein is secreted to the outside of the bacterium (into the culture solution) without accumulating in the cell plasma. The object of the present invention is achieved by recovering the desired foreign protein from the culture.
従って、本発明は、下記の利点を有するものである。Therefore, the present invention has the following advantages.
(1) 遺伝子工学的手法による蛋白質の製造・回収工
程が簡素化される。(1) The process of producing and collecting proteins using genetic engineering techniques will be simplified.
本発明の方法に従えば、上記(イ)および(ロ)の要件
を満すベクターに所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を組
込んでなる組換えDNAで宿主微生物を形質転換して形
質転換体を得てこれを培養すれば、所望蛋白質は成熟蛋
白質として(シグナル配列は蛋白質がペリプラズムに分
泌されるときに切断されている)培養液中まで分泌され
る。すなわち、形質転換された宿主微生物をオスモティ
ック・ショック法に付すことなく、培養液中から蛋白質
を回収するだけでよいのである。従って、遺伝子工学的
手法による蛋白質の製造・回収工程が簡素化されること
になる。According to the method of the present invention, a host microorganism is transformed with a recombinant DNA obtained by incorporating a structural gene of a desired foreign protein into a vector that satisfies the requirements (a) and (b) above, and a transformant is obtained. When obtained and cultured, the desired protein is secreted into the culture medium as a mature protein (the signal sequence is cleaved when the protein is secreted into the periplasm). That is, it is sufficient to simply recover the protein from the culture solution without subjecting the transformed host microorganism to the osmotic shock method. Therefore, the process of producing and recovering proteins using genetic engineering techniques is simplified.
なお、本発明方法はダラム陽性菌にも適用されるのであ
るが、枯草菌のようなダラム陽性菌はべりプラズムがな
いので、本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中に
まで分泌されるということはいうまでもない。The method of the present invention can also be applied to Durum-positive bacteria, but since Durum-positive bacteria such as Bacillus subtilis do not have a plasmid, if the method of the present invention is followed, the desired protein will be secreted into the culture solution. That goes without saying.
(2) 所望蛋白質の精製が容易である。(2) It is easy to purify the desired protein.
本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中まで分泌さ
れ、その分泌の際にシグナル配列は膜酵素によって切断
されるのでシグナル配列が付着していない蛋白質が得ら
れる。ここで得られる蛋白質は、シグナル配列をコード
する遺伝子と所望蛋白質をコードする遺伝子との間に余
分な遺伝子(リンカ−としてDNAI伝子)が存在すれ
ば、余分なアミノ酸を付着したままで分泌される。しか
しながら、本発明の一興体例で示されたようにシグナル
配列をコードする遺伝子の直後に所望蛋白質をコードす
る遺伝子を結合しておけば、所望蛋白質は余分なアミノ
酸が付着することなく完全な成熟蛋白質として培養液中
に分泌される。従って、形質転換体の培養を菌体が溶菌
していない時IIに終了しておけば、培養液中には実質
的に所望蛋白質および培haの構成成分のみが存在■る
ことになる。使用した培養液はその構成成分が判ってい
るのであるから、従って、目的蛋白質の精製は容易であ
る。According to the method of the present invention, the desired protein is secreted into the culture medium, and during secretion, the signal sequence is cleaved by a membrane enzyme, so that a protein without a signal sequence attached can be obtained. If there is an extra gene (DNAI gene as a linker) between the gene encoding the signal sequence and the gene encoding the desired protein, the protein obtained here will be secreted with the extra amino acids attached. Ru. However, as shown in one example of the present invention, if the gene encoding the desired protein is linked immediately after the gene encoding the signal sequence, the desired protein will be a complete mature protein without any extra amino acids attached. It is secreted into the culture medium as Therefore, if the culture of the transformant is terminated at step II when the bacterial cells are not lysed, substantially only the desired protein and the constituent components of the culture medium will be present in the culture solution. Since the constituent components of the culture solution used are known, it is therefore easy to purify the target protein.
(3) 先願発明よりも蛋白質の生産効率がよい。(3) Protein production efficiency is better than the prior invention.
先願発明の工程(C)において培養温度を培養中にシフ
トすることにより生産効率の向上(先願発明の1.5〜
2倍)が実現した。Improving production efficiency by shifting the culture temperature during culturing in step (C) of the earlier invention (1.5 to 1.5% of the earlier invention)
2 times) was realized.
本発明は菌体外分泌による蛋白質の製造法に係るもので
あるところ、この方法は工程(A)〜(D)よりなるも
のである。The present invention relates to a method for producing proteins by extracellular secretion, and this method consists of steps (A) to (D).
工程(A)/ベクターの用意
本発明に用いるベクターは、本発明の工程(C)におけ
る培養方法が、アルカリ性ホスファターゼが無機燐の存
在量により影響を受ける( 8iochem。Step (A)/Preparation of Vector In the vector used in the present invention, alkaline phosphatase is affected by the amount of inorganic phosphorus present in the culture method in step (C) of the present invention (8iochem).
Biophys、 Acta、38.460(1960
))、Nattlre、 183 。Biophys, Acta, 38.460 (1960
)), Nattlre, 183.
1529(1959) )という事実を利用するもので
あるところから、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロ
モーター遺伝子を具備することが要件であり、そして、
さらに、蛋白質の分泌に関与するシグナル遺伝子をその
制御下に具備するものであり、また、予定した宿主細胞
内で増殖可能なもの(前記(イ)および(ロ)の要件を
満すベクター)であればよい。1529 (1959)), it is necessary to have a promoter gene derived from alkaline phosphatase, and
Furthermore, it is a vector that has a signal gene involved in protein secretion under its control and is capable of proliferating within the intended host cell (a vector that satisfies the requirements of (a) and (b) above). Good to have.
そして、このようなベクターとして特に好ましいものは
、(イ)および(ロ)の必須要件を具備したうえ、シグ
ナル遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質の構
造遺伝子を結合させ得るように仕組れたものである。A particularly preferable vector is one that not only meets the essential requirements (a) and (b), but also has a structure that allows the structural gene of the desired exogenous protein to be linked immediately to the downstream end of the signal gene. It is something that was given.
この好ましいベクター(プラスミド)の具体例としては
、本発明者らの共同研究者によって先に提案されたプラ
スミドpTA529 (特願昭58−140748号)
、oTA1529 (特願昭59−159703号)、
pTA2539 (特願昭59−279585号)等が
ある。これらのプラスミドはいずれもアルカリ性ホスフ
ァターゼ由来のプロモーターおよびシグナル配列(前二
者についてはアルカリ性ホスファターゼ由来、pTA2
539はβ−ラクタマーゼ由来)を具備するものであり
、かつシグナル配列をコードする遺伝子の直後に外来性
蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なものである。ここで
pTA1529は、pTA529[)YK283(E、
coli K12C600(pYK283>として微
工研に寄託(微工研条寄第556号)〕をもとにしてこ
れを組換DNA技術において慣用されている方法(特に
、特願昭58−140748号の明1B書に記載の方法
)に従って造成したもの)とpH81(このプラスミド
は、pBR322(E、co I 1K12C600(
DBR322)として微工研に寄託(微工研条寄第23
5号)〕をv1限酵素EC0RIおよびHi ndl[
[で消化し、この IEcoRI−Hindl[[部分
を下記の塩基配列(I)で示される合成リンカ−と置換
したもの(特開昭59−71692号公報参照))とか
ら造成したものである。このプラスミドの造成操作の詳
細は特願昭59−159703号の明細書を参照された
い。A specific example of this preferred vector (plasmid) is the plasmid pTA529 (Japanese Patent Application No. 140748/1982), which was previously proposed by the present inventors' collaborators.
, oTA1529 (Patent Application No. 59-159703),
pTA2539 (Japanese Patent Application No. 59-279585), etc. All of these plasmids contain a promoter and signal sequence derived from alkaline phosphatase (the former two are derived from alkaline phosphatase, pTA2
539 is derived from β-lactamase), and allows for the binding of the structural gene of the foreign protein immediately after the gene encoding the signal sequence. Here, pTA1529 is pTA529[)YK283(E,
coli K12C600 (pYK283>, deposited with FIKEN (FeIKEN Article No. 556))], this was prepared using methods commonly used in recombinant DNA technology (in particular, Japanese Patent Application No. 140748/1983). pBR322 (E,co I 1K12C600(
DBR322), deposited with the FEIKEN (FEITEC Article No. 23)
No. 5)] with the v1 restriction enzyme EC0RI and Hin dl [
[] and this IEcoRI-Hindl [[] portion was replaced with a synthetic linker represented by the following base sequence (I) (see Japanese Patent Application Laid-open No. 71692/1983)]. For details of the procedure for constructing this plasmid, please refer to the specification of Japanese Patent Application No. 59-159703.
EcoRI 81)a I 5Ila I
Hind 11!(I>
ここで破線は制限酵素切断部位を示し、ECOR工等は
その切断を行う制限酵素の名称を示す。EcoRI 81)a I 5Ila I
Hind 11! (I> Here, the broken line indicates the restriction enzyme cleavage site, and ECOR etc. indicates the name of the restriction enzyme that performs the cleavage.
また、pTA2539は、pTA1529のアンピシリ
ン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に変換し、さら
にシグナル配列をβ−ラクタマーゼ由来のものに変換し
たプラスミドである。このプラスミド造成の詳細は、特
願昭59−279585号の明18書を参照されたい。Furthermore, pTA2539 is a plasmid in which the ampicillin resistance gene of pTA1529 was converted to a kanamycin resistance gene, and the signal sequence was further converted to one derived from β-lactamase. For details of this plasmid construction, please refer to Japanese Patent Application No. 59-279585, Mei 18.
ここでpTA1529は下記の塩基配列(It)からな
るDNA部分を含むので、シグナル遺伝子の直後に外来
性蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なプラスミドである
。Since pTA1529 contains a DNA portion consisting of the following base sequence (It), it is a plasmid that allows the structural gene of a foreign protein to be ligated immediately after the signal gene.
配列(II)はシグナル遺伝子部分(1)とその下流側
に結合されたDNA部分(2)とからなっているが、本
発明の一実施態様でいう「シグナル配列をコードする遺
伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋白質をコードする
遺伝子を結合させ得るよ〜うに仕組れたもの1とは、こ
のようなりNA部分を含むものである。なお、本発明に
おいてDNAに関して「下流側」というときは、5′→
3′鎖(■鎖)を上に3′←5′鎖(O鎖)を下に表示
したときの右側を意味する。Sequence (II) consists of a signal gene part (1) and a DNA part (2) linked to the downstream side thereof, and in one embodiment of the present invention, the "downstream end of the gene encoding the signal sequence" 1 that is designed to be able to immediately bind a gene encoding a desired foreign protein is one that contains an NA portion as described above.In addition, in the present invention, when referring to DNA as "downstream side", 5 ′→
It means the right side when the 3' chain (■ chain) is displayed at the top and the 3'←5' chain (O chain) at the bottom.
m基配列(If)は、二本鎖DNAからなるDNA3!
伝子の一部を示すものであって、A、G。The m-base sequence (If) is DNA3! consisting of double-stranded DNA!
They show part of the genes, A and G.
CおよびTはそれぞれアデニン、グアニン、シトシンお
よびチミンを示しく前記の(I)も同様)、LySSA
+ aおよびTrpはそれぞれリジン、アラニンおよ
びトリプトファンを示す。この二本鎖DNAの区域(1
)はシグナル遺伝子部分であり、区域(3)はυ1限肝
素Hi ndlllの認識部位であり、破線はHind
l[[切断部位である。区域(2)は、シグナル遺伝子
の下流側の直後に結合されたDNA部分である。C and T represent adenine, guanine, cytosine and thymine, respectively; the same applies to (I) above), LySSA
+a and Trp represent lysine, alanine and tryptophan, respectively. This area of double-stranded DNA (1
) is the signal gene part, area (3) is the recognition site of the υ1 critical element Hindlll, and the broken line is the Hindlll part.
l[[is the cleavage site. Area (2) is the DNA portion joined immediately downstream of the signal gene.
本発明に用いるベクターは、シグナル遺伝子がアルカリ
性ホスファターゼ由来であるものである。The vector used in the present invention has a signal gene derived from alkaline phosphatase.
この遺伝子の塩基配列は、下流側末端のアラニンのコド
ンがGCCである。In the base sequence of this gene, the alanine codon at the downstream end is GCC.
一方、上記塩基配列(I)は、アルカリ性ホスファター
ゼ由来の遺伝子の部分(1)の下流側末端のアラニンの
コドンGCCをGCTに、ざらに統(塩基C′をTに改
変したものに相当する。アラニンのコドンには縮重があ
るから、改変後のGCTもアラニンのコドンであり、従
って上記(II)のDNA部分(1)は依然としてアル
カリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝子に対応する
DNAである。On the other hand, the above nucleotide sequence (I) corresponds to the alanine codon GCC at the downstream end of the alkaline phosphatase-derived gene portion (1) changed to GCT and the base sequence (base C' changed to T). Since the alanine codon is degenerate, the modified GCT is also an alanine codon, and therefore the DNA portion (1) in (II) above still corresponds to the signal gene derived from alkaline phosphatase.
ところで、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺
伝子は、その下流側末端のアラニンのコドンの上流側に
リジンのコドンAAAおよび下流側にアルギニンのコド
ンCGGを有する。Incidentally, the signal gene derived from alkaline phosphatase has a lysine codon AAA upstream of the alanine codon at its downstream end and an arginine codon CGG downstream.
従って、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝
子が本来布していた下流末端のアラニンのコドンGCC
をGCT4C改変し、さらにアラニンに統く塩MCをT
に改変したことによって、この末端の塩基対と上流側の
4塩基対および下流側の1塩基対とで制限酵素Hind
nlの認識部位(3)AAGCTTが現出している。す
なわち、シグナル遺伝子には、少なくとも該末端の塩基
対を構成員の少なくとも一部とする制限酵素認識部位が
創出されている訳である。Therefore, the alanine codon GCC at the downstream end of the signal gene derived from alkaline phosphatase
was modified with GCT4C, and the salt MC connected to alanine was modified with T.
By modifying this terminus, the restriction enzyme Hind
The nl recognition site (3) AAGCTT appears. In other words, a restriction enzyme recognition site is created in the signal gene, in which at least a portion of its members are at least the base pairs at the ends.
pTA1529の上記(II)の具体例では、)1in
dIIIの認識部位(3)内の切断部位は破線で示した
通りであって、その位置はシグナル遺伝子とその下流側
直後に結合されていることあるべきDNA部分く上記p
TA529に係る塩基配列(II)では、既に結合され
ている区域(2))との間に存在している(切断部位の
位置は、二本鎖DNAの下流側のそれを意味する)。I
II限酊素切断部位がこのような位置に存在することは
、本発明に用いるベクターにおいて最も好ましいことで
ある。何故ならば、この切断部位はそれを利用して外来
性蛋白質の構造遺伝子をこのシグナル遺伝子が発現して
生じる雑種ないし融合蛋白はシグナル配列とそれに続く
蛋白との間でシグナル・ペプチダーゼよって切断される
のであるから、制限酵素切断部位とシグナル・ペプチダ
ーゼ切断位置とがこのように一致していれば、上記DT
A1529の例でいえば外来性蛋白質の構造遺伝子(こ
の例では、TrpののコドンTGGで始まつている)の
■鎖の5′○側にAGCTを補なっておくだけで、Hi
ndl消化後のシグナル遺伝子の粘着末端との間の結合
が可能だからである。なお、外来性遺伝子のe鎖の3′
−側にも塩基を補なうことを厭わなければ、制限酵素
切断部位が上流側に存在してもよいことはいうまでもな
く、そのような切断部位の存在するベクターもまた本発
明に用いられる範囲内である。In the specific example of (II) above of pTA1529, )1in
The cleavage site within the recognition site (3) of dIII is as shown by the broken line, and its position is the DNA part that should be linked to the signal gene and immediately downstream of it.
In the base sequence (II) related to TA529, it exists between the already bound region (2)) (the position of the cleavage site means that on the downstream side of the double-stranded DNA). I
It is most preferable that the II restriction cleavage site be present at such a position in the vector used in the present invention. This is because this cleavage site is used to express the structural gene of a foreign protein and the resulting hybrid or fusion protein is cleaved by a signal peptidase between the signal sequence and the following protein. Therefore, if the restriction enzyme cleavage site and the signal peptidase cleavage site match in this way, the above DT
In the case of A1529, Hi
This is because it is possible to bond with the sticky end of the signal gene after ndl digestion. In addition, the 3' e chain of the foreign gene
It goes without saying that a restriction enzyme cleavage site may be present on the upstream side, as long as you do not mind supplementing the - side with a base, and vectors containing such a cleavage site can also be used in the present invention. It is within the range.
「シグナル配列をコードする遺伝子」は、−般にシグナ
ル配列の種類に応じて各種の塩基配列のものがある。シ
グナル配列の具体例をいくつか挙げれば、β−ラクタマ
ーゼのもの(Proc、 Ha口。"Genes encoding signal sequences" generally have various base sequences depending on the type of signal sequence. Some specific examples of signal sequences include those of β-lactamase (Proc).
Acad、 Sci、 U、S、A、 75.3737
(1978)) 、リボ蛋白のもの(同上、74.10
04(1977)) 、アルカリ性フォスファターゼの
もの(Eur、 J、 Biochet 96.49
(1979) )等がある。シグナル配列については、
「蛋白質・核酸・酵素」臨時増刊号(「遺伝子操作」)
、第26巻、第4号、第386−394頁、を参照する
ことができる。しかしながら、本発明で使用する好まし
いシグナル配列は、アルカリ性ホスファターゼの塩基配
列のものおよびβ−ラクタマーゼ由来のものである。こ
のようなシグナル配列を具備する上記プラスミドであれ
ば、本発明の工程(C)の培養方法を利用することによ
り前記したような利点が得られるからである。Acad, Sci, U, S, A, 75.3737
(1978)), riboproteins (ibid., 74.10)
04 (1977)), that of alkaline phosphatase (Eur, J., Biochet 96.49
(1979)) etc. Regarding the signal sequence,
Special issue of "Proteins, Nucleic Acids, and Enzymes"("GeneManipulation")
, Vol. 26, No. 4, pp. 386-394. However, preferred signal sequences for use in the present invention are those of alkaline phosphatase and those derived from β-lactamase. This is because the above-mentioned plasmid having such a signal sequence can provide the above-mentioned advantages by using the culture method of step (C) of the present invention.
上記(IF)に示した本発明に用いプラスミド(ベクタ
ー)が具備するDNA遺伝子の一興体例は、アルカリ性
ホスファターゼ由来のDNAを改変してつくったもので
あるから、シグナル遺伝子DNAの部分(1)の下流側
末端直後にアルカリ性ホスファターゼ由来のDNA部分
(2)が結合している。本発明の具体例は、このDNA
部分(2)が外来性蛋白質をコードする遺伝子に対応す
るDNA部分であるものである。The example of a DNA gene included in the plasmid (vector) used in the present invention shown in (IF) above is one made by modifying the DNA derived from alkaline phosphatase, so the signal gene DNA portion (1) is A DNA portion (2) derived from alkaline phosphatase is bound immediately after the downstream end. A specific example of the present invention is this DNA
Part (2) is a DNA part corresponding to a gene encoding a foreign protein.
なお、この具体例の範躊に属する本発明に用いるプラス
ミドが具備するDNA遺伝子の一例は、シグナル遺伝子
部分が天然物由来の部分と合成された部分とからなるも
のである。すなわち、制限酵素切断部位より上流側が天
然物由来の部分であり、下流側が合成されたものである
。この場合の下流側の合成された部分は上記(■)した
ような切断部位の位置の場合には■鎖の4塩基(AGC
T)であるが、切断部位がこれより上流側に存在すれば
O鎖にも合成部分が必要となることはいうまでもない。An example of a DNA gene included in a plasmid used in the present invention that falls within the scope of this specific example is one in which the signal gene portion consists of a natural product-derived portion and a synthetic portion. That is, the part upstream of the restriction enzyme cleavage site is derived from a natural product, and the part downstream is a synthetic part. In this case, the synthesized part on the downstream side is the 4 bases of the ■ chain (AGC
T), but it goes without saying that if the cleavage site is located upstream from this, a synthetic portion is also required in the O chain.
工程(B)/形質転換体の造成
微生物の形質転換は、組換えDNA技術の分野における
公知の常法に従って行うことができる。Step (B)/Creation of transformants Transformation of microorganisms can be carried out according to conventional methods known in the field of recombinant DNA technology.
例えば、上記プラスミドに所望外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んで組換えDNA (キメラプラスミド)とし
、これを用いて微生物を公知の方法〔例えシクシュナー
法(GenetiCEngineering、凹、17
(1978)) )に従って形質転換したのち、所望の
形質転換体を取得(通常はプラスミドのマーカーを利用
する)する合目的的な任意の方法によって行うことがで
きる。For example, a structural gene of a desired foreign protein is incorporated into the above-mentioned plasmid to obtain a recombinant DNA (chimera plasmid), and this is used to generate a microorganism by a known method [for example, the Schikschner method (GenetiCE Engineering, Volume 17, pp.
(1978))), and then any suitable method for obtaining the desired transformant (usually using a plasmid marker) can be used.
本発明によるこのようなキメラプラスミドによって形質
転換しつる微生物は、その菌体内で上記プラスミドが増
殖しうるちのであればよく、具体的には大I!菌、枯草
菌および醇母菌等がある。なかでも大腸菌が比較的よく
利用されており、そして本発明は大腸菌のようなダラム
陰性菌を宿主菌として用いるときに特に前記したような
効果を有するものである。大腸菌としては、例えば、E
、coli K12 C600(微工研条寄第11
5号)、E、Co11 K12 YK537(微工
研菌寄第7941号)、E、coliRRl (ATC
C31447)およびE。The microorganism that can be transformed with such a chimeric plasmid according to the present invention may be one in which the above-mentioned plasmid can proliferate within the microbial cell, and specifically, the microorganism that can be transformed with the chimeric plasmid according to the present invention is a microorganism that can be transformed with the chimeric plasmid of the present invention. There are bacteria such as Bacillus subtilis and Bacillus subtilis. Among them, Escherichia coli is relatively commonly used, and the present invention particularly has the above-mentioned effects when using Durham-negative bacteria such as Escherichia coli as a host bacterium. As E. coli, for example, E.
, coli K12 C600 (Feikoken Joyori No. 11
5), E, Co11 K12 YK537 (Feikoken Bacteria No. 7941), E, coliRRl (ATC
C31447) and E.
coli HBlol(ATCC33694)等があ
る。本発明の具体例では、E、coliK12 YK
537を用いている。coli HBlol (ATCC33694). In embodiments of the invention, E. coli K12 YK
537 is used.
本発明において使用したこのような形質転換体の具体例
は、プラスミドE)TA1529.(前記)に人工的に
合成したhEGF (後記)の構造遺伝子を組込んでキ
メラプラスミドpTA1522を造成し、ついでこのキ
メプラスミド(組換えDNA)を宿主菌E、coli
K12 YK537に移入させることにより造成し
た形質転換体E、coli K12 YK537(
pTA1522)、E、coli RRI(pTA1
522)およびE、coli HBIOI(DTA1
522)である。A specific example of such a transformant used in the present invention is plasmid E) TA1529. A chimeric plasmid pTA1522 was constructed by incorporating the structural gene of hEGF (described later) which was artificially synthesized into (above), and then this chimeric plasmid (recombinant DNA) was injected into host bacteria E, coli.
Transformant E, coli K12 YK537 (
pTA1522), E. coli RRI (pTA1
522) and E. coli HBIOI (DTA1
522).
なお、上記プラスミドに組込む所望外来性蛋白質をコー
ドする遺伝子としては、ホルモン、免疫関連物質、神経
ペプチドおよび酵素等のものが考えられる。これらの構
造遺伝子の調製方法としては、天然の染色体DNAより
取得する方法や、あるいは人工的に合成する方法等が考
えられ、実際の構造遺伝子の調製方法については棒々の
成書や文献を参照することができる。In addition, the gene encoding the desired foreign protein to be incorporated into the above-mentioned plasmid may include hormones, immune-related substances, neuropeptides, enzymes, and the like. Methods for preparing these structural genes include methods for obtaining them from natural chromosomal DNA and methods for artificially synthesizing them.For actual methods for preparing structural genes, refer to various books and literature. be able to.
本発明の一興体例においては、このような外来性蛋白質
の構造遺伝子としてヒト上皮細胞成長因子(hEGF/
hUG、以下fiEGFと記す)をコードする遺伝子で
あって化学的に合成したもの(合成の詳細は特願昭58
−123520号の明細書参照のこと)、を用いた。In one embodiment of the present invention, human epidermal growth factor (hEGF/
A chemically synthesized gene encoding hUG (hereinafter referred to as fiEGF) (details of the synthesis are provided in the patent application filed in 1983).
-123520) was used.
工程(C)/微生物の培養
本発明の工程(C)による培養は、アルカリ性ホスファ
ターゼ由来のプロモーターを具備するベクター(プラス
ミド)に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を組込んでキ
メラプラスミド(組換えDNA)とし、これを宿主微生
物に移入させることにより形質転換した微生物の対象と
するものである。Step (C)/Cultivation of microorganisms Cultivation according to step (C) of the present invention is carried out by inserting a structural gene of a desired foreign protein into a vector (plasmid) having a promoter derived from alkaline phosphatase to generate a chimeric plasmid (recombinant DNA). ), which is then transferred into a host microorganism and used as the target of the transformed microorganism.
そして、本工程の培養方法の特徴は、形質転換された微
生物が保持しているベクター(プラスミド)の性質、す
なわち無機燐量に依存して蛋白質合成能に誘導がかかっ
たり、かからなかったりする性質(前記B10Che1
. B10E)hys、 ACta、およびNattl
re) 、を巧みに利用して、単一の培養系において微
生物の増殖とそれに続く微生物による蛋白質誘導とをお
こなわせ、しかも培養途中で培!!温度を低温域から高
温地域ヘシフトさせることにより、所望蛋白質の産生効
率の向上を図るということである。The characteristic of the culture method in this step is that the protein synthesis ability may or may not be induced depending on the nature of the vector (plasmid) held by the transformed microorganism, that is, the amount of inorganic phosphorus. Properties (the above B10Che1
.. B10E) hys, ACta, and Nattl
re), can be skillfully used to grow microorganisms and subsequently induce protein by the microorganisms in a single culture system, and even cultivate the microorganisms in the middle of the culture! ! By shifting the temperature from a low temperature region to a high temperature region, the production efficiency of the desired protein is improved.
このような培養方法の詳細は、下記の通りである。Details of such a culture method are as follows.
1) 培養法
本工程による微生物の培養方法は、典型的には、形質転
換された微生物を単細胞純粋分離培養し、ついで前培養
に付したのち(以上は微生物を培養する場合の公知の常
法であり、多数の文献や底置を参照することができる。1) Cultivation method The method for culturing microorganisms in this step typically involves culturing the transformed microorganism in single-cell pure isolation, and then subjecting it to preculture (the above is a known conventional method for culturing microorganisms). You can refer to a large number of documents and foundations.
例えば、成占「微生物学実験法」 (講談社刊)、「微
生物実験法」 (共立出版刊)、「細胞学実習提要」
(丸善刊)等がある。)、単一の培養系においてその培
養を行うことからなるものである。For example, Seishan's ``Experimental Methods of Microbiology'' (published by Kodansha), ``Experimental Methods of Microorganisms'' (published by Kyoritsu Shuppan), and ``Cytology Training Presentation''.
(published by Maruzen), etc. ), which consists of culturing in a single culture system.
この単一の培養系は通気撹拌培養の範躊に属するもので
あって、具体的には、培養系において菌を接種したのち
培地に無菌空気(必要に応じて純酸素を混入したもの)
を導入し、これを物理的に撹拌しつつ、pH,温度、溶
存酸素濃度等を、培養する微生物の生育条件に適合させ
て好適な条件下に維持しながら培養を行うことからなる
。This single culture system belongs to the category of aerated agitation culture, and specifically, after inoculating bacteria in the culture system, sterile air (with pure oxygen mixed in as necessary) is added to the culture medium.
The microorganism is introduced into the microorganism, and the microorganism is physically stirred while the pH, temperature, dissolved oxygen concentration, etc. are maintained under suitable conditions to suit the growth conditions of the microorganism to be cultured.
このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
行われ、そして適当なスケールアップが可能であること
はいうまでもない(底置「生物化学工学」 (上)、(
下)巻く東京大学出版会)参照〕。Such culture is usually carried out using a jar fermenter, and it goes without saying that appropriate scale-up is possible (see ``Biochemical Engineering'' (1), (1)
(see below), University of Tokyo Press).
2) 培 地
本工程に用いる培地組成は、LB培地(トリプトン、酵
母エキス、NaC1)を基本培地とし、必要に応じて他
の成分(例えばMaSO4・ 、7H20,抗生物質等
)を添加したものであって、さらに形質転換された微生
物の増殖過程における対数増殖期後期から停止期前期に
かけて蛋白質合成能の誘導を起すに必要充分口の無機燐
を含有するものより構成される。また、必要に応じて添
加する抗生物質として、本発明の具体例ではアンピシリ
ンを添加している。本発明の具体例において形質転換体
が保持しているプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子
を具備していて、形質転換体はアンピシリン耐性となっ
ている。従って、培養中でプラスミドが親藩した菌(耐
性がない)は培地中のアンピシリンによって成育が抑制
されるので、プラスミドを保持している宿主菌のみが成
育することになる。このように、培地への抗生物質の添
加は、宿主菌の生育上の便宜を図るための一手段である
。2) Medium The medium composition used in this step is LB medium (tryptone, yeast extract, NaCl) as the basic medium, with other components added as necessary (e.g. MaSO4, 7H20, antibiotics, etc.). Furthermore, it contains a sufficient amount of inorganic phosphorus to induce protein synthesis ability from the late logarithmic growth phase to the early arrest phase during the growth process of the transformed microorganism. Further, in the specific example of the present invention, ampicillin is added as an antibiotic added as necessary. In a specific example of the present invention, the plasmid held by the transformant contains an ampicillin resistance gene, making the transformant resistant to ampicillin. Therefore, since the growth of bacteria (not resistant) to which the plasmid has parented during culture is suppressed by ampicillin in the medium, only host bacteria that retain the plasmid will grow. In this way, the addition of antibiotics to the culture medium is a means to facilitate the growth of host bacteria.
3) 培養条件
(1) 培養温度
培養温度は、使用する微性物(形質転換体)の増殖また
は生育がM≠可能でかつ産生物が安定である範囲内の温
度であればよい。3) Culture conditions (1) Culture temperature The culture temperature may be within a range where M≠ allows the microorganism (transformant) used to multiply or grow and the product is stable.
本発明によれば、この温度範囲内において、培養温度?
低温域から高温域ヘシフトさせる。両温度域での培′7
!i温度の差は、少なくとも4℃であるべきである。According to the present invention, within this temperature range, the culture temperature?
Shift from low temperature range to high temperature range. Culture in both temperature ranges'7
! The difference in temperature should be at least 4°C.
ここで低温域とは、中温菌の場合は、25℃〜35℃程
度の範囲内であり、高温域とは32℃〜42℃程度の範
囲内をいう。例えば、本発明の一実施例において用いら
れた形質転換体が大腸菌のような場合は、低温域として
30℃付近が好ましく、高温域としては37℃付近が好
ましい。Here, in the case of mesophilic bacteria, the low temperature range is within the range of approximately 25°C to 35°C, and the high temperature range is within the range of approximately 32°C to 42°C. For example, when the transformant used in one example of the present invention is E. coli, the low temperature range is preferably around 30°C, and the high temperature range is preferably around 37°C.
そして、低温域から高温域へのPJ差温度のシフトは、
蛋白質の合成能の誘導の観点から行う。すなわち、蛋白
質の合成能の誘導が起る前は低温域で培養し、誘導後は
培養温度を高温域へ移行させる。培養温度を低温域から
高温域への移行は、培養液の熱容量が許す限り急速に行
うことが望ましい。そのための手段は任意のものであり
うるが、一つの手段は培養槽の外部熱媒体の温度を急速
に上昇させることである。他の手段としては、培養液を
低温培養槽、から高温培養槽へ移動させることである。Then, the shift of the PJ difference temperature from the low temperature range to the high temperature range is
This is done from the perspective of inducing protein synthesis ability. That is, before induction of protein synthesis ability occurs, the culture is carried out in a low temperature range, and after induction, the culture temperature is shifted to a high temperature range. It is desirable to shift the culture temperature from a low temperature range to a high temperature range as quickly as the heat capacity of the culture solution allows. The means for this purpose may be arbitrary, but one means is to rapidly increase the temperature of the external heating medium of the culture tank. Another option is to transfer the culture fluid from a low-temperature culture tank to a high-temperature culture tank.
各温度域での培養温度は、微生物培養の常法に従えば実
質的に一定に保つことがふつうである。The culture temperature in each temperature range is usually kept substantially constant according to conventional methods for culturing microorganisms.
培養温度シフトの時期の判断は、培養液中の無機燐量を
モニターすることによって行うのが便利である。すなわ
ち、培養開始より無機燐量を経時的に定量していき、そ
の量が最小になるまで(本発明の一実施例では約9時1
!りは低温域で培養し、それから急に培養温度を高温域
にシフトさせるのがよい。It is convenient to determine the timing of culture temperature shift by monitoring the amount of inorganic phosphorus in the culture solution. That is, the amount of inorganic phosphorus is quantified over time from the start of culture until the amount reaches the minimum (in one embodiment of the present invention, at about 9:00 p.m.
! It is best to culture in a low temperature range and then suddenly shift the culture temperature to a high temperature range.
(2)培養時間
本工程の培養時間は、培養温度を低温域から高゛温域ヘ
シフトさせた後であって、培養液中に分泌されている所
望物質の産生量が最大となる時間、が好ましい。そして
、さらに好ましい培養時間は、菌が溶菌せずにかつ所望
蛋白質が培養液中に予示に分泌されている時間である。(2) Culture time The culture time in this step is the time after the culture temperature has been shifted from a low temperature range to a high temperature range, at which the production amount of the desired substance secreted into the culture solution is at its maximum. preferable. A more preferable culture time is a time during which the bacteria are not lysed and the desired protein is secreted into the culture solution.
本発明の一興体例では、hEGFを製造する場合は約2
0.5時間を採用している。それ以上培養を行うと、菌
体が溶菌し、菌体中の種々の雑多な物質が培地中に混入
するに到って所望蛋白質の回収が難しくなるからである
。このような培養時間の検討は、培地中のグルコースお
よび無機燐の定m、OD 660の測定、生国数の測定
、ペリプラズム中および培養液中の産生物質の定量を指
標として行うことができる。グルコースの定量はグルコ
ースオキシダーゼ法(ニューグルコスタット「フジサワ
」のキットを利用。)により行うことができる。生国数
は、E、coli K12 YK537(pTAl
522)の場合についていえばアンピシリンを含むし
一培地(前記)およびL−培地の寒天上に生育するコロ
ニー数を測定すればよい。そして、本発明の一実施例で
は、アンピシリン含有し一培地の寒天上に生育するコロ
ニー数に対するし一培地の寒天上に生育するコロニー数
の割合(%)をプラスミド保持率として算出している。In one embodiment of the present invention, when producing hEGF, approximately 2
0.5 hours is adopted. This is because if the culture is carried out any longer, the bacterial cells will be lysed and various miscellaneous substances in the bacterial cells will be mixed into the medium, making it difficult to recover the desired protein. Such examination of culture time can be performed using as indicators the determination of glucose and inorganic phosphorus in the medium, the measurement of OD 660, the measurement of the number of birthplaces, and the quantification of produced substances in the periplasm and in the culture solution. Glucose can be quantified by the glucose oxidase method (using the New Glucostat "Fujisawa" kit). The country of birth is E, coli K12 YK537 (pTAL
In the case of 522), the number of colonies growing on agar of L-medium (described above) and L-medium containing ampicillin may be measured. In one embodiment of the present invention, the plasmid retention rate is calculated as the ratio (%) of the number of colonies growing on one agar medium containing ampicillin to the number of colonies growing on agar one medium medium.
無機燐の定量はモリブデンブルー法(工場排水試験方法
:JIS K 0102)に従って行った。また、
培養液中の産物hEGFの定量はまず培養液(10si
りをとり、これを遠心したのち上清をRRA法(後記)
に従って行い、ペリプラズム中のhEGFについては菌
体をオスモティック・ショック法(前記J、 Biol
、 Chew )によって処理後、この溶液を遠心して
上清をラジオレセプターアッセイ(RRA)法(J、
Biol、 Chet、 257.3053(1982
))によって分析することにより行ったhEGF定量の
詳細は後記参考例および特願昭59−159703号明
lII書参照)。The amount of inorganic phosphorus was determined according to the molybdenum blue method (factory wastewater test method: JIS K 0102). Also,
To quantify the product hEGF in the culture solution, first quantitate the culture solution (10si
After centrifuging this, the supernatant was subjected to RRA method (see below).
For hEGF in the periplasm, bacterial cells were subjected to the osmotic shock method (J. Biol.
After treatment by the radioreceptor assay (RRA) method (J, Chew), the solution was centrifuged and the supernatant was purified by radioreceptor assay (RRA)
Biol, Chet, 257.3053 (1982
)) For details of the hEGF quantification carried out by analysis, see Reference Examples and Japanese Patent Application No. 159703/1983, which will be described later.
なお、ここで菌体内で発現されたhEGFが菌体内(1
8胞質内)に存在しているかどうかをも調べた。It should be noted that hEGF expressed within the bacterial cells is expressed within the bacterial cells (1
We also investigated whether it was present in the cytoplasm.
すなわち、上記オスモティック・ショック処理後、得ら
れた沈殿(菌体)を純水に再度懸濁させたのち、超音波
処理を行って菌体を破壊し、ついで遠心を行って上清を
得て、この上清を上記RRA法に従って分析することに
より、菌体内(細胞質内)のhEGFを定】した。That is, after the above-mentioned osmotic shock treatment, the resulting precipitate (bacterial cells) is resuspended in pure water, and then subjected to ultrasonic treatment to destroy the bacterial cells, and then centrifuged to obtain a supernatant. By analyzing this supernatant according to the RRA method described above, hEGF within the bacterial cells (inside the cytoplasm) was determined.
(3) 培地のpH
pHは微生物の生育可能な範囲であればよく、用いられ
る微生物によって適宜好ましいpHを設定すればよい。(3) pH of culture medium The pH may be within a range in which microorganisms can grow, and a preferable pH may be set as appropriate depending on the microorganisms used.
大腸菌を用いる場合には、大腸菌の生育可能なpHは通
常4.6〜8.8であり、このうちpH7,0〜8.0
の間が特に好ましい。When using Escherichia coli, the pH at which Escherichia coli can grow is usually 4.6 to 8.8, among which pH 7.0 to 8.0.
Particularly preferred is between.
なお、ここで培養中のpHは変動するのがふつうである
が、−定pH付近に保っておくのが好ましい。Incidentally, although the pH during the culture normally fluctuates, it is preferable to keep it around a - constant pH.
(4) 消泡剤
培養中発泡の著しいときは、消泡剤(高級アルコール、
植物油等)を添加するのが常套手段である。本発明の場
合において用いる消泡剤は無機燐の存在量によって微生
物の蛋白質合成能を制御するのであるから、無**を含
有しないものであることが肝要である。そのような消泡
剤の具体例としては、「アンチホーム−AF−エマルジ
ョン」(半井化学)がある。(4) Antifoaming agent If foaming is significant during culturing, use an antifoaming agent (higher alcohol,
It is a common practice to add vegetable oil, etc.). Since the antifoaming agent used in the present invention controls the protein synthesis ability of microorganisms depending on the amount of inorganic phosphorus present, it is important that the antifoaming agent does not contain inorganic phosphorus. A specific example of such an antifoaming agent is "Antiform-AF-Emulsion" (Hani Chemical).
(5) 溶存酸素(Do)
溶存酸素とは、液相中に溶解している分子状酸素のこと
をいう。(5) Dissolved oxygen (Do) Dissolved oxygen refers to molecular oxygen dissolved in the liquid phase.
一般に通気撹拌培養に際しては、Doが過多の場合は微
生物の増殖は阻害され、−万〇〇が11)9m以下にな
っても同様に増殖が阻害されるということが知られてい
る。従うて、DOffiを微生物生育の阻害因子となら
ないように制御することが好ましい。本発明の一興体例
の場合はDoコントロール装置〔オリエンタル電気−F
C−4型〕によりDo猪を41)l)Imに保持してい
る。It is generally known that in aerated agitation culture, if Do is too large, the growth of microorganisms will be inhibited, and even if -11) 9m or less, the growth will be similarly inhibited. Therefore, it is preferable to control DOffi so that it does not become an inhibitor of microbial growth. In the case of one example of the present invention, the Do control device [Oriental Electric-F
C-4 type] holds the Do boar in 41) l) Im.
工 /の
生成蛋白質の回収は、公知の常法に従って行うことがで
きる。The protein produced by / can be recovered according to known conventional methods.
例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフイー、電気泳動法、高速液体クロマトグラ
フィーあるいはこれらを種々組合せた方法等〔底口「生
化学実験講座1タンパク質の化学■」日本生化学会編、
東京化学同人刊(1982)参照)があり、m製する蛋
白質あるいはペプチドの性質にあわせて適当なものを選
択して使用すればよい。For example, ion-exchange chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, high-performance liquid chromatography, or various combinations of these methods [Sokoguchi, "Biochemistry Experiment Course 1 Chemistry of Proteins", edited by the Japanese Biochemical Society,
(See Tokyo Kagaku Dojin Publishing (1982)), and an appropriate one can be selected and used according to the properties of the protein or peptide to be produced.
本発明の一実施例では、培養終了後の培養液を遠心し、
ついで得られる上滑を逆層カラムに通じてゲル濾過を行
ってhEGFが含有されている画分をDEAE−TOY
OPEARL■(イオン交換)に通じることにより1E
GF画分を分離して、所、望両分を回収した。なお、本
発明の方法に従って産生された目的蛋白質をより多(し
かも効率よく回収しようとするならば、培養液中に分泌
される目的蛋白質の量が多くかつ菌体が溶菌していない
時期に培養を終了して、培養液中から目的蛋白質を回収
すると共に菌体を集菌後にオスモティック・ショック法
により処理後ペリプラズム中の目的蛋白質を回収すれば
よい。本発明方法によれば宿主菌体内で産生された目的
蛋白質は菌体内(細胞質中)に留ることなくペリプラズ
ム(少量)あるいは培養液中(大部分)のいずれかに分
泌されているので、この回収法によれば菌体内で産生さ
れた殆んどの蛋白質が回収されるであろう。なお、ペリ
プラズム中の蛋白質の回収は、例えば、本発明者らの共
同研究者らによって先に提案された特願昭60−226
30号の方法によればよい。In one embodiment of the present invention, the culture solution after completion of culture is centrifuged,
The resulting supernatant was then gel-filtered through a reverse phase column, and the hEGF-containing fraction was purified by DEAE-TOY.
1E by being familiar with OPEARL■ (ion exchange)
The GF fraction was separated and the desired fractions were collected. In addition, if you want to recover more (and more efficiently) the target protein produced according to the method of the present invention, culture should be carried out at a time when the amount of target protein secreted into the culture solution is large and the bacterial cells are not lysed. After completing the process, the target protein is recovered from the culture solution, and the target protein is recovered from the periplasm after treatment by the osmotic shock method after collecting the bacterial cells.According to the method of the present invention, the target protein is recovered from the host bacterial body The target protein produced does not remain within the bacterial body (in the cytoplasm) but is secreted either into the periplasm (a small amount) or into the culture medium (mostly); therefore, with this recovery method, the target protein produced within the bacterial body is secreted either into the periplasm (a small amount) or into the culture medium (mostly). Most of the proteins in the periplasm will be recovered.Recovery of proteins in the periplasm is possible, for example, as described in Japanese Patent Application No.
The method of No. 30 may be used.
友−1−1
(1) 形質転換体の造成
下記の方法に従って形質転換体E、coliK12
YK537(pTA1522)を造成した。Tomo-1-1 (1) Creation of transformants Transformants E and coli K12 were prepared according to the following method.
YK537 (pTA1522) was constructed.
pTA1529(造成の詳細は特願昭59−15970
3号の明りIl書参照)5μ9を、50μmの緩衝液(
10mMトリス−塩i!緩衝液(以下Tris−HCI
><pH7,5)、10mMMgCl 50mM
NaCI)中で4単位の制限酵素Hindlll(タ
カラ〕 (以下Hi ndll)を用いて37℃で1時
間加水分解した。ついで、エタノール沈殿を行い、得ら
れた沈殿物を、30μmの反応液(67mM Tri
s−HCIIH8,8) 、16.6mMtjl酸アン
モニウム〔以下(NH4)2S04〕、6.7mMエチ
レンジアミン四酢酸(以下EDTA)、0.66mMず
つのdATPSdCTP、dGTP、TTP)中で1単
位のT4− DNAポリメラーゼを用いて、37℃で1
5分間処理した。ついで、エタノール沈殿物を、50μ
mの反応液(6mM Tris−HCI (p
H8,0) 、 6mM M g C
l 2.150mM NaC1)中で4単位の制
限酵素3al I(タカラ〕 (以下、3alJと記
す)を用いて37℃で1時間加水分解した。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動によって、3900bpのD
NA断片(第1図中■)を得た。pTA1529 (details of construction are in patent application No. 59-15970)
5 μ9 (see the light Il of No. 3) in a 50 μm buffer solution (
10mM Tris-salt i! Buffer solution (hereinafter referred to as Tris-HCI
><pH 7,5), 10mM MgCl 50mM
Hydrolysis was carried out at 37°C for 1 hour using 4 units of the restriction enzyme Hindll (Takara) (hereinafter referred to as Hindll) in NaCI). Ethanol precipitation was then performed, and the resulting precipitate was diluted with 30 μm of the reaction solution (67 mM Tri
s-HCIIH8,8), 1 unit of T4-DNA in 16.6mM ammonium chloride [hereinafter (NH4)2S04], 6.7mM ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter EDTA), 0.66mM each of dATPS, dCTP, dGTP, TTP). 1 at 37°C using polymerase.
Processed for 5 minutes. Then, the ethanol precipitate was added to 50μ
m reaction solution (6mM Tris-HCI (p
H8,0), 6mM MgC
Hydrolysis was carried out at 37°C for 1 hour using 4 units of restriction enzyme 3al I (Takara) (hereinafter referred to as 3alJ) in 2.150 mM NaCl). After the reaction, a 3900 bp D
An NA fragment (■ in Figure 1) was obtained.
プラスミドpBR322−hLIG (pBRa22
(E、co l i Kl 2 C600(pBR
322)として寄託済み〔微工研条寄第235号〕)を
EC0RIおよびSa I Iテ消化、したものに人工
的に合成したhEGF構造逅伝子をEC0RIおよび5
alIで消化した断片を組み込んでもの〕5μ9を、5
0μmの反応液(100mM Tris−Hcl(p
H7,5)、50mM Nacl、50mM Mg
Cl2)中で4単位の制限酵素EcoRI (タカラ〕
を用いYK537 (oTA1522)を以下のように
して培養した。単細胞純粋分離したE、 Co I i
で37℃で1時間加水分解したのち、上記と同様にT4
DNAポリメラーゼ処理を行い、さらに5alI処理を
行ったのち、アガロースゲル電気泳動によって160b
pのDNA断片(第1図中■)を得た。Plasmid pBR322-hLIG (pBRa22
(E, co l i Kl 2 C600 (pBR
The hEGF structure gene, which was artificially synthesized by digesting the hEGF structure deposited as 322) [Feikoken Article No. 235]) with EC0RI and SaII, was synthesized with EC0RI and 5.
5μ9 [incorporating the fragment digested with alI],
0μm reaction solution (100mM Tris-Hcl (p
H7,5), 50mM NaCl, 50mM Mg
4 units of restriction enzyme EcoRI in Cl2) (Takara)
YK537 (oTA1522) was cultured as follows. Single cell pure isolated E, Co Ii
After hydrolysis at 37℃ for 1 hour, T4
After DNA polymerase treatment and further 5alI treatment, 160b was isolated by agarose gel electrophoresis.
A DNA fragment of p (■ in Figure 1) was obtained.
上記で調製した二つのDNA断片(第1図中■および■
)を、30μmの反応液(20mMTris−HCI
(pH7,5)、10mMMgC12,10mM D
TT、0.5mMATP)中で300単位のT4DNA
リガーゼ(タカラ〕を用いて14℃で16時間反応させ
た。The two DNA fragments prepared above (■ and ■ in Figure 1)
) to 30 μm reaction solution (20mM Tris-HCI
(pH 7,5), 10mM MgC12, 10mM D
300 units of T4 DNA in TT, 0.5mM ATP)
The reaction was carried out at 14° C. for 16 hours using ligase (Takara).
反応終了後、これで大腸菌に12 YK537の形質
転換を行って、目的のプラスミド〔以下pTA1522
)(第1図中■)を含有する形質転換株(E、coli
K12 YK537(pTAl 522))を得
た。After the reaction was completed, E. coli was transformed with 12 YK537, and the target plasmid [hereinafter pTA1522] was transformed.
) (■ in Figure 1).
K12 YK537 (pTAL 522)) was obtained.
(2) 形質転換体の培養
本発明者らの共同研究者らにより組換えDNA技術によ
ってプラスミドpTA1522を用いて形質転換された
微生物E、coli K12YK537 (pTAl
522)を以下のようにして培養した。単細胞純粋分
離したE、coliK12 YK537(pTA15
22)−白金耳をトリプト2ゴ0
/リットル、NaC1 59/リツトル、アンピシリ
ン20q/リツトルからなる培地100mに接種し、5
00d容の坂ロコルペンで37℃で一夜振盪培養を行っ
た。(2) Cultivation of transformants The microorganism E, coli K12YK537 (pTA1
522) was cultured as follows. Single cell pure isolated E. coli K12 YK537 (pTA15
22) - Platinum loops were inoculated into 100 m of a medium consisting of 0/l of Trypto, 59/l of NaCl, and 20 q/l of ampicillin, and
Shaking culture was carried out overnight at 37°C in a 00d volume of Sakarokorpen.
次に、この培養?1k10dをとり、グルコース109
/リツトル、トリプトン109/リツトル、酵母エキス
5gリットル、MaSO4・7820 0、5SF/
リツトル、およびアンピシリン20η/リツトルよりな
る培地2リツトルに接種し、3リツトル容のミニジャー
ファーメンタ−で培養した。培iui度は、無機燐聞が
最小になるまで(培養開始後約9時間)は30℃付近と
し、それ以降は急激に37℃に変換した。通気量は0、
5vvi ( 1 vvmはi VOIu+me
−VOIu+ae−minuteのことで、1分間あた
り培養液1リツトルに対して1リツトルの空気が導入さ
れることを意味するものである。)、pHは7.2(4
N NaOHまたは4N HCIで調整する)、溶
存酵素(Do)濃度はDOコントロール装置により撹拌
速度を変化させて4 1)DI付近に保持した。培養は
、グルコースおよび無機燐の定量、生菌数の測定、菌体
内(細胞中)、ペリプラズム中および培養液中のhEG
Fの定量を経時的に行うことにより、培地中のhEGF
の農がペリプラズム中のhEGFより多くなるまで(培
養開始から約20.5時間)行った。グルコースの定量
はグルコースオキシダーゼ法にューグルコスタット「フ
ジサワ」のキットを用いた)に従って行った。生菌数は
アンピシリン20ttty/リツトルを含むし一培地(
トリプト2ゴ0
NaCl 59/リツトル)の寒天プレート上に出現
するコロニーの数を測定することにより行った。0D6
6。は菌体量の指標として測定したちのであり、無機燐
の定量はモリブデンブルー法(前記)によって行った。Next, this culture? Take 1k10d, glucose 109
/Little, Tryptone 109/Little, Yeast Extract 5g Liter, MaSO4.78200, 5SF/
1 liter of ampicillin and 20 η/liter of ampicillin, and cultured in a 3 liter mini jar fermenter. The culture temperature was kept at around 30°C until the inorganic phosphorus content was at its minimum (approximately 9 hours after the start of culture), and then rapidly changed to 37°C. The ventilation amount is 0,
5vvi (1 vvm is i VOIu+me
-VOIu+ae-minute means that 1 liter of air is introduced per 1 liter of culture solution per minute. ), pH is 7.2 (4
(adjusted with N NaOH or 4N HCI), and the dissolved enzyme (Do) concentration was maintained near 41) DI by changing the stirring speed using a DO control device. Cultivation involves quantifying glucose and inorganic phosphorus, measuring the number of viable bacteria, and measuring hEG within the bacterial body (inside cells), in the periplasm, and in the culture solution.
hEGF in the medium was determined by quantifying F over time.
The cultivation was continued until the amount of hEGF exceeded the amount of hEGF in the periplasm (approximately 20.5 hours from the start of culture). Glucose was quantified according to the glucose oxidase method using a kit for euglucostat "Fujisawa"). The number of viable bacteria is determined by one medium containing 20ttty/liter of ampicillin (
This was done by measuring the number of colonies appearing on an agar plate of Trypto 2 Go 0 NaCl 59/liter). 0D6
6. was measured as an indicator of bacterial mass, and inorganic phosphorus was determined by the molybdenum blue method (described above).
なお、この定mは、培養温度シフト時期の目安とするも
のである。菌体内(it胞質中)、培養液中およびブリ
ベラダム中のhEGFの定量は下記の方法で行った。す
なわち
培養液10dをとり、遠心分離したのら上清をRRA法
(下記)で分析することにより培養液中のhEGFを定
量し、ついでこのとき沈殿物として得られた菌体を20
%シュークロース、0、03M Tris−HCI(
pH8.0)、EDTA O.001Mからなる溶液
20威に懸濁させ、V温で10分放置した。ついで、再
度遠心して集菌し、この菌体を20mの冷u1水(0℃
〜4℃)に懸濁させ、水中で10分間放置した(オスモ
ティック・ショック法による処理)。そしてこの懸濁液
を遠心して上清を得、この上清をラジオリセブターアッ
セイ(RRA)法によって分析することによりペリプラ
ズム中のhEGFを定量した。また、上記オスモティッ
ク・ショック処II債に得られた沈殿物(菌体)を純水
10dに再懸濁したのちこれを超音波処理(「クボタイ
ンソネーターモデル200Mj )(10分間)を行っ
て菌体を破壊し、遠心(27000g、30分間)して
得られた上清をRRA法(下記)に従って分析すること
により、菌体中(細胞質中)のhEGFの定員を行った
。Note that this constant m is used as a guideline for the timing of culturing temperature shift. Quantification of hEGF in the bacterial cells (in the IT cytoplasm), in the culture solution, and in the Bribelladum was performed by the following method. That is, 10 d of the culture solution was taken, centrifuged, and the supernatant was analyzed by the RRA method (described below) to quantify hEGF in the culture solution.
% Sucrose, 0.03M Tris-HCI (
pH 8.0), EDTA O. The suspension was suspended in a solution of 0.001M and left at temperature V for 10 minutes. Then, centrifuge again to collect the bacteria, and soak the bacteria in 20 m of cold water (0°C).
~4°C) and left in water for 10 minutes (treatment by osmotic shock method). This suspension was centrifuged to obtain a supernatant, and hEGF in the periplasm was quantified by analyzing this supernatant by radioreceptor assay (RRA). In addition, the precipitate (bacterial cells) obtained in the Osmotic Shock Treatment II bond was resuspended in 10 d of pure water, and then subjected to ultrasonication (Kubota Insonator Model 200Mj) (10 minutes). The population of hEGF in the bacterial cells (cytoplasm) was determined by disrupting the bacterial cells and analyzing the supernatant obtained by centrifugation (27,000 g, 30 minutes) according to the RRA method (described below).
RRA法は、下記のようにして行った。まず、ヒト鼻咽
腔癌細胞由来のKB[1ffd (ATCCIIQCC
L17)を800dのフラスコ中でダルベツーコ変法イ
ーグル(DME)培地〔日永〕中でFIill培養を行
った。ついで培地を除き、0.05%のEDTAを含む
リン酸平衡化塩溶液(PBS)を用いて細胞をはがして
、細胞懸濁液を作成した。The RRA method was performed as follows. First, KB [1ffd (ATCCIIQCC
L17) was cultured in an 800 d flask in Dulbecco's modified Eagle (DME) medium [Hinaga]. The medium was then removed and the cells were detached using phosphate balanced salt solution (PBS) containing 0.05% EDTA to create a cell suspension.
その後、20mMヒーブス(Hepes ) (D
H7,4)を含むハンクス(Hanks)平衡塩類溶液
(HBSS)で2回細胞を洗浄した。細胞をパインディ
ング・ツルージョン(Binding solutio
n)(DME培地培地20上
7、4>−0.35g/リットルNaHCO3”100
μ9/dストレプトマイシン〕にli!!濁後、細胞数
を計算して30万〜40万10. 2al!パインデイ
ング・ツルージョンとなる様調整し、チューブに0.2
dずつ分注した。ついで上記の3種の上清を各々および
I −mEGF (71クス上皮細胞成長囚子(以
下mEGF))を含む試料液0、 2nd!をチューブ
に加えて、37℃で1時間インキュベートした。細胞を
氷冷したHBSSで3°回洗浄後、10%のトリクロ0
酢酸〔以下、TCA)に懸濁させ、グラスフィルターを
用いて細胞を固定した。アセトンでTCAを除いた後、
液体シンチレーションカウンターを用いて計数した。そ
してhEGFの逗をmEGFに換算した。Then 20mM Hepes (D
Cells were washed twice with Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) containing H7,4). Binding solution
n) (DME medium 20 top 7, 4>-0.35 g/liter NaHCO3"100
μ9/d streptomycin] to li! ! After turbidity, the number of cells was calculated to be 300,000 to 400,000. 2al! Adjust so that it becomes a pin ding trusion, and add 0.2 to the tube.
d portions were dispensed. Next, each of the above three types of supernatant and a sample solution containing I-mEGF (71x epithelial cell growth captive (hereinafter referred to as mEGF)) 0, 2nd! was added to the tube and incubated at 37°C for 1 hour. After washing the cells 3 times with ice-cold HBSS, 10% Trichlor 0
The cells were suspended in acetic acid (hereinafter referred to as TCA) and fixed using a glass filter. After removing TCA with acetone,
Counts were performed using a liquid scintillation counter. Then, the amount of hEGF was converted to mEGF.
なお、β−ガラクトシダーゼ(β−gal)は、細胞内
に存在する酵素である。従って、もしも菌体が溶菌して
いるならば、この酵素も菌体外に漏出しているであろう
と推察される。そこでβ−galの定量を行うことによ
り、宿主菌(形質転換体)が溶菌しているかどうかを判
断した(European Journal of A
pplied Hicrobiolngyand Bi
otechnology 、 16、14G−150(
1982) 、周り、5〜12(1984)) 。Note that β-galactosidase (β-gal) is an enzyme that exists within cells. Therefore, if the bacterial cells are lysed, it is inferred that this enzyme will also leak out of the bacterial cells. Therefore, by quantifying β-gal, it was determined whether the host bacteria (transformants) were lysed (European Journal of A
pplied Hicrobiolngyand Bi
otechnology, 16, 14G-150 (
1982), Around, 5-12 (1984)).
なお、β−galの定量は、ミラーの方法〔底置Exp
erimental in Mo1ecular Ge
netics。Note that β-gal was quantified using Miller's method [bottom Exp
erimental in Molecular Ge
netics.
355、 (1972)、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−刊)に従って行ない、0D42。で
その活性を示した。355, (1972), Cold Spring Harbor Laboratory), 0D42. showed its activity.
これらの実験での培養時間、OD 、生菌数、無機
燐のm、グルコース量、hEGF(g4体中(細胞質中
)、ペリプラズム中および培養液中)の吊およびβ−g
alの定は結果を表1に表す。In these experiments, the culture time, OD, number of viable bacteria, m of inorganic phosphorus, amount of glucose, suspension of hEGF (in the body (cytoplasm), periplasm and culture medium) and β-g
The results of the determination of al are shown in Table 1.
また、これらの結果を、図に示したものが第2図および
第3図(a)および(b)である。第2図はグルコース
凹、生菌数、吸光度および無機燐の定積結果をプロット
したものであり、第3図は、全hEGF (合計)、培
養液中のhEGF,ペリプラズム中のhEGFおよび細
胞内のhEGFを測定したときの結果(a)および各々
の画分の全hEGFffiに対する割合(b)を示した
ものである。Furthermore, these results are illustrated in FIGS. 2 and 3 (a) and (b). Figure 2 plots the constant volume results for glucose, viable count, absorbance, and inorganic phosphorus, and Figure 3 plots the total hEGF (total), hEGF in the culture medium, hEGF in the periplasm, and intracellular The results of measuring hEGF (a) and the ratio of each fraction to the total hEGFffi (b) are shown.
これらの表および図より、培養開始4120.5時間後
に、培養液中のhEGF量が最大となっていることがわ
かる。また、I8胞内に存在すべき酵素であるβ−ga
lは、培養開始以来その細胞内の比率が一定であるとこ
ろから、菌体は破壊されていないであろうと示唆される
。従って、この培養工程では、培養開始後9時間目に培
養温度をシフトしたのち、さらに培!開始後20.5時
間まで′培養を続けることにより54.71Rg/リッ
トルのhEGFを得ることができ、これは従来法の2倍
にも達していた。From these tables and figures, it can be seen that the amount of hEGF in the culture solution reaches its maximum 4120.5 hours after the start of culture. In addition, β-ga, an enzyme that should be present in the I8 cell,
Since the ratio of 1 in the cells has been constant since the start of culture, it is suggested that the bacterial cells have not been destroyed. Therefore, in this culture process, the culture temperature is shifted 9 hours after the start of culture, and then further culture is performed. By continuing the culture until 20.5 hours after initiation, 54.71 Rg/liter of hEGF could be obtained, which was twice as much as the conventional method.
(3) 蛋白質の回収
上記培養液1リツトルを遠心分離
(12,000g、10分)して上清を得て、これを逆
層クロマトグラフィー(カラムサイズ:直径4.1a+
X長さ8 an 、樹脂:prep PAK500/
C18逆層樹脂(ウォーターズ社))に付して所望蛋白
質画分を分離した。ついで、F記りロマトグラフィーに
よって得られた所望画分をDEAE −TOYOPEA
RL■(カラムサイズ:直径1.5cIRX長さ25
cta )カラムに付したのち、博望蛋白質画分を分離
した。なお、ここで得られた所望蛋白質の両分の一部を
とってポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ、h
EGF標品と同一位置にバンドが見られたので、所望蛋
白質hEGFが回収されていることが示唆された。(3) Protein recovery One liter of the above culture solution was centrifuged (12,000g, 10 minutes) to obtain a supernatant, which was then subjected to reverse layer chromatography (column size: diameter 4.1a+
x length 8 an, resin: prep PAK500/
The desired protein fraction was separated using C18 reverse phase resin (Waters). Then, the desired fraction obtained by the chromatography described in F was purified by DEAE-TOYOPEA.
RL■ (Column size: diameter 1.5c IRX length 25
cta ) column, the desired protein fraction was separated. In addition, when a portion of both parts of the desired protein obtained here was subjected to polyacrylamide electrophoresis, h
Since a band was observed at the same position as the EGF standard, it was suggested that the desired protein hEGF was recovered.
比 較 例
本発明に係る培養法を確立すべく、培養温j文を一定に
保った培養、培養途中に高温域から低温域へ、あるいは
低温域から高温域へシフトさせた培養等を行ってみた。Comparative Example In order to establish the culture method according to the present invention, culture was carried out while keeping the culture temperature constant, culture was shifted from a high temperature range to a low temperature range, or from a low temperature range to a high temperature range during the culture, etc. saw.
以下にそのときの結果を示す。The results are shown below.
化1f九ユ
培養温度を30℃に保って培養を続けるということ以外
は全て、実施例と同様に実験を行った。The experiment was conducted in the same manner as in the example except that the culture temperature was maintained at 30° C. and the culture was continued.
そのときの結果を第2表に示す。この結果より、培養液
中に分泌されたhEGFは26.4#+9/リツトルが
最大であり、これは培養開始後27時時間和得られたも
のであった。なお、表中の*1〜*4の意味は第1表と
同一である。The results are shown in Table 2. From this result, the maximum amount of hEGF secreted into the culture solution was 26.4#+9/liter, which was obtained at 27 hours after the start of culture. Note that the meanings of *1 to *4 in the table are the same as in Table 1.
直蚊五ユ
培養温度を37℃に保って培養を続けるということ以外
は全て実施例と同様に実験を行った。そのときの結果を
第3表に示す。この結果より、培養液中に分泌されたh
EGFは28.61R9/リツトルが最大であり、これ
は培養開始後23時間目に得られたものであった。なお
、表中の*1〜*4の意味は第1表と同一である。The experiment was conducted in the same manner as in the example except that the culture temperature was maintained at 37° C. and the culture was continued. The results are shown in Table 3. From this result, the h secreted into the culture medium
The maximum EGF was 28.61R9/liter, which was obtained 23 hours after the start of culture. Note that the meanings of *1 to *4 in the table are the same as in Table 1.
L狡亘ユ
培養開始から9時間後までは、培養温度を37℃とし、
それ以降は培?&湿度を急激に25℃ヘシフトさせると
いうこと以外は、全て実施例と同様に実験を行った。そ
のときの結果を第4表に示す。Until 9 hours after the start of culture, the culture temperature was 37°C.
Cultivate after that? & The experiment was conducted in the same manner as in the example except that the humidity was suddenly shifted to 25°C. The results are shown in Table 4.
表中のネ1〜ネ4の意味は第1表と同一である。The meanings of Ne1 to Ne4 in the table are the same as in Table 1.
この結果より、hEGFは培養開始後30.5時間で最
大の3.9019/リツトルとなった。なお、ここでは
β−ga1に加えβ−ラクタマーゼ(b I a)の定
量をも行っている。From this result, hEGF reached its maximum level of 3.9019/liter 30.5 hours after the start of culture. Note that in addition to β-ga1, β-lactamase (b I a) was also quantified here.
blaの定量を行ったのは、blaはアルカリ性ホスフ
ァターゼ同様ペリプラズム酵素であってペリプラズムに
蓄積するものだからである。従って、所望蛋白質の培養
液中への分泌が菌体の溶菌によるものであれば、bla
も培i時間の経過とともに培養液中に漏出すると考えら
れる。菌体のペリプラズム中および培口液中のblaの
定量は下記の通りである。すなわち、培養液中のbla
の定mは、培養液10−をとって遠心し、上清を0.1
Mナトリウム−リン酸緩衝液(9日7,0)により適当
に希釈して!ナンブル溶液をつくり、その0.5d(下
式vIR1)にPADAC(b I aの基質であって
、blaにより分解されて紫色→黄色に変化する。使用
に際しては、上記緩衝液に溶解させて00 ’?3
.0となるように調整する(カルビオケム・ベーリング
社(CALBIOCHEH−BEIIRING)) 0
、5 dを加えて37℃で10分(下式t)程度反応
を行ったのち5分間煮沸し、直ちに水中で冷却し、つい
でoD を測定した。The reason why bla was quantified is because bla, like alkaline phosphatase, is a periplasmic enzyme and accumulates in the periplasm. Therefore, if the secretion of the desired protein into the culture solution is due to bacterial lysis, bla
It is also thought that the microorganisms leak into the culture medium over time. The quantification of bla in the periplasm of bacterial cells and in the culture mouth fluid is as follows. That is, bla in the culture solution
The constant m is as follows: Take 10 - of the culture solution, centrifuge it, and dilute the supernatant to 0.1
Appropriately diluted with M sodium-phosphate buffer (9 days 7,0)! Prepare a nanbul solution, and add PADAC (b I a substrate, which changes from purple to yellow when it is decomposed by bla, to 0.5 d (formula vIR1 below). '?3
.. Adjust to 0 (CALBIOCHEH-BEIIRING) 0
, 5d was added thereto, and the reaction was carried out at 37°C for about 10 minutes (formula t below), then boiled for 5 minutes, immediately cooled in water, and then the oD was measured.
この測定値と対照(ザンプル溶液として上記緩衝液を上
記と同様にして測定したもの)の0D56゜の測定値と
の差(ΔoD )より、次式を用いてblaの活性を
測定した。また、ペリプラズム中のblaの測定は、上
記で得られた菌体をオスモティック・ショック法(前記
)に従って処理したのち、この溶液を0.1Mナトリウ
ム−リン酸緩衝液(p)17.O>で適当に希釈して、
以下培養液中の
blaの定量と同様に行った。Based on the difference (ΔoD) between this measured value and the measured value at 0D56° of a control (measured using the above buffer as a sample solution in the same manner as above), the activity of bla was measured using the following formula. In addition, to measure bla in the periplasm, the bacterial cells obtained above were treated according to the osmotic shock method (described above), and then this solution was mixed with 0.1M sodium-phosphate buffer (p17. Appropriately dilute with O>
The following procedure was carried out in the same manner as the quantification of bla in the culture solution.
ここでユニットは、基質PADAC1μa+olのβ−
ラクタム環を1分間で加水分解づる酵素活性を1ユニツ
トとしたもので、tは反応時間(分)を、■はサンプル
溶液のfli! (d)を示すものである(「蛋白質・
核酸・酵素」且、390〜400 (1978))。こ
の表中のβ−galおよびblaの定置結果より、β−
galはその大半が細胞内に留っていること、およびb
laの大半がベリブラズに留っていることより、宿主菌
は破壊されていないことが示唆される。Here, the unit is the β-
The enzyme activity that hydrolyzes a lactam ring in 1 minute is defined as 1 unit, where t is the reaction time (minutes), and ■ is the fli! of the sample solution. (d) (“Protein・
Nucleic Acids and Enzymes” and 390-400 (1978)). From the emplacement results of β-gal and bla in this table, β-
The majority of gal remains within the cell, and b
The fact that most of the la remains in Belibraz suggests that the host bacteria are not destroyed.
比較例4
培養開始から約9時間までは培養温度を37℃とし、そ
れ以降は培養温度を30℃にシフトするということ以外
は全て実施例と同様に実験を行った。そのときの結果を
第5表に示す。この結果より、培養液中へ分泌されたE
GFは27.7#/リツトルが最大であり、これは培t
&開始後29時間目に得られたものであった。なお、表
中の本1〜本3の意味は第1表と同一である。Comparative Example 4 An experiment was conducted in the same manner as in Example except that the culture temperature was 37°C for about 9 hours from the start of culture, and thereafter the culture temperature was shifted to 30°C. The results are shown in Table 5. From this result, the E secreted into the culture medium
The maximum GF is 27.7 #/liter, which is
& It was obtained 29 hours after the start. The meanings of Books 1 to 3 in the table are the same as in Table 1.
工狡■1
培養開始から約7時間までは培養温度を37℃とし、そ
れ以降は培養温度を40℃にシフトするということ以外
は実施例と同様に実験を行った。Technique 1 The experiment was carried out in the same manner as in Example except that the culture temperature was 37°C for about 7 hours from the start of culture, and thereafter the culture temperature was shifted to 40°C.
そのときの結果を第6表に示す。この結果より、培養液
中へ分泌されたEGFは28.5IItg/リットルが
最大であり、これは培養開始後21時間口に得られたも
のであった。なお、表中の本1〜本3の意味は第1表と
同一である。The results are shown in Table 6. From this result, the maximum amount of EGF secreted into the culture solution was 28.5 IItg/liter, which was obtained in the mouth 21 hours after the start of culture. The meanings of Books 1 to 3 in the table are the same as in Table 1.
ルJロ九旦
第7表
以上、実施例および比較例の結果より、培養温度のシフ
ト範囲、シフト時間、培養液中のEGFmが最大となっ
た培養時間およびそのときのEGFm <Rg/J )
を第7表にまとめた。これより、本実施例のように、低
温域から高温域へ培養をシフトさせる培養法によれば通
常の培養法(37℃で一定)よりも2倍程度産生■の増
加が認められる。From the results of Examples and Comparative Examples in Table 7 of Table 7 of Le J. Ro, the shift range of culture temperature, shift time, culture time at which EGFm in the culture solution reached its maximum, and EGFm at that time <Rg/J)
are summarized in Table 7. From this, it can be seen that the culture method of shifting the culture from a low temperature range to a high temperature range, as in this example, increases the production (2) by about twice that of the normal culture method (constant at 37° C.).
関連微生物の菌学的性質および受託#を号本発明におい
て開示された微生物の菌学的性質および受託番号は下記
の通りである。Mycological properties and accession numbers of related microorganisms The mycological properties and accession numbers of the microorganisms disclosed in the present invention are as follows.
受託年月日
(1) 昭和56年 6月 9日
(2) 昭和58年 4月30日
(3) 昭和56年 6月 9日
(4) 昭和56年11月14日
本 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託
番号
** A T CC(American Type
Cu1tureCollection)の受託番号
鼠3」υ1亘
(1) E、coli K12C600この菌
は、グラム隙性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の
大腸菌属の一般属性を有する他、F因子を含まず、サプ
レッサー遺伝子Eの機能を欠き、遺伝子組替えに関与す
るヌクレアーゼをコードするrecBcLf伝子に欠陥
を有するものである。栄養要求性としては、トレオニン
とロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする。ま
た、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものであ
る。なJ3、水筒に関する文献は以下の通りである。Entrustment date (1) June 9, 1981 (2) April 30, 1981 (3) June 9, 1981 (4) November 14, 1981 Japan Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology Microbial Technology Research Institute accession number ** A T CC (American Type)
Cur1ture Collection) accession number 3" υ1 Wataru (1) E. coli K12C600 This bacterium is a Gram-space bacillus, does not produce spores, has general attributes of the genus Escherichia coli such as facultative anaerobic ability, and has the F factor. It lacks the function of suppressor gene E and has a defect in the recBcLf gene, which encodes a nuclease involved in genetic recombination. As an auxotroph, it requires threonine and leucine for growth on its minimal medium. Furthermore, taxonomically, it belongs to the family Enterobacteriaceae and the genus Escherichia coli. The literature regarding the J3 water bottle is as follows.
(イ) Genetics、39.440(1954
)(口) Nature、 217.1110(1
968)(2) E、coli K12C600(
pYKこの菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通
性嫌気性等の大腸菌属の一般属性を有する他、F因子を
含まず、サプレッサー遺伝子Eの機能を欠き、遺伝子組
替えに関与するヌクレアーゼをコードするrecBG遺
伝子に欠陥を有するものである。栄養要求性としては、
トレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要
とする。(b) Genetics, 39.440 (1954
) (mouth) Nature, 217.1110 (1
968) (2) E. coli K12C600 (
pYK This bacterium is a Durham-negative bacillus, does not produce spores, has general attributes of the genus Escherichia coli such as being facultatively anaerobic, does not contain F factor, lacks the function of suppressor gene E, and has no nuclease involved in genetic recombination. It has a defect in the recBG gene encoding. As for nutritional requirements,
Requires threonine and leucine for growth on its minimal medium.
phOA遺伝子のプロモーター−オペレーター領域pA
CYC177由来の複製開始領域およσpBR322の
b I a31i伝子から構成されたプラスミドpYK
283を含み、アンピシリンに対して耐性を示す。また
、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである
。Promoter-operator region pA of phOA gene
Plasmid pYK composed of the replication initiation region derived from CYC177 and the b I a31i gene of σpBR322
283 and is resistant to ampicillin. Furthermore, taxonomically, it belongs to the family Enterobacteriaceae and the genus Escherichia coli.
なお、プラスミドpYK283由来の形質を除けば、こ
の菌株の菌学的性質はその親株E。The mycological properties of this strain are those of its parent strain E, except for the traits derived from plasmid pYK283.
coli K12C600のそれと同じである。It is the same as that of coli K12C600.
(3) E、coli K12C600(pBRこ
の菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性
等の大腸菌属の一般属性を右づる他、F因子を含まず、
サプレッサー遺伝子Eの機能を欠き、遺伝子組替えに関
与するヌクレアーゼをコードするrecBC遺伝子に欠
陥を有するものである。栄養要求性としては、トレオニ
ンとロイシンをその最小培地上でのi!!殖に必要とす
る。また、薬剤耐性プラスミドpBR322を含む。な
お、プラスミドpBR322に関してはGene、 2
.95(1977)、大腸菌Kl 2C600に関して
は上記Nutureを参照することができる。pBR3
22由来の形質を除けば、E、coli K12C6
00(pBR322)の菌学的性質は親株のそれと同じ
である。(3) E. coli K12C600 (pBR) This bacterium is a Durham-negative bacillus, does not produce spores, exhibits the general attributes of the genus E. coli such as facultative anaerobic properties, and does not contain the F factor.
It lacks the function of suppressor gene E and has a defect in the recBC gene, which encodes a nuclease involved in genetic recombination. As auxotrophs, threonine and leucine are added to the i! ! Required for breeding. It also contains drug resistance plasmid pBR322. Regarding plasmid pBR322, see Gene, 2
.. 95 (1977), Nature, supra, regarding E. coli Kl 2C600. pBR3
Except for the traits derived from E. coli K12C6
The mycological properties of 00 (pBR322) are the same as those of the parent strain.
(4) E、coli K12YK537大腸菌に
12YK537は、公知株であるところの大腸菌に12
株()licrobioloqica! IteVie
WS 。(4) E. coli K12YK537 12YK537 is a known strain of E. coli 12YK537.
Stock () licrobioloqica! IteVie
WS.
44.1〜56(1980))の誘導体大腸菌Kl 2
RR1(Gene、 2.95(1977)、Bioc
hem、 Biophys。44.1-56 (1980)) derivative of Escherichia coli Kl 2
RR1 (Gene, 2.95 (1977), Bioc
hem, Biophys.
ACta、 、655.243(1981) )をさら
に改変したものであり、下記の性質を示し、他の性質に
ついてはに12RR1のそれと異なるところのない菌株
である。(recAl、phOA8、pro+)(5)
F:、coli HB101大腸菌に12株(上
記)と大腸菌Bとをハイブリッドさせて造成した菌であ
り、下記の遺伝子型を有する。なおこの株に圓する文献
としてはJ、 t4o1. Biol、 41.459
(1969) 83よび)lcthodsEnzymo
l、、68.24B(1979)がある。ACta, 655.243 (1981)), and exhibits the following properties, and is a strain that does not differ from that of 12RR1 in other properties. (recAl, phOA8, pro+) (5)
F: coli is a bacterium created by hybridizing 12 strains of E. coli HB101 (described above) and E. coli B, and has the following genotype. The literature related to this strain is J, t4o1. Biol, 41.459
(1969) 83 and) lcthodsEnzymo
1, 68.24B (1979).
F” 、hsds20 (r −、mB−)、rec
Al3、ara−14、prOA2、l acYl 、
aa l K2、rpsL20(3m )、xy+−
5、mt l −1,5uDE44、λ−
(6) E、coli RRI
大[IHBlolをrecA+に改変したE。F'', hsds20 (r-, mB-), rec
Al3, ara-14, prOA2, lacYl,
aa l K2, rpsL20 (3m), xy+-
5, mt l -1, 5uDE44, λ- (6) E, coli RRI large [E with IHBlol modified to recA+.
coli )−18101の誘導体である。従って、
遺伝子型は(F−、reCA+以外はHBlolと同一
)である。なお、この株に関する文献としてはcane
2.95(1977)およびBiochimica′
et Biophysica ACta 、 655
.243(19&i)がある。coli)-18101. Therefore,
The genotype is (F-, same as HBLol except reCA+). In addition, the literature regarding this strain is cane
2.95 (1977) and Biochimica'
et Biophysica ACta, 655
.. There are 243 (19&i).
第1図は、E、coli K12Y537を形質転換
するために使用したプラスミドpTA1522造成のた
めのフローチャートである。
第2図ならびに第3図<a)および(b)は、第1表の
結果をプロットした図面である。FIG. 1 is a flowchart for constructing plasmid pTA1522 used to transform E. coli K12Y537. FIG. 2 and FIG. 3 <a) and (b) are drawings in which the results of Table 1 are plotted.
Claims (1)
る、菌体外分泌による蛋白質の製造法。 (A)アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターを
コードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナ
ル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿
主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を用意すること
。 (B)上記ベクターに外来蛋白質をコードする遺伝子を
組込んで組換えDNAを造成し、ついでこの組換えDN
Aを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主の形
質転換を行つて、形質転換体を得ること。 (C)上記形質転換体を、微生物の増殖過程における対
数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘
導がおこるに必要な量の無機燐を含有する培地での培養
に付し、その際に蛋白質合成能の誘導が起る前は低温域
で、蛋白質合成能誘導後は高温域で培養を行つて、両培
養温度差が少なくとも4℃となるようにすること。 (D)上記培養終了後、培地中より産生外来性蛋白質を
回収すること。 2、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターをコ
ードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナル
配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿主
微生物細胞内で増殖可能なベクターが、そのシグナル配
列をコードする遺伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋
白質をコードする遺伝子を結合させ得るように仕組まれ
たものである、特許請求の範囲第1項記載の菌体外分泌
による蛋白質の製造法。 3、工程(B)においてベクターに組込む外来性蛋白質
をコードする遺伝子が、ヒト上皮細胞成長因子である、
特許請求の範囲第1項または第2項のいずれかに記載の
菌体外分泌による蛋白質の製造法。[Scope of Claims] 1. A method for producing proteins by extracellular secretion, which comprises the following steps (A) to (D). (A) To prepare a vector that is equipped with a gene encoding a promoter derived from alkaline phosphatase, and also has a gene encoding a signal sequence under its control, and is capable of propagating within the intended host microorganism cell. (B) A gene encoding a foreign protein is inserted into the above vector to create a recombinant DNA, and then this recombinant DNA is
Transforming a host by transferring A into host microorganism cells to obtain a transformant. (C) The above transformant is cultured in a medium containing an amount of inorganic phosphorus necessary to induce protein synthesis ability from the late logarithmic growth phase to the early arrest phase in the growth process of the microorganism. Culture should be carried out in a low temperature range before induction of protein synthesis ability occurs, and in a high temperature range after induction of protein synthesis ability, so that the difference in temperature between the two cultures is at least 4°C. (D) After the completion of the above culture, the produced exogenous protein is recovered from the medium. 2. A vector that is equipped with a gene encoding a promoter derived from alkaline phosphatase and also has a gene encoding a signal sequence under its control, and is capable of proliferating within the intended host microorganism cells, encodes the signal sequence. The method for producing a protein by extracellular secretion according to claim 1, which is designed to allow a gene encoding a desired foreign protein to be linked immediately after the downstream end of the gene. 3. The gene encoding the foreign protein to be incorporated into the vector in step (B) is human epidermal growth factor.
A method for producing a protein by extracellular secretion according to claim 1 or 2.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61149093A JPS633799A (en) | 1986-06-25 | 1986-06-25 | Production of protein by extracellular secretion |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61149093A JPS633799A (en) | 1986-06-25 | 1986-06-25 | Production of protein by extracellular secretion |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS633799A true JPS633799A (en) | 1988-01-08 |
Family
ID=15467541
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61149093A Pending JPS633799A (en) | 1986-06-25 | 1986-06-25 | Production of protein by extracellular secretion |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS633799A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1568561A1 (en) | 2004-02-24 | 2005-08-31 | HONDA MOTOR CO., Ltd. | Brake device for motorcycle |
-
1986
- 1986-06-25 JP JP61149093A patent/JPS633799A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP1568561A1 (en) | 2004-02-24 | 2005-08-31 | HONDA MOTOR CO., Ltd. | Brake device for motorcycle |
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